Bionawozy zawierające rizobiowe czynniki Nod jako nowy trend w uprawie roślin motylkowatych Dominika Kidaj * * Zakład Genetyki i Mikrobiologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin; dominika.maj@poczta.umcs.lublin.pl Teoretycznie uprawy roślin motylkowatych, w tym gatunków charakterystycznych dla Polski takich jak wyka, groch i koniczyna, są samowystarczalne pod kątem zapotrzebowania na azot. Jednak pomimo wiedzy o niskich wymaganiach tych roślin, wielu rolników rezygnuje z ich uprawiania. Wynika to z faktu, że uprawy te są mało stabilne, tzn. zmienne w kolejnych latach, głównie z powodu niekorzystnej pogody i braku, lub nieodpowiedniej formy dodatkowych zabiegów agrotechnicznych. Jednocześnie w Polsce istnieje kilkudziesięcioprocentowy deficyt surowców białkowych potrzebnych do produkcji pasz dla zwierząt, który zaspokajany jest poprzez import śruty sojowej. Równie dobrym źródłem białka jest nasz rodzimy gatunek rośliny strączkowej groch i stąd potrzeba opracowania nowych bionawozów promujących wzrost i plonowanie roślin motylkowatych. Znaczenie biologicznego wiązania azotu Azot to pierwiastek wchodzący w skład wszystkich najważniejszych związków budujących każdą żywą komórkę aminokwasów białkowych i nukleotydów kwasów nukleinowych (DNA i RNA). Na Ziemi azot występuje w formie nieorganicznej (poza organizmami żywymi) w ilości 98% całkowitej ilości tego pierwiastka oraz w postaci biotycznej (w ciałach organizmów żywych i ich otoczeniu) w ilości zaledwie 2% (Krug i Winstanley, 2002). Niestety forma gazowa azotu (N 2 ) nie jest bezpośrednio przyswajalna przez organizmy żywe. W naturalnych ekosystemach to proces biologicznego wiązania azotu jest jedyną drogą wprowadzania do gleby zredukowanych związków azotowych dostępnych dla roślin. Zjawisko biologicznej redukcji azotu jest szeroko wykorzystywane zgodnie z założeniami nowoczesnego zrównoważonego rolnictwa, które równocześnie ogranicza stosowanie sztucznych nawozów azotowych oraz chemicznych środków ochrony roślin. Biologiczna redukcja azotu atmosferycznego do jonów amonowych, przyswajanych przez 1
rośliny, prowadzona jest wyłącznie przez bakterie nazwane diazotrofami (Mancinelli i in., 1996; Mancinelli i in., 1999). Najlepiej poznaną grupą tych mikroorganizmów są bakterie z rodzaju Rhizobium. Rizobia występują powszechnie praktycznie we wszystkich typach gleb, ale nie mogą wiązać azotu pozostając w formie wolnożyjącej. Dopiero symbioza tych bakterii z roślinami motylkowatymi skutkuje redukcją azotu atmosferycznego w ilości kilkuset kg/n/ha/rok (dane zależne od gatunków obu partnerów symbiozy oraz warunków klimatyczno-glebowych). Symbioza z rizobiami zmniejsza zatem zapotrzebowanie roślin motylkowatych na sztuczne nawozy azotowe, a w idealnym układzie czyni uprawy samowystarczalnymi. Uprawy roślin motylkowatych, stosowane w płodozmianie, wzbogacają glebę w azot, który w kolejnym sezonie wegetacyjnym wykorzystują rośliny następcze. Plony zbóż uprawianych po roślinach motylkowatych są wyższe i powtarzalne w kolejnych latach mimo braku nawożenia sztucznego (Hatano i Lipiec, 2004). Uprawa motylkowatych przyczynia się również do ograniczania zanieczyszczenia środowiska, które związane jest z silnym wymywaniem z gleby sztucznie wprowadzonego azotu. Straty te sięgają nawet 60% dawki nawozu azotowego wprowadzonego do gleby (von Richthofen 2006) i mogą wywoływać eutrofizację okolicznych zbiorników wodnych. Również wysokie ceny nawozów mineralnych powinny zachęcać rolników do uprawy roślin współżyjących z bakteriami azotowymi. Zarys przebiegu symbiozy Interakcja roślin motylkowatych i rizobiów jest specyficzna. Dany gatunek rośliny motylkowatej może nawiązać symbiozę jedynie z wybranym/wybranymi gatunkami rizobiów. Wzajemne rozpoznanie się partnerów symbiozy opiera się na wymianie specyficznych sygnałów molekularnych pochodzenia roślinnego flawonoidów oraz bakteryjnego czynnik Nod (Rys. 1) (Perret i in., 2000; Spaink 2000; Jones i in., 2007). 2
Rys. 1. Proces inicjacji symbiozy w układzie Rhizobium - roślina motylkowata polegający kolejno na: wydzielaniu induktorów flawonoidowych przez korzenie rośliny; indukcji transkrypcji rizobiowych genów nod poprzez aktywowane specyficznym flawonoidem regulatorowe białko NodD; uwalnianiu do środowiska glebowego czynników Nod przez bakterie zaadsorbowane na powierzchni włośników korzeniowych; deformacjach i skręcaniu się włośników korzeniowych w odpowiedzi na czynniki Nod; rozwoju nici infekcyjnej i wnikaniu rizobiów do systemu korzeniowego; indukcji podziałów mitotycznych w komórkach kory korzenia i powstaniu zawiązków brodawek, wewnątrz których bakteroidy wiążą azot atmosferyczny. W reakcji na swoiste flawonoidy, produkowane przez rizobia regulatorowe białko NodD indukuje ekspresję genów nodulacji (geny nod), w wyniku czego syntetyzowany jest niskocząsteczkowy chitolipooligosacharyd zwany czynnikiem Nod (Spaink 2000; D Haeze i Holsters, 2002). Sekrecja czynników Nod do środowiska glebowego wywołuje aktywację roślinnych białek tzw. nodulin, indukcję podziałów komórkowych kory korzenia, powstawanie brodawek i nici infekcyjnych, poprzez które następuje wnikanie rizobiów do tworzącej się brodawki (Jones i in., 2007). Brodawki korzeniowe stanowią dla rizobiów rodzaj niszy ekologicznej, wewnątrz której panują warunki beztlenowe, a bakterie 3
przyjmują postać tzw. bakteroidów komórek redukujących azot atmosferyczny przy udziale enzymu nitrogenazy (Kaminski i in., 1998; Patriarca i in., 2002). W zamian za zredukowane związki azotu roślina dostarcza swoim bakteryjnym symbiontom związki węgla wytworzone podczas fotosyntezy. Zapewniają one bakteroidom energię niezbędną do redukcji azotu atmosferycznego (Karunakaran i in., 2009; Prell i in., 2009). Czynniki wpływające na spadek efektywności procesu symbiozy Wydajność procesu symbiozy, czyli po prostu ilość związanego azotu atmosferycznego, najczęściej określa się poprzez zważenie otrzymanej biomasy uprawianej rośliny motylkowatej, podanie ilości brodawek korzeniowych oraz liczby i masy nasion w przypadku roślin grubonasiennych, np. fasola, groch. Niestety większość rolników w Polsce rezygnuje z upraw motylkowatych, gdyż plony tych roślin w warunkach klimatycznoglebowych tej części Europy są raczej niestabilne i mało przewidywalne. Taki stan rzeczy wynika z kilku przyczyn. Po pierwsze, dostępności nawet niewielkich ilości azotu mineralnego, który pozostał w glebie po poprzedniej uprawie wspomaganej nawozami sztucznymi. Łatwy dostęp do azotu glebowego czyni proces nawiązywania symbiozy niekorzystnym energetycznie dla roślin. Po drugie, stosowania pestycydów, które często niszczą lub ograniczają rozwój mikroflory glebowej, w tym populacji rizobiów (Martyniuk i in., 1999). Po trzecie, warunków glebowo-klimatycznych w danym sezonie wegetacyjnym takich jak: ph gleby, ilość dostępnych składników pokarmowych innych niż azot, wilgotności i struktury gleby, temperatury itp. (Streeter 1994). I w końcu, gatunku i odmiany rośliny oraz konkurencyjności poszczególnych szczepów rizobiów w stosunku do innych rizobiów wchodzących w skład danej populacji glebowej. Wniosek stąd, że wbrew powszechnej opinii rośliny motylkowate wymagają nieco większej uwagi niż sądzi o tym typowy polski rolnik. Tradycyjne zabiegi wspomagające symbiozę Samowystarczalność azotowa uprawy jest skutkiem wysokoefektywnej współpracy obu partnerów symbiozy: rośliny i bakterii. Zwykle, aby zapewnić infekcję brodawek korzeniowych przez szczepy wysokowydajne w redukcji N 2 rolnicy decydują się na zastosowanie tradycyjnych szczepionek rizobiowych, zawierających żywe komórki bakterii. Jest to jedna z najstarszych metod agrobiotechnologicznych. Bakterie selekcjonowane są z populacji glebowej danego regionu rolnego, co wynika z wysokiej specyficzności doboru symbiontów. Stąd też, np. firma BIOFOOD z Wałcza produkuje na zamówienie szczepionki rizobiowe, które znajdują zastosowanie jedynie na terenie Polski, a działająca w Finlandii 4
firma Elomestari Ltd. wytwarza podobne szczepionki tylko na rynek skandynawski (Lindström i in., 2010). Stosowanie szczepionek z żywymi rizobiami ma jednak sens tylko w sytuacji, gdy dany gatunek rośliny motylkowatej nigdy nie był uprawiany na danym terenie lub też nie był tam uprawiany przez kilka lat z rzędu. Wtedy szczep szczepionkowy nie napotyka silnej konkurencji ze strony rizobiów lokalnej populacji glebowej (Streeter 1994; Brockwell i in., 1995; Giller i Cadish, 1995; Skorupska i in., 2010). Doskonały przykład stanowią uprawy soji (roślina pochodząca z Azji) w Ameryce Północnej, gdzie jak dotąd z powodzeniem stosuje się preparat żywych kultur Bradyrhizobium japonicum (Souleimanov i in., 2002). Natomiast charakterystyczne dla polskiego rolnictwa wyka, groch i koniczyna uprawiane są w Polsce od dawna, a dodatkowo ich dzicy krewni są pospolitymi przedstawicielami flory obszarów pozarolniczych. Stąd wysoka liczebność szczepów Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (symbiont koniczyny) i Rhizobium leguminosarum bv. viciae (symbiont wyki, peluszki i grochu) w polskich glebach (Martyniuk i in., 2005). A zatem głównym problemem w próbach wykorzystania szczepionek z żywymi komórkami rizobiów w polskim rolnictwie jest brak konkurencyjności szczepów wprowadzanych do gleby względem dużo liczniejszych autochtonów, które są jednocześnie lepiej przystosowane do zmiennych warunków panujących w glebie. Czynnik Nod jako składnik aktywny biopreparatu promującego wzrost roślin motylkowatych Obecnie, najnowszym światowym trendem w badaniach nad zwiększaniem efektywności biologicznej redukcji N 2 jest rezygnacja z tradycyjnych szczepionek z żywymi bakteriami na rzecz biopreparatów, których substancję aktywną stanowią czynniki Nod, izolowane ze specjalnie wyselekcjonowanych szczepów o wysokiej wydajności symbiotycznej. Podanie czynników Nod bezpośrednio na nasiona przed siewem lub opryskanie ich roztworem kilkudniowych siewek wywołuje przyspieszenie procesu nawiązywania symbiozy oraz zwiększenie liczby brodawek korzeniowych zasiedlanych przez obecne w glebie rizobia autochtoniczne (Prithiviraj i in., 2003; Macchiavelli i Belles-Marino, 2004; Maj i in., 2009; Kidaj i in., 2011). Rozwiązanie takie prowadzi do zwiększenia ilości zredukowanego azotu nawet przy niskiej wydajności symbiotycznej szczepów autochtonicznych zakażających poszczególne brodawki jednej rośliny. Omija też główne wady inokulacji roślin tradycyjnymi żywymi kulturami rizobiów związane z wysoką wrażliwością żywych komórek na ewentualne niekorzystne warunki występujące podczas przechowywania oraz dozowania szczepionki (np. niedobór lub nadmiar wody, niewłaściwa 5
temperatura, ph) oraz konkurencją szczepów szczepionkowych z naturalnymi szczepami autochtonicznymi (Streeter 1994). Dodatkowo działanie morfogenne czynników Nod przyspiesza kiełkowanie i wzrost siewek oraz stymuluje wzrost biomasy korzeni roślin motylkowatych (Prithiviraj i in., 2003; Macchiavelli i Belles-Marino, 2004; Maj i in., 2009; Kidaj i in., 2011) jak i niemotylkowatych (bawełna, kukurydza) (Souleimanov i in. 2002; Prithiviraj i in. 2003). Rizobiowe czynniki Nod okazały się również skutecznym aktywatorem merystemów wtórnych w doświadczeniach z Daucus carota (de Jong i in. 1993), Nicotiana tabacum (Schmidt i in. 1993), czy Picea abies (Dyachok i in. 2000). Wspomniane eksperymenty sugerują możliwość dość uniwersalnego zastosowania czynników Nod również na roślinach niemotylkowatych w celu skrócenia czasu kiełkowania nasion i wzrostu siewek oraz prawdopodobnie łatwiejszego ukorzeniania roślin rozmnażanych wegetatywnie. Co ważne, czynniki Nod wykazują aktywność biologiczną w bardzo niskich stężeniach (10-9 - 10-12 M), a ich produkcja jest dość prosta i tania w porównaniu z kosztami produkcyjnymi sztucznych nawozów azotowych. W Polsce pionierem w badaniach nad tego typu rozwiązaniem jest Zakład Genetyki i Mikrobiologii Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi UMCS w Lublinie, w którym opracowano dwa biopreparaty, zawierające czynniki Nod izolowane ze szczepów R. leguminosarum bv. viciae GR09 oraz R. leguminosarum bv. trifolii KO17 z powodzeniem stosowane odpowiednio w uprawach grochu i wyki oraz koniczyny (P 391 304; P 388 372). W projekt ten zaangażowane są również Instytut Agrofizyki PAN w Lublinie oraz Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach. Literatura 1. De Jong A. J., Heidstra R., Spaink H. P., Hartog M. V., Meijer E. A., Hendriks T., Schiavo F.L., Terzi M., Bisseling T., Van Kammen A., De Vries S. C. (1993) Rhizobium lipooligosaccharides rescue a carot somatic embryo mutant. Plant Cell 5: 615 620 2. D'Haeze W., Holsters M. (2002) Nod factors structures, responses and perception during initiation of nodule development. Glycobiol 12: 79-105 3. Dyachok J. V., Tobin A. E., Price N. P. J., von Arnold S. (2000) Rhizobial Nod factors stimulate somatic embryo development in Picea abies. Plant Cell Rep 19:290 297 4. Hatano R., Lipiec J. (2004) Effects of land use and cultural practices on greenhouse gas fluxes in soil. Acta Agrophysica 111: 5-51 6
5. Jones K. M., Kobayashi H., Davies B. W., Taga M. E., Walker G. C. (2007) How symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model. Nat Rev Microbiol 5:619 633 6. Kaminski P. A., Batut J., Boistard P. (1998) A survay of symbiotic nitrogen fixation by rhizobia. In: Spaink H. P., Kondorosi A., Hooykaas P. J. (eds) The Rhizobiaceae. Molecular biology of model plant - associated bacteria. Kluver Academic Publisher, Dordrecht, The Netherland, pp 426-490 7. Karunakaran R., Ramachandran V. K., Seaman J. C., East A. K., Mouhsine B., Mauchline T. H., Prell J., Skeffington A., Poole P. S. (2009) Transcriptomic analysis of Rhizobium leguminosarum biovar viciae in symbiosis with host plants Pisum sativum and Vicia cracca. J Bacteriol 191: 4002-4014 8. Kidaj D., Wielbo J., Skorupska A. (2011) Nod factors stimulate seed germination and promote growth and nodulation of pea and vetch under competitive conditions. Microbiol Res doi. 10.1016/j.micres.2011.06.001 (w druku) 9. Krug E. C., Winstanley D. (2002) The need for comprehensive and consistent treatment of the nitrogen cycle in nitrogen cycling mass balance studies: I. Terrestial nitrogen cycle. Sci Total Environ 293: 1-29 10. Lindström K., Murwira M., Willems A., Altier N. (2010) The biodiversity of beneficial microbe-host mutualism: the case of rhizobia. Res Microbiol 161: 453-463 doi: 10.1016/j.resmic.2010.05.005 11. Macchiavelli R. E., Brelles-Marino G (2004) Nod factor-treated Medicago truncatula roots and seeds show an increased number of nodules when inoculated with a limiting population of Sinorhizobium meliloti. J Exp Bot 55: 2635-2640 12. Maj D., Wielbo J., Marek-Kozaczuk M., Skorupska A. (2009) Pretreatment of clover seeds with Nod factors improves growth and nodulation of Trifolium pratense. J Chem Ecol 35: 479 487 13. Mancinelli R. L. (1996) The nature of nitrogen: an overview. Life Support Biosph Sci 3:17-24 14. Mancinelli R. L., Smernoff D. T., White M. R. (1999) Controlling denitrification in closed artificial ecosystems. Adv Space Res 24: 329-334 15. Martyniuk S., Oroń J., Martyniuk M. (2005) Diversity and numbers of root-nodule bacteria (Rhizobia) in Polish soils. Acta Soc Bot Polon 74: 83-86 16. Martyniuk S., Woźniakowska A., Martyniuk M. (1999) Interakcje pomiędzy zaprawami chemicznymi i szczepionką Rhizobium na nasionach grochu. Post. Ochr. 7
Rośl. 39: 120-125 17. Patriarca E. J., Tate R., Iaccarino M. (2002) Key role of bacterial NH 4+ metabolism in Rhizobium - plant symbiosis. Microbiol Mol Biol Rev 66: 203-222 18. Perret X., Staehelin C., Broughton W. J. (2000) Molecular basis of symbiotic promiscuity. Microbiol Mol Biol Rev 64: 180-201 19. Prell J., White J. P., Bourdes A., Bunnewell S., Bougaerts R. J., Polle P. S. (2009) Legumes regulate Rhizobium bacteroid development and persistance by the supply of branched-chain amino acids. PNAS 106: 12477-12482 doi. 10.1073/pnas.0903653106 20. Prithiviraj B., Zhou X., Souleimanov A., Khan W., Smith D. L. (2003) A host specific bacteria-to-plant signal molecule (Nod Factor) enhances germination and early growth of diverse crop plants. Planta 216: 437-445 21. Schmidt J., Röhrig H., John M., Wieneke U., Stacey G., Koncz C., Schell J. (1993) Alteration of plant growth and development by Rhizobium noda and nodb genes involved in the synthesis of oligosaccharide signal molecules. Plant J 4: 651 658 22. Skorupska A., Wielbo J., Kidaj D., Marek-Kozaczuk M. (2010) Enhancing Rhizobium-legume symbiosis using signaling factors. In: Khan M. S. et al. (eds) Microbes for legume improvement. SringerWienNewYork, pp 27-54 23. Souleimanov A., Prithiviraj B., Smith D. L. (2002) The major Nod factor of Bradyrhizobium japonicum promotes early growth of soybean and corn. J Exp Bot 376: 1929-1934 24. Spaink H. P. (2000) Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. Annu Rev Microbiol 54: 257-288 25. Streeter J. G. (1994) Failure of inoculant rhizobia to overcome the dominance of indigenous strains for nodule formation. Can J Microbiol 40: 513-522 26. Von Richthofen J. S. (2006) Agro-economic benefits of grain legumes in cropping system. In: Benefits of grain legumes for European agriculture and environment: new results and prospects. GL-Pro Dissemination Event, Brussels pp 17-26 8