Wyniki Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2013

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(1): 37-44 Praca oryginalna Original Article Wyniki Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 2013 Results of Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics POLMICRO 2013 Ewa Młodzińska 1, Elżbieta Stefaniuk 1,2, Karolina Bosacka 1, Beata Chmylak 1, Monika Fortuna 1, Waleria Hryniewicz 1,2 1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa Streszczenie W 2013 roku w ramach działania statutowego Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (CO- BJwDM) przeprowadzono dwa typy sprawdzianów: jeden przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę pełnoprofilową oraz drugi - oddzielny sprawdzian przeznaczony dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Przesyłane w ramach Programu izolaty bakteryjne różniły się wrażliwością na antybiotyki oraz obecnością różnych mechanizmów oporności. Celem programu POLMICRO 2013 była ocena biegłości laboratoriów w identyfikacji drobnoustrojów, oznaczaniu wrażliwości na leki i wykrywaniu mechanizmów oporności. Praca przedstawia wyniki XX edycji - POLMICRO 2013. Summary In 2013 Centre for Quality Control in Microbiology (CQCM) organized two different types of proficiency programmes: one was designed for laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics and the second was prepared for laboratories dealing with enteric infections only. Bacterial isolates distributed within the Programme differed in their susceptibility to antibiotics and a presence of various resistance mechanisms. The aim of the POLMICRO 2013 program was to evaluate proficiency of laboratories in the identification of microorganisms, determination of their drug susceptibility to antibiotics and detection of resistance mechanisms. The paper presents the results of the XX edition - POLMICRO 2013. Słowa kluczowe: POLMICRO, zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności Key words: POLMICRO, external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance mechanisms Wstęp Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) w Warszawie jest odpowiedzialny za coroczną organizację Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO. CO- BJwDM prowadzi dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO dla laboratoriów świadczących pełnoprofilową diagnostykę mikrobiologiczną (Edycja Ogólna) oraz sprawdzian POLMICRO/SSE - dla laboratoriów schorzeń jelitowych. Celem programu jest ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w zakresie identyfikacji, oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących najczęstsze zakażenia u człowieka. Kolejne, coroczne edycje poświęcane były wykrywaniu nowo pojawiających się mechanizmów oporności na antybiotyki wśród ważnych klinicznie szczepów bakteryjnych, standaryzacji stosowanych metod do identyfikacji i oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów. Po raz pierwszy, w roku 2013, w ramach XX edycji programu POLMICRO, jeden ze sprawdzianów został przeprowadzony w wersji elektronicznej. Zadaniem laboratoriów było zidentyfikowanie mechanizmów oporności pałeczek Gram-ujemnych na podstawie zdjęć testów fenotypowych umożliwiających określenie mechanizmów oporności. Biegłość laboratorium w wykrywaniu szczególnie niebezpiecznych mechanizmów oporności umożliwia podejmowanie odpowiednich decyzji terapeutycznych i działań związanych z kontrolą zakażeń. Głównym problemem jest wykrywanie szczepów 37

