(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 169932 (13) B1

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 169932 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 310796 (22) Data zgłoszenia 25.08.1992 (51) IntCl6 A61K 39/12 C 12N 7/08 (54) Sposób atenuacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń (30) Pierwszeństwo: 05.08.1992,US,07/921891 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: 295727 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.05.1993 BUP 10/93 (73) Uprawniony z patentu: Boehringer Igelheim Animal Health, Inc., St Joseph, US (72) Twórcy wynalazku: Danny W. Chladek, St.Joseph, US David E. Gorcyca, St. Joseph, US Louis L Harris, St. Joseph, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.1996 WUP 09/96 (74) Pełnomocnik: PATPOL Spółka z o.o. (57) 1. Sposób atenuacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń ATCC-VR2332, znamienny tym, że stosuje się pasażowanie wirusa przez całą albo częściową linię komórek małpich w temperaturze około 35-37 C i następnie pasażowanie otrzymanego wirusa przez całą linię komórek małpich w temperaturze około 31 C. PL 169932 B1

Sposób atenuacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób atenuacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń ATCC-VR2332, znamienny tym, że stosuje się pasażowanie wirusa przez całą albo częściową linię komórek małpich w temperaturze około 35-37 C i następnie pasażowanie otrzymanego wirusa przez całą linię komórek małpich w temperaturze około 31 C. 2. Sposób według zastrz. 1, w którym linią komórek nerek małpich jest MA-104. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że prowadzi się pasażowanie czynnika wirusowego w medium hodowlanym, w obecności surowicy. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wartość ph medium hodowlanego wynosi około 7,6. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik wirusowy pasażuje się około 25 razy w temperaturze około 35-37 C i 12 razy w temperaturze około 31 C. 6. Sposób według zastrz. 2, w którym pasaże przeprowadza się bez CO2. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób atenuacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń do wytwarzania szczepionki. Wyraźnie nowa choroba świń, powodująca ciężkie straty w stadach hodowlanych, pojawiała się ostatnio w Stanach Zjednoczonych i w niektórych regionach Kanady. Keffaber K.K., "Reproduktive Failure of Unknown Etiology" (Niepowodzenia hodowlane o nieznanej etiologii) American Association of Swine Praktitionere Newsletter, 1:109 (1989). Podobna choroba została opisana także w niektórych regionach Niemiec, w Holandii oraz w Zjednoczonym Królestwie i Hiszpanii Wensvoort C., i in., "Blue Ear Disease of Pigs" (Choroba niebieskich uszu świń) Vet. Rec.,128:574 (1991). Najważniejszym objawem klinicznym choroby jest rodzenie się nieżywych lub chorych prosiąt, przy czym niektóre prosięta wyglądają jak zdrowe ale następnie żywią się słabo albo rozwijają się w nich zaburzenia w oddychaniu, objawy ze strony ośrodkowego układu nerwowego i zdychają. W niektórych stadach dotkniętych chorobą, straty sięgają 75% wszystkich prosiąt. Następstwa ekonomiczne choroby są więc rujnujące. Nazwano ją "tajemniczą chorobą świń", zespołem niepłodności i oddechowych świń (SIRS), "chorobą niebieskich uszu" i zespołem reprodukcji i oddechowych świń. SIRS jest najwyraźniej chorobą zakaźną, którą charakteryzuje niepowodzenie reprodukcji, zaburzenia oddechowe i zmienne objawy kliniczne takie jak brak łaknienia, gorączka, duszność i lekkie objawy neurologiczne. Choroba atakuje wszystkie rodzaje zakładów produkcji świń i jest być może najkosztowniejszą z chorób obecnie zagrażających przemysłowi produkcji świń. Poison D.P. i in, "Financial Implications of Mystery Swine Disease" (Finansowe następstwa tajemniczej choroby świń) Proceedings, Libestock Conservation Institute, Denver, CO (October 6,1990). Zakażenie macior może przebiegać niezauważone, albo się przejawiać gorszą ogólną kondycją przez jeden lub kilka dni. Na przykład maciory mogą nie jeść i wykazują temperaturę ciała powyżej lub poniżej prawidłowej. W okresie rodzenia objawy choroby obejmują depresję, śpiączkę, gorączkę, czasem wymioty, poronienia, rodzenie martwych i/lub zmumifikowanych płodów. Najczęstszym objawem klinicznym jest dramatyczny wzrost liczby martwo urodzonych prosiąt. Liczba martwych urodzeń może sięgać 25 do 30 procent wszystkich urodzeń w zakażonym stadzie. Wiele z płodów martwo urodzonych jest zmacerowanych, wskazując, że były nieżywe od 24 do 48 godzin.

