POLSKI PRZEGLĄD CHIRURGICZNY 2014, 86, 8,

POLSKI PRZEGLĄD CHIRURGICZNY 2014, 86, 8, 684 665 Związek polimorfizmu Lys589Glu genu EXO1 z ryzykiem występowania raka jelita grubego w populacji polskiej* Association of polymorphism of Lys589Glu EXO1 gene with the risk of colorectal cancer in the polish population Jacek Kabziński 1, Karolina Przybylowska 1, Michał Mik 2, Andrzej Sygut 2, Łukasz Dziki 2, Adam Dziki 2, Ireneusz Majsterek 1 Z Zakładu Chemii i Biochemii Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 1 (Department of Clinical Chemistry and Biochemistry Medical University in Łódź) Kierownik: prof. dr hab. I. Majsterek Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Plac Hallera 1, 90-647 Łódź Z Kliniki Chirurgii Ogólnej i Kolorektalnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 2 (Department of General and Colorectal Surgery Medical University in Łódź) Kierownik: prof. dr hab. A. Dziki Zachorowalność na raka jelita grubego (RJG) rośnie z roku na rok. Pomimo intensywnych badań etiologia RJG pozostaje nieznana. Badania sugerują, że u podstaw procesu nowotworzenia leżeć może obniżona efektywność mechanizmów naprawy DNA, często powodowana polimorfizmami w genach naprawy DNA. Celem pracy było określenie związku pomiędzy polimorfizmem Lys589Glu genu EXO1 a modulacją ryzyka wystąpienia raka jelita grubego w populacji polskiej. Określenie molekularnych podstaw procesu nowotworzenia i wytypowanie polimorfizmów zwiększających ryzyko jego wystąpienia pozwolą na kwalifikowanie pacjentów do grupy podwyższonego ryzyka i objęcie ich programem profilaktycznym. Materiał i metodyka. Jako materiał wykorzystano krew pobraną od 130 pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem jelita grubego. Grupę kontrolną stanowiło 135 zdrowych osób. Genotypowanie przeprowadzono metodą TaqMan. Wyniki. Uzyskane wyniki wskazują, iż genotyp Lys/Glu jest związany ze zwiększonym ryzykiem występowania raka jelita grubego (OR 1,811; Cl 95% 1,031-3,181; p=0,038). Wnioski. Na podstawie uzyskanych wyników wnioskujemy, że polimorfizm Lys589Glu genu EXO1 może mieć związek ze zwiększonym ryzykiem występowania raka jelita grubego. Słowa kluczowe: rak jelita grubego, polimorfizmy, EXO1, naprawa DNA The incidence of colorectal cancer (CRC) is increasing from year to year. Despite intensive research CRC etiology remains unknown. Studies suggest that at the basis of the process of carcinogenesis can lie reduced efficiency of DNA repair mechanisms, often caused by polymorphisms in DNA repair genes. The aim of the study was to determine the relationship between gene polymorphism Lys589Glu of EXO1 gene and modulation of the risk of colorectal cancer in the Polish population. Determination of the molecular basis of carcinogenesis process and predicting increased risk will allow qualifying patients to increased risk group and including them in preventive program. * Praca finansowana z grantu UMed 502-03/5-170-01/502-54-107 / This study was supported by Medical University in Łódź Grant 502-03/5-170-01/502-54-107

Obrażenia tkanek miękkich twarzy w wyniku pogryzienia przez psa 685 Material and methods. The material used in study was blood collected from 130 patients diagnosed with colorectal cancer. The control group consisted of 135 healthy people. Genotyping was performed by TaqMan method. Results. The results obtained indicate that the genotype Lys/Glu is associated with an increased risk of colorectal cancer (OR 1.811, 95% Cl 1,031-3,181, p = 0.038). Conclusion. On the basis of these results, we conclude that Exo1 gene polymorphism Lys589Glu may be associated