MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA

MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA ORGAN NARODOWEGO INSTYTUTU ZDROWIA PUBLICZNEGO PAŃSTWOWEGO ZAKŁADU HIGIENY I POLSKIEGO TOWARZYSTWA MIKROBIOLOGÓW 1 ROK LXVII KWARTALNIK 2015 NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY

MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA Organ Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny i Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów REDAKCJA Redaktor: WALDEMAR RASTAWICKI Zastępca Redaktora: RAFAŁ GIERCZYŃSKI Sekretarz: KATARZYNA ZACHARCZUK Redaktor językowy (język polski): STANISŁAW KAŁUŻEWSKI Redaktor językowy (język angielski): MARIA DOMINGUEZ Redaktor statystyczny: DANIEL RABCZENKO KOMITET REDAKCYJNY D. Dzierżanowska - Warszawa, S. Giedrys-Kalemba - Szczecin, E. Gołąb - Warszawa, E. Gospodarek - Bydgoszcz, P.B. Heczko - Kraków, A. Jaworski - Łódź, B. Litwińska - Warszawa, K. Piekarska - Warszawa, B. Różalska - Łódź, A. Stankiewicz - Warszawa, E.M. Szewczyk - Łódź, A. Szkaradkiewicz - Poznań, J. Szych - Warszawa, E.A. Trafny - Warszawa, S. Tyski - Warszawa, M.L. Zaremba - Białystok, A.A. Zasada - Warszawa, Z. Zwolska - Warszawa Adres Redakcji: 00-791 Warszawa 36, ul. Chocimska 24 E-mail: medmikrobiol@pzh.gov.pl Tel: 22 54 21 325; 22 54 21 240 Fax: 22 54 21 307 www.medmikro.org.pl Indeks 365226 Punktacja za publikację wg MNiSW 5 pkt. Index Copernicus 4,82 pkt. Kwartalnik Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia jest indeksowany w bazie danych pn. Polska Bibliografia Lekarska (PBL). NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY Skład i druk: Libra-Print Daniel Puławski, Al. Legionów 114b, 18-400 Łomża tel./fax 86 473 77 84, www.libra-print.pl

SPIS TREŚCI PRACE ORYGINALNE S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły. Obecność laktoferyny w kale jako wskaźnik zakażenia Clostridium difficile u dzieci... 1 P. Karpiński, H. Pituch, D. Lachowicz, M. Piotrowski, P. Obuch- -Woszczatyński. Ocena wzrostu na podłożu chromid C. difficile Agar klinicznych szczepów Clostridium difficile należących do różnych PCR-rybotypów.... 9 G. Madajczak, J. Szych, M. Wasiak. Zastosowanie mikromacierzy Salmonella Check&Trace do oznaczania typu serologicznego pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica w ramach międzynarodowych sprawdzianów kompetencji (EQAS)... 15 B. Młynarczyk-Bonikowska, M. Kujawa, G. Młynarczyk, M. Malejczyk, S. Majewski. Wrażliwość na spektynomycynę szczepów Neisseria gonorrhoeae izolowanych w Polsce w latach 2012-2013... 23 E. Skulska, B. Młynarczyk-Bonikowska, S. Walter de Walthoffen, G. Młynarczyk, M. Malejczyk, S. Majewski. Porównanie metody Real- -Time PCR i hodowli bakteryjnej w laboratoryjnej diagnostyce rzeżączki u pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego... 29 K. Piekarska, W. Rastawicki, A. Michalak, M. Rzeczkowska, T. Kamińska, G. Wojtas, I. Paradowska-Stankiewicz. Wady i zalety mikrobiologicznych metod diagnostycznych stosowanych w rozpoznaniu zakażenia wywołanego przez Mycoplasma pneumoniae na przykładzie wybranej sytuacji klinicznej... 39 A. Chojecka, O. Wiercińska, E. Röhm-Rodowald, K. Kanclerski, B. Jakimiak. Wrażliwość wybranych szczepów używanych do oceny biobójczej skuteczności preparatów dezynfekcyjnych oraz antybiotykoopornych szczepów na rozpuszczony w 2-propanolu chlorek didecylodimetyloamoniowy. 47 PRACE POGLĄDOWE O. Wiercińska, A. Chojecka, K. Kanclerski, E. Rőhm-Rodowald, B. Jakimiak. Znaczenie pomp efflux w wielolekowej oporności Gram-ujemnych bakterii... 55

CONTENTS ORIGINAL ARTICLES S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły. Presence of lactoferrin in faeces as the indicator of Clostridium difficile in pediatric patients... 1 P. Karpiński, H. Pituch, D. Lachowicz, M. Piotrowski, P. Obuch- -Woszczatyński. Evaluation of growth of clinical Clostridium difficile strains belonging to different PCR-ribotypes on chromid C. difficile Agar.... 9 G. Madajczak, J. Szych, M. Wasiak. Results of Salmonella enterica subsp. enterica serotype identification by Salmonella Check&Trace microarray in international External Quality Assurance Systems... 15 B. Młynarczyk-Bonikowska, M. Kujawa, G. Młynarczyk, M. Malejczyk, S. Majewski. Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Poland in 2012-2013 to spectinomycin... 23 E. Skulska, B. Młynarczyk-Bonikowska, S. Walter de Walthoffen, G. Młynarczyk, M. Malejczyk, S. Majewski. The Comparison of Real-Time PCR and bacterial culture in laboratory diagnostics of gonorrhoea in patients of Department of Dermatology and VenereologyMedicalUniversity of Warsaw... 29 K. Piekarska, W. Rastawicki, A. Michalak, M. Rzeczkowska, T. Kamińska, G. Wojtas, I. Paradowska-Stankiewicz. Advantages and disadvantages of microbiological methods used in the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections in selected clinical situation... 39 A. Chojecka, O. Wiercińska, E. Röhm-Rodowald, K. Kanclerski, B. Jakimiak. Susceptibility of selected strains used for evaluation of biocidal efficiency of disinfectants and antibiotic-resistant strains to didecyldimethylammonium chloride in 2-propanol... 47 REVIEWS O. Wiercińska, A. Chojecka, K. Kanclerski, E. Rőhm-Rodowald, B. Jakimiak. Significance of efflux pumps in multidrug resistance of Gram-negative bacteria... 55