169 932 3 Jak powiedziano wyżej, głównym składnikiem SIRS jest załamanie się reprodukcji, które przejawia się jako przedwczesne urodzenia, późne poronienia, rodzenie się słabych prosiąt, wzrost liczby martwo urodzonych, zmumifikowane płody, mniejsza liczebność porodów i opóźniony powrót do cyklu rujowego. Te objawy kliniczne obserwuje się w stadzie typowo przez 4 do 16 tygodni, lub nawet dłużej. Martwo urodzone płody w zakażonym miocie często są we wczesnych stadiach mumifikacji, co widać brunatno-brązowym przebarwieniu skóry i autolizie pośmiertnej. Czasem obserwuje się kopulaste zniekształcenia czaszki płodów. Kliniczne objawy choroby oddechowej są wyrażone najbardziej u prosiąt poniżej 3 tygodnia życia, ale w zakażonych stadach opisano je u prosiąt w każdym wieku. Chore prosięta rosną wolno, mają szorstką szczelinę, trudności oddechowe ("ciężki oddech") i wykazują wyższą śmiertelność (do około 80 procent śmiertelności przed odstawieniem od ssania). Wyniki wstępnych badań zmian makro- i mikroskopowych u świń chorych na SIRS sugerują, że zmiany mikroskopowe w płucach są ważnym objawem klinicznym tej choroby. Mimo wyraźnych objawów oddechowych, płuca bez powikłania następowym zakażeniem bakteryjnym są albo makroskopowo prawidłowe albo wykazują delikatne, rozproszone przebarwienia brunatno-szarej powierzchni. Jednak badanie mikroskopowo tkanki płucnej prosiąt chorych na SIRS wykazuje charakterystyczny obraz zapalenia śródmiąższowego. Colins J.H. i in., "Respiratory Disease in a Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure Syndrome" (Choroba oddechowa w stadzie świń dotkniętym zespołem niepowodzenia reprodukcji) Proceedings, Minnesota Swine Conference for Veterinarians, str. 254, St. Paul, MN (September 10-18, 1990). SIRS albo "tajemnicza choroba świń" występuje szeroko w Stanach Zjednoczonych, doniesiono o niej z co najmniej 11 stanów. Jak doniesiono w literaturze, wśród badanych pierwotnych czynników przyczynowych są wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (encephalomyccarditis - ENC), wirus grupy świń (SIV), mykotoksyny i chlamydie. Przedmiotem wynalazku jest sposób atenuacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń do wytwarzania szczepionki. Wynalazek obejmuje w szczególności następujące przedmioty: sposób atenuacji wirusa SIRS ATCC-VR2332 polegający na pasażowaniu wirusa przez całą albo częściową linię komórek małpich w temperaturze około 35-37 C i następnie pasażowaniu otrzymanego wirusa przez całą linię komórek małpich w temperaturze około 31C ; sposób atenuacji jak opisano wyżej polegający na pasażowaniu przez linię komórek małpich w otrzymanym medium hodowlanym w obecności surowicy przy ph wynoszącym około 7,6; sposób atenuacji jak opisano wyżej polegający napasażowaniu w temperaturze około 34-37 C dwudziestopięciokrotnie i pasażowaniu w temperaturze około 31 C dwunastokrotnie; sposób atenuacji jak opisano wyżej polegający na tym, że stosuje się linię komórek nerek małpich MA-104; sposób atenuacji jak opisano wyżej polegający na pasażowaniu bez CO2. Homogenat tkankowy, otrzymany z prosiąt w stadach zakażonych SIRS podany donosowo gnotobiotycznym prosiętom i ciężarnym