pałeczek Gram-ujemnych, zarówno jelitowych z rodziny Enterobacteriaceae jak i pałeczek niefermentujących, wytwarzających enzymy nabyte takie jak: β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) czy karbapenemazy. Wśród bakterii Gram-dodatnich wytwarzających mechanizmy oporności szczególnie niebezpieczne są szczepy Staphylococcus aureus oporne na meticylinę, wankomycynę czy linezolid, gatunki z rodzaju Enterococcus oporne na wankomycynę i linezolid oraz izolaty Streptococcus pneumoniae oporne na penicylinę, makrolidy i cefalosporyny III generacji. W obliczu coraz częściej pojawiających się i rozprzestrzeniających szczepów wielolekoopornych szybka i wiarygodna identyfikacja mechanizmów oporności ma kluczowe znaczenie w terapii zakażeń. Przedmiotem sprawdzianów edycji ogólnej były więc izolaty posiadające różne mechanizmy oporności. Łącznie w roku 2013 zorganizowano pięć tur sprawdzianów, trzy w edycji ogólnej i dwie dotyczące identyfikacji pałeczek jelitowych zakażeń przewodu pokarmowego. Tematem niniejszego opracowania jest przedstawienie wyników edycji programu POLMICRO 2013. Materiał i metody W roku 2013 porównania międzylaboratoryjne zostały przeprowadzone z wykorzystaniem szczepów bakteryjnych przedstawionych w Tabeli I. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja izolatów do poziomu gatunku i określenie ich wrażliwości na leki z wykryciem mechanizmów oporności. Uzyskane wyniki przesyłane były do Centralnego Ośrodka drogą elektroniczną, poprzez wypełnienie ankiety dostępnej dla każdego laboratorium na stronie internetowej Ośrodka www.polmikro.edu.pl. Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla izolatów poprawnie zidentyfikowanych; ocenę przeprowadzono w oparciu o kategoryzację błędnych wyników interpretacji klinicznej na małe, duże i bardzo duże błędy. Mały błąd (me - minor error) przyznawany był w sytuacji, kiedy szczep wrażliwy lub oporny został zaliczony jako średniowrażliwy; bądź szczep średniowrażliwy jako wrażliwy lub oporny. Duży błąd (ME- major error) oznaczał zakwalifikowanie szczepu wrażliwego jako oporny. Bardzo duży błąd (VME - very major error), za popełnienie którego przyznawano ocenę negatywną, oznaczał określenie szczepu opornego jako wrażliwy na dany antybiotyk/chemioterapeutyk. Zastosowana kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Na rycinie 1. przedstawiono liczbę laboratoriów biorących udział w poszczególnych turach POLMICRO 2013. Szczegółowe wyniki poszczególnych edycji sprawdzianu oraz interpretacja wyników każdorazowo są zamieszczane na stronie internetowej Ośrodka. Na podstawie wyników uzyskanych we wszystkich turach sprawdzianu w danym roku laboratoriom przyznawane są Świadectwa Zewnątrzlaboratoryjnego Ogólnopolskiego Sprawdzianu Jakości Badań w Mikrobiologii. Przyznawane świadectwa posiadają indywidualny numer i zachowują ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia. Wyniki i omówienie I tura POLMICRO 2013 - edycja ogólna W I turze sprawdzianu POLMICRO 2013 należało udzielić Tabela I. Izolaty bakteryjne wykorzystane w ogólnej edycji sprawdzianu POLMICRO 2013 (XX edycja). Gatunek drobnoustroju nr kolekcji POLMICRO Fenotyp/mechanizmy oporności POLMICRO 2013 tura I Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa PM-215 PM-216 ESBL-ujemny, MBL-dodatni, KPC-ujemny MBL-dodatni, KPC-ujemny Klebsiella pneumoniae PM-217 MBL ujemny, KPC-dodatni Pseudomonas aeruginosa PM-218 ESBL-ujemny, AmpC indukcyjny Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae PM-219 PM-220 KPC-ujemny MBL-ujemny, KPC-ujemny POLMICRO 2013 tura II Staphylococcus aureus PM-210 MRSA Staphylococcus aureus PM-211 MRSA, MLS B indukcyjny POLMICRO 2013 tura III Enterococcus faecalis PM-214 VanA POLMICRO 2013/SSE tura I Salmonella Enteritidis PM-208 Salmonella Colindale PM-209 POLMICRO 2013/SSE tura II Salmonella Paratyphi B PM-212 Shigella flexneri PM-213 Legenda: ESBL - β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym; KPC karbapenemazy klasy A; MBL - karbapenemazy klasy B, tzw. metalo β-laktamazy; MRSA gronkowiec złocisty oporny na meticylinę; MLS B - oporność na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B; VanA fenotyp oporności na glikopeptydy 38