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 1-8 Obecność laktoferyny w kale jako wskaźnik zakażenia Clostridium difficile u dzieci Presence of lactoferrin in faeces as the indicator of Clostridium difficile in pediatric patients Sylwia Dąbrowska 1, Urszula Demkow 1,2, Edyta Podsiadły 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Imunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego SPDSK, Warszawa 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Imunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny Zakażenie Clostridium difficile (CDI) jest wciąż mało poznanym czynnikiem zachorowań w populacji pediatrycznej. Celem pracy była ocena przydatności badania podwyższonego poziomu laktoferyny w kale jako wskaźnika potwierdzającego zakażenie C. difficile. Zbadano 55 próbek kału, pochodzących od dzieci z klinicznymi objawami infekcji, w których wykryto toksynę A/B lub izolowano toksynotwórczy szczep C. difficile. Grupę kontrolną stanowiło 15 próbek kału, pobranych od dzieci, u których nie potwierdzono bakteriologicznym badaniem CDI oraz 7 próbek kału pobranych od zdrowych dzieci. Przeprowadzone badania wykazały u 45,5% (25/55) chorych z CDI podwyższony poziom laktoferyny a u 54,5% badanych osób z tej grupy ujemny wynik oznaczenia. W grupie kontrolnej laktoferynę w istotnym stężeniu stwierdzono u jednego dziecka, od którego wyhodowano szczep nietoksynotwórczy (1/15), natomiast oznaczenia wykonane we wszystkich próbkach kału pobranych od zdrowych osób dały wynik ujemny. Nie zaobserwowano różnic w częstości występowania podniesionego poziomu CRP u dzieci z CDI w stosunku do pacjentów bez zakażenia. Laktoferyna wydaje się obiecującym wskaźnikiem różnicującym między kolonizacją a zakażeniem CDI w populacji pediatrycznej. Słowa kluczowe: laktoferyna, Clostridium.difficile, dzieci ABSTRACT Introduction: Number of infection caused by Clostridium difficile in hospitalized children is increasing. Even though children unlike adults seldom develop complications after being

2 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 ill, cases of persistent diarrhoea triggered by this pathogen and mortality from this origin have been reported. At present the important problem constitute differentiation between the colonization and infection limiting the proper diagnosis of C. difficile infections (CDI) in this age group. The aim of this study was to evaluate the presence of lactoferrin in faeces as the inflammatory marker confirming C. difficile infections in children. Methods: Seventy seven samples of faeces where examined. Among them in 55 toxin A/B or C. difficile toxinogenic strain and in 15 nontoxinogenic C. difficile had been detected, 7 were collected from healthy children. Stool samples were tested with the use of method routinely applied in laboratory: automatic VIDAS C. difficile Toxin A&B test (biomerieux, France), culture and GDH test. Lactoferrin in stool has been identified with ELISA IBD- -SCAN test (Techlab, Blacksburg, VA). The CRP protein was detected with VITROS 5600. Results: Among 55 children with CDI lactoferrin was detected in 45,5% (25/55) of them. In 30 (54,5%) CDI patients the inflammatory biomarker was not identified. In 15 persons with nontoxinogenic strain cultured, one child had lactoferrin present. CDI was detected most frequently (51%) in 6-11 years old children. The increase of CDI cases was observed in period 2013-2014. Neither differences in frequency of raised CRP level in examined groups of children nor correlation between presence of lactoferrin and CRP was observed. Conclusions: Lactoferrin an intestinal inflammatory biomarker may be a useful tool in distinguishing between C. difficile infection and colonization. More studies including clinical observations are needed. Key words: lactoferrin, Clostridium difficile, children Clostridium difficile jest jedną z najczęstszych przyczyn biegunek związanych z hospitalizacją osób dorosłych (7). Na zakażenia C. difficile (CDI ang. Clostridium difficile infection) szczególnie narażone są osoby > 65 roku życia, u których występują one 20-krotnie częściej, niż u osób poniżej 20 roku życia. Do niedawna przeważał pogląd, że u dzieci w wieku 5-14 lat zapadalność na te zakażenia jest bardzo niska (7). Ostatnie badania wskazują, że CDI jest istotnym czynnikiem zachorowań a nawet śmiertelności w populacji pediatrycznej (4,13,14). U dzieci w odróżnieniu od osób dorosłych rzadziej występują powikłania po przechorowaniu, jednak biegunka wywołana przez ten patogen może przechodzić w formę przewlekłą i stanowić problem w wyleczeniu. Jedną z cech CDI jest zapalenie śluzówki okrężnicy rozwijające się pod wpływem toksyn wydzielanych przez bakterie (3). Toksyny oddziałują na komórki nabłonka jelita grubego, powodując rozluźnienie silnych połączeń międzykomórkowych, co indukuje apoptozę i powoduje infiltrację oraz agregację neutrofili (3). Zarówno fekalna laktoferyna jak i fekalna kalprotektyna są wskaźnikami zwiększania translokacji granulocytów do śluzówki jelitowej (3,6). Z tego względu produkty wydzielane przez leukocyty w kale jak: cytokiny, laktoferyna, kalprotektyna są kandydatami na biomarkery zapalenia jelitowego. Laktoferyna należy do wielofunkcyjnych białek z grupy transferryn, jest produkowana przez granulocyty obojętnochłonne. Występuje w wydzielinach śluzowych: ślinie, w mleku matki (siara), łzach, nasieniu, drogach oddechowych, układzie pokarmowym oraz w granulocytach obojętnochłonnych, nerkach i w kale (1,2,12). Już w latach 90-tych ubiegłego wieku podkreślano możliwość wykorzystania oznaczania stężenia laktoferyny w kale do

Nr 1 Laktoferyna w kale jako wskaźnik zakażenia C. difficile 3 różnicowania między biegunką o etiologii bakteryjnej i wirusowej postulując wykorzystanie tego parametru w diagnostyce ostrych biegunek. Poziom laktoferyny w kale wzrasta w przypadku zakażenia patogenami wywołującymi biegunki o charakterze zapalnym jak: Shigella sp., EIEC, VTEC. Oznaczanie stężenia laktoferyny znalazło zastosowanie w diagnostyce nieswoistego zapalenia jelit oraz jako marker zapalenia występującego w obrębie jelit zarówno o infekcyjnym jak i nieinfekcyjnym podłożu. Zaobserwowano zależność poziomu laktoferyny od natężenia zmian w obrazie endoskopowym, im wyższy stopień nasilenia zmian w badaniu koloskopowym tym wyższe było jej stężenie w kale (1,2). Jednak według niektórych autorów, umiejscowienie zmian w jelitach nie znajduje odzwierciedlenia w poziomach tego białka w stolcach (1,2). Nosicielstwo C. difficile zarówno toksynotwórczymi jak i nietoksynotwórczymi szczepami jest wysokie, stwierdzono je u 3% zdrowych osób oraz 20-40% osób hospitalizowanych (7). Nie zawsze w wyniku kolonizacji dochodzi do rozwoju zakażenia. Istotnym ograniczeniem diagnostyki zakażeń C. difficile u dzieci jest brak wiarygodnych markerów, które umożliwiłyby zróżnicowanie pomiędzy kolonizacją a zakażeniem. Celem przeprowadzonego badania było sprawdzenie możliwości wykorzystania laktoferyny jako lokalnego markera zapalnego związanego z rozwojem CDI u dzieci. MATERIAŁ I METODY Próbki materiału klinicznego. Zbadano 55 próbek kału, w których wykryto toksynę A/B C. difficile lub wyhodowano toksynotwórczy szczep C. difficile. Próbki pochodziły od dzieci hospitalizowanych w Samodzielnym Publicznym Dziecięcym Szpitalu Klinicznym w Warszawie z objawami nieżytu żołądkowo-jelitowego i zostały przysłane do przyszpitalnej Pracowni Mikrobiologii na badanie w kierunku C. difficile. Próbki zbierano w okresie wrzesień 2013 - luty 2015 od dzieci do 18 roku życia. W przeprowadzonej pracy badano pierwszą otrzymaną próbkę kału. Grupę odniesienia stanowiły 22 próbki kału pobrane od: 7 dzieci bez objawów zakażenia pokarmowego i 15 próbek, w których stwierdzono obecność nietoksynotwórczego szczepu C. difficile. Jako zakażenie C. difficile uznawano przypadek nieżytu żołądkowo-jelitowego z pozytywnym testem na obecność toksyny A/B C. difficile w kale lub wyhodowanie toksynotwórczego szczepu C. difficile. Pierwsza próbka kału przysłana od chorego z podejrzeniem CDI, po wykonaniu badania w kierunku toksyny C. difficile była mrożona w temp. -80 C i przechowywana w tych warunkach do momentu oznaczenia laktoferyny. Wszystkie analizowane próbki kału wykorzystywane w badaniu były traktowane jako pozostałości po rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej. Oznaczanie obecności laktoferyny w kale. Poziom laktoferyny w kale oznaczano testem ELISA IBD-SCAN (Techlab, Blacksburg, VA) wg instrukcji producenta. W skrócie, 50 mg lub 50 ml kału rozcieńczano w rozcieńczalniku do próbek w stosunku 1:10, 1:100. Zawiesinę inkubowano na płytce opłaszczonej swoistymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciwko laktoferynie. Powstałe kompleksy wykrywano przeciwciałami poliklonalnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową. Do wykreślenia krzywej kalibracyjnej zastosowano standardy laktoferyny w zakresie od 6,25 do 100 ng/ml korzystając z programu EXEL stosując analizę Trendu liniowego/typu regresji. Pomiar absorbancji wykonano na aparacie Fluorostar Omega (BMG LabTech, Niemcy). Zgodnie z instrukcją producenta za

4 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 wartości prawidłowe uważano stężenie laktoferyny w zakresie 0-7,24μg/ml kału. Wszystkie próbki, w których wykryto stężenie laktoferyny 7,25μg/ml uważano za dodatnie. Oznaczanie obecności toksyny A/B C. difficile oraz wykrywanie C. difficile w próbkach kału. Jakościowe wykrywanie toksyny A/B C. difficile w próbkach stolca wykonano przy pomocy automatycznego testu VIDAS C. difficile Toxin A&B (biomerieux, Francja). W oznaczeniu wykorzystano technikę ELFA (enzymoimmunofluorescencji), w której mierzona fluorescencja była wprost proporcjonalna do ilości toksyny A/B. Za wynik ujemny przyjmowano wartość < 0,13; jako wynik wątpliwy - od 0,13 do 0,37, a jako wartość dodatnią powyżej 0,37. W próbkach ujemnych badano obecność dehydrogenazy glutaminianowej (GDH) za pomocą testu immunochromatograficznego Clostridium K-seT (CORIS BioConcept, Belgia). Próbki w których wykryto obecność GDH wysiewano na podłoże Clo (Biomerieux, Francja). Inkubację prowadzono w temp. 36 +/- 1 C warunkach beztlenowych przez 48 h. Kolonie fenotypowo przypominające te tworzone przez C. difficile (kształt, zapach) identyfikowano przy pomocy testów biochemicznych rapid ID 32 A (biomerieux, Francja). Dla każdego wyhodowanego szczepu C. difficile badano jego zdolność do wytwarzania toksyn metodą ELFA VIDAS C. difficile Toxin A&B (biomerieux, Francja). Wykrywanie obecności rotawirusów i adenowirusów w kale. U 37 dzieci ze stwierdzonym CDI wykonano oznaczenie w kierunku obecności rota-, adenowirusów testem imunochromatograficznym VIKIA Roto Adeno (biomerieux, Francja). Badania wykonano zgodnie z instrukcją producenta. Grudkę kału rozcieńczano w rozpuszczalniku i nanoszono na okienko testowe. Odczyt prowadzono po 10 minutach inkubacji. Wykrywanie białka CRP. Białko CRP wykonywano przy użyciu slajdów CRP VITROS oraz zestawu kalibracyjnego 7 do systemu biochemicznego VITROS na analizatorze VITROS 5600. Za wynik dodatni uznawano wartość > 0,5mg/dl. WYNIKI Spośród grupy badanych u 55 dzieci stwierdzono obecność toksyny lub szczepu toksynotwórczego C. difficile, a u 15 chorych wykryto kolonizację nietoksynotwórczym szczepem C. difficile (Tabela I). Tabela I. Obecność laktoferyny w kale dzieci chorych z nieżytem żołądkowo-jelitowym. Laktoferyna Grupa badana Liczba Liczba Liczba osób Liczba (odsetek) (odsetek) z podwyższonym badanych osób z obecną osób bez poziomem CRP laktoferyną laktoferyny Dzieci z obecną toksyną A/B C. difficile lub toksynotwórczym 55 25 (45,5%) 30 (54,5%) 27 (49,1%) szczepem Dzieci skolonizowane szczepami nietoksynotwórczymi 15 1 (6,7%) 14 (93,3%) 8 (53,3 %) Dzieci bez objawów nieżytu żołądkowo-jelitowego 7 0 7 (100%) nd