maciorom, stale odtwarzał oddechowe i reprodukcyjne postacie SIRS. Prosięta gnotobiotyczne, którym w ten sposób podano inokulum niesączone lub sączone (0,45,0,22 lub 0,1 μm) traciły łaknienie i rozwijały się u nich mikroskopowe zmiany w płucach podobne do obserwowanych w stadach zakażonych SIRS. To samo inokulum wywoływało także reprodukcyjne identyczne z tymi, które są obserwowane w stadach zakażonych SIRS. To samo inokulum wywoływało także efekty reprodukcyjne identyczne z tymi, które są obserwowane w stadach zakażonych SIRS. Z homogenatu tkankowego uzyskano czynnik wirusowy. Ten czynnik wirusowy powoduje chorobę, która naśladuje SIRS u prosiąt i ciężarnych macior. Czynnik wirusowy zdeponowano 18 lipca 1991 r w American Type Culture collection (Amerykańska Kolekcja Szczepów i Hodowli), Rockville, Maryland pod numerem ATCC-VR2332. Ten czynnik wirusowy jest wymagającym, niehemaglutynuącym wirusem RNA, posiadającym otoczkę. Przykład I. Izolacja Tkanka płuc oraz połączone tkanki mózgu-śledziony-wątroby-nerki, otrzymane z zakażonego prosięcia w stadzie zakażonym SIRS homogenizowano oddzielnie. Poszczególne homogenaty zmieszano z modyfikowanym podłożem Eagle (MEM) zawierającym około 100 μg/ml genetyczny. Obie próby wirowano przez około 25 minut przy około 4000 μg. Nadsącz zebrano

4 169 932 i sączono przez filtr 0,45 μm (wielkość oczek). Homogenaty płuc i tkanek połączono i połączony materiał użyto do zakażenia różnych hodowli tkanek w butelkach. Przeprowadzono dwa doświadczenia, używając butelek plastikowych 75 cm2. W doświadczeniu 1 połączony materiał zaszczepiono do dwu butelek zawierających pełną warstwę komórek jednej z podanych niżej linii komórkowych. Ponadto do jednej butelki z każdą z linii komórkowych dodano około 2,5 mg trypsyny. Wszystkie pozostałe warunki były takie same dla każdej butelki z hodowlą linii komórkowej. Podłoże hodowlane nie zawierało surowicy. Inokulum wynosiło około 1 ml. Wszystkie butelki inkubowano przez około 7 dni w temperaturze w przybliżeniu 34 C. Wyniki odczytywano pod koniec okresu około 7 dni. Po zamrożeniu i odmrożeniu pobierano próbkę do drugiego pasażu na tej samej linii komórek. Pozostały materiał zamrażano i przechowywano w około -60 C. W doświadczeniu 2 połączonym materiałem zaszczepiono butelki z tymi samymi liniami komórek jak w doświadczeniu 1. Jednak w momencie zaszczepienia warstwy komórek były pełne tylko w 20-40%. Podłoża hodowlane zawierały około 10% płodowej surowicy cielęcej. Inokulum wynosiło znów 1 ml, a hodowle inkubowano przez około 7 dni w temperaturze około 34 C. Wyniki doświadczeń 1 i 2 są podsumowane niżej: Użyta linia komórkowa Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Małżowina bydlęca (BT) Nerka kota (CRFK) Nerka małpy (Vero) Płuco małpy (Vero) Nerka psa (MDCK) Nerka świń (PK2a) Płuco norki Płuco fretki Płuco bydlęce Płuco byka Nerka bydlęca (MDDK) Jądro świni (ST) Nerka małpy (MA-104) - + Guz odbytu człowieka (HRT-18) - NT Płuco człowieka NT + = CPE (efekt cytopatyczny) = brak CPE NT = nie badano Nie obserwowano efektu cytopatycznego w doświadczeniu 1 w żadnej z ocenianych linii komórkowych. W doświadczeniu 2 natomiast małe skupienia komórek M