with an increased risk of colorectal cancer. Key words: colorectal cancer, polymorphisms, EXO1, DNA repair Rak jelita grubego (RJG) jest obecnie drugim najczęściej występującym nowotworem wśród kobiet i trzecim wśród mężczyzn. Współczynnik zachorowalności rośnie z roku na rok, a pomimo prowadzenia intensywnych badań w tym zakresie etiologia choroby pozostaje nadal nieustalona. Niska responsywność na terapię oraz wysoka złośliwość są przyczyną bardzo niskiego współczynnika 5-letniej przeżywalności (w Polsce około 30%) oraz sprawiają, że RJG jest na czwartym miejscu pod względem przyczyny zgonów spowodowanych nowotworami. Szacuje się, że 15-30% zachorowań ma charakter rodzinny, z czego około 3% powodowane jest mutacjami genów predyspozycji. Jednak pomimo faktu, iż około 70% przypadków to rak sporadyczny powodowany czynnikami środowiskowymi, badania wskazują, iż może on występować przede wszystkim u osób posiadających genetyczne predyspozycje, związane przede wszystkim ze zmianami w genach naprawy DNA. Wyróżnić należy cztery podstawowe systemy naprawy DNA: naprawa przez wycinanie zasad (BER, ang. baseexcision repair), naprawa przez wycinanie nukleotydu (NER, ang. nucleotide-excision repair), naprawa niesparowanych zasad (MMR, ang. mismatch repair) i naprawa uszkodzeń obu nici (DSB, ang. Double-strand breaks). Dotychczas w toku prowadzonych badań ustalono niepodważalny związek pomiędzy występowaniem mutacji w obrębie genów systemu MMR a dziedzicznym rakiem jelita grubego niezwiązanym z polipowatością (Zespół Lyncha). Proces ten jest związany z mutacjami w ludzkich homologach białek Mut (MSH2 I MLH1), które powodować mogą niestabilność mikrosatelitarną obserwowaną w większości ludzkich komórek rakowych. Produkt genu EXO1 egzonukleaza 1 jest enzymem ściśle oddziałującym z białkami MSH2 I MLH1, przez co może mieć wpływ na efektywność systemu MMR i pośred- Colorectal cancer (CRC) is currently the second most common cancer among women and the third among men. Incidence is increasing from year to year, and in spite of intensive research in this area, etiology of the disease remains undetermined. Low responsiveness to therapy and high malignancy are the cause of a very low coefficient of 5-year survival (in Poland about 30%) and make the CRC fourth cause of death from cancer. It is estimated that 15-30% of cases is familial, with about 3% is caused by mutations of strongly predisposed genes. However, despite the fact that approximately 70% of sporadic cancer is caused by environmental factors, studies indicate that it may occur primarily in people with a genetic predisposition, associated mainly with changes in the DNA repair genes. Four basic systems of DNA repair should be distinguished: base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), mismatch repair (MMR) and repair of Double-strand breaks (DSB). So far, in the course of the study, irrefutable relationship between the presence of mutations in the MMR system genes and hereditary colorectal cancer unrelated polyposis (Lynch syndrome) has been found. This process is associated with mutations in human homologues Mut proteins. The gene product EXO1 exonuclease 1 is an enzyme interacting closely MSH2 and MLH1 protein, which can affect the efficiency of the system and the MMR indirectly modulate the risk of CRC. EXO1 gene polymorphisms are currently under investigation in terms of their potential impact on the incidence of colorectal cancer. The aim of this study was to determine the effect of gene polymorphism Lys589Glu of EXO1 gene on the risk of colorectal cancer in the Polish population.