Nr 1 Laktoferyna w kale jako wskaźnik zakażenia C. difficile 5 Zakażenie CDI wykrywano najczęściej w grupie wiekowej 6-11 lat (27/53, 51%). U dzieci w wieku 2-5 lat toksynę A/B lub C. difficile wykryto u 28,3% badanych, natomiast u dzieci 12-18 letnich u 20,8% (Tabela II). Tabela II. Występowanie zakażeń C. difficile w zależności od wieku. Wiek (lata) Liczba dzieci z CDI 2-5 15 6-11 27 12-18 11 RAZEM 53 W wyniku retrospektywnej analizy przeprowadzonej na podstawie badań wykonanych w okresie 2013-2014 w SPDSK stwierdzono wzrost liczby CDI. W roku 2013 CDI stwierdzono u 10,8%, a w 2014 u 14,9% u hospitalizowanych dzieci (Tabela III). Tabela III. Odsetek potwierdzonych diagnostycznie pediatrycznych przypadków CDI w latach 2013-2014. Rok Liczba osób badanych w kierunku C. difficile Liczba dodatnich wyników Odsetek dodatnich wyników 2013 415 45 10,8% 2014 443 66 14,9% Razem 858 111 12,9% U 45,5% dzieci z laboratoryjnie potwierdzonym podejrzeniem CDI stwierdzono podwyższony poziom laktoferyny. U 54,5 dzieci z tej grupy nie wykryto tego białka. Częstość występowania laktoferyny w kale była wyższa w próbkach pochodzących od dzieci z CDI niż u dzieci skolonizowanych nietoksynotwórczymi szczepami tych bakterii (1/15) i dzieci zdrowych (0/7) (Tabela I). Nie zaobserwowano różnic w częstości występowania podniesionego poziomu CRP u dzieci z CDI w stosunku do dzieci skolonizowanych nietoksynotwórczymi szczepami C. difficile, odsetki osób z wynikiem dodatnim wynosiły odpowiednio 49% i 53% (Tabela I). U 11 dzieci z CDI nie doszło do wytworzenia żadnego z badanych markerów zapalenia: CRP i laktoferyny. U 12 dzieci stwierdzono zarówno podwyższony poziom laktoferyny jak i CRP. Natomiast u 25 badanych z CDI wskaźniki te nie korelowały (Tabela IV). Tabela IV. Korelacja między podwyższonym stężeniem CRP a obecnością laktoferyny w kale u 48 dzieci z CDI. Laktoferyna (+) CRP Laktoferyna (+) CRP n Laktoferyna (-) CRP Laktoferyna (-) CRP n Liczba 12 11 14 11 Odsetek 25 22,9 29,2 22,9 Laktoferyna (+) chorzy z poziomem laktoferyny w kale 7,25 µg/ml CRP n poziom CRP w granicach wartości normalnych CRP - podwyższone stężenie CRP

6 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 Testy na obecność rotawirusów wykonano u 37 z 55 dzieci z CDI. U jednego z pacjentów stwierdzono jednoczesną koinfekcję rotawirusem a u 3 adenowirusem. U żadnego z badanych chorych nie znaleziono innego bakteryjnego czynnika wywołującego nieżyt żołądkowo-jelitowy. DYSKUSJA Obecność laktoferyny w kale stwierdzono u około 46% dzieci z potwierdzonym laboratoryjnie CDI. U 54% badanych z tej grupy nie wykazano w stolcu markera zapalnego. Prawdopodobnie obraz kliniczny zakażenia różnił się w obrębie tych dwóch grup (zbieranie tych danych klinicznych nie zostało objęte protokołem badania). El Feghaly i wsp. (5), którzy badali u dzieci z CDI obecność w kale takich markerów zapalnych jak: pp38, CXCL-5, Il-8 i laktoferyna, stwierdzili, że czynniki te występują tylko w stolcu pacjentów z objawowym CDI. Nie stwierdzano ich obecności u chorych skolonizowanych bez objawów chorobowych (5). Uzyskany w niniejszej pracy brak odpowiedzi zapalnej u dzieci którym zlecono wykonanie badania w tym kierunku najprawdopodobniej stanowi dowód na kolonizację. Dowiedziono, że przedłużonemu nosicielstwu C. dificile sprzyja długotrwała hospitalizacja i kontakt ze skontaminowanym środowiskiem szpitalnym (9,10). W przypadku prezentowanych badań był to bardzo silny czynnik ryzyka i dotyczył wszystkich badanych pacjentów. Udowodnienie prawdopodobnego braku zależności między obecnością C. difficile lub ich toksyn a podejrzeniem aktywnego zakażenia wymagałoby wykonania analizy na podstawie danych klinicznych dotyczących badanych chorych. Zjawisko wysokiego odsetka kolonizacji i przedłużonego nosicielstwa C. difficle zostało zaobserwowane również przez innych badaczy (6,10). Badania przeprowadzone metodą real-time PCR wykazały, że liczba bakterii, stwierdzona na postawie uzyskanego Ct, jest wyższa u dzieci bezobjawowo skolonizowanych, niż u dzieci z aktywnym zakażeniem. Obserwacja ta sugeruje, że choroba o tej etiologii jest niezależna od obecności bakterii C. difficile, ale od odpowiedzi gospodarza, w tym odpowiedzi zapalnej. W grupie dzieci z objawowym zakażeniem C. difficile obecność markerów zapalnych (pp38, IL-8, CXCL-5) korelowała z wystąpieniem niepowodzenia w leczeniu (przedłużoną biegunką) i dłuższym czasem utrzymywania się objawów (5). W prezentowanym badaniu różnica w częstości występowania laktoferyny u dzieci u których zlecono badanie w kierunku C. difficile a skolonizowanych toksynotwórczymi szczepami C. difficile i dziećmi bez nieżytu żołądkowo-jelitowego była istotna statystycznie. W badaniu Pai i wsp. (11) wykazano, że przebieg CDI u dzieci jest dużo łagodniejszy niż u dorosłych i w związku z tym często nie wymaga leczenia. Dlatego największym problemem w diagnostyce CDI w populacji pediatrycznej wydaje się nie tylko wykrycie zakażenia, ale również wykluczenie kolonizacji. Otwartą kwestią pozostaje wybór najodpowiedniejszego markera zapalnego. W ostatnio opublikowanych badaniach wykazano, że wśród kliku badanych lokalnych markerów obecnych w kale rozwój zakażenia C. difficile korelował z obecnością pp38, niestety jednocześnie stwierdzono bardzo niską czułość tego parametru. Jednocześnie w badaniach tych wykazano, że podniesiony poziom markerów zapalnych istotnie zwiększa prawdopodobieństwo przejścia zakażenia w formę przewlekłą (5).

Nr 1 Laktoferyna w kale jako wskaźnik zakażenia C. difficile 7 Mimo, że kałowe markery stanu zapalnego wydają się mieć większe znaczenie w zakażeniach C. difficile według niektórych autorów w celu potwierdzenia infekcji istotne jest również stwierdzenie obecności ogólnych markerów stanu zapalnego jak: CRP, leukocytów, prokalcytoniny (7). W naszym badaniu nie stwierdziliśmy zależności pomiędzy białkiem stanu zapalnego CRP, a występowaniem CDI. Nie stwierdzono również korelacji między jednoczesnym występowaniem podwyższonego poziomu białka CRP i laktoferyny. Niektórzy autorzy podają sprzeczne informacje na temat korelacji CRP z obecnością laktoferyny w kale. Roszak zaobserwowała wzrost stężenia laktoferyny wraz ze wzrostem stężenia CRP, natomiast Borkowska nie wykazała korelacji między tymi parametrami (1,12). W badaniach przeprowadzonych w USA w latach 2006-2011 roczny wskaźnik zapadalności na CDI wzrósł z 2,6 do 4 na 1000 hospitalizacji. Średnia wieku dzieci z CDI wynosiła 4 lata. Autorzy odnotowali również, w okresie badania, wzrost liczby CDI w grupie wiekowej 5-17 lat (8). Wśród dzieci objętych przedstawianymi badaniami najczęściej stwierdzano zakażenia w grupie wiekowej 6-11 lat. Zarysowała się też tendencja coraz częstszego występowania tych zakażeń u hospitalizowanych dzieci w kolejnych latach. PODSUMOWANIE Uzyskane wyniki sugerują, że należy z ostrożnością interpretować obecność toksyny A/B C. difficile w kale u dzieci, gdyż jej wykrycie może nie stanowić potwierdzenia laboratoryjnego klinicznego podejrzenia choroby. Nie w każdej sytuacji w przypadku obecności C. difficile w jelicie dochodzi do rozwoju procesu zapalnego. Wykazanie w postępowaniu diagnostycznym, że wykryte bakterie jedynie kolonizują jelito grube pozwoliłoby uniknąć niepotrzebnej antybiotykoterapii oraz możliwości postawienia niewłaściwego rozpoznania. U dzieci w każdym wieku ostateczne potwierdzenie CDI stanowi stwierdzenie zmian w badaniu endoskopowym. PIŚMIENNICTWO 1. Borkowska A, Liberek A, Plata-Nazar K i inni. Utility of fecal marker of inflammation in the diagnostics of inflammatory bowel diseases. Med Wieku Rozwoj 2010;14: 37-41. 2. Borkowska A. Laktoferyna w kale jako wykładnik aktywności procesu zapalnego w nieswoistych zapaleniach jelit u dzieci. Praca na stopień doktora nauk medycznych. Akademia Medyczna w Gdańsku, Gdańsk 2008. 3. Darkoh C, Turnwald BP, Koo HL i inni. Colonic immunopathogenesis of Clostridium difficile infections. Clin Vaccine Immunol 2014; 21: 509-17. 4. Dulęba K, Pawłowska M, Wietlicka-Piszcz M. Clostridium difficile infection in children hospitalized due to dirrhea. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014; 33: 201-9. 5. El Feghaly RE, Stauber JL, Tarr PI i inni. Intestinal inflammatory biomarkers and outcome in pediatric Clostridium difficile infections. J Pediatr 2013; 163: 1697-1704. 6. Guerrant RL, Araujo V, Soares E i inni. Measurement of fecal lactoferrin as a marker of fecal leukocytes. J Clin Microbiol 1992; 30: 1238-42. 7. Hryniewicz W, Martirosian G, Ozorowski T. Zakażenia Clostridium difficile Diagnostyka, terapia, leczenie. Narodowy Program Ochrony Antybiotyków. Warszawa 2011. 8. Khanna S, Baddour LM, Huskins WC i inni. The epidemiology of Clostridium difficile infection in children: a population-based study. Clin Infec Dis 2013; 56: 1401-6.

8 S. Dąbrowska, U. Demkow, E. Podsiadły Nr 1 9. Kim J. Editorial commentary: Clostridium difficile in pediatric oncology patients: more questions than answers. Clin Infect Dis 2014; 59:404-405. 10. Na JY, Park JM, Kim YJ i inni. Clinical characteristic of symptomatic Clostridium difficile infection in children: conditions as infection risk and whether probiotics is effective. Pediatr Gastroenterol Hepatol Nut 2014;17:232-8. 11. Pai S, Aliyu SH, Enoch DA i inni. Five years experience of Clostridium difficile infection in children at a UK tertiary hospital: proposed criteria for diagnosis and management. PLOS ONE 2012;7:e51728. 12. Roszak A. Ocena diagnostyczno-prognostyczna wybranych markerów zapalnych, flory bakteryjnej i predyspozycji genetycznych w nieswoistych chorobach zapalnych jelit u dzieci. Praca na stopień doktora nauk medycznych. Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Poznań 2012. 13. Schutze GE, Willoughby RE. Clostridium difficile infection in infants and children. Pediatrics 2013;131:196-200. 14. Wultańska D, Banaszkiewicz A, Radzikowski A i inni. Clostridium difficile infection In Polish pediatric outpatients with inflamatory bowel disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010;29:1265-70. Otrzymano: 30 III 2015 r. Adres Autora: 00-576 Warszawa, ul. Marszałkowska 24, Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Imunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego SPDSK w Warszawie