Rycina 1. Liczba laboratoriów biorących udział w poszczególnych turach POLMICRO 2013 (XX edycja). odpowiedzi na sześć pytań dotyczących wykrywania mechanizmów oporności u pałeczek Gram-ujemnych. Uczestnicy programu, na podstawie opisu i zdjęć testów fenotypowych zamieszczonych na stronie internetowej Centralnego Ośrodka, mieli za zadanie wybrać poprawną odpowiedź spośród czterech zaproponowanych wariantów. Pytania wyświetlały się pojedynczo, kolejne pytanie pojawiało się dopiero po udzieleniu odpowiedzi na poprzednie. Nie było możliwości powrotu do pytania, na które została udzielona odpowiedź. Ankieta była dostępna dla laboratorium tylko jeden raz, co oznaczało, że uczestnik po zalogowaniu i pobraniu ankiety musiał odpowiedzieć na wszystkie sześć pytań. Nie było także możliwości powrotu do ankiety, jak również jej korekty. Do sprawdzianu przystąpiło łącznie 416 laboratoriów. Wyniki Określenie obecności lub wykluczenie wytwarzania karbapenemaz typu MBL i KPC na podstawie przedstawionych zdjęć nie sprawiło laboratoriom trudności. Odsetek prawidłowych odpowiedzi na pytania II, III i VI dotyczące interpretacji testów fenotypowych u izolatów Pseudomonas aeruginosa PM-216, P. aeruginosa PM-217 oraz Klebsiella pneumoniae PM-220 wyniósł ponad 98%. Najwięcej błędów pojawiło się w odpowiedzi na pytanie I dotyczące interpretacji testu fenotypowego pozwalającego wykryć obecność β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) u Enterobacter cloacae PM-215. Aż czterdzieści osiem laboratoriów (11,5%) błędnie uznało przedstawiony na zdjęciu test na obecność ESBL jako pozytywny. Wynik pozytywny testu polega na wyraźnym powiększeniu strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z ceftazydymem lub cefotaksymem od strony krążka z amoksycyliną i kwasem klawulanowym, natomiast na zdjęciu testu fenotypowego w kierunku ESBL nie doszło do powiększenia strefy. Obecność dużych stref zahamowania wzrostu wokół cefalosporyn i brak charakterystycznego rozszerzenia oznaczało, że szczep E. cloacae nie wytwarzał ESBL. Omówione pytanie I zamieszczono na rycinie 2. Kolejnym pytaniem, z którym laboratoria miały trudności, było pytanie IV przedstawione na rycinie 3; prawidłowej odpowiedzi udzieliły trzysta dziewięćdziesiąt trzy laboratoria (94,9%). P. aeruginosa PM-218 jest naturalnym producentem AmpC, widoczne na zdjęciu ścięcie strefy zahamowania wzrostu wokół krążków z ceftazydymem (30 µg) i cefotaksymem (30 µg) od strony krążka z amoksycyliną i kwasem klawulanowym (20/10 µg) świadczy o wytwarzaniu przez szczep indukcyjnej cefalosporynazy AmpC, a nie β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) [ścięcie stref, a nie rozszerzenie od strony krążka z amoksycyliną/klawulanianem]. Szesnaście laboratoriów popełniło błąd przy AmpC i zaznaczyło odpowiedź ESBL ujemny, AmpC zderepresjonowany, co zostało ocenione jako niepoprawnie*. Jednak, z uwagi na brak potrzeby różnicowania AmpC w rutynowej Rycina 2. Pytanie I I tura POLMICRO 2013 edycja Ogólna 39

Rycina 3. Pytanie IV I tura POLMICRO 2013 edycja Ogólna. których przedstawiciele uczestniczyli w Wiosennej Szkole Mikrobiologii w maju 2013, podczas której po raz pierwszy poinformowano o zmianie zaleceń dotyczących oceny testu KPC dla pałeczek niefermentujących. Zgodnie z zaleceniami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów różnica stref zahamowania wzrostu wokół krążka z meropenemem (10 µg) i kwasem boronowym (300µg) oraz krążka z meropenemem (10 µg) dla szczepów pałeczek niefermentujących (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp.) podejrzanych o wytwarzanie karbapenemazy KPC wynosi 7 mm. Z uwagi na powyższe do potwierdzenia obecności karbapenemazy KPC u pałeczek niefermentujących należy przesłać wyłącznie izolaty, dla których różnica wielkości stref w teście KPC wynosi 7 mm (KORLD Wykrywanie karbapenemaz zalecenia 2013 ). pracy laboratorium, w tym przypadku ocena niepoprawnie* nie skutkowała przyznaniem końcowej oceny negatywnej, pod warunkiem, że pozostałe odpowiedzi były prawidłowe. Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2013 uzyskało 345 (83%) laboratoriów biorących udział w programie. Ocenę końcową przyznawano na podstawie odpowiedzi na pytania od I do IV oraz pytanie VI. Warunkiem uzyskania oceny pozytywnej było udzielenie prawidłowych odpowiedzi na wszystkie z tych pytań. W przypadku pytania IV decyzyjne kryterium oceny stanowiło poprawne stwierdzenie braku mechanizmu ESBL i dlatego pomimo oceny niepoprawnie* za udzielenie odpowiedzi ESBL ujemny, AmpC zdrepresjonowany zamiast ESBL ujemny, AmpC indukcyjny, w końcowej ocenie utrzymywano ocenę pozytywną, z zastrzeżeniem, że był to jedyny błąd popełniony dla pięciu ocenianych pytań. Siedemdziesiąt jeden laboratoriów (17%) nie spełniło tego warunku i otrzymało negatywną ocenę końcową. Jedno laboratorium popełniło 3 błędy, trzy laboratoria popełniły po dwa błędy, pozostałe po jednym. Z oceny wyłączono pytanie V dotyczące testu fenotypowego dla szczepu Pseudomonas aeruginosa PM-219 pozwalającego wnioskować o wytwarzaniu karbapenemazy KPC. Prawidłowej odpowiedzi mogły udzielić tylko te laboratoria, II tura POLMICRO 2013 - edycja ogólna Wszystkie laboratoria otrzymały zestaw zawierający dwa szczepy Staphylococcus aureus pochodzące z zakażeń łożyska krwi. Materiały rozesłano do 464 laboratoriów, odpowiedzi udzieliło 458 uczestników. Identyfikacja Identyfikacja szczepów nie sprawiła laboratorium żadnych trudności, wszystkie laboratoria poprawnie zakwalifikowały szczepy do gatunku. Lekowrażliwość i mechanizmy oporności Z klinicznego i epidemiologicznego punktu najważniejszym wśród gronkowców mechanizmem oporności na antybiotyki β-laktamowe jest oporność na meticylinę, która oznacza brak wrażliwości na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, z wyjątkiem ostatnio zarejestrowanej ceftaroliny. Oporność na meticylinę związana jest z obecnością białka wiążącego penicylinę zwanego PBP2 lub PBP2 kodowanego przez gen meca lub jego homolog meca LGA251 - nowy gen zlokalizowany w kasecie SCCmec typu XI ostatecznie nazwany mecc. Meticylinooporność szczepów S. aureus PM-210 i PM-211 prawidłowo określiło 100% laboratoriów uczestniczących Rycina 4. Rozkład rozkład wielkości stref zahamowania wzrostu wokół krążka z cefoksytyną 30 µg szczepu S.aureus PM-210 Rycina 5. Rozkład rozkład wielkości stref zahamowania wzrostu wokół krążka z cefoksytyną 30 µg szczepu S.aureus PM-211 40

w niniejszej turze sprawdzianu, w tym czterysta trzydzieści osiem (95,6%) na podstawie testu z cefoksytyną (30 µg), dwadzieścia ośrodków (4,4%) przy wykorzystaniu metod automatycznych. Ryciny 4 i 5 przedstawiają rozkład wielkości stref zahamowania wzrostu izolatów PM-210 i PM-211 wokół krążka z cefoksytyną 30 µg. Mechanizm oporności na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B (MLS B ) w szczepie PM-211 i brak tego mechanizmu w szczepie PM-210 prawidłowo wykryło 457 ośrodków 99,8%. Tylko jedno laboratorium podało błędną odpowiedź dotyczącą MLS B w obu przesłanych izolatach bakteryjnych, co najprawdopodobniej było błędem powstałym w trakcie wypełniania ankiety. Cztery laboratoria (22,7%) nie podały interpretacji klinicznej oznaczenia wrażliwości na klindamycynę. W przypadku fenotypu oporności MLS B indukcyjnego, mimo uzyskania in vitro wrażliwości na klindamycynę, należy dokonać zmiany interpretacji klinicznej na oporny, gdyż w tym przypadku zastosowanie klindamycyny nie jest zalecane (Eksperckie zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zalecenia EUCAST wersja 2.0). Szczep PM-210 (MRSA) jest oporny na ciprofloksacynę, wartość MIC ciprofloksacyny wynosi powyżej 32 mg/l. Czterysta pięćdziesiąt trzy ośrodki (98,9%) poprawnie oznaczyło szczep jako oporny. Oznaczenia wrażliwości na pozostałe antybiotyki i chemioterapeutyki wypadły zadowalająco. Szczep PM-211, także MRSA, jest wrażliwy na ciprofloksacynę; prawidłowej odpowiedzi udzieliło czterysta czterdzieści osiem laboratoriów (97,8%). Wyniki oznaczeń wrażliwości szczepu na kolejne antybiotyki i chemioterapeutyki przedstawiały się następująco: gentamicyna - czterysta pięćdziesiąt sześć (99,6%) ośrodków uzyskało prawidłowe wyniki, wankomycyna czterysta trzydzieści sześć (95,2%) i teikoplanina czterysta dziewięć laboratoriów (89,3%) określiło prawidłowo wrażliwość. Pomimo wrażliwości na ciprofloksacynę nie powinna ona być stosowana w leczeniu zakażeń wywołanych przez MRSA. Zgodnie z zaleceniami EUCAST wrażliwość gronkowców na wankomycynę i teikoplaninę należy oznaczać tylko i wyłącznie na podstawie wartości MIC. Cztery laboratoria wykonały oznaczenie