A-104 zaczęły pęcznieć i tworzyć "dziury" w jednolitej warstwie komórek przy krawędziach butelki. Płyn pobrano z butelki i przeniesiono do nowej butelki z komórkami MA-104 (znów 20-40% jednolitej warstwy komórek), a następnie posażowano po raz trzeci. Efekt cytopatyczny (CPE) nasilał się z każdym pasażem. Opisane postępowanie powtórzono z linią komórek MA-104, używając pełnej warstwy komórek. Efekt cytopatyczny obserwowano również. Dalsze badanie wykazało, że czynnik wirusowy namnaża się także w temperaturze około 37 C. Obecność surowicy może być pomocna w początkowej izolacji czynnika wirusowego. W dalszych pasażach czynnika wirusowego na komórkach linii MA-104 CPE występuje bez obecności surowicy. Jednak bardziej nasilony CPE obserwuje się przy użyciu surowicy w podłożu wzrostowym dla komórek linii M A-104. Stwierdzono również, że czynnik wirusowy jest częściowo oporny na ogrzewanie w około 56 C przez około 50 minut. W wyniku takiego traktowania ciepłem miano wirusa spadło o około 3 logarytmy. Czynnik wirusowy pasażowano ośmiokrotnie z dobrym efektem cytopatycznym,

169 932 5 rozwijającym się w ciągu 3 dni w pasażu piątym i następnym. Otrzymane miano wynosiło w przybliżeniu 5 1/2 log (105,5). Czynnik wirusowy namnaża się także na innych małpich liniach komórkowych. Jest zatem sprawą indywidualnego doświadczenia w tej dziedzinie aby namnażać wirus SIRS ATCC-2332, lub jego mutanty na innych liniach komórkowych przy pomocy modyfikacji warunków wzrostu, podłoży wzrostowych itd. Przykład II. Badanie in vivo Zbiór z trzeciego pasażu użyto do zaszczepienia dwu trzydniowych prosiąt gnotobiotycznych. Obu podano donosowo odpowiednio 1 i 2 ml. Prosięta obserwowano 7 dni, następnie zabito. Pobrano próbki tkanek do histopatologii i do izolacji czynnika wirusowego. Badanie histopatologiczne potwierdziło, że zmiany w płucach zakażonych prosiąt były identyczne ze zmianami w płucach prosiąt z SIRS. Próbki tkanek opracowano jak poprzednio, następnie podano do hodowli 20-40% i 100% warstwy komórek linii MA-104 z płodową surowicą bydlęcą. Czynnik wirusowy ponownie izolowano. Zbiór z trzeciego pasażu użyto także do zaszczepienia macior, celem weryfikacji że efekty reprodukcyjne choroby można odtworzyć i potwierdzić. Dwie maciory rodzące po kilka młodych zaszczepiono donosowo około 93 dnia ciąży. Odpowiednio 112 i 114 dnia ciąży maciory wydały mioty, w których było 50 procent martwo urodzonych (8/13 i 6/14 martwych/żywych). Siedem z martwo urodzonych prosiąt było częściowo zmumifikowanych, a żywe prosięta były słabe i nie ssały prawidłowo. Z tkanek martwo urodzonych prosiąt izolowano czynnik wirusowy. Czynnik wirusowy izolowano w trzech stadach, w których znane było SIRS. W tych samych stadach stwierdzono miana przeciwciał dla czynnika ATCC-V2332. Chociaż występują pewne różnice w klinicznych objawach, to jest sinica skóry uszu, ogona i wymienia u krów europejskich, przeważa pogląd, że chorobę północnoamerykańską i europejską wywołuje ten sam wirus. C. Charakterystyka wirusa ATCC-VR2332 stale wywoływał objawy kliniczne i zmiany w płucach u gnotobiotycznych świń i dawał ujemne wyniki immunofluorescencji (ImF), wskazujące, że wirus nie