686 B. Zielińska-Kaźmierska i wsp. nio modulować ryzyko występowania RJG. Polimorfizmy genu EXO1 są obecnie przedmiotem badań w zakresie ich potencjalnego wpływu na zachorowalność na raka jelita grubego. Celem tej pracy było określenie wpływu polimorfizmu Lys589Glu genu EXO1 na ryzyko występowania raka jelita grubego w populacji polskiej. Materiał i metodyka Materiał doświadczalny DNA do badań wyizolowano z limfocytów krwi obwodowej z próbek pobranych od 150 niespokrewnionych ze sobą pacjentów. U wszystkich pacjentów potwierdzono histopatologicznie nowotwory jelita grubego. Grupa badana składała się z 89 mężczyzn i 61 kobiet (średnia wieku 65 lat ±7). Do oceny stopnia zaawansowania nowotworu zastosowano skalę TNM. Szczegółowy podział pacjentów obrazuje tab. 1. Grupę kontrolną stanowiło 150 osób odpowiadających wiekowo grupie badanej, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej. Metody Izolację DNA przeprowadzono komercyjnym zestawem QIAamp DNA Blood Mini Kit for isolation of high-molecular-weight DNA (Qiagen). Rozkład wariantów polimorficznych Lys589Glu EXO1 zbadano przy użyciu metody TaqMan. Dla badanego polimorfizmu refsnp to 1047840. Analiza statystyczna Otrzymana liczba każdego z genotypów porównywana była z wartością oczekiwaną na podstawie prawa Hardy ego-weinberga. Istot- Material and methods Experimental material Test DNA was isolated from peripheral blood samples collected from 150 unrelated patients. All patients had histologically confirmed colorectal cancer. The study group consisted of 89 men and 61 women (mean age 65 ± 7). To assess the stage of cancer TNM scale was used. A detailed information about the patients illustrates tab. 1. The control group consisted of 150 persons age corresponding to the study group who did not have cancer. Methods DNA isolation was performed with commercial kit QIAamp DNA Blood Mini Kit for isolation of high-molecular-weight DNA (Qiagen). The distribution of polymorphic variants EXO1 Lys589Glu was examined using Taq- Man method. Test polymorphism refsnp is 1047840. Statistical analysis The resulting number of each genotype was compared with the expected value based on Hardy-Weinberg equilibrium. The significance of differences between the frequencies of alleles and genotypes between groups was assessed using χ2 test. The risk of an event was assessed using multivariate regression analysis (odds ratio, OR) with corresponding confidence interval 95% (CI 95%). Results Table 2 presents the analysis of the distribution of polymorphic variants of the gene Pacjenci / Patients Tabela 1. Charakterystyka grup pacjentów z rakiem jelita grubego Table 1. Characteristics of the groups of patients with colorectal cancer Płeć / Sex Stan zaawansowania nowotworu wg klasyfikacji TNM / Stage of tumor according to TNM classification Stan zaawansowania nowotworu wg klasyfikacji AJCC / Stage of tumor according to AJCC classification T N M I II III Liczebność / n K / F M 1 2 3 4 0 1 2 0 1 (T1-2N0) T3-4N0) (T1-4N1-2) 150 61 89 21 26 99 4 90 39 21 150 0 47 43 60

Obrażenia tkanek miękkich twarzy w wyniku pogryzienia przez psa 687 ność różnic między częstościami występowania alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniono za pomocą testu χ2. Ryzyko wystąpienia zdarzenia oceniono za pomocą wieloczynnikowej analizy regresji (iloraz szans, OR odds ratio) przy odpowiednim przedziale ufności (CI 95 % confidence interval 95%). Wyniki W tab. 2 zaprezentowano analizę rozkładu wariantów polimorficznych Lys589Glu genu EXO1 oraz ich korelację z modulacją ryzyka występowania raka jelita grubego. Badania wskazują, że genotyp Lys/Glu może wpływać na zwiększone ryzyko występowania RJG (OR 1,811; Cl 95% 1,031-3,181; p=0,038). Dokonano również podziału pacjentów według stanu zaawansowania nowotworu zgodnie ze skalą American Joint Committee on Cancer. Wyniki przedstawiono w tab. 3. Analiza wyników wskazuje, iż żaden z genotypów ani alleli polimorfizmu badanego genu nie ma wpływu na progresję choroby nowotworowej. Omówienie Od dawna podejrzewany związek pomiędzy polimorfizmami genów naprawy DNA a procesem nowotworzenia z każdym rokiem, dzięki prowadzonym badaniom, staje się coraz bardziej udokumentowany. Nadal jednak do ustalenia niepodważalnych zależności droga pozostaje daleka, pomimo wielu badań i publikacji w tym zakresie wyniki często są nieroz- Lys589Glu EXO1 and their correlation with the modulation of the risk of colorectal cancer. Research indicates that the genotype Lys/Glu may affect the increased risk of CRC (OR 1.811, 95% Cl 1.031-3.181, p=0.038). Also the distribution of patients according to the severity of the tumor according to the scale of the American Joint Committee on Cancer has been made. The results are shown in Table 3. Analysis of the results shows that none of the genotypes or alleles of tested polymorphism affect the progression of cancer. Discussion A long suspected link between polymorphisms of DNA repair genes and the process of carcinogenesis becomes more and more Tabela 2. Związek polimorfizmu Arg399Gln genu XRCC1 z występowaniem raka jelita grubego Table 2. Correlation of Arg399Gln polymorphism of XRCC1 gene and the occurrence of colorectal cancer Genotyp / Genotype Pacjenci / Patients n=150 Kontrole / Controls n=150 OR (95% CI) Lys/Lys 33 39 1 (ref) - Lys/Glu 95 62 1,811 0,038 (1,031-3,181) Glu/Glu 22 49 0,531 0,068 (0,268-1,052) Lys 140 161 1 (ref) - Glu 160 139 1,324 (0,960-1,825) 0,086 p Tabela 3. Związek polimorfizmu Arg399Gln genu XRCC1 z występowaniem raka jelita grubego. Wyniki skorelowano ze stanem zaawansowania nowotworu wg klasyfikacji American Joint Committee on Cancer Table 3. Correlation of Arg399Gln polymorphism of XRCC1 gene and the occurrence of colorectal cancer. The results were correlated with the state of the tumor according to the classification of American Joint Committee on Cancer Pacjenci / Patients n=150 II vs I III vs II III vs I Genotyp/Allel / I II III Genotype/Allel OR (95% CI) p OR (95% CI) p OR (95% CI) p (T1-2N0) (T3-4N0) (T1-4N1-2) Lys/Lys 13 8 12 1 (ref) - 1 (ref) - 1 (ref) - Lys/Glu 24 34 37 2,302 0,106 0,726 0,532 1,670 0,281 (0,827-6,410) (0,265-1,989) (0,654-4,266) Glu/Glu 10 1 11 - - - - 1,192 0,764 (0,373-3,807) Lys 50 50 61 1 (ref) - 1 (ref) - 1 (ref) - Glu 44 36 59 0,818 (0,454-1,476) 0,502 1,343 (0,769-2,348) 0,299 1,099 (0,640-1,877) 0,729

688 B. Zielińska-Kaźmierska i wsp. strzygające, a czasem nawet sprzeczne. Przyczyn takiego stanu rzeczy szukać należy w złożoności procesu karcenogenezy i bardzo szerokim spektrum czynników zarówno endo-, jak i egzogennych, mogących mieć wpływ na występowanie nowotworów. Nie bez znaczenia są również różnice pomiędzy badanymi populacjami oraz oddziaływania międzygenowe mające wpływ na efektywność systemów naprawy DNA oraz proces nowotworzenia. Według obecnego stanu wiedzy udało się ustalić przede wszystkim niepodważalny związek pomiędzy dziedzicznym rakiem jelita grubego niezwiązanym z polipowatością (hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) a defektami systemu naprawy błędnie sparowanych zasad (DNA mismatch repair, MMR) (1, 2, 3), które w wyniku mutacji w białkach Mut zaburzają stabilność genomu, co prowadzi do niestabilności mikrosatelitarnej obserwowanej w większości ludzkich nowotworów. Obecnie badania koncentrują się na wpływie czynników oddziaływujących z białkami Mut na ich mutacje. Celem tej pracy było zbadanie wpływu polimorfizmu Lys589Glu genu EXO1 na modulację ryzyka wystąpienia raka jelita grubego. Egzonukleaza 1, produkt genu EXO1, jest enzymem biorącym udział w naprawie uszkodzeń DNA ściśle oddziaływującym z białkami Mut MSH2 (4, 5, 6) i MLH1 (7, 8). Dlatego należy podejrzewać, że w wyniku wystąpienia polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (Single-nucleotide polymorphisms, SNPs), które mogą wpływać negatywnie na aktywność enzymatyczną białka powodując obniżenie efektywności naprawy DNA, należy spodziewać się modulacji ryzyka wystąpienia RJG. Przeprowadzone badania wskazują, że genotyp Lys/ Glu badanego genu może zwiększyć ryzyko wystąpienia raka jelita grubego (OR 1,811; CI 95%: 1,031-3,181; p=0,038). Uzyskane wyniki są zgodne z częścią dostępnej literatury (9, 10), która potwierdza istnienie zależności, ale jednocześnie stoją w opozycji do innych doniesień (11) które negują korelację pomiędzy polimorfizmami genu EXO1 a zapadalnością na RJG. Przyczyn niejednoznaczności należy szukać w różnicach w badanych populacjach (np. różne rasy) oraz jak wspomniano we wstępie w oddziaływaniach z innymi grupami genów które mogą modulować ryzyko wystąpienia raka. Jest to zgodne z najnowszymi badaniami sugerującymi, że nawet w przypadku braku documented every year, through research. Yet still, despite many studies and publications in this field, road to determine irrefutable linkage remains long, since results are often inconclusive and sometimes contradictory. The reasons for this state should be sought in the complexity of the process of carcinogenesis and a wide range of factors, both endoand exogenous, which may affect the incidence of cancer. There are also important differences between the study populations and the impact of gene-gene interactions affecting the efficiency of DNA repair systems and the process of carcinogenesis. According to current knowledge, it has been determined primarily irrefutable link between the hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) and defects of the DNA mismatch repair (MMR) (1, 2, 3), which by mutations in Mut proteins interfere genome stability, leading to microsatellite instability observed in most human cancers. Currently, research is focused on the impact of factors affecting mutations of Mut protein. The aim of this study was to investigate the effect of gene polymorphism Lys589Glu Exo1 on the modulation of risk of colorectal cancer. Exonuclease 1, EXO1 gene product, is the enzyme involved in the repair of DNA damage the interacting closely with Mut proteins MSH2 (4, 5, 6), and MLH1 (7, 8). Therefore, one should suspect that as a result of single nucleotide polymorphisms (SNPs) that may adversely affect the enzymatic activity of the protein causing a decrease in the efficiency of DNA repair, leading to modulation of the risk of CRC. The study indicates that the genotype Lys/Glu gene of interest may increase the risk of colorectal cancer (OR 1.811, 95% CI: 1.031-3.181, p=0.038). The results are consistent with part of the available literature (9, 10), which confirms the existence of dependencies, but also stand in contrast to other reports (11) that deny the correlation between gene polymorphisms of Exo1 and the incidence of CRC. The reasons for the ambiguity should be found in differences in study populations (eg, different races), and as mentioned in the introduction in interactions with other groups of genes that may modulate the risk of cancer. This is consistent with recent studies suggesting that even in the absence of a clear link between the given polymorphism and the process of car-

Obrażenia tkanek miękkich twarzy w wyniku pogryzienia przez psa 689 wyraźnego związku pomiędzy danymi polimorfizmami a procesem nowotworzenia, związek taki może wystąpić w przypadku analizy oddziaływań międzygenowych mających znaczący wpływ na modulację ryzyka (12, 13). Jednocześnie dokonano analizy związku pomiędzy badanym polimorfizmem a stopniem zaawansowania RJG według wg klasyfikacji American Joint Committee on Cancer. Nie znaleziono żadnego wpływu badanego polimorfizmu na progresję choroby nowotworowej, co wyraźnie wskazuje, iż gen ten bierze udział jedynie w procesie transformacji nowotworowej, natomiast nie ma późniejszego wpływu na jej rozwój. Dlatego uważamy, że badany polimorfizm genu EXO1 jest związany z podwyższonym ryzykiem wystąpienia raka jelita grubego w populacji polskiej. Konieczne są jednak dalsze badania w celu ustalenia oddziaływań międzygenowych i ich wpływu na proces nowotworzenia. Pozwoli to w przyszłości na prostą analizę i typowanie pacjentów z predyspozycją do wystąpienia RJG i włączanie ich do programów profilaktycznych. cinogenesis, such a correlation can occur in the case of the analysis of gene-gene interactions having a significant impact on the modulation of risk (12, 13). At the same time the analysis of the relationship between the studied polymorphisms and progression of CRC according to the classification by the American Joint Committee on Cancer showed that there are no effect of the tested polymorphism on the progression of cancer, which clearly indicates that this gene is involved only in the process of neoplastic transformation, but there is no subsequent impact on its development. Therefore, we believe that the tested EXO1 gene polymorphism is associated with an increased risk of colorectal cancer in the Polish population, however, further studies are needed to determine the effects of intergenic interactions and their impact on the process of carcinogenesis. This will allow in the future for simple analysis and typing of patients with a predisposition to the occurrence of CRC and including them into prevention programs. Piśmiennictwo / references 1. Iyer R, Pluciennik A, Burdett V, Modrich P: DNA mismatch repair: functions and mechanisms. Chem Rev 2006; 106 (2): 302-23. 2. Hsieh P, Yamane K: DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev 2008; 129(7-8): 391 407 3. Friedberg EC, Walker GC, Siede W et al.: DNA repair and Mutagenesis, 2nd edition, ASM press. 4. Tran HT, Gordenin DA, Resnick MA: The 3 ->5 Exonucleases of DNA Polymerases δ and ɛ and the 5 ->3 Exonuclease Exo1 Have Major Roles in Postreplication Mutation Avoidance in Saccharomyces cerevisiae Mol Cell Biol March 1999; vol. 19: no. 3. 5. Tishkoff DX, Boerger AL, Bertrand P: Identification and characterization of Saccharomyces cerevisiae EXO1, a gene encoding an exonuclease that interacts with MSH2 Proc Natl Acad Sci USA 1997 Jul 8; 94. 6. Eccleston J, Yan C, Yuan K: Mismatch repair proteins MSH2, MLH1, and EXO1 are important for class-switch recombination events occurring in B cells that lack nonhomologous end joining. J Immunol 2011 Feb 15; 186. 7. Schmutte, C; Sadoff MM; Shim KS: The interaction of DNA mismatch repair proteins with human exonuclease I. J Biol Chem (United States) 276 (35): 33011 18. 8. Neelam S. Amin, My-Nga Nguyen: Scott Oh exo1- Dependent Mutator Mutations: Model System for Studying Functional Interactions in Mismatch Repair Mol. Cell Biol August 2001; vol. 21: no. 15. 9. Zheng J, Chunxiang L, Ye X: A meta-analysis on XRCC1 and XRCC3 polymorphisms and colorectal cancer risk. Int J Colorectal Dis 2010; 25:169-80. 10. Turnbull C, Seal S, Renwick A: Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Hum Mol Genet 2012 Feb 15; 21(4): 958-62. 11. Shantie Jagmohan-Changur, Taija Poikonen, Susa Vilkki: EXO1 Variants Occur Commonly in Normal Population. Evidence against a Role in Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Cancer Res January 1, 2003 63; 154. 12. Goode EL, Ulrich CM, Potter JD: Polymorphisms in DNA Repair Genes and Associations with Cancer Risk Cancer. Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11: 1513. 13. Dunning AM, Healey CS, Pharoah PDP: A Systematic Review Of Genetic Polymorphisms and Breast Cancer Risk Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999; 8: 843. Pracę nadesłano: 14.07.2014 r. Adres autora: 90-647 Łódź, Pl. Hallera 1 e-mail: jacek.kabzinski@umed.lodz.pl