metodą dyfuzyjno-krążkową, co zostało ocenione jako bardzo duży błąd i przyznano im negatywną ocenę końcową. W ankiecie zamieszczono antybiotyki i chemioterapeutyki, które swoim spektrum przeciwbakteryjnym obejmują Staphylococcus aureus, jednak nie stanowią opcji terapeutycznej w zakażeniach łożyska krwi np. mupirocyna, tetracyklina, tigecyklina czy kwas fusydowy. Z tego względu część ośrodków nie oznaczyła wrażliwości na te leki, pozostałe oznaczyły wrażliwość na wszystkie antybiotyki i chemioterapeutyki podając interpretację kliniczną tylko dla leków, które mogą być zastosowane w terapii. Ocenie podlegała interpretacja kliniczna leków stanowiących opcję terapeutyczną. Wewnętrzna kontrola testów lekowrażliwości Laboratoria podawały w ankiecie informację o szczepach wzorcowych stosowanych w kontroli jakości. Zgodnie z wytycznymi EUCAST w ocenie jakości krążków antybiogramowych i pasków z gradientem stężeń do oznaczania lekowrażliwości Staphylococcus spp. należy stosować szczep Staphylococcus aureus ATCC 29213. Trzysta sześćdziesiąt sześć laboratoriów (79,9%) zadeklarowało stosowanie tego szczepu wzorcowego. Siedemdziesiąt pięć laboratoriów (16,4%) użyło do kontroli jakości szczepu S. aureus ATCC 25923, a pięć laboratoriów zastosowało szczep S. aureus ATCC 43300 oporny na meticylinę przeznaczony do kontroli jakości wykrywania mechanizmu oporności na meticylinę. Pozytywny wynik II tury sprawdzianu POLMICRO 2013 uzyskało 451 (98,5%) laboratoriów biorących udział w programie. III tura POLMICRO 2013 - edycja ogólna Wszystkie laboratoria otrzymały szczep Enterococcus faecalis PM-214 w dwóch powtórzeniach, jako szczepy A i B. Izolat charakteryzował się obecnością fenotypu VanA, oznaczającego oporność zarówno na wankomycynę (MIC >256mg/L), jak i teikoplaninę (MIC =128 mg/l). Identyfikacja 451 laboratoriów (99,5%) poprawnie określiło gatunek badanych izolatów, tylko 2 laboratoria popełniły błędy w identyfikacji drobnoustrojów. Jedno laboratorium poprawnie zidentyfikowało szczep A, natomiast szczep B zakwalifikowało do gatunku Enterococcus faecium. Drugie laboratorium zidentyfikowało szczep A jako Enterococcus casseliflavus, a B jako Enterococcus gallinarum. Lekowrażliwość i mechanizmy oporności Wszystkie enterokoki uważane są za naturalnie oporne na niskie stężenia aminoglikozydów, cefalosporyny, linkozamidy i sulfonamidy. U gatunku E. faecium obserwuje się zwiększenie oporności na ampicylinę, związanej ze zmianami w białkach PBP5, które powodują obniżenie powinowactwa do β-laktamów, w tym na wszystkie penicyliny i karbapenemy. Z klinicznego i epidemiologicznego punktu widzenia znaczenie mają mechanizmy oporności nabytej: oporność na wysokie stężenia aminoglikozydów (HLAR) oporność na glikopeptydy (VRE) oporność na linezolid (LRE). Szczep E. faecalis PM-214 wykazywał oporność wysokiego stopnia na streptomycynę i oporność na wankomycynę i teikoplaninę. Trzynaście laboratoriów (2,9%) uznało, że szczep jest oporny na wysokie stężenia aminoglikozydów HLAR, osiem z nich podjęło taką decyzję na podstawie wyniku oznaczenia wrażliwości na streptomycynę. Informacja ta została przesłana w komentarzu do wyników. Zgodnie z eksperckimi zasadami interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów (EUCAST wersja 2.0): Zasada nr 12.4 - W przypadku oporności wysokiego stopnia 41

na streptomycynę (MIC>512mg/L) izolaty należy raportować jako oporne na wysokie stężenia streptomycyny Zasada nr 12.6 - W przypadku oporności wysokiego stopnia na gentamicynę (MIC>128mg/L) izolaty należy raportować jako oporne na wysokie stężenia wszystkich aminoglikozydów z wyjątkiem streptomycyny. Zatem, na podstawie wyniku uzyskanego dla streptomycyny, nie można wnioskować o oporności wysokiego stopnia na wszystkie aminoglikozydy (HLAR), wynik w tym przypadku odnosi się wyłącznie do streptomycyny. W ankiecie III tury POLMICRO 2013 odpowiedzi na pytanie dotyczące oporności wysokiego stopnia na aminoglikozydy należało udzielić w oparciu o wynik oznaczenia wrażliwości na gentamicynę. Czterysta czterdzieści laboratoriów (97,1%) udzieliło prawidłowej odpowiedzi nie stwierdzono HLAR. Blisko 100% laboratoriów prawidłowo wykryło oporność szczepu E. faecalis PM-214 na glikopeptydy: na teikoplaninę - 99,9% (n=443), na wankomycynę - 99,3 % (n=450). W oznaczaniu wrażliwości na pozostałe leki odnotowano pojedyncze błędy, odsetek prawidłowych wyników wyniósł ponad 99%. Szczegółowa analiza wyników pozwoliła stwierdzić fakt stosowania przez dwa laboratoria krążków z niewłaściwymi stężeniami antybiotyków kluczowych z punktu widzenia terapii zakażeń; zastosowano krążki ampicyliny 10 µg zamiast 2 µg; gentamicyny 120 µg zamiast 30 µg; wankomycyny 30 µg zamiast 5 µg. Postępowanie takie jest niezgodne z zaleceniami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów i zostało zakwalifikowane do kategorii bardzo duży błąd, co zadecydowało o przyznaniu laboratoriom negatywnej oceny końcowej. Precyzja w warunkach odtwarzalności dla metody dyfuzyjno-krążkowej Wszystkie laboratoria otrzymały szczep Enterococcus faecalis PM-214 w dwóch powtórzeniach. Zebrane wyniki umożliwiły oszacowanie precyzji w warunkach odtwarzalności dla metody dyfuzyjno-krążkowej. Precyzja określana jest jako stopień zgodności między niezależnymi wynikami pomiarów otrzymanymi w określonych warunkach. Oznacza to, że na poszczególne wyniki badania nie mają wpływu wyniki uzyskane dla tego samego (powtarzalność) lub podobnego (odtwarzalność) obiektu (obiektem są w tym przypadku krążki antybiogramowe, podłoża, czy przyrząd pomiarowy) w określonym przedziale czasowym. Precyzja zależy od rozkładu błędów losowych i przedstawia rozrzut wyników wokół wartości średniej X Śr. Miarą precyzji jest: odchylenie standardowe - S (im większe, tym precyzja mniejsza), względne odchylenie standardowe RSD, współczynnik zmienności - W(z). Dla metody dyfuzyjno-krążkowej oznaczania wrażliwości Enterococcus faecalis PM-214 na antybiotyki i chemioterapeutyki wartości tych parametrów przedstawiono w tabeli II. Zgromadzone dane wskazują, że wielkości stref zahamowania wzrostu drobnoustrojów wokół krążka antybiogramowego w warunkach powtarzalności oznaczono ze średnią precyzją 12,84% (wartość średnia współczynnika zmienności dla wszystkich badanych antybiotyków), co oznacza wynik pozytywny, gdyż przyjmuje się, że dla metod mikrobiologicznych akceptowalne względne odchylenie standardowe mieści się w zakresie 15-30%. Wewnętrzna kontrola testów lekowrażliwości Do oceny jakości krążków antybiogramowych i pasków z gradientem stężeń pozwalających ocenić lekowrażliwość Enterococcus spp. należy stosować szczep Enterococcus faecalis ATCC 29212 - szczep ten zastosowało czterysta siedemnaście laboratoriów (92%), jedno laboratorium zastosowało E. faecalis ATCC 51299. Pozostałe laboratoria zastosowały następujące szczepy wzorcowe: Staphylococcus aureus ATCC 29213 - trzynaście laboratoriów (2,9%), S. aureus ATCC 25923-11 laboratoriów (2,4%) oraz Escherichia coli ATCC 25922 - cztery laboratoria. Stosowanie w kontroli jakości antybiogramów szczepów innych gatunków niż rekomendowane jest nieprawidłowe i wymaga przeanalizowania procedur laboratoryjnych. Pozytywny wynik III tury sprawdzianu POLMICRO 2013 uzyskało 434 (95,8%) laboratoriów biorących udział w programie. Wyniki Polmicro 2013/sse Przedmiotem porównań międzylaboratoryjnych przeprowadzonych w ramach edycji POLMICRO 2013/SSE była identyfikacja szczepów izolowanych z zakażeń przewodu pokarmowego na poziomie zadeklarowanym przez każde z laboratoriów. W poszczególnych turach POLMICRO 2013/ SSE uczestniczyły laboratoria stacji sanitarno-epidemiologicznych, laboratoria mikrobiologiczne spoza PIS oraz laboratoria weterynaryjne. Wszystkie laboratoria otrzymały zestaw zawierający dwa szczepy A i B pochodzące z zakażeń przewodu pokarmowego. Pozytywne wyniki w I i II turze Tabela II. Precyzja w warunkach odtwarzalności: metoda dyfuzyjno-krążkowa, szczep E.faecalis PM-214 Enterococcus faecalis PM-214 Ampicylina Gentamycyna Linezolid Wankomycyna Teikoplanina Wartość średnia X Śr 18 14 22 6 8 Odchylenie standardowe S 3 2 2 1 2 Względne odchylenie standardowe RSD 0,146 0,112 0,08 0,075 0,229 Współczynnik zmienności W(z) 14,6 % 11,2% 8% 7,5% 22,9% 42

sprawdzianu POLMICRO 2013/SSE uzyskało 113 laboratoriów 95,8% biorących udział w programie. I tura programu POLMICRO 2013/SSE Izolaty kliniczne rozesłane w ramach I tury POLMICRO 2013/ SSE przedstawiono w tabeli I. Szczepy należały do dwóch grup według Taksonomii i nazewnictwa rodzaju Salmonella Światowej Organizacji Zdrowia Próbka A zawierała szczep Salmonella Enteritidis PM-208 należący do grupy O:9 (D 1 ), antygen somatyczny O 1,9,12; antygen rzeskowy H I faza g,m. Próbka B zawierała szczep Salmonella Colindale PM 209, grupa O:7 (C 1 ), antygen somatyczny O 6,7; antygen rzeskowy H I faza r; II faza 1,7. Oceniano poprawność identyfikacji zgodnie z zakresem podanym przez każdego z uczestników programu POLMI- CRO/SSE. Wszystkie laboratoria zidentyfikowały szczep A poprawnie. Szczep B został błędnie zidentyfikowany jako Salmonella Virchow przez 3 laboratoria (2,5%). Salmonella Virchow i Salmonella Colindale należą do tej samej grupy O:7 (C 1 ). Salmonella Virchow posiada następujące składniki antygenu somatycznego - 6,7,14, antygeny rzęskowe (H): fazy I r, fazy II-1,2. Składniki antygenu O wyróżnione podkreśleniem czyli w omawianej sytuacji O -14, wykryć można tylko w szczepie poddanym lizogenizacji odpowiednim fagiem konwertującym. S. Virchow dodatkowo różni się od S. Colindale antygenem flagelarnym H w drugiej fazie rzęskowej. Zaniechanie odpowiedniej kontroli jakości odczynników mogło przysporzyć trudności w prawidłowej identyfikacji badanego izolatu. Dwa laboratoria poprawnie określiły przynależność szczepu B do grupy O:7 (C 1 ), jednakże ze względu na niezgodność podanej identyfikacji z zadeklarowanym zakresem badań, ośrodkom tym przyznano ocenę negatywną. II tura programu POLMICRO 2013/SSE Próbka A zawierała szczep PM-212 Salmonella Paratyphi B, który według Taksonomii i nazewnictwa rodzaju Salmonella WHO należy do grupy O:4 (B), antygen somatyczny O 1,4,[5],12; antygen rzęskowy H I faza b; II faza 1,2; inne [z 5 ],[z 33 ]. Próbka B zawierała szczep PM-213 Shigella flexneri. Materiały kontrolne rozesłano do 123 laboratoriów, w tym laboratoriów stacji sanitarno-epidemiologicznych (n=113), laboratoriów mikrobiologicznych spoza PIS (n=7) oraz laboratoriów weterynaryjnych (n=3). Odpowiedzi udzieliło 118 laboratoriów. Zakresy udzielanych odpowiedzi (poziom identyfikacji) przedstawiono w Tabeli III. W tabeli III. porównano zadeklarowany przez uczestników zakres identyfikacji z zakresem wykonanym, zamieszczonym w ankiecie z wynikami. W przypadku szczepu A Salmonella Paratyphi B sześć laboratoriów (5,1%) zdecydowało się rozszerzyć poziom identyfikacji do serowaru, w przypadku szczepu B deklarowany zakres został rozszerzony przez 18,7% laboratoriów (n=22). Poprawność identyfikacji oceniano zgodnie z zakresem podanym przez każdego z uczestników programu POLMICRO/SSE, natomiast, w sytuacji rozszerzenia zakresu, ocenie podlegała wskazana w ankiecie odpowiedź. Wyniki dla izolatu a - pm-212 salmonella paratyphi b Szczep A prawidłowo zidentyfikowało sto czternaście laboratoriów (96,6%). Dwa laboratoria (1,7%) udzieliły błędnej odpowiedzi identyfikując próbkę A jako Salmonella Brandenburg. Kolejne dwa laboratoria (1,7%) wykonały oznaczenie w zakresie węższym niż deklarowany - jedno laboratorium podało identyfikację wyłącznie do grupy zamiast do serowaru, a drugie zakwalifikowało szczep wyłącznie do rodzaju zamiast określić grupę. Wyniki dla izolatu b - pm-213 shigella flexneri Szczep B Shigella flexneri został prawidłowo zidentyfikowany przez 117 ośrodków (99,2%). Sto dwa laboratoria (86,4%) określiły gatunek izolatu, w tym dwadzieścia dwa laboratoria (18,7%) rozszerzyły zakres identyfikując szczep B do poziomu gatunku. Jedno laboratorium nie wykonało oznaczenia szczepu B do poziomu gatunku, co było niezgodne z zadeklarowanym zakresem identyfikacji. Na określeniu wyłącznie rodzaju drobnoustroju poprzestało 16 laboratoriów (13,6%). Zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej i obowiązującymi procedurami diagnostycznymi identyfikacja Tabela III. Poziom identyfikacji badanych izolatów w programie POLMICRO/2013/SSE/II tura w odniesieniu do wcześniejszych deklaracji Poziom identyfikacji badanych izolatów, deklarowanej i wykonanej, przez laboratoria biorące udział w II turze sprawdzianu POLMICRO/SSE w 2013 roku (n=118) Identyfikacja do rodzaju do gatunku do grupy do typu serologicznego (serowaru) Salmonella (n=118) zakres deklarowany 14 2 44 58 zakres wykonany 10 4 41 63 Shigella zakres 37 81 (n=118) deklarowany zakres wykonany 16 102 43