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 9-14 Ocena wzrostu na podłożu chromid C. difficile Agar klinicznych szczepów Clostridium difficile należących do różnych PCR-rybotypów Evaluation of growth of clinical Clostridium difficile strains belonging to different PCR-ribotypes on chromid C. difficile Agar Paweł Karpiński, Hanna Pituch, Dominika Lachowicz, Michał Piotrowski, Piotr Obuch-Woszczatyński Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Zastosowanie chromogennego podłoża ChromID C. difficile Agar do izolacji klinicznych szczepów Clostridium difficile przyspiesza wykrywanie tego patogenu w próbkach kału chorych z biegunką. Typowe szczepy C. difficile rosną na tym podłożu w postaci ciemnych kolonii. Jednak niektóre warianty mogą rosnąć nietypowo, w postaci jasnych kolonii, co może skutkować nierozpoznaniem tego patogenu. Odsetek polskich szczepów pochodzących z różnych źródeł, które rosły w postaci jasnych kolonii wyniósł ok. 6% i wszystkie należały do PCR-rybotypu 023. Słowa kluczowe: Clostridium difficile, podłoże chromogenne, ChromID C. difficile, PCR-rybotyp 023 ABSTRACT Introduction: Clostridium difficile is main reason of antibiotic-associated diarrhea in hospitalized patients. Diagnostic method for detection of Clostridium difficile infection (CDI) are limited to an enzyme immunoassays (EIAs), while the culture of toxigenic strains is still seen as the gold standard for the laboratory diagnosis. The aim of this study was to compare growth of C. difficile strains belonging to different polymerase chain reaction (PCR) ribotypes on new ChromID C. difficile Agar (CDIFF, biomérieux, Marcy l Etoile, France). Materials and Methods: One hundred thirty one of clinical C. difficile strains stored in Anaerobic Laboratory were cultured on ChromID C. difficile Agar. Ten faecal samples were cultured on the same chromogenic medium and incubated at 37 C for 24 h under anaerobic conditions. Isolates were confirmed as C. difficile on the basis of well-known criteria. PCR-ribotyping was performed by visually comparison of patterns of PCR products of the 16S 23S rrna intergenic spacer region. We examined the occurrence of beta-glucosidase

10 P. Karpiński i inni Nr 1 gene, responsible for the dark color of the colony C. difficile on ChromID C.difficile Agar using a pair of primers: gluf (5 -AAGGT GTAAATTTAGGAGGTTGGTT-3 ) i glur (5 -AGGTCCCAACTATCCC ATCC-3 ). Results: Among ten C. difficile isolates obtained from stool specimens one formed colorless colonies. We received 8 colorless isolates from 131 additional examined strains. All C. difficile isolates forming colorless colonies belonged to PCR ribotype 023. The prevalence of PCR-ribotype 023 was about 6%. We detected lack of beta-glucosidase gene in PCR-ribotype 023 isolates. Conclusions: There are some C. difficile strains forming colorless colonies on ChromID C.difficile Agar. This appearance is important in routine diagnostic use this chromogenic culture medium. Key words: Clostridium difficile, chromogenic culture medium, ChromID C. difficile medium, PCR-ribotype 023 WSTĘP Clostridium difficile to beztlenowa, przetrwalnikująca laseczka, stanowiąca ważny etiologiczny czynnik biegunek szpitalnych (7). W patogenezie biegunki o etiologii C. difficile najważniejszą rolę odgrywają dwie toksyny: toksyna A (TcdA) i toksyna B (TcdB) (4, 5). Niektóre szczepy mogą wytwarzać trzecią toksynę tzw. toksynę binarną. Szczepy C. difficile zarówno toksynotwórcze, jak i nietoksynotwórcze, wytwarzają w dużych ilościach typowe dla C. difficile białko o właściwościach antygenu tj. dehydrogenazę glutaminianową (GDH), którą wykorzystano w testach przesiewowych jako marker zakażenia. Zastosowanie testów immunoenzymatycznych do wykrywania toksyn A/B oraz antygenu C. difficile GDH to powszechnie stosowana metoda rozpoznawania zakażeń C. difficile (10). Wynik ujemny testu immunoenzymatycznego nie zawsze jednak wskazuje na brak zakażenia C. difficile, co w konsekwencji może prowadzić do niewłaściwej diagnozy (2). Metody hodowlane stanowią złoty standard w diagnostyce zakażeń C. difficile i dlatego zostały włączone do schematu postępowania diagnostycznego (3, 8). Wprowadzenie nowoczesnych pożywek selektywnych, jak np. pożywka ChromID C. difficile Agar, znacznie skróciło czas hodowli jak też zwiększyło czułość tej metody (6, 11). W pracy poddano ocenie wzrost klinicznych szczepów C. diffcile należących do różnych PCR-rybotypów na pożywce ChromID C. difficile Agar. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiło 131 klinicznych szczepów C. difficile wyhodowanych z próbek kału chorych z biegunką szpitalną. Szczepy wyhodowano na pożywkach selektywnych, niechromogennych (np. pożywka CLO, biomérieux, Marcy l Etoile, France) stosowanych wcześniej, w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej, przed wprowadzeniem do użytku pożywki ChromID. Szczepy do czasu eksperymentu przechowywano w stanie zamrożenia w temperaturze -70 C z wykorzystaniem systemu Microbank (Pro-Lab Diagnostics).

Nr 1 Wzrost klinicznych szczepów na podłożu chromid C. difficile Agar 11 W badaniach uwzględniono również 10 próbek kału pochodzących od chorych z rozpoznaniem zakażenia C. difficile. W próbkach kału, w ramach rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej, wykryto antygen GDH i toksyny A/B C. difficile stosując test C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE (TechLab, USA). Próbki kału nie były wcześniej posiewane na żadną pożywkę selektywną. Do izolacji szczepów C. difficile z próbek kału zastosowano podłoże chromid C.difficile Agar (biomérieux, Marcy l Etoile, Francja). Hodowlę prowadzono w warunkach beztlenowych w ciągu 24 godz. a wyhodowane szczepy potwierdzano jako C. difficile stosując dodatkowo standardowe metody (1). Typ genetyczny (tzw. PCR-rybotyp) szczepów C. difficile określono stosując metodę PCR-rybotypowanie, opartą na wykrywaniu różnic w profilach amplifikowanych fragmentów DNA w regionie o wysokiej zmienności, położonego między genami kodującymi podjednostki 23SrRNA i 16SrRNA (9). Przeprowadzono również test PCR na obecność genu beta-glukozydazy, enzymu warunkującego reakcję, w wyniku której szczep rośnie na pożywce chromogennej w postaci ciemnych kolonii. W tym celu, zaprojektowano startery do wykrywania genu glu za pomocą programu Primer 3 Plus. Zastosowano startery gluf (5 -AAGGTGTAAATTTAGGAGGTT- GGTT-3 ) i glur (5 -AGGTCCCAACTATCCC ATCC-3 ) i ustalono profil temperaturowy: denaturacja wstępna 5 min 94 C, następnie 35 cykli denaturacja 30s, hybrydyzacja starterów 30 sek, 55 C, elongacja 1min, 72 C oraz elongacja końcowa 5min 72 C. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Spośród 131 szczepów C. difficile posianych na podłoże chromid C. difficile Agar, 123 szczepy rosły w postaci typowych, ciemnych kolonii, natomiast 8 szczepów rosło w postaci jasnych kolonii (Ryc.1-2). Przeprowadzono PCR-rybotypowanie 131 szczepów i określono, że należały one do PCR-rybotypów: 001, 014, 017, 023, 027, 046 i 176. Wszystkie szczepy Ryc. 1 Wzrost szczepów C.difficile o PCR-rybotypie 023 na podłożu chromid C.difficile.

12 P. Karpiński i inni Nr 1 Ryc. 2 Porównanie wzrostu C.difficile na podłożu chromid C.difficile w zależności od PCR-rybotypu. należące do PCR-rybotypu 023 rosły w postaci jasnych kolonii, natomiast pozostałe rosły w postaci ciemnych kolonii. Z każdej z 10 próbek kału wyhodowano szczep C. difficile (n=10). Dziewięć szczepów wyrosło w postaci ciemnych kolonii a jeden szczep rósł nietypowo, dając jasne kolonie. Za pomocą metody PCR-rybotypowanie ten szczep przypisano do PCR-rybotypu 023. Szczepy należące do PCR-rybotypu 023 są toksynotwórcze i wytwarzają toksynę A i B oraz posiadają geny toksyny binarnej. Badania populacji polskich szczepów szpitalnych potwierdziły obserwacje innych autorów, że szczepy należące do PCR-rybotypu 023, mogą rosnąć w postaci jasnych koloni (7). Natomiast nie potwierdzono w naszej pracy, obserwacji tychże autorów, że bezbarwne kolonie tworzą też izolaty należące do PCR-rybotypu 001. Żaden z polskich szczepów należących do PCR-rybotypu 001 nie rósł w postaci jasnych kolonii i charakteryzowały się one typowym, ciemnym wzrostem na podłożu chromogennym. Odsetek szczepów izolowanych w Polsce należących do PCR-rybotypu 023 o jasnej barwie kolonii wyniósł 5,7%. Odsetek szczepów należących do PCR-rybotypu 023 w pracy Perry i wsp. był ponad 8-krotnie niższy (7). Szczepy PCR-rybotypu 023 zbadano również pod względem występowania genu kodującego beta-glukozydazę, enzymu odpowiedzialnego między innymi za charakterystyczny kolor kolonii na podłożu ChromID C. difficile Agar. Zaobserwowano brak genu beta-glukozydazy w szczepach należących do PCR-rybotypu 023, które rosły w postaci jasnych kolonii. Jako szczepów kontrolnych użyto izolatów rosnących typowo na podłożu chromogennym, należących między innymi do PCR-rybotypów: 017, 027 oraz 176. W szczepach tych wykryto fragment genu beta-glukozydazy o długości 1114 par zasad (Ryc.3).

Nr 1 Wzrost klinicznych szczepów na podłożu chromid C. difficile Agar 13 Ryc.3 Porównanie występowania genu beta-glukozydazy u szczepów o PCR-rybotypie 023 z innymi PCR-rybotypami. (1 GENERULER 100BP DNA LADDER PLUS, READY-TO- -USE, 2-4 PCR-rybotyp 023, 5 PCR-rybotyp 039, 6 PCR-rybotyp 017, 7 PCR-rybotyp 176, 8 PCR-rybotyp 027) PODSUMOWANIE Zastosowanie pożywki Chrom ID C. difficile Agar do izolacji szczepów C. difficile z próbek kału biegunkowego znacznie skraca czas hodowli szczepów. Jest to związane między innymi z krótszym okresem hodowli (24 godziny), w porównaniu do innych pożywek selektywnych (48 godzin), jak też możliwością przyspieszenia wstępnej identyfikacji szczepu ze względu na charakterystyczny wzrost. Należy jednak brać pod uwagę możliwość wystąpienia w Polsce szczepów C. difficile, które rosną na tym podłożu nietypowo, w postaci jasnych kolonii. Występowanie takich szczepów szacuje się na poziomie około 6%. Szczepy te mogą być pomijane w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej ze względu na ich nietypowy wzrost. W związku z tym zaleca się bardzo wnikliwą ocenę wzrostu na pożywce ChromID Agar wyhodowanych szczepów z próbek kału pacjentów z podejrzeniem biegunki poantybiotykowej, w szczególności jeśli obserwuje się mieszaną hodowlę (jasnych i ciemnych kolonii) lub obserwuje się,,monokulturę w postaci jasnych kolonii na ciemnym podłożu. Uważna obserwacja z zastosowaniem lupy umożliwia wykrycie tych szczepów ze względu na charakterystyczny kształt kolonii szczepów C. difficile mimo ich nietypowego koloru. Praca została sfinansowana z grantu NCN nr DEC-2011/01/B/NZ7/02720.

14 P. Karpiński i inni Nr 1 PIŚMIENNICTWO 1. Carman RJ, Wickham KN, Chen L i inni. Glutamate dehydrogenase is highly conserved among Clostridium difficile ribotypes. J Clin Microbiol 2012; 50: 1425-6. 2. Eastwood K, Else P, Charlett A i inni. Comparison of nine commercially available Clostridium difficile toxin detection assays, a real-time PCR assay for C. difficile tcdb, and a glutamate dehydrogenase detection assay to cytotoxin testing and cytotoxigenic culture methods. J Clin Microbiol 2009; 47: 3211 7. 3. Kądzielska J, Pituch H, Banaszkiewicz A i inni Ocena przydatności podłoża chromogennego do izolacji Clostridium difficile z przewodu pokarmowego dzieci z biegunką. Med Dośw Mikrobiol 2012; 64: 197-201. 4. Kuehne SA, Cartman ST, Minton NP. Both, toxin A and toxin B, are important in Clostridium difficile infection. Gut Microbes 2011; 2: 252-5. 5. Obuch-Woszczatynski P, Lachowicz D, Schneider A. Occurrence of Clostridium difficile PCR-ribotype 027 and it s closely related PCR-ribotype 176 in hospitals in Poland in 2008-2010. Anaerobe 2014; 28: 13-7. 6. Perry JD, Asir K, Halimi D i inni. Evaluation of a chromogenic culture medium for isolation of Clostridium difficile within 24 hours. J Clin Microbiol 2010; 48: 3852 8. 7. Rupnik M, Wilcox MH, Gerding DN. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol 2009; 7: 526-36. 8. Shin BM, Kuak EY, Lee E J i inni. Algorithm combining toxin immunoassay and stool culture for diagnosis of Clostridium difficile infection. J Clin Microbiol 2009; 47: 2952 6. 9. Stubbs SL, Brazier JS, O Neill GL i inni. PCR targeted to the 16S-23S rrna gene intergenic spacer region of Clostridium difficile and construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes. J Clin Microbiol 1999; 37: 461 3. 10. Swindells J, Brenwald N, Reading N. Evaluation of diagnostic tests for Clostridium difficile infection. J Clin Microbiol 2010; 48: 606-08. 11. Yang J, Nam Y, Kim M. Evaluation of a Chromogenic Culture Medium for the Detection of Clostridium difficile. Yonsei Med J 2014; 55: 994-8. Otrzymano: 10 III 2015 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 15-22 Zastosowanie mikromacierzy Salmonella Check&Trace do oznaczania typu serologicznego pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica w ramach międzynarodowych sprawdzianów kompetencji (EQAS) Results of Salmonella enterica subsp. enterica serotype identification by Salmonella Check&Trace microarray in international External Quality Assurance Systems Grzegorz Madajczak, Jolanta Szych, Monika Wasiak National Institute of Public Health National Institute of Hygiene, Department of Bacteriology, Warsaw, Poland W ramach międzynarodowych sprawdzianów kompetencji, w zakresie oznaczania typu serologicznego pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica, zastosowano obok klasycznej metody serotypowania, oznaczanie serotypu przy użyciu mikromacierzy Salmonella Check&Trace (CheckPoints, Holandia). Spośród 80 badanych szczepów 66% zostało zidentyfikowanych poprawnie, dla 4% uzyskano niepełne wyniki, a dla 29% uzyskano wynik Salmonella, genovar. Jeden z badanych szczepów został rozpoznany nieprawidłowo. Słowa kluczowe: Salmonella, typowanie serologiczne, mikromacierz ABSTRACT Introduction: Traditionally Salmonella enterica subsp. enterica serotypes are identified by slide agglutination with specific antisera for somatic, flagellar and sometimes capsular antigens. An alternative way is genoserotyping using for example a microarray, eg. commercially available test Check&Trace Salmonella. The goal of this study was to evaluate the Check&Trace Salmonella microarray for Salmonella enterica subsp. enterica serotype identification, using Salmonella strains provided by reference laboratories during External Quality Assurance Systems organized for national reference laboratories by ECDC and WHO GFN. Material and Methods: 80 Salmonella enterica subsp. enterica have been tested using Check & Trace Salmonella (Check-Points BC, Netherlands). Also classical slide agglutination was performed according to EN ISO 6579:2003/A1:2007 norm, used as reference method.

16 G. Madajczak, J. Szych, M. Wasiak Nr 1 Results: In the group of 80 tested strains, 66% were identified correctly, 4% gave uncertain results and 29% showed Salmonella, genovar without a serotype, of which 69% were not included in the CTS list of serotypes. Finally one strain has been recognized incorrectly. Discussion: Because of IVD certification lack, the CTS test could not be recommended to clinical laboratories. AOAC-RI and OIE certification for test cause, that CTS could be used in most food, environmental and veterinary laboratories with the condition, that all unrecognized strains should be sent to a reference laboratory, to type according to EN ISO 6579:2003/A1:2007 norm, by KWM serotyping or other equal alternative methods. Keywords: Salmonella, serotyping, microarray INTRODUCTION Salmonella is one of most important bacterial zoonotic pathogen, isolated from animals, food, feed and also some environmental samples. Most of more than 1500 Salmonella enterica subsp. enterica serotypes could be virulent for humans, but not all are isolated from clinical samples with the same frequency and not all present the same virulence for humans. For those and other, for example epidemiological, reasons serological typing is an essential element of Salmonella identification. Traditionally, according to procedure initially developed by Kauffmann and White, serological classification of Salmonella species is based on diversity of somatic O, flagellar H and capsular Vi antigens (7). Most common way to determine the antigenic formulae of Salmonella isolates is slide agglutination with H- and O-specific antisera (11, 14). This method has multiple limitations, like untypable strains because of rough- or monophasic phenotype, capsule presence and different quality of antisera. For those reasons many different molecular biology techniques were described, which aim was to substitute or improve traditional technique. Many different molecular biology techniques to Salmonella antigenic pattern identification were described. Most of them are only applicable for a selected or limited group of bacteria, for example strains with the same of flagellar antigenic complex, like H:1, in the Echeita et al. paper or a broader group of antigens (4, 5). Also wide-range serovars tests were described, like microarray for Salmonella genoserotyping developed by Franklin et al. and Braun et al. (2, 6). The commercial and simplified version of such tests is Check&Trace Salmonella (CTS) former Premi Test Salmonella, produced by Check-Point (http:// www.check-points.com). The main principle of this method is the confirmation of the Salmonella species, and the identification of subspecies by analysing the presence of 3 general DNA markers and 28 highly specific DNA markers of the Salmonella genome. Presence of these markers is detected in multiplex ligation detection reaction (LDR) and the resulting pattern of markers is converted to an unique identifier, which could be characteristic for one or more serotypes (8). CTS currently identify 102 Salmonella serotypes, covering most of the serotypes observed in Europe, North America and Latin America. According to data of Salmonella serotypes occurrence frequency in 2012 y, published on the web page of Country Databank provided by World Health Organization Global Foodborne Infections Network (WHO GFN), 52 of most common Salmonella serotypes were notified in Europe