Słowa kluczowe: Yarrowia lipolytica, glicerol, kwas pirogronowy, kwas α-ketoglutarowy

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 12 (4) 2013, 5-14 ISSN 1644 065X (print) ISSN 2083 8654 (on-line) BIOSYNTEZA KWASU PIROGRONOWEGO Z GLICEROLU PRZEZ DROŻDŻE YARROWIA LIPOLYTICA A-101 Krzysztof Cybulski Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Streszczenie. Porównano parametry produkcji kwasu pirogronowego przez szczep Yarrowia lipolytica A-10 z kosmetycznego (czystego) i odpadowego glicerolu przy różnym stosunku węgla do azotu (C:N = 26,8 i 17,9). Wyższe stężenie kwasu pirogronowego uzyskano w hodowli o stosunku C:N = 26,8, w której substratem był glicerol odpadowy. Po 92 godzinach hodowli otrzymano 58,2 g dm -3 kwasu pirogronowego z wydajnością 0,39 g g -1 i szybkością objętościową produkcji 0,63 g dm -3 h -1. Biomasę z tej hodowli odseparowano od płynu pohodowlanego i analizowano pod kątem zawartości białka oraz wewnątrzkomórkowego tłuszczu. Komórki drożdży Yarrowia lipolytica A-10 były zbudowane w 43,9% z białka i 10,42% z tłuszczu, w składzie którego dominowały kwasy tłuszczowe nienasycone: linolowy (18:2, 33,94%) i oleinowy (18:1, 30,98%). Słowa kluczowe: Yarrowia lipolytica, glicerol, kwas pirogronowy, kwas α-ketoglutarowy WSTĘP Niekonwencjonalne drożdże z gatunku Yarrowia lipolytica są w ostatnich latach przedmiotem badań wielu ośrodków naukowych w Polsce i na świecie. Te wybitnie tlenowe drożdże mają bogaty aparat enzymatyczny, który umożliwia komórkom nie tylko przyswajanie zróżnicowanych surowców w charakterze źródła węgla i energii, ale również wydajną nadprodukcję (produkcję przewyższającą potrzeby metaboliczne komórki) wielu cennych metabolitów komórkowych. Źródłami węgla dostępnymi dla komórek drożdży Y. lipolytica są, między innymi, heksozy (glukoza, fruktoza, mannoza), kwasy organiczne (octowy, mlekowy, cytrynowy), alkohole (etanol, glicerol) oraz związki hydrofobowe (oleje roślinne, kwasy tłuszczowe, n-alkany) [Rodrigues i in. 1997, Flores i in. 2000, Il`chenko i in. 2002, Musiał i in. 2004, Rywińska i in. 2013]. Co więcej, drożdże Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Krzysztof Cybulski, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. Chełmońskiego 37/41, 51-630 Wrocław, e-mail: krzysztof.cybulski@up.wroc.pl

6 K. Cybulski Y. lipolytica mają status GRAS (Gennerally Recognized As Safe) przyznany przez Agencję Żywności i Leków (FDA, USA), a biomasa tych mikroorganizmów na terenie Unii Europejskiej może być zagospodarowywana na dodatki do pasz dla zwierząt hodowlanych (wpis katalogowy Europejskiej Federacji Producentów Pasz nr 00 575-EN). Na przestrzeni kilkunastu ostatnich lat naukowcy opracowali podstawy wielu procesów biosyntezy różnorodnych produktów przy udziale drożdży Y. lipolytica. Wyróżnić można tutaj produkcję m.in.: kwasów organicznych (cytrynowy, pirogronowy, α-ketoglutarowy, bursztynowy) o bardzo szerokim zastosowaniu w wielu gałęziach przemysłu [Sauer i in. 2008, Zinjarde 2014]; lipaz (E.C. 3.1.1.3), enzymów stosowanych w produkcji żywności, detergentów i do oczyszczania wód [Corzo, Rewah 1999, Fickers i in. 2005]; polioli, m.in. erytrytolu i mannitolu używanych jako niskokaloryczne, naturalne słodziki [Rywińska i in. 2013]; Single Cell Oil (SCO), otrzymanego mikrobiologicznie oleju, który może znaleźć zastosowanie jako źródło NNKT w diecie ludzi oraz zwierząt hodowlanych [Kosa, Ragauskas 2011]; Single Cell Protein (SCP), otrzymanego mikrobiologicznie białka, stosowanego jako dodatek białkowy do pasz [Musiał, Rymowicz 2002, Juszczyk i in. 2013]; związków zapachowych, np. γ-dekalaktonów używanych w przemyśle spożywczym [Aguedo i in. 2004]. Wykorzystanie drożdży Y. lipolytica w powyższych celach jest szczególnie opłacalne w aspekcie zagospodarowania produktów odpadowych. Ze względu na zwiększającą się rokrocznie produkcję biodiesla jednym z najtańszych obecnie produktów odpadowych jest glicerol. Możliwość wykorzystania tego surowca została podsumowana przez Rywińską i in. [2013], obejmując biosyntezę większości wymienionych wcześniej produktów. Celem podjętych badań była ocena wpływu relacji węgla do azotu na wydajność oraz dynamikę produkcji kwasu pirogronowego przez drożdże Y. lipolytica z glicerolu kosmetycznego (czystego) (98%) oraz odpadowego (83%). Ponadto, zadaniem była również ocena możliwości wykorzystania biomasy pozostałej po procesie produkcji kwasu pirogronowego na cele paszowe. MATERIAŁ I METODY BADAŃ Mikroorganizm. Do badań wykorzystano szczep drożdży Y. lipolytica A-10 o potwierdzonej zdolności do produkcji kwasu pirogronowego z glicerolu [Cybulski i in. 2012]. Szczep drożdży pochodził z kolekcji mikroorganizmów Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Materiał komórkowy przechowywano na skosach YM w temperaturze 4 C. Podłoża. Medium inokulacyjnym było gotowe podłoże YNB (Yeast Nitrogen Base) [Sigma-Aldrich 2012]. Skład podłoża obejmował (g dm -3 ): glicerol kosmetyczny 50; YNB 0,67; wodę destylowaną do 1 litra. Podłoże produkcyjne składało się z (g dm -3 ): glicerolu odpadowego 150; (NH 4 ) 2 SO 4 10 lub 15; KH 2 PO 4 2; MgSO 4 (7H 2 O) 1,4; NaCl 0,5; Ca(NO 3 ) 2 (4H 2 O) 0,8; biotyny (40 μg dm -3 ); wody wodociągowej do 1 litra. Podłoża sterylizowano w 121 C przez 20 minut. Acta Sci. Pol.

Biosynteza kwasu pirogronowego... 7 Substrat. Substratem w hodowlach inokulacyjnych i produkcyjnych był glicerol kosmetyczny (98% w/w, Chempur, Polska). Do produkcji kwasu pirogronowego zastosowano także glicerol odpadowy pochodzący z produkcji biodiesla (Wratislavia Bio, Polska) zawierający 83% (w/w) glicerolu i 7,3% (w/w) NaCl. Warunki hodowli. Namnażanie biomasy w hodowlach inokulacyjnych prowadzone było w kolbach Erlenmeyera o pojemności 300 cm 3 przy objętości podłoża 100 cm 3. Drożdże hodowano na wstrząsarce rotacyjnej typu Certomat IS (Sartorius Stedim, Niemcy) przy obrotach 140 rpm, w temperaturze 30 C przez 72 godziny. Podłoże produkcyjne zaszczepiano 200 cm 3 hodowli inokulacyjnej, aby uzyskać końcową roboczą objętość podłoża równą 2 dm 3. Hodowle produkcyjne prowadzone były w bioreaktorze Biostat B+ (Sartorius, Niemcy) o objętości całkowitej 5 dm 3, w stałych warunkach temperatura 30 C, napowietrzanie 0,6 vvm, szybkość obrotów mieszadła 800 rpm. Odczyn podłoża (ph 3,5) był utrzymywany automatycznie poprzez dodatek 40% NaOH. Metody analityczne. Pobrane w trakcie hodowli próbki o objętości 10 cm 3 odwirowywano w temperaturze pokojowej przy 5000 rpm przez 5 minut. Biomasę oznaczano metodą wagową separowano na filtrze membranowym Millipore o porowatości 0,45 μm, przemywano wodą destylowaną i dosuszano do stałej masy w temperaturze 105 C. Stężenie glicerolu, kwasu pirogronowego i α-ketoglutarowego w supernatancie oznaczano metodą wysoko sprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Analizy prowadzono w temperaturze 65 C na kolumnie HyperRez Xp carbohydrate H + (Dionex, Ultimate 3000 Series) podłączonej do detektorów UV i RI. Przepływ fazy ciekłej (25 mm TFA kwas trifluorooctowy) wynosił 0,6 cm 3 min -1. Tłuszcz wewnątrzkomórkowy oznaczano metodą wagową po ekstrakcji biomasy drożdży metodą Bligh i Dyer [Kates 1972], fazę chloroformową odparowywano pod próżnią i suszono do stałej masy w naczynkach wagowych w 105 C. Skład kwasów tłuszczowych w tłuszczu wewnątrzkomórkowym oznaczano, stosując chromatografię gazową, zgodnie z metodologią przedstawioną przez Kitę i in. [2007]. Zawartość białka w biomasie drożdży oznaczano metodą Kjeldahla. SPIS UŻYTYCH SYMBOLI PA kwas pirogronowy pyruvic acid KGA kwas α-ketoglutarowy α-ketoglutaric acid FA kwasy tłuszczowe fatty acids Q PA objętościowa szybkość produkcji kwasu pirogronowego volumetric pyruvic acid production rate (g dm -3 h -1 ) Y PA wydajność całkowita produkcji kwasu pirogronowego total yield of pyruvic acid (g g -1 ) X stężenie biomasy drożdży yeast cells concentration (g dm -3 ) OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Produkcja kwasu pirogronowego Kwas pirogronowy (PA) jest końcowym produktem glikolizy powstającym bezpośrednio z aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Może on być następnie przekształcany w procesie Biotechnologia 12 (4) 2013

8 K. Cybulski dekarboksylacji w acetylo-coa i włączany do cyklu Krebsa. Odpowiednia manipulacja stężeniem m.in. tiaminy, źródła węgla i azotu może przekierować metabolizm drożdży Y. lipolytica na nadprodukcję i pozakomórkowe wydzielanie kwasu α-ketoglutarowego (KGA) i PA. Warunkiem koniecznym do nadprodukcji tych kwasów jest nadmiar źródła węgla i azotu oraz limitujące wzrost drożdży stężenie tiaminy. W prezentowanych badaniach źródłem węgla było 150 g dm -3 gliceryny, natomiast stężenie tiaminy w podłożu produkcyjnym wynosiło 4 μg dm -3. Przeprowadzono cztery procesy produkcyjne, w których zastosowano czysty i odpadowy glicerol, a stosunek węgla do azotu wynosił 26,8 i 17,9. Wszystkie hodowle prowadzono do momentu całkowitego wykorzystania substratu. W stacjonarnej fazie wzrostu hodowli, w których stosowano 10 g dm -3 siarczanu amonu, czyli przy stosunku C:N wynoszącym 26,8, poziom biomasy komórkowej wynosił 11,7 i 14,3 g dm -3, odpowiednio w przypadku gliceryny kosmetycznej i odpadowej (rys. 1A, B). Wyższe stężenie biomasy w hodowli z użyciem glicerolu odpadowego wynikało z obecności w tym substracie niewielkich ilości składników odżywczych, prawdopodobnie witamin lub soli mineralnych. Obecność i stężenie tych substancji w glicerolu odpadowym zależą od wielu czynników, wśród których wymienić można m.in. rodzaj substratu do produkcji biodiesla czy zastosowaną technologię produkcji [Thompson, He 2006]. Zmniejszenie stosunku C:N uzyskane poprzez zwiększenie ilości siarczanu amonu w podłożu produkcyjnym miało wpływ na stężenie biomasy drożdży podczas procesu biosyntezy PA. Poziom biomasy w hodowlach prowadzonych przy C:N = 17,9 był wyższy i wynosił, odpowiednio dla glicerolu kosmetycznego i odpadowego, 14,3 i 16,8 g dm -3 (tab. 1). Wpływ stosunku C:N na całkowity czas procesu produkcji PA zależał od użytego substratu. W przypadku zastosowania glicerolu kosmetycznego czas biosyntezy został skrócony o 11 godzin (ze 112 do 101 godz.) poprzez obniżenie wskaźnika C:N. Natomiast w hodowlach, w których źródłem węgla był glicerol odpadowy, obniżenie stosunku C:N skutkowało efektem odwrotnym. Czas całkowitej utylizacji substratu wydłużył się z 92 do 117,5 godz. (tab. 1, rys. 1A, B). Tabela 1. Wpływ stosunku C:N na stężenie biomasy drożdży Y. lipolytica A-10 oraz produkcję kwasu pirogronowego i α-ketoglutarowego z glicerolu kosmetycznego i odpadowego Table 1. Influence of C:N ratio on Y. lipolytica A-10 biomass concentration and production of pyruvic and α-ketoglutaric acids from pure and crude glycerol Stosunek C:N C:N ratio Czas [h] Time X [g dm -3 ] PA [g dm -3 ] KGA [g dm -3 ] PA:KGA Y PA [g g -1 ] Q PA [g dm -3 h -1 ] Glicerol kosmetyczny Pure glycerol 26,8 112 11,7 40,3 24,8 1,7 0,27 0,36 17,9 101 14,3 41,0 29,0 1,4 0,27 0,41 Glicerol odpadowy Crude glycerol 26,8 92 14,3 58,2 23,6 2,5 0,39 0,63 17,9 117,5 16,8 38,5 27,5 1,4 0,26 0,33 Acta Sci. Pol.

Biosynteza kwasu pirogronowego... 9 Rys. 1. Produkcja biomasy (X), kwasu pirogronowego (PA), kwasu α-ketoglutarowego (KGA) oraz zużycie glicerolu (GLY) przez Y. lipolytica A-10 w hodowlach okresowych. A substrat glicerol kosmetyczny. B substrat glicerol odpadowy. Białe znaczniki hodowle o stosunku C:N = 26,8. Czarne znaczniki hodowle o stosunku C:N = 17,9 Fig. 1. Biomass (X), pyruvic acid (PA), α-ketoglutaric acid (KGA) production and uptake of glycerol (GLY) during batch culture of Y. lipolytica A-10. A substrate pure glycerol. B substrate crude glycerol. White marks C:N ratio = 26.8. Black marks C:N ratio = 17.9 Obniżenie stosunku C:N z 26,8 na 17,9 było również przyczyną wymiernych różnic w ilościach i proporcjach wyprodukowanych ketokwasów. Stosunek rozpatrywanych pierwiastków biogennych (C:N) miał niewielki wpływ na wynik hodowli, w których substratem był glicerol kosmetyczny. W hodowli z 15 g dm -3 siarczanu amonu produkcja PA była zbliżona do wyniku uzyskanego w procesie, w którym dodawano 10 g dm -3 źródła azotu. Zawartość niepożądanego KGA wzrosła natomiast o 4,2 g dm -3 w stosunku do hodowli z 10 g dm -3 siarczanu amonu. Tym samym, stosunek wyprodukowanych ketokwasów (PA:KGA) uległ obniżeniu na niekorzyść PA, z 1,7 do 1,4. Wydajność produkcji PA w hodowlach z glicerolem kosmetycznym (0,27 g g -1 ) była nieco wyższa niż w przypadku opatentowanego procesu produkcji tego kwasu z użyciem drożdży Candida maltoza. Substratem w przytoczonym procesie był kwas propionowy, źródłem azotu siarczan Biotechnologia 12 (4) 2013

10 K. Cybulski amonu lub azotan (III) amonu, a drożdże wyprodukowały podczas hodowli wstrząsanej 2,2 g dm -3 PA z wydajnością 0,22 g g -1 [Uchio i in. 1974]. Zaskakujące okazały się wyniki hodowli z glicerolem odpadowym. Przy stosunku C:N równym 26,8 drożdże wyprodukowały 58,2 g dm -3 PA z wydajnością 0,39 g g -1, co było najlepszym wynikiem otrzymanym podczas przeprowadzonych badań. Wydajność produkcji PA na tym poziomie jest porównywalna z wynikami otrzymanymi przez Hua i Shimizu [1999]. Badacze uzyskali 42 g dm -3 PA z wydajnością 0,45 g g -1 z glukozy przy użyciu szczepu Torulopsis glabrata IFO 0005. Warto podkreślić, iż drożdże te reprezentowały fenotyp B 1- Bio - B 6- NA -, co oznacza, że szczep jest auksotrofem w stosunku do aż 4 witamin, a dodatkowo ich komórki nie przyswajają mineralnych form azotu, co znacznie podwyższa koszty produkcji PA. Przy obniżonym stosunku węgla do azotu (C:N = 17,9) drożdże Y. lipolytica A-10 wyprodukowały tylko 38,5 g dm -3 PA z glicerolu odpadowego. W przypadku tego substratu wraz z obniżeniem stosunku C:N wzrosła również zawartość niepożądanego KGA z 23,6 do 27,5 g dm -3. Inhibicja produkcji PA pod wpływem zwiększonej ilości siarczanu amonu w podłożu przełożyła się na obniżenie szybkości objętościowej produkcji PA z 0,63 do 0,33 g dm -3 h-1 (tab. 1). Charakterystyka biomasy drożdży Biomasę drożdży po hodowli w podłożu z glicerolem odpadowym (stosunek C:N = 26,8) odwirowano od płynu pohodowlanego, wysuszono w temperaturze pokojowej, dosuszono do stałej wagi w temperaturze 105 C i poddano analizom pod kątem oznaczenia ilości białka i wewnątrzkomórkowego tłuszczu oraz profilu kwasów tłuszczowych. Biomasa drożdży Y. lipolytica ma zastosowanie jako dodatek białkowy do pasz dla zwierząt hodowlanych i została dopuszczona do obrotu na terenie Unii Europejskiej przez Europejską Federację Producentów Pasz. Polskie przepisy określają jednoznacznie, iż suszone preparaty drożdży powinny charakteryzować się zawartością białka w granicach od 40 do 52% w przeliczeniu na suchą masę [PN-81/A-79006]. Otrzymany metodą Kjeldahla wynik zawartości białka w biomasie Y. lipolytica A-10 wynosił 43,9% (tab. 2) i był o ponad 5% wyższy niż w przypadku wcześniej uzyskanych wyników [Cybulski i in. 2012]. Ten znaczący wzrost ilości białka mógł być spowodowany kilkoma czynnikami, wśród których wymienić można rodzaj zastosowanego glicerolu odpadowego oraz dodatek 40 μg dm -3 biotyny. Podobne stężenie białka (42 45%) w biomasie Y. lipolytica namnożonej w podłożu z glicerolem odpadowym zostało oznaczone przez Juszczyka i in. [2013]. Tabela 2. Zawartość białka, tłuszczu oraz profil kwasów tłuszczowych w biomasie drożdży Y. lipolytica A-10 uzyskanej po hodowli okresowej z glicerolem odpadowym (C:N 26,8) Table 2. Content of protein, intracellular fat and fatty acid profile of Y. lipolytica A-10 biomass obtained in batch culture supplemented with crude glycerol (C:N ratio 26.8) Białko Protein [%] Tłuszcz Fat [%] 43,90 10,42 Kwas tłuszczowy Fatty acid udział w sumie kwasów tłuszczowych [%] % of total fatty acids 14:0 16:0 17:0 18:0 16:1 n7 18:1 n7 16:1 n9 18:1 n9 18:2 n6 18:3 n3 0,48 18,58 0,31 4,86 5,21 0,98 1,17 30,98 33,94 2,76 Acta Sci. Pol.

Biosynteza kwasu pirogronowego... 11 Kwasy tłuszczowe Fatty acid [%] nasycone ogółem saturated nienasycone ogółem unsaturated jednonienasycone mono-unsaturated dwunienasycone di-unsaturated trójnienasycone tri-unsaturated Rys. 2. Procentowa zawartość kwasów tłuszczowych w wewnątrzkomórkowym tłuszczu drożdży Y. lipolytica A-10 Fig. 2. The percentage of fatty acids in the intracellular lipids of Y. lipolytica A-10 Cennym składnikiem biomasy drożdżowej jest również wewnątrzkomórkowy tłuszcz (SCO), mogący w przyszłości stanowić alternatywę dla użycia konwencjonalnych źródeł tłuszczów w skarmianiu zwierząt. O wartości żywieniowej SCO decyduje nie tylko jego ilość w komórkach drożdży, ale również skład kwasów tłuszczowych (FA). Biomasa Y. lipolytica A-10 uzyskana po procesie produkcji PA z glicerolu odpadowego charakteryzowała się zawartością wewnątrzkomórkowego tłuszczu na poziomie 10,42% w przeliczeniu na suchą masę. Musiał i in. [2003] oznaczyli nieco niższą zawartość tłuszczu w biomasie drożdży Y. lipolytica 8,9%, jednakże substratem w tym procesie był olej rzepakowy. Przy zastosowaniu glicerolu odpadowego jako źródła węgla i energii w procesie produkcji biomasy drożdżowej Juszczyk i in. [2013] otrzymali od 6,5 do 11,1% tłuszczu wewnątrzkomórkowego, co zależało od użytego szczepu drożdży Y. lipolytica. Wobec tego otrzymane 10,42% tłuszczu wydaje się być wynikiem bardzo dobrym. Wyekstrahowany chloroformem tłuszcz został poddany analizie pod kątem zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych. Wyniki tego eksperymentu zostały podsumowane w tabeli 2. FA, których stężenie nie przekraczało 0,3% całkowitej sumy kwasów, zostały pominięte, a wśród nich wyróżnić można było m.in. kwas kaprylowy (8:0), kaprynowy (10:0), pentadekanowy (15:0) i arachidowy (20:0). Ogólna procentowa zawartość FA z podziałem ze względu na ich stopień nasycenia została przedstawiona na rysunku 2. Nienasycone kwasy tłuszczowe stanowiły aż 75,1% ogólnej sumy FA w tym 38,4 i 33,9% to kwasy, odpowiednio, jedno- i dwunienasycone. Proporcje pomiędzy poszczególnymi FA zawartymi w biomasie drożdży zależą przede wszystkim od użytego substratu i składu pożywki hodowlanej. Przeważającymi w komórkach drożdży Y. lipolytica A-10 kwasami tłuszczowymi były kwasy nienasycone linolowy (18:2, 33,9%), występujący w przyrodzie w oleju słonecznikowym i lnianym oraz oleinowy (18:1, 31%), spotykany głównie w oliwie z oliwek i tranie. Wśród kwasów nasyconych dominował natomiast kwas palmitynowy (16:0, 18,6%). Wysoka zawartość nienasyconych FA jest związana z użyciem gli- Biotechnologia 12 (4) 2013

12 K. Cybulski cerolu jako substratu, co zostało wykazane w badaniach Papanikolaou i in. [2002]. Szczególnie interesująca jest bardzo wysoka ilość kwasu linolowego. Zarówno w badaniach Juszczyka i in. [2013], jak i Papanikolau i in. [2002] zawartość tego kwasu w ogólnej puli FA nie przekroczyła 25%. Porównując, drożdże Y. lipolytica LGAM S(7)I namnożone na podłożu z glicerolem technicznym zawierały głównie kwasy: oleinowy 45%, linolenowy (18:3) 20% i palmitynowy 15% [Papanikolaou, Aggelis 2002]. Zupełnie odmienny skład kwasów tłuszczowych stwierdzono u drożdży Candida lipolytica wyrosłych na podłożu z metanolem. W ich składzie dominowały kwasy nasycone (71,8 76,6%), w tym kwas palmitynowy (45,8 56%) i stearynowy (18:0, 20,6 25,9%) [Iwanny, Rashad 1984]. PODSUMOWANIE Przeprowadzone w niniejszej pracy badania wykazały, że na produkcję kwasu pirogronowego wpływ ma zarówno rodzaj zastosowanego glicerolu, jak i stosunek C:N. Uzyskane wyniki świadczą o dużym potencjale drożdży Y. lipolytica A-10 w produkcji kwasu pirogronowego z glicerolu odpadowego. Przy stosunku C:N wynoszącym 26,8 szczep produkował 58,2 g dm -3 tego kwasu z wydajnością 0,39 g g -1. Niezależnie od zastosowanego substratu niższy stosunek C:N (17,9) predysponował komórki drożdży do wzmożonej produkcji KGA, którego ilość była średnio o 4 g dm -3 wyższa w porównaniu z hodowlami, w których C:N wynosił 26,8. Badania wykazały również, że biomasa drożdży uzyskana po procesie biosyntezy kwasu pirogronowego może być cennym produktem, ponieważ charakteryzowała się znaczną zawartością białka i tłuszczu na poziomie, odpowiednio, 43,9 i 10,42% w suchej masie. W puli kwasów tłuszczowych dominowały kwasy nienasycone, głównie kwas linolowy (33,94%) i oleinowy (30,98%). Zgodnie z regulacjami prawnymi Polski i Unii Europejskiej biomasa o takich właściwościach może zostać wykorzystana jako dodatek białkowy do pasz dla zwierząt hodowlanych. PIŚMIENNICTWO Aguedo M., Wache Y., Coste F., Husson F., Belin J-M., 2004. Impact of surfactants on the biotransformation of methyl ricionoleate into γ-decalactone by Yarrowia lipolytica. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 29, 31 36. Corzo G., Revah S., 1999. Production and characteristics of the lipase from Yarrowia lipolytica 681. Bioresource Technol.,70, 173 180. Cybulski K., Tomaszewska L., Rywińska A., 2012. Dobór podłoża inokulacyjnego do produkcji ketokwasów przez drożdże Yarrowia lipolytica. Biotechnologia, ACTA Scient. Polon. Biotechnol., 11(3), 5 14. Fickers P., Fudalej F., Nicaud J.M., Destain J., Thonart P., 2005. Selection of new over-producing derivatives for the improvement of extracellular lipase production by the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica. Journal of Biotechnology, 115, 379 386. Flores C.L., Rodriguez C., Petit T., Gancedo C., 2000. Carbohydrate and energy yielding metabolism in non-conventional yeasts. FEMS Microbiology Reviews, 24, 507 529. Hua Q., Shimizu K., 1999. Effect of dissolved oxygen concentration on intracelluar flux distribution for pyruvate fermentation. J. Biotechnol., 68, 135 147. Acta Sci. Pol.

Biosynteza kwasu pirogronowego... 13 Il chenko A.P., Chernyavskaya O.G., Shishkanova N.V., Finogenova T.V., 2002. Metabolism of Yarrowia lipolytica grown on ethanol under conditions promoting the production of α-ketoglutaric and citric acids: a comparative study of the central metabolism enzymes. Microbiology, 71(3), 269 274. Iwanny E.W., Rashad M.M., 1984. Lipid contens and fatty acid composition from Candida lipolytica and Pichia guilliermondii grown on methanol. Egypt. J. Food Sci., 12(1 2), 21 28. Juszczyk P., Tomaszewska L., Kita A., Rymowicz W., 2013. Biomass production by novel strains of Yarrowia lipolytica using raw glycerol, derived from biodiesel production. Bioresource Technology, 137, 124 131. Kates M., 1972. Techniques of lipidology: isolation, analysis and identification of lipids. Lab. Tech. Biochem. Mol., (ed.) T.S. Work and E. Work, Amsterdam. Kita A., Lisinska G., Gołubowska G., 2007. The effect of oils and frying temperatures on the textures and fat content of potato crisps. Food Chem., 102, 1 5. Kosa M., Ragauskas A.J., 2011. Lipids from heterotrophic microbes: advances in metabolism research. Trends in Biotechnology, 29, 53 61. Musiał I., Rymowicz W., 2002. Charakterystyka produkcji single-cell-biomass z oleju rzepakowego w różnych systemach hodowlanych. Inżynieria i Aparatura Chemiczna, 3, 108 109. Musiał I., Rymowicz W., Kramkowski R., 2003. Charakterystyka drożdży paszowych Yarrowia lipolytica suszonych metodą rozpyłową. ACTA Scient. Polon. Biotechnol., 2(1 2), 41 49. Musiał I., Rymowicz W., Kita A., 2004. Produkcja biomasy drożdży Yarrowia lipolytica z tłuszczów odpadowych po smażeniu produktów przekąskowych. Biotechnologia, ACTA Scient. Polon. Biotechnol., 3(1 2), 75 83. Papanikolaou S., Aggelis G., 2002. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresour. Technol., 82(1), 43 49. Papanikolaou S., Chevalot I., Komaitis M., Marc I., Aggelis G., 2002. Single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derative of animal fat in batch cultures. Appl. Microbiol. Biotechnol., 58, 308 312. PN-81/A-79006, Drożdże paszowe suszone. Rodrigues G., Pais C., 1997. The influence of acetic and other weak carboxylic acids on growth and cellular death of the yeast Yarrowia lipolytica. Food Technology and Biotechnology, 38, 27 32. Rywińska A., Juszczyk P., Wojtatowicz M., Robak M., Lazar Z., Tomaszewska L., Rymowicz W., 2013. Glycerol as a promising substrate for Yarrowia lipolytica biotechnological applications. Biomass and Bioenergy, 146 166. Sauer M., Porro D., Mattanovich D. and Branduardi P., 2008. Microbial production of organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol., 26, 100 108. Sigma-Aldrich Product Information [online]. Sigma-Aldrich 2012, dostępny w Internecie:http:// www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/sigma/product_information_sheet/y0626pis. Par.0001.File.tmp/y0626pis.pdf Thompson J.C., He B.B., 2006. Characterization of crude glycerol from biodiesel production from multiple feedstocks. Appl. Eng. Agric., 22, 261 265. Uchio R., Maeyashiki I., Okada H., 1974. Fermentative production of pyruvic acid. JP patent 74102894. Zinjarde S.S., 2014. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chemistry, 152, 1 10. Biotechnologia 12 (4) 2013

14 K. Cybulski BIOSYNTHESIS OF PYRUVIC ACID FROM GLYCEROL BY YARROWIA LIPOLYTICA YEAST Abstract. The parameters of pyruvic acid production by Yarrowia lipolytica A-10 strain from pure and crude glycerol at different C:N ratio (26.8 and 17.9) were compared. The highest pyruvic acid concentration was achieved in culture with C:N ratio 26.8, using crude glycerol as a substrate. After 92 hours of cultivation yeast produced 58.2 g dm -3 of pyruvic acid with yield 0.39 g g -1 and volumetric production rate 0.63 g dm -3 h -1. Biomass from this process was separated from cultivation medium and determined for quantity of protein and intracellular fat. Cells of Yarrowia lipolytica A-10 were composed of 43.9% of protein and 10.42% of fat, in which unsaturated acids represented the majority of total fatty acids (linoleic acid, 18:2 33.94% and oleic acid, 18:1 30.98%). Key words: Yarrowia lipolytica, glycerol, pyruvic acid, α-ketoglutaric acid Zaakceptowano do druku Accepted for print: 30.12.2013 Do cytowania For citation: Cybulski K., 2013. Biosynteza kwasu pirogronowego z glicerolu przez drożdże Yarrowia Lipolytica A-10. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 12 (4), 5 14. Acta Sci. Pol.