drobnoustrojów do poziomu rodzaju jest niewystarczająca i laboratoria, które obecnie na tym etapie kończą diagnostykę powinny dostosować swoje procedury badawcze do aktualnych wymagań. Podsumowanie Program POLMICRO już od kilku lat przeprowadzany jest z wykorzystaniem specjalnie przygotowanej strony internetowej www.polmikro.edu.pl. Laboratoria wprowadzają wyniki poszczególnych edycji sprawdzianu przez internet. Analiza przesyłanych do Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej wyników, przygotowywanie ocen dla pojedynczych uczestników programu, czy też przygotowywanie ocen zbiorczych odbywa się również drogą elektroniczną. W roku 2013 jeden ze sprawdzianów został przeprowadzony w całości w wersji elektronicznej, każdy z uczestników Programu dokonywał oceny tych samych testów fenotypowych. Celem przeprowadzonej tury było sprawdzenie biegłości laboratoriów w wykrywaniu szczególnie niebezpiecznych mechanizmów oporności. Wykrywanie mechanizmów oporności jest istotnym elementem diagnostyki mikrobiologicznej, umożliwia laboratoriom podejmować odpowiednie decyzje terapeutyczne i działania związane z kontrolą zakażeń. Zaletę wersji elektronicznej sprawdzianu stanowiła tzw. równa szansa wszystkich uczestników POLMICRO. Presja czasu, brak możliwości powrotu do pytań/ankiety mogły stanowić trudność w podejmowaniu decyzji i rzutować na poprawność odpowiedzi. Dla organizatora badań porównawczych taka wersja sprawdzianu znacznie upraszcza ocenę wyników sprawdzianu, zaś dla Laboratoriów może stanowić rodzaj szkolenia e-learningowego. Ocena poprawności identyfikacji, prawidłowe oznaczenie fenotypu wrażliwości na leki badanych izolatów bakteryjnych z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechanizmów oporności były przedmiotem pozostałych ogólnych sprawdzianów XX edycji POLMICRO 2013. Procent prawidłowych wyników uzyskiwanych przez laboratoria w kolejnych turach programu był wysoki i wyniósł ponad 95%. Ogółem w roku 2013 przyznano 466 świadectw: 359 w edycji ogólnej i 107 w edycji w zakresie schorzeń jelitowych. hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu; wersja 3.1, 2013; Polskie tłumaczenie pod red. prof. Walerii Hryniewicz www.korld.edu.pl 6. Grimont PAD, Weill F-X. Antigenic formule of the Salmonella serovars, WHO Collaborating Centre for Refference and Research on Salmonella, 2007, 9 th edition. 7. Rekomendacje European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST, Version 3.1, 2013 - www.eucast.org 8. www.eucast.org 9. www.sccmec.org Adres do korespondencji: mgr Ewa Młodzińska Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej 01-793 Warszawa, ul. Rydygiera 8 tel/faks +48 22 8415834 e-mail: emlodzinska@cls.edu.pl, sprawdzian@cls.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: 10.03.2014 Piśmiennictwo: 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty Third Informational Supplement, CLSI document M100-S23, Wayne PA, 2013. 2. Clark RB, Lewiński MA, Loeffelholz MJ, Tibbetts RJ. Verification and Validation of Procedures in the Clinical Microbiology Laboratory. Cumitech 2009, 2; 2-5. 3. Eksperckie zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zalecenia EUCAST, wersja 2.0, Polskie tłumaczenie pod red. prof. Walerii Hryniewicz www.korld.edu. pl 4. Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing Methods, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 2000, 54, 3; Supp. TR33 5. Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST), Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń 44