posiada antygenu grupowego, antygenowego podobnego do wirusów aktualnie znanych rodzajów togawirusów (Togaviridae). Zatem wirus ATCC-VR2332 może reprezentować niezidentyfikowany rodzaj togawirusów (Togaviridae). Wirus ATCC-VR2332 nie jest także znanym patogenem świń, ponieważ swoiste antysurowice przeciw znanym wirusowym patogenom świń nie neutralizowany wirusa ani nie wykrywały antygenów w zakażonych komórkach. ATCC-VR2332 jest to wymagający, nie hemaglutynujący wirus RNA posiadający otoczkę. Namnaża się linii ciągłej komórek, w szczególności MA-104 i innych małpich liniach komórkowych. Wirus ATCC-VR2332 namnaża się do wysokich mian (107TCID50/ml) w handlowej linii komórek M A-104. Wirus ATCC-VR2332 posiada otoczkę lipidową, na co wskazuje utrata zakaźności po traktowaniu chloroformem. Otoczkę lipidową można także uwidocznić jako elektronowo przejrzysty pierścień otaczający puste cząstki. Morfologia wirusa SIRS nie jest wyraźna w bezpośredniej mikroskopii elektronowej (DEM) i jest niezwykle trudna do identyfikacji w preparatach zawierających resztki komórkowe. Wiriony ATCC-VR2332 można zidentyfikować po oczyszczeniu w gradientach CsCli następnie wyznakowaniu wirionów konjugatem złota i hyperimmunizowanej surowicy anty ATCC-VR2332. Gęstość pływakowa wirionów ATCC-VR2332 w gradientach CsCl wynosi 1,18-1,19 g/ml. Gradienty sacharozy stale powodowały straty miana wirusa i zostały zaniechane jako gradienty do oczyszczania. Morfologia oczyszczonych w gradiencie cząstek ATCC-VR2332 oraz przeciętna średnica 62 nm są bardzo podobne do wirionów wirusów zapalenia tętnic koni i dehydrogenazy mlekowej. Wirus zapalenia tętnic koni ma opisaną wielkość 50-73 nm, podobną do wielkości 48-84 nm wirusa ATCC-VR2332. W niektórych cząstkach ATCC-VR2332 obserwowano rdzenie 30-35 nm, które przypominają nukleokapsydowe rdzenie opisane u wirusa zapalenia tętnic koni. Tak więc morfologicznie ATCC-VR2332 najbardziej przypomina grupę wirusów zapalenia tętnic. Obecność genomu RNA ATCC-VR2332 została potwierdzona przez zdolność wirusa do kontynuowania replikacji w obecności 5-bromo-2-dezoksyurydyny i mitomycyny C, które są

6 169 932 znane jako inhibitory replikacji DNA i jednej rodziny wirusów RNA (retrowirusów - Retroviridae) ale nie innych wirusów RNA. Jednak tymczasowa klasyfikacja ATCC-VR2332 jako wirusa RNA jest zgodna z obserwacją, że wirus ten replikuje się w cytoplazmie komórki, na co wskazuje obecność antygenów wirusa wykrywany ImF, Również aktynomycyna D, która interferuje z transkrypcją RNA zależną od DNA, nie wpływa na replikację wirusa ATCC-VR2332. Wyniki badań wskazują, że wirus ATCC-VR2332 nie wymaga funkcji jądra dla swojej replikacji. Wirus ATCC-VR2332 jest termolabilny w 37 C i 56 C, ale jest trwały przez długi czas w 4 C i -70 C. Termolabilność w 37 C może sugerować, że wirus jest stosunkowo nietrwały w ciepłych warunkach otoczenia. Ma to również praktyczne zastosowanie dla namnażania wirusa, sugerując że wzrost w temperaturach niższych niż 37 C będzie dawał wyższą wydajność wirusa ATCC-VR2332. Chłodzenie powinno wystarczać dla przechowania próbek diagnostycznych do izolacji wirusa przez krótki czas, w innym przypadku próbkę należy przechowywać w stanie zamrożenia. Podsumowując, wielkość, morfologia, obecność genomu RNA oraz inne cechy biologiczne prowizorycznie lokują wirus ATCC-VR2332 w rodzinie togawirusów (Togaviridae). Jednak ATCC-VR2332 nie może definitywnie umieszczony w jednym ze znanych rodzajów tej rodziny. Aczkolwiek morfologicznie wirus ATCC-VR2332 bardzo przypomina arteriwirusy, nie należy go umieszczać w określonym rodzaju dopóki nie będą dostępne dodatkowe dane co do struktury RNA i białka. Przykład IV. Zmodyfikowany preparat żywej szczepionki. Skonstruowano preparat szczepionkowy, zawierający zmodyfikowany lub atenuowany żywy ATCC-VR2332, który skutecznie uodpornił świnie na zakażenia. Wirus SIRS ATCC- VR2332 namnażano w linii ciągłej komórek MA-104. Linię komórek hodowano w butelkach zawierających MEX z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej, ph podłoża nastawiono na 7,2 i inkubowano w około 37 C. Komórki zaszczepiono wirusem dodając około 1 ml mrożonego inokulum do płynu hodowlanego. Wirus absorbowano do komórek przez 24 godziny. Po tym czasie płyn wzrostowy zmieniono na podłoże utrzymujące, złożone z MEM z dodatkiem 4% płodowej surowicy cielęcej, ph 7,6. Temperatura otoczenia wynosiła 35-37 C. Wzrost wirusa utrzymywano aż do destrukcji 50% warstwy komórek MA-104. Następnie próbkę zamrożono i przygotowano do pasażu w innej butelce z komórkami MA-104. Tę procedurę kontynuowano przez 25 pasaży wirusa w linii komórkowej. Następnie wirus namnażano jeszcze 12 razy w około 31 C, w odróżnieniu od 35-37 C, stosując technikę taką samą jak opisano wyżej. Pasaż 12 zamrożono w małych porcjach i oznaczono jako wzorcowy wirus nasienny. Przygotowanie atenuowanego ATCC-VR2332 I. Podłoża i płyny: a. Podłoże minimalne Eagle'a (MEM), JHR Biosciences, 200-2041 b. Płodowa surowica cielęca, JHR Biosciences c. Podłoże wzrostowe do hodowli komórek - NEM + 10% płodowa surowica cielęca. d. Podłoże utrzymujące - MEM + 4% płodowa surowica cielęca e. Trypsyna - Wersene IX f. Dwuwęglan sodu 5% lub nasycony II. Hodowla tkanek: Zastosowana linia komórkowa: MA-104 (komórek nerki zielonej małpy afrykańskiej, na poziomie 20 pasaży (pasaż 58-78) III. Wyposażenie butelki 75 cm do hodowli tkanek zestaw do inkubacji w 35-37 C zestaw do inkubacji 31 C wirówka IV. Metoda użyta do atenuacji wirusa SIRS VR-2332 namnażanego w 35-37 C A. Przygotowanie wyjściowej hodowli tkanek I. 5- do 7-dniowe hodowle MA-104 w butelkach 75 cm2 rozsiewa się 1:4 w następujący sposób: a) wylać wszystkie podłoża (50 ml na butelkę) b) odkleić warstwę komórek przy użyciu 10 ml trypsyny-wersene i inkubacji w 37 C przez 5-10 minut

169 932 7 c) usunąć komórki z butelki i wirować 5-10 minut przy 270 x g d) odlać nadsącz i zawiesić komórki w 5-10 ml podłoża wzrostowego (MEM+10% FCS), e) umieścić wszystkie komórki w 200 ml MEM 10% FCS, który następnie rozlać do czterech butelek 75 cm, po 50 ml na butelkę, uzyskując rozsiew 1:4. Butelki następnie trzymać w 35-37 C stosownie do potrzeby (można wykonać także bez CO2), f) 3- lub 4-dniowe butelki, w których wytworzyła się pełna warstwa komórek, są teraz gotowe do użycia, g) w 50 ml podłoża w butelce nastawić ph na 7,2 i następnie dodać do podłoża 1 ml wirusa SIRS, umieścić butelkę w 35-37 C (można wykonać także bez CO2), h) po 24 godzinach podłoża odlać i do butelki dodać 50 ml MEM 4% FCS ph 7,6, inkubować dalej w 35-37 C, i) 24 godziny po tej zmianie płynu powinien pojawić się efekt cytopatyczny (CPE) i gdy warstwa komórek wykazuje 50-60% ognisk (dziur), zamrozić, j) odmrozić butelkę i pobrać 1 ml płynu, przenieść do nowej butelki 75 cm jak opisano wyżej, wykonując w ten sposób następny pasaż wirusa SIRS VR2332, Powyższą procedurę powtórzono 25 razy, zatem SIRS VR2332 pasażowano 25 razy, namnażając w 35-37 C. V. Metoda użyta do atenuacji wirusa SIRS VR2332 namnażanego w 31 C (ważne jest zaznaczyć, że wirus SIRS VR2332 pasażowany 25 razy w 35-37 C użyto do wykonania pasażu 1 wirusa SIRS VR2332 namnażanego w 31 C). A. Przygotowanie wyjściowej hodowli tkanek I. 5- do 7-dniowe hodowle MA-104 w butelkach 75 cm2 rozsiewa się 1:4 w następujący sposób: a) wylać wszystkie podłoża (50 ml na butelkę), b) odkleić warstwę komórek przy użyciu 10 ml trypsyny-wersene i inkubacji w 37 C przez 5-10 minut, c) usunąć komórki z butelki i wirować 5-10 minut przy 270 x g, d) odlać nadsącz i zawiesić komórki w 5-10 ml podłoża wzrostowego (MEM + 10% FCS) e) umieścić wszystkie komórki w 200 ml MEM 10% FCS, który następnie rozlać do czterech butelek 75 cm, po 50 ml na butelkę, uzyskując rozsiew 1:4. Butelki następnie trzymać w 35-37 C stosownie do potrzeby (można wykonać także bez CO2), f) 3- lub 4-dniowe butelki, w których wytworzyła się pełna warstwa komórek, są teraz gotowe do użycia, g) w 50 ml podłoża w butelce nastawić ph na 7,2 i następnie dodać do podłoża 1 ml wirusa SIRS, umieścić butelkę w 31 C (można wykonać także bez CO2), h) po 24 godzinach podłoże odlać i do butelki dodać 50 ml MRM 4% FCS ph 7,6 inkubować dalej w 31 C, i) 24 godziny po tej zmianie płynu powinien pojawiać się efekt cytopatyczny i gdy warstwa komórek wykazuje 50-60% ognisk (dziur), zamrozić, j) odmrozić wyżej opisaną butelkę i pobrać 1 ml płynu, przenieść do nowej 7,5 cm butelki jak opisano powyżej celem wykonania następnego pasażu wirusa SIRS VE2332. Powyższą procedurę powtórzono 12 razy w 31 C. Dwunasty pasaż wirusa namnażanego w 31 C oznaczono jako wzorcowy wirus nasienny do produkcji szczepionki. Wirus adaptowany do zimna, wzorcowy wirus nasienny o mianie w przybliżeniu 104,5 do około 105,0 TCID50/ml, podano donosowo i domięśniowo normalnym świniom. Jako kontrolę podano donosowo i domięśniowo normalnym świniom nośnik farmaceutyczny. Po dawce wywołującej (challenge) ATCC-VR2332 (miano 104,2TCID50/ml) u świń szczepionych atenuowanym wirusem nie wystąpiły żadne objawy SIRS, podczas gdy u świń kontrolnych objawy SIRS wystąpiły. Wirus adaptowany do zimna można połączyć z dowolnym możliwym do przyjęcia konwencjonalnym nośnikiem farmaceutycznym. Ponadto, chociaż preparat szczepionkowy podano donosowo i domięśniowo, inne drogi podawanie są możliwe i przewidywane. Dla doświadczonych w tej dziedzinie powinno być widoczne, że można łatwo wprowadzić różne modyfikacje warunków wzrostu, i metody atenuacji wirusa SIRS ATCC-YR2332.

169 932 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł