InŜynieria genetyczna Udział w badaniach w celu walki z miaŝdŝycą Warsztaty doświadczalne PROTOKÓŁ
InŜynieria genetyczna Poszukiwanie miejsca docelowego dla leku na miaŝdŝycę Wprowadzenie Badania biomedyczne dotyczą procesów fizycznych i chemicznych, które przebiegają we wnętrzu organizmów Ŝywych, a takŝe procesów wywołujących choroby. Jednym z głównych celów tej dziedziny badań jest określenie miejsc docelowych działania leków, czyli np. części ciała, w które moŝna skierować nowe leki, czego wynikiem będzie uzyskanie odpowiedzi i pomoc w walce z chorobą. Ten protokół jest zgodny z wytycznymi naukowych badań biomedycznych dotyczącymi badania potencjalnego miejsca docelowego, które mogłoby zostać rozpoznane przez lek na miaŝdŝycę. Co powoduje miaŝdŝycę? MiaŜdŜyca jest chorobą naczyń spowodowaną nagromadzeniem się tłuszczy na ścianach naczyń krwionośnych. Istnieje wiele róŝnych oznak i stopni cięŝkości choroby zaleŝnie od tego, gdzie znajdują się chore naczynia i jak bardzo choroba się rozwinęła. SpoŜywanie pokarmów bogatych w tłuszcze nasycone doprowadziło w naszym społeczeństwie do znacznego wzrostu ryzyka rozwoju chorób układu sercowo-naczyniowego. Ten nadmiar tłuszczu w naszym organizmie moŝe się odłoŝyć i zgromadzić w niektórych miejscach ścian tętnic w postaci blaszek zwanych blaszkami miaŝdŝycowymi, które następnie powodują zahamowanie przepływu krwi. ----- Tętnica prawidłowa ----- MiaŜdŜyca umiarkowana ----- MiaŜdŜyca cięŝka InŜynieria genetyczna - 2 -
Cholesterol i makrofagi Cholesterol jest jednym z wielu lipidów wchodzących w skład blaszek miaŝdŝycowych. Aby nie dopuścić do odkładania się cholesterolu na ścianach naczyń, nasz organizm jest wyposaŝony w układ oczyszczający, czyli makrofagi, które są komórkami krąŝącymi we krwi i wychwytującymi cząsteczki złego cholesterolu znanego jako LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości). LDL Makrofagi rozpoznają te cząsteczki dzięki znajdującym się na ich błonach receptorom. Układ oczyszczający jest wydajny, jeŝeli stęŝenie cholesterolu nie jest nadmiernie podwyŝszone. Utleniony LDL Utlenianie LDL JeŜeli stęŝenie cholesterolu jest zbyt wysokie, makrofagi nadal będą wychwytywać LDL, ale gdy pochłoną zbyt duŝe ich ilości, przekształcą się w tak zwane komórki piankowe. Takie komórki wytwarzają substancje indukujące stan zapalny i proliferację komórek w ścianach tętnic (komórek śródbłonka), czego wynikiem jest powstanie blaszek miaŝdŝycowych blokujących przepływ krwi. Proliferacja komórek śródbłonka Aktywacja układu immunologicznego Komórka piankowa LDL Obecnie grupy naukowców na całym świecie, w tym takŝe grupa zajmująca się badaniem receptorów jądrowych na uniwersytecie w Barcelonie, starają się lepiej zrozumieć mechanizm, za pośrednictwem którego makrofagi są zaangaŝowane w regulację stęŝenia cholesterolu i rozwój miaŝdŝycy. Naukowcy badają w szczególności rolę znajdującego Utlenianie LDL się w makrofagach białka, noszącego nazwę MYLIP. Główną funkcją tego białka jest rozkładanie receptora błonowego makrofagów odpowiedzialnego za rozpoznawanie LDL. Naukowcy zaobserwowali, Ŝe jeŝeli to białko jest wytwarzane w duŝych ilościach, InŜynieria genetyczna - 3 -
makrofagi wchłaniają mniej cholesterolu. Niemniej jednak jego rola w kontekście miaŝdŝycy nadal nie jest w pełni poznana. Makrofag Utleniony LDL PoniewaŜ zaobserwowano, Ŝe białko MYLIP jest związane z regulacją stęŝenia złego cholesterolu, naukowcy uwaŝają, Ŝe moŝe to być nowe w procesie regulacji miejsce docelowe dla leków na miaŝdŝycę. Utlenianie LDL W jaki sposób moŝemy badać białko MYLIP zaangaŝowane w regulację stęŝenia cholesterolu? Aby naukowcy mogli zbadać to potencjalne miejsce docelowe, muszą wytworzyć w laboratorium znaczne ilości tego białka. W tym celu wykorzystują metodę inŝynierii genetycznej, tak zwaną transformację bakteryjną, za pomocą której przenoszą DNA z organizmu do bakterii, dzięki czemu bakterie będą wytwarzać duŝe ilości DNA, które następnie moŝna wprowadzić do innych komórek, aby produkowały one białko docelowe dla celów badania. Naukowcy zaczynają od oczyszczonej postaci genu produkującego białko MYLIP. Następnie łączą je z kolistym fragmentem DNA zwanym plazmidem i wprowadzają go do bakterii, aby mogły one produkować repliki materiału genetycznego. W ramach tego protokołu zapraszamy Was do pracy w roli biotechników i przeprowadzenia transformacji bakteryjnej! InŜynieria genetyczna - 4 -
Organizacja warsztatów: 1. Rozpoczniemy od przeprowadzenia transformacji bakteryjnej obejmującej wprowadzenie DNA odpowiedzialnego za wytwarzanie białka MYLIP, aby bakterie mogły pełnić funkcję bioreaktorów i wytwarzać materiał genetyczny w znacznych ilościach. 2. Następnie umoŝliwimy hodowlę bakterii na odpowiedniej poŝywce i wybierzemy te bakterie, które wbudowały gen. 3. Oczyścimy materiał genetyczny odpowiedzialny za wytwarzanie białka MYLIP tak, aby moŝna go było wprowadzić do innych typów komórek, które następnie będą wytwarzać białko (*). (*) PoniewaŜ wzrost bakterii trwa półtora dnia, oczyszczanie zostanie przeprowadzone z wykorzystaniem hodowli bakteryjnej przygotowanej wcześniej przez monitorów InŜynieria genetyczna - 5 -
Sprzęt i materiały wymagane dla kaŝdej grupy/tabela 2 probówki z 1 probówka na lodzie 1 probówka z poŝywką Mikropipety o bakteriami na lodzie, z kolistym DNA, LB do hodowli bakterii pojemności 20 µl i oznaczone nr 1 i 2. plazmid (C) 200 µl (A) pudełko pcr2.1-mylip. polistyrenowe + (B) lód Końcówki do Końcówki do 2 szalki Petriego z Ezy plastikowe mikropipet o mikropipet o agarem i pojemności 20 µl i pojemności 20 µl i antybiotykiem: 200 µl 200 µl (D) ampicyliną Łaźnia wodna z wodą Pływak na probówki Zlewka na odpady Zlewki na odpady destylowaną stoper stałe płynne Plaster 1 probówka z 1 ml 1 probówka z 1 probówka z Trwały marker hodowli bakteryjnej roztworem 1 Mini- roztworem 2 Mini- (E) prep (F) prep (G) 1 probówka z 1 probówka z 1 probówka z 1 probówka z wodą roztworem 3 Mini- chloropanem (I) etanolem ultraczystą (milliq). prep (H) InŜynieria genetyczna - 6 -
(A) Bakterie, do których moŝna wprowadzić DNA (zwane komórkami kompetentnymi XL1-blue) (B) Koliste DNA zwane plazmidem (pcr2.1) (C) PoŜywka hodowlana LB (Luria-Bertani): ekstrakt z droŝdŝy 5 g/l, Trypton 10 g/l, NaCl 5 g/l. Sterylizować w autoklawie. Przechowywać w chłodnym miejscu. (D) Płytki z poŝywką LB/ampicyliną: PoŜywka hodowlana LB, agar 1,6%, ampicylina 100 µg/ml. (E) Bakterie hodowane w poŝywce 2XYT, przez noc (16 h) (F) Roztwór 1: 50 mm glukozy/25 mm Tris-HCl ph 8,0/10 mm EDTA/Rozcieńczyć wodą destylowaną. (G) Roztwór 2: 20 µl detergentu SDS (siarczan dodecylosodowy) 10%/4 µl NaOH 10N/176 µl H 2 O mq/dla kaŝdej próbki. Sporządzić duplikat w dniu warsztatów. (H) Roztwór 3 Mini-prep: 73,60 g octanu potasu/28,75 ml kwasu octowego/rozcieńczyć w H 2 O mq do końcowej objętości 250 ml. (I) Chloropan: 25 ml zrównowaŝonego fenolu/24 ml chloroformu/1 ml alkoholu izoamylowego. Wirować przez 10 min przy 3000 obr./min. InŜynieria genetyczna - 7 -
Procedury 1- TRANSFORMACJA BAKTERYJNA Transformacja bakteryjna jest procesem biotechnologicznym, w trakcie którego naukowcy wprowadzają materiał genetyczny odpowiedzialny za wytwarzanie danego białka do komórki bakteryjnej. Taka komórka będzie następnie pełnić funkcję bioreaktora i wytwarzać kopie tego materiału genetycznego, które w dalszej kolejności będzie moŝna wprowadzić do innego typu komórek, aby mogły one wytwarzać białko docelowe. (*) W trakcie tych warsztatów rozpoczniemy od wytworzenia oczyszczonego genu białka MYLIP, który następnie wprowadzimy do plazmidu, czyli kolistej cząsteczki DNA. Korzystając z tego materiału genetycznego, przeprowadzimy transformację bakteryjną, czyli wprowadzimy do bakterii gen odpowiedzialny za wytwarzanie naszego białka, stosując metodę szoku cieplnego poddając próbkę działaniu róŝnych temperatur. (*)W przypadkach gdy białko docelowe nie jest tak złoŝone, bakterie po transformacji same mogą pełnić rolę bioreaktorów i wytwarzać to białko. InŜynieria genetyczna - 8 -
Protokół transformacji bakteryjnej 1. Mamy na lodzie dwie probówki zawierające bakterie. KaŜda probówka zawiera roztwór buforu, który wspomoŝe transformację dzięki obecności kationów Ca 2+ pochodzących z soli CaCl 2 znajdującej się w buforze. Co się dzieje? W zimnej temperaturze kationy Ca 2+ wpływają na błony komórek tak, Ŝe stają się one przepuszczalne dla DNA. Jony Ca 2+ wiąŝą się z fosfolipidami błony komórkowej, chroniąc ich ujemny ładunek i tworząc niewielkie pory w błonie bakterii. 2. Dodanie DNA w formie plazmidu do bakterii: za pomocą mikropipety 20 µl, odpipetować 10 µl plazmidu (probówka P) i dodać do probówki 2 zawierającej bakterie. Zamknąć probówkę i delikatnie wymieszać, ostukując probówkę palcem. Probówka 1 będzie probówką kontrolną, poniewaŝ zawiera bakterie bez plazmidu. InŜynieria genetyczna - 9 -
Co się dzieje? Jony Ca 2+ wchodzą w reakcje z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi DNA, dzięki czemu mogą się znaleźć blisko błon bakteryjnych, ale nie zostają od nich odepchnięte ze względu na ich ładunek elektryczny. 3. Pozostawić probówki na 15 minut w celu inkubacji * W międzyczasie przeprowadzić pierwszy etap protokołu Hodowla transformowanych bakterii (page 12). 4. Po 15 minutach włoŝyć probówkę 1 i 2 do łaźni wodnej o temperaturze 42ºC na dokładnie 1 minutę i 30 sekund. Co się dzieje? Kolista cząsteczka DNA lub plazmid przechodzi przez pory niektórych bakterii. W jaki sposób? W temperaturze 42ºC elastyczność błony bakteryjnej rośnie, dzięki czemu plazmid moŝe łatwiej przejść przez pory. InŜynieria genetyczna - 10 -
5. WłoŜyć probówki 1 i 2 z powrotem do lodu na 2 minuty. Co się dzieje? Gdy temperatura spada, błony się stabilizują i plazmid, który przeszedł przez pory, pozostaje wewnątrz bakterii. InŜynieria genetyczna - 11 -
2- HODOWLA TRANSFORMOWANYCH BAKTERII Po wprowadzeniu plazmidu do bakterii naleŝy doprowadzić do namnaŝania się bakterii, zapewniając im odpowiednią poŝywkę i właściwą temperaturę. PoniewaŜ w wyniku transformacji bakteryjnej powstaje zwykle niewiele komórek, w których zaszła transformacja, i wiele komórek bez transformacji, potrzebna jest metoda do rozpoznania komórek, które wbudowały plazmid. NaleŜy dopilnować, aby namnaŝać tylko bakterie stransformowane, co moŝna wykonać, prowadząc hodowlę na płytkach hodowlanych zawierających antybiotyk. PoniewaŜ plazmid zawiera gen odpowiedzialny za oporność bakterii na ten lek, jedynie stransformowane bakterie będą tworzyć kolonie. Następnie pobierając bakterie z tych kolonii, będziemy mogli prowadzić hodowlę tylko tych bakterii, które wytwarzają gen docelowy. Gen MYLIP Ampicylina Gen oporności na ampicylinę Ampicylina InŜynieria genetyczna - 12 -
Protokół hodowli transformowanych bakterii 1. Oznaczyć płytki, na których będą hodowane bakterie. Jedna z nich będzie płytką kontrolną do hodowli bakterii bez plazmidu, a druga będzie przeznaczona do hodowli bakterii z plazmidem. 2. Za pomocą mikropipety 200 µl dodać 500 µl poŝywki hodowlanej LB zawierającej składniki odŝywcze do probówki 1 i 2. Zamknąć probówki i delikatnie wymieszać, ostukując probówki palcem. 3. Inkubować mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 37ºC przez 30 minut. Co się dzieje? W tym okresie bakterie mają czas, aby się namnaŝać, czyli podwajają swoje DNA i tworzą takŝe kopię plazmidowego DNA zawierającego docelowy gen. *Czekając na wzrost bakterii, moŝna przeprowadzić trzeci etap warsztatów obejmujący izolację materiału genetycznego z bakterii (page 16). InŜynieria genetyczna - 13 -
4. Za pomocą mikropipety 200 µl (za kaŝdym razem naleŝy korzystać z nowej końcówki) dodać bakterie (100-200 µl) z probówki 1 i 2 na płytki agarowe zawierające takŝe antybiotyk, ampicylinę. 5. Rozmieścić bakterie na powierzchni kaŝdej płytki agarowej, za kaŝdym razem stosując nową, sterylną plastikową ezę. Obracać płytkę w trakcie przesuwania ezy tam i z powrotem. Zakleić płytki taśmą i napisać na niej swoje inicjały oraz datę i typ bakterii. InŜynieria genetyczna - 14 -
6. Odwrócić płytki i inkubować w temperaturze 37ºC i następnego dnia sprawdzić wyniki. JeŜeli inkubator nie jest dostępny, wystarczy po prostu pozostawić bakterie do wzrostu przez kilka dni w temperaturze pokojowej. InŜynieria genetyczna - 15 -
3- IZOLACJA UZYSKANEGO MATERIAŁU GENETYCZNEGO Aby uzyskać duŝe ilości materiału, naukowcy pobierają próbkę transformowanych bakterii, które utworzyły kolonie, i wprowadzają ją do innej poŝywki hodowlanej zawierającej składniki odŝywcze. Materiał genetyczny wytworzony przez bakterie musi zostać wyizolowany, czyli naleŝy go oddzielić od pozostałych części bakterii, takich jak RNA, DNA bakterii i białka. Aby wyizolować plazmid, naukowcy przeprowadzają protokół o nazwie Mini-prep. Ta procedura pozwala na separację DNA w postaci plazmidu dzięki wykorzystaniu róŝnych rozpuszczalników i cykli wirowania, w trakcie których stopniowo są odrzucane róŝne składniki komórkowe. Oczyszczone DNA jest bardzo przydatne dla naukowców, którzy mogą prowadzić dalsze eksperymenty nad jego rolą w regulacji stęŝenia cholesterolu i w miaŝdŝycy oraz badania dotyczące nowych leków. PoniewaŜ proces hodowli większej ilości bakterii zajmuje około półtora dnia, w trakcie tych warsztatów będzie wykorzystywana hodowla przygotowana wcześniej przez monitorów. ROZTWÓR 2 ROZTWÓR 3 CHLOROPAN ETANOL gen MYLIP Gen oporności na ampicylinę InŜynieria genetyczna - 16 -
Protokół oczyszczania plazmidowego DNA z hodowli bakteryjnej (Miniprep) 1. Zwirować probówkę z hodowlą bakterii przy maksymalnej prędkości przez 30 sekund. Następnie odrzucić supernatant. Co się dzieje? Komórki zostają oddzielone od poŝywki hodowlanej, w której wzrastały, zwykle zawierającej odpady komórek i inne cząsteczki, których się chcemy pozbyć. 2. Następnie naleŝy odrzucić supernatant i za pomocą mikropipety 200 µl zawiesić osad w 100 µl roztworu 1 i wymieszać pipetą. Co się dzieje? Bakterie zostają zawieszone w roztworze, dzięki czemu proces oczyszczania moŝe postępować dalej, ale tym razem stęŝenie bakterii jest wyŝsze, poniewaŝ znajdują się w mniejszej objętości. Roztwór 1 jest buforem zapobiegającym denaturacji kolistego DNA w postaci plazmidu, która by nastąpiła, gdyby ph wzrosło powyŝej 12,6. 3. Dodać 200 µl roztworu 2 i delikatnie wymieszać, odwracając. ROZTWÓR 2 Co się dzieje? Roztwór 2 zawierający detergent niszczy błony fosfolipidowe bakterii, uwalniając całą zawartość komórek do poŝywki w trakcie procesu zwanego lizą bakteryjną. Ten roztwór zawiera takŝe silną zasadę (wodorotlenek sodu, NaOH) denaturującą białka podtrzymujące strukturę błony komórkowej i własne DNA bakterii. Niemniej jednak plazmidowe DNA pozostaje nienaruszone, poniewaŝ ph wynosi poniŝej 12,6. InŜynieria genetyczna - 17 -
4. Dodać 150 µl roztworu 3 i wymieszać, odwracając. ROZTWÓR 3 Co się dzieje? Roztwór 3 jest kwaśnym roztworem octanu sodu, który neutralizuje ph roztworu i zatrzymuje proces lizy. Na tym etapie większość zawartości komórek białka, fosfolipidy błon i własne DNA bakterii wytrąca się, tworząc białą zawiesinę. Własne DNA bakterii, teraz zdenaturowane, tworzy nierozpuszczalny kompleks, który się wytrąca, poniewaŝ jony K + wiąŝą się z grupami fosforanowymi DNA i w ten sposób neutralizują ich ujemny ładunek. 5. Dodać 300 µl chloropanu, dobrze wymieszać, odwracając i wirować przez 3 minuty przy maksymalnej prędkości, aby oddzielić plazmid zawarty w genie od MYLIP. Co się dzieje? W tym etapie plazmidowe DNA zostaje oddzielone od pozostałości komórkowych białek, lipidów i innych kwasów nukleinowych. Chloropan jest CHLOROPAN mieszaniną rozpuszczalników organicznych zawierającą fenol i chloroform. Te rozpuszczalniki rozpuszczają cząsteczki hydrofilne, takie jak błony lipidowe, i denaturują białka, w wyniku czego stają się one nierozpuszczalne w wodzie. Dzięki wirowaniu mieszanina zostaje podzielona na dwie fazy: fosfolipidy i białka komórkowe pozostają w roztworze w dolnej fazie z chloropanem lub znajdują się na powierzchni między fazami w postaci białej, wytrąconej zawiesiny. Plazmidowe DNA będzie się znajdować się w górnej fazie wodnej, poniewaŝ jego ładunki elektryczne nie zostały zneutralizowane i tym samym jest rozpuszczalne w wodzie. 6. Za pomocą pipety 200 µl naleŝy przenieść górną, przezroczystą fazę wodną do nowej probówki. InŜynieria genetyczna - 18 -
7. Za pomocą pipety 200 µl dodać 900 µl 100% etanolu i dobrze wymieszać. Po dodaniu etanolu plazmidowe DNA wytrąca się z roztworu wodnego. gen oporności na ampicylinę 8. Wirować przez 5 minut przy maksymalnej prędkości. Widoczny wytrącony osad będzie zawierać DNA w postaci plazmidu. 9. Pipetą 200 µl odciągnąć CAŁY etanol. 10. Zawiesić osad z plazmidowym DNA w 20 µl oczyszczonej H 2 O. InŜynieria genetyczna - 19 -
Wyniki i omówienie 1. Wykonaj diagram procesu transformacji bakteryjnej i objaśnij, jaką pełni rolę w badaniach nad poszukiwaniem nowych leków w celu walki z miaŝdŝycą. 2. Korzystając z diagramu, objaśnij, czym jest szok cieplny. 3. W celu prowadzenia hodowