239 Hacquetia-epipactis- -rozmna anie-in-vitro-i-zdolnoœæ-kie³kowania-nasion-ex-situ 239 Hacquetia epipactis (Apiaceae) rozmna anie in vitro i zdolnoœæ kie³kowania nasion w warunkach ex situ Hacquetia epipactis (Apiaceae): in vitro propagation and germination capacity of seeds ex situ BARBARA NOWAK, EWA SITEK, ZBIGNIEW GAJEWSKI B. Nowak, E. Sitek, Z. Gajewski, Katedra Botaniki i Fizjologii Roœlin, Wydzia³ Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy, al. 29 Listopada 5, 31-425 Kraków; e-mails: bnowak@ogr.ar.krakow.pl, ewasitek@poczta.fm, zbychor@poczta.fm ABSTRACT: Demographic studies often point out the poor state of insular populations of Hacquetia epipactis. The species is under strict protection. This is due to both natural and anthropogenic factors, including the collection of intact plants for gardens. As a form of integrated protection, an attempt at ex situ propagation was undertaken using seeds and tissue culture. KEY WORDS: micropropagation, tissue culture, transplants Wstêp Cieszynianka wiosenna (Hacquetia epipactis), gatunek objêty œcis³¹ ochron¹ gatunkow¹ i ujêty w Polskiej Czerwonej Ksiêdze Roœlin w kategorii [V], ma ograniczony zasiêg wystêpowania w Polsce. Badania demograficzne czêsto stwierdzaj¹ z³y stan, zw³aszcza niewielkich, wyspowych populacji tego gatunku spowodowany zarówno czynnikami naturalnymi, jak i antropogenicznymi. Nale y tu wymieniæ wzrost zacienienia, zag³uszanie przez rozrastaj¹ce siê je yny, zgryzanie przez dzikie zwierzêta, zrywanie kwiatostanów oraz pozyskiwanie ca³ych roœlin do prywatnych ogrodów (Duda i in. 2001; Malara i in. 2004). W zwi¹zku z trudnoœciami w zdobyciu sadzonek (Radziul 2004) czêsty jest proceder pozyskiwania roœlin ze stanowisk naturalnych. W naturze Hacquetia epipactis wykazuje cechy byliny o dwóch sposobach reprodukcji, tzn. mo e zachodziæ zarówno rozmna anie wegetatywne, jak NOWAK B., SITEK E., GAJEWSKI Z. 2011. Hacquetia epipactis (Apiaceae) rozmna anie in vitro i zdolnoœæ kie³kowania nasion w warunkach ex situ. W: K CKI Z., STEFAÑSKA-KRZACZEK E. (red.), Synantropizacja w dobie zmian ró norodnoœci biologicznej. Acta Botanica Silesiaca 6: 239 248.
240 Barbara-Nowak-et-al. 240 i generatywne. Czêsto obserwowane jest obfite kwitnienie i wi¹zanie owoców, znacznie rzadziej jednak notowane s¹ siewki, a nawet jeœli wspomina siê o ich wystêpowaniu, to z uwagi na wysok¹ œmiertelnoœæ, podkreœla siê marginalne znaczenie rozmna ania generatywnego w rozwoju kolejnych generacji. Niewiele jest informacji dotycz¹cych warunków kie³kowania nasion. Na stanowiskach naturalnych siewki pojawiaj¹ siê po up³ywie roku od wysiania, w maju, co sugeruje koniecznoœæ ich stratyfikacji. Poœrednio oszacowano, e w warunkach in situ kie³kuje oko³o 3% zawi¹zanych nasion (Sitek, Nowak 2009). W jedynej znanej próbie oceny zdolnoœci kie³kowania ex situ, nasiona zebrane w niepe³nej dojrza³oœci i wysiewane w kontrolowanych warunkach skie³kowa³y na poziomie 30 40%, a prze ywalnoœæ pikowanych siewek wynosi³a 80% (Duda i in. 2001). W sytuacji, kiedy rozmna any materia³ mateczny jest dostêpny w ograniczonej liczbie roœlin, jak w przypadku licznych gatunków roœlin objêtych ochron¹ i dodatkowo o ma³ym potencjale reprodukcyjnym celowe jest stosowanie mikropropagacji jako rozmna ania klonalnego. Opracowanie alternatywnej metody rozmna ania zarówno z zachowaniem istniej¹cej puli genowej, jak i ze stymulowan¹ zmiennoœci¹ pozwoli na dysponowanie metod¹ rozmna ania w aspekcie ochrony gatunku, ale te w celach u ytkowych. Cieszynianka nale y do rodziny selerowatych skupiaj¹cej szereg gatunków bogatych w olejki eteryczne, wiele z nich jest roœlinami przyprawowymi, inne wzbudzaj¹ zainteresowanie jako potencjalne roœliny lecznicze i przemys³owe z uwagi na zawartoœæ rozmaitych metabolitów wtórnych, dlatego stanowi¹ one czêsty obiekt badañ biotechnologicznych a postêp dokonany w ostatnich latach jest ogromny (Ekiert 2000). Pomimo tak znacznego zainteresowania rodzin¹ brak jest dostêpnych danych odnoœnie rozmna ania cieszynianki in vitro, a z zaliczanych do tej samej podrodziny Saniculoideae rodzajów rozmna anie w kulturach tkankowych opisano jedynie dla rodzaju Eryngium (Ignacimuthu i in. 1999; Arockiasmay i in. 2002; Mohamed-Yasseen 2002; Martin 2004; Thiem, Wiatrowska 2007). Celem badañ by³a ocena zdolnoœci do kie³kowania nasion cieszynianki jako elementu wyjœciowego do stworzenia kolekcji roœlin ywych oraz opracowanie biotechnologicznych metod propagacji cieszynianki zarówno z zachowaniem istniej¹cej w naturze puli genów jak i z indukowaniem zmiennoœci somaklonalnej. 1. Materia³ i metody 1.1. Rozmna anie in vitro Kultury in vitro inicjowane by³y z nasion, wierzcho³kowych p¹ków wegetatywnych oraz fragmentów liœci i ogonków liœciowych.
241 Hacquetia-epipactis- -rozmna anie-in-vitro-i-zdolnoœæ-kie³kowania-nasion-ex-situ 241 Dwunasienne roz³upnie po stratyfikacji przez 3 miesi¹ce w wilgotnym piasku + 4 0 C, by³y sterylizowane przez 30 s. w 70% etanolu, potem przez 10 lub 15 min. w 0,1% HgCl 2, a nastêpnie p³ukane trzykrotnie w sterylnej wodzie destylowanej. Po³owa nasion w obu wariantach sterylizacji przed wysiewem by³a zanurzana w 0,7% chloraminie. Ka d¹ kombinacjê stanowi³y 3 lub 4 kolby zawieraj¹ce po 5 nasion wysianych na po ywkê MS (Murashige, Skoog 1962) zestalon¹ agarem 0,8%, ph 5,8. Nasiona na po ywkach umieszczono w fitotronie w warunkach 16/8 h fotoperiodu, w temperaturze 24 ± 2 0 C. P¹ki wierzcho³kowe pobierane w fazie spoczynku od paÿdziernika do grudnia z roœlin znajduj¹cych siê w prywatnej kolekcji by³y sterylizowane przez 30 s. w 70% etanolu, a nastêpnie przez 5 lub 10 min w 0,1% HgCl 2 i trzy razy p³ukane w sterylnej wodzie destylowanej. Po³owa p¹ków dodatkowo przed wyszczepieniem by³a zanurzana w 0,7% chloraminie. P¹ki po sterylizacji wyk³adane by³y na po ywkê stabilizuj¹c¹ MS z dodatkiem 0,5 mg/l BAP i 0,1 mg/l IBA oraz 100 mg/l floroglucynolu. Po oko³o 6 tygodniach p¹ki przeniesiono na po ywkê o tym samym sk³adzie, na której pod koniec pasa u p¹ki rozpoczê³y proliferacjê. Efektem proliferacji by³y skupienia p¹ków wierzcho³kowych otoczonych liœæmi, traktowanych dalej jako eksplantaty, bêd¹ce odpowiednikiem ramet. Po rozpoczêciu proliferacji, w fazie namna ania, zosta³y przetestowane trzy po ywki zawieraj¹ce MS z dodatkiem 0,1 mg/l IBA oraz 100 mg/l floroglucynolu ró ni¹ce siê zawartoœci¹ cytokiny BAP: 0,5; 0,75 oraz 1,0 mg/l. Na zestalon¹ po ywkê w 100 ml kolbkach wyszczepiano po piêæ 2-liœciowych eksplantatów (=ramet) o wysokoœci ok. 2 cm. Po 7 8 tygodniach eksplantaty by³y przenoszone na œwie ¹ po ywkê. Doœwiadczenie oceniaj¹ce namna anie wykonano trzykrotnie, zak³adaj¹c ka dorazowo po 4 kolbki w kombinacji (³¹cznie 12 kolbek w kombinacji). Pod koniec ka dego pasa u oceniano wspó³czynnik namno enia (liczbê wytworzonych p¹ków), liczbê liœci dla poszczególnych p¹ków oraz ich wysokoœæ. Za wysokoœæ eksplantatu przyjêto d³ugoœæ najwiêkszego liœcia wraz z ogonkiem. Wyniki porównano analiz¹ wariancji z wykorzystaniem testu t-studenta dla p=0,05. Liœcie sterylizowane by³y przez 30 s. w 70% etanolu, a nastêpnie przez 6 min w 0,1% HgCl 2. Fragmenty blaszki liœciowej (ok. 0,5 cm 0,5 cm z fragmentem g³ównego nerwu) oraz ogonków liœciowych (ok. 1 cm) wyszczepiane by³y na po ywkê: liœcie odosiow¹ powierzchni¹ w kontakcie z po ywk¹, ogonki liœciowe poziomo lub pionowo na po ywce. Dla ka dej kombinacji po ywka/eksplantat wszczepiano po 5 eksplantatów do 8 kolbek, z których po³owê umieszczano w warunkach 16/8 h fotoperiodu, a drug¹ po³owê w ciemnoœci w fitotronie w temperaturze 24 ± 2 0 C. ¹cznie przebadano 39 po ywek ró ni¹cych siê sk³adem regulatorów wzrostu i antyoksydantów. Testowanymi regulatorami wzrostu by³y: IBA, NAA, 2,4 D, Dicamba, BAP, picloram, zeatyna, kinetyka oraz TDZ w ró nych kombinacjach i stê eniach,
242 Barbara-Nowak-et-al. 242 a jako antyoksydanty stosowano kwas cytrynowy, k. askorbinowy, floroglucynol lub wêgiel aktywowany. 1.2. Kie³kowanie nasion ex situ Nasiona Hacquetia epipactis bezpoœrednio po dojrzeniu (pocz¹tek czerwca) wysiewano do wystawionych na zewn¹trz skrzynek z brunatn¹ gleb¹ leœn¹ w dwóch kombinacjach: przykryte ziemi¹ (kie³kowanie w ciemnoœci) i na powierzchni (kie³kowanie na œwietle). Dla obu kombinacji wysiano nasiona w postaci dwunasiennych roz³upni w czterech seriach po 100 nasion. Nasiona poddano naturalnej stratyfikacji. 2. Wyniki 2.1. Rozmna anie in vitro Nasiona po sterylizacji œciemnia³y, ale po kilku dniach na po ywce spêcznia³y a pierwsze siewki pojawi³y siê po 4 tygodniach. Zastosowane metody sterylizacji nasion charakteryzowa³y siê nisk¹ skutecznoœci¹; odsetek zaka eñ by³ wysoki (18 44% w poszczególnych kombinacjach), tylko pojedyncze nasiona kie³kowa³y (0 10%), a siewki bardzo szybko zamiera³y. Skutecznoœæ stosowanych metod sterylizacji p¹ków wierzcho³kowych waha³a siê w granicach 75 100%, i wszystkie czyste p¹ki w ci¹gu dwóch miesiêcy rozpoczyna³y wzrost a potem namna anie. Wskutek proliferacji wyszczepianych p¹ków inicjuj¹cych kulturê, a potem wyszczepianych eksplantatów powstawa³y skupienia p¹ków otoczonych liœæmi, nie wytwarzaj¹ce wyraÿnego pêdu (k³¹cza) na testowanych po ywkach. Najwiêkszy wspó³czynnik rozmno enia cieszynianki 2,16 by³ odnotowany dla eksplantatów wyszczepianych na po ywkê z najwiêksz¹ dawk¹ cytokininy (tab. 1), jednak pokrój roœlin (wysokoœæ, liczba liœci) na wszystkich po ywkach by³ podobny (ryc. 1). Nowe p¹ki rozwija³y siê zarówno u nasady wyszczepionych liœci, jak i na krawêdzi ciêcia, po spodniej stronie eksplantatu. Na wszystkich po ywkach dochodzi³o do spontanicznego ukorzeniania siê eksplantatów z jednakow¹ efektywnoœci¹. Ukorzenione roœliny zosta³y wysadzone do sterylnego pod³o a (perlit i substrat torfowy, w stosunku 1:1), gdzie przesz³y aklimatyzacjê. i zosta³y wysadzone w kolekcji UR. Skutecznoœæ odka ania eksplantatów liœciowych by³a bardzo zró nicowana w zale noœci od terminu pobierania materia³u matecznego co mog³o byæ zwi¹zane z warunkami pogodowymi (temperatura, wilgotnoœæ). Eksplantaty reagowa³y silnym br¹zowieniem na krawêdziach ciêcia i czêsto zamiera³y, dlatego konieczne
243 Hacquetia-epipactis- -rozmna anie-in-vitro-i-zdolnoœæ-kie³kowania-nasion-ex-situ 243 Tabela 1. Efektywnoœæ procesu rozmna ania i ukorzeniania eksplantatów Hacquetia epipactis na po ywkach ze zró nicowan¹ zawartoœci¹ BAP Table 1. The effectiveness of the proliferation and rooting of Hacquetia epipactis eksplants on media with diversified content of BAP Po ywka/ Medium [mg/l] MS + 0,1 IBA + 0,5 BA MS + 0,1 IBA + 0,75 BA MS + 0,1 IBA + 1,0 BA Wspó³czynnik rozmno enia/ Multiplication coefficient Liczba liœci eksplantatów/ Leaf number per explantat Wysokoœæ eksplantatów/ Heighth of explants % ukorzeniania/ % of rooting Liczba korzeni eksplantatów/ Root number per explant 1,62 a* 3,18 a 1,97 a 10,8 a 1,7 a 1,74 a 3,03 a 1,72 a 12,4 a 1,2 a 2,16 b 2,91 a 1,73 a 15,0 a 2,0 a Objaœnienia: *Wartoœci liczbowe w kolumnach oznaczone t¹ sam¹ liter¹ nie ró ni¹ siê istotnie dla p=0,05, zgodnie z testem t-studenta. Explanations: *Values within columns followed by the same letter do no differ significantly for p=0.05, according to t-student s test. Ryc. 1. Eksplantaty cieszynianki wiosennej po 3 tygodniach kultury na po ywce MS z 0,1 mg/l IBA i 0,5 mg/l BA Fig. 1. Hacquetia epipactis explants after 3 weeks of cultivation on medium MS with 0.1 mg/l IBA and 0.5 mg/l BA
244 Barbara-Nowak-et-al. 244 by³o wprowadzenie do po ywek substancji hamuj¹cych utlenianie. Z licznych po ywek, na których kultywowano fragmenty liœci i ogonków liœciowych, jedynie na po ywce mineralnej MS z dodatkiem, 10 mg/l kwasu askorbinowego, 10 mg/l kwasu cytrynowego, 100 mg/l floroglucynolu, 10,0 mg/l TDZ oraz 2,5 mg/l NAA zestalonej agarem 0,8%, na krawêdziach ogonków liœciowych w ciemnoœci wykszta³ci³ siê wolno rosn¹cy, zwarty kalus. Kalus pasa owany co 3 miesi¹ce na œwie ¹ po ywkê (bez dzielenia) kontynuowa³ wzrost w jednakowym tempie zarówno w ciemnoœci jak i po przeniesieniu na œwiat³o (ryc. 2). Obserwacje mikroskopowe pozwoli³y na odnotowanie zjawiska ksylogenezy zarówno w kalusie rosn¹cym w ciemnoœci, jak i na œwietle. Ryc. 2. Kalus powsta³y na po ywce MS zawieraj¹cej 100 mg/l floroglucynolu, 10,0 mg/l TDZ i 2,5 mg/l NAA po 3 miesi¹cach kultury na œwietle Fig. 2. Callus produced on medium MS supplemented with 100 mg/l phloroglucinol, 10.0 mg/l TDZ, and 2.5 mg/l NAA 2.2. Kie³kowanie nasion ex situ Nasiona wysiane do pod³o a stopniowo br¹zowia³y do koñca czerwca. Kie³kowa³y epigeicznie dopiero w kolejnym roku. Pierwsze siewki w fazie dwóch
245 Hacquetia-epipactis- -rozmna anie-in-vitro-i-zdolnoœæ-kie³kowania-nasion-ex-situ 245 liœcieni obserwowano w po³owie lutego. Zdolnoœæ kie³kowania nasion H. epipactis w warunkach ex situ pod koniec marca wynios³a œrednio 46,75%. Po tym terminie tylko sporadycznie obserwowano kolejne wschody (ryc. 3), a jednoczeœnie czêœæ siewek wiêd³a i zamiera³a prawdopodobnie na skutek erowania larw ziemiórek. Nie stwierdzono ró nic w zdolnoœci i tempie kie³kowania pomiêdzy nasionami kie³kuj¹cymi w ciemnoœci i na œwietle. Wytwarzanie pierwszych liœci m³odocianych obserwowano w drugiej po³owie kwietnia wykszta³ci³y siê u 20,5% siewek. W maju ze wzglêdu na przegêszczenie czêœæ siewek przepikowano, jednak po oko³o dwóch tygodniach wszystkie przepikowane siewki zamar³y. Ryc. 3. Dynamika liczebnoœci siewek Hacquetia epipactis wysiewanych do pod³o a po naturalnej stratyfikacji Fig. 3. Dynamics of number of Hacquetia epipactis seedlings after natural stratification in the soil 3. Dyskusja Najmniej inwazyjnym dla roœlin donorowych sposobem inicjacji kultur tkankowych w celu mikorpropagacji jest wysiew nasion na po ywki. W prezentowanych badaniach ta metoda okaza³a siê nieskuteczna. Nasiona kie³kowa³y s³abo i by³o du o zaka eñ. W przysz³oœci nale a³oby zaproponowaæ stratyfikacjê nasion na po ywce w warunkach ja³owych, co jednoczeœnie zapewni optymaln¹ wilgotnoœæ oraz ograniczy rozwój mikroorganizmów.
246 Barbara-Nowak-et-al. 246 Wysoce efektywne okaza³o siê inicjowanie kultury z p¹ków wierzcho³kowych. Roœliny uzyskane w drodze mikropropagacji pobudzonych do namna ania na po ywkach p¹ków wierzcho³kowych i bocznych reprezentuj¹ genotyp roœlin matecznych. Izolowanie jednak takich p¹ków z roœlin matecznych Hacquetia epipactis nie jest mo liwe bez znacznego uszkodzenia k³¹cza roœlin macierzystych, co nie jest po ¹dane u wolno rosn¹cych gatunków. Prowadzony monitoring k³¹czy, z których pozyskano p¹ki wierzcho³kowe do za³o enia kultur pozwoli³ na zaobserwowanie rozwoju p¹ków œpi¹cych, z których roœliny te we wszystkich przypadkach odtworzy³y nowe wierzcho³ki. Nie odnotowano zatem niekorzystnego wp³ywu pobierania p¹ków wierzcho³kowych na dalszy rozwój roœliny macierzystej cieszynianki. U namna anych eksplantatów cieszynianki nie zaobserwowano wykszta³cania pêdów: rozwija³y siê skupienia p¹ków otoczonych liœæmi, zarówno p¹ków k¹towych pojawiaj¹cych siê u podstawy liœci wyszczepianego eksplantatu, jak i p¹ków przybyszowych formuj¹cych siê u jego podstawy na krawêdzi ciêcia, podczas gdy w kulturach rodzaju Eryngium eksplantaty namna a³y siê wytwarzaj¹c pêdy. Jednak zarówno E. foetidum (Ignacimuthu i in. 1999; Arockiasmay i in. 2002; Mohamed-Yasseen 2002; Martin 2004) jak i rodzimy miko³ajek polny E. campestre (Thiem, Wiatrowska 2007) rosn¹c w naturalnych warunkach taki pêd wykszta³caj¹, podczas gdy cieszyniankê charakteryzuje inny typ wzrostu: posiada wolno rosn¹ce k³¹cze bez pêdów nadziemnych. Stopieñ rozmno enia cieszynianki na po ywkach nie by³ du y, podobnie s³abo krzewi³y siê wierzcho³ki pêdów E. campestre. Skuteczn¹ metod¹ rozmno enia miko³ajka by³a organogeneza poœrednia, gdy na organogennym kalusie wykszta³ca³y siê liczne pêdy (Thiem, Wiatrowska 2007). Jednak dla cieszynianki uda³o siê uzyskaæ tylko wolno rosn¹cy kalus z pocz¹tkami ró nicowania. W przysz³oœci mo e on stanowiæ stadium wyjœciowe do uzyskania roœlin w organogenezie poœredniej z potencjalnie wzbudzon¹ zmiennoœci¹. Taki materia³ móg³by byæ cenny w pracach hodowlanych dla uzyskania nowych form ozdobnych gatunku. Odnotowana w doœwiadczeniu zdolnoœæ do kie³kowania nasion jest porównywalna do tej wczeœniej uzyskanej przez Dudê i in. (2001) Nieudanym natomiast zabiegiem, w przeciwieñstwie do opisywanych wczeœniej wyników, by³o pikowanie, po którym wszystkie siewki zamar³y. Roœliny pikowane we wczeœniejszych badaniach (Duda i in. 2001) by³y przenoszone z naturalnego stanowiska z grudk¹ ziemi, co minimalizowa³o prawdopodobieñstwo uszkodzenia korzeni. Zabieg taki jest utrudniony w sytuacji, gdy siewki rosn¹ zbyt gêsto i prawdopodobnie to sta³o siê przyczyn¹ zamierania. Nale y rozwa yæ te mo liwoœæ istnienia zwi¹zków mikoryzowych w warunkach naturalnych, a nie istniej¹cych w pod³o ach sztucznych. W takim wypadku korzenie roœlin ³atwiej znosz¹ uszkodzenia i adaptacje do nowego miejsca.
247 Hacquetia-epipactis- -rozmna anie-in-vitro-i-zdolnoœæ-kie³kowania-nasion-ex-situ 247 Opracowanie ró nych metod rozmna ania ex situ pozwoli z jednej strony na zachowanie zasobów genowych zarówno na poziomie populacji jak i gatunku, z drugiej strony na generowanie bioró norodnoœci skutkiem zmiennoœci somaklonalnej wynikaj¹cej z rozmna ania in vitro. Indukowana zmiennoœæ mo e byæ podstaw¹ do hodowli nowych form ozdobnych. Roœliny uzyskane w drodze propagacji ex situ dostêpne w handlu mog³yby stanowiæ alternatywê dla roœlin pozyskiwanych ze stanowisk naturalnych Literatura AROCKIASMAY S., PRAKASH S., IGNACIMUTHU S. 2002. Direct organogenesis from mature leaf and petiole explants of Eryngium foetidum L. Biologia Plantarum 45(1): 129 132. DUDA J., PUCHALSKI J., SZENDERA W. 2001. Studies on distribution and generative propagation of Hacquetia epipactis (SCOP.) DC. Biuletyn Ogrodów Botanicznych i Arboretów 10: 23 29. EKIERT H. 2000. Medicinal plant biotechnology: the Apiaceae family as the example of rapid development. Pharmazie 55: 561 567. IGNACIMUTHU S., AROCKIASAMY S., ANTONYASAMY M., RAVICHANDRAN P. 1999. Plant regeneration through somatic embryogenesis from mature leaf explants of Eryngium foetidum, a codiment. Plant Cell Tiss. Cult. 56: 131 137. MALARA J. GANCARCZYK-GOLA M., GOLA T. 2004. Charakterystyka populacji cieszynianki wiosennej (Hacquetia epipactis (Scop.) DC. w Porêbie ko³o Zawiercia. Chroñmy Przyr. Ojcz. 60(2): 61 68. MARTIN K.P. 2004. In vitro propagation of the herbal spice Eryngium foetidum L. on sucrose-added and sucrose-free medium without growth regulators and CO 2 enrichment. Scientia Horticulturae 102: 277 282. MOHAMED-YASSEEN Y. 2002. In vitro regeneration, flower and plant formation from petiolar and nodal explants of cilantro (Eryngium foetidum L.). In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 38: 423 426. MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473 97. RADZIUL E. 2004. Roœliny cenne, rzadkie, poszukiwane. PWRiL, Warszawa, 262 ss. SITEK E., NOWAK B., 2009. Status of the Hacquetia epipactis (Apiaceae) populationin in the Cieszynianka floristic reserve in Mogilany village near Kraków (Pogórze Wielickie Foothills, S Poland). W: MIREK Z., NIKIEL A. (red.), Rare, relict and endangered plants and fungi in Poland. W. Szafer Institiute of Botany, Polish Academy of Sciences, Kraków, s. 479 486. THIEM B., WIATROWSKA I. 2007. Mikrorozmna anie Eryngium campestre L. Materia³y 54 Zjazdu PTB Botanika w Polsce - sukcesy, problemy, perspektywy, Szczecin 3 8 IX 2007, s. 123.
248 Barbara-Nowak-et-al. 248 Summary Demographic studies often point out the poor state of insular populations of Hacquetia epipactis. The species is under strict protection. This is due to both natural and anthropogenic factors, including the collection of intact plants for gardens. As a form of integrated protection, an attempt at ex situ propagation was undertaken using seeds and tissue culture. The seeds germinated after the natural stratification during the next season. However, they did not survive transplanting. A complete in vitro plant was obtained only from bud apex explants. The highest multiplication coefficient (2.16) was obtained MS medium supplemented with 0.1 mg/l IBA and 1.0 mg/l BAP. The microplants rooted spontaneously on all media tested with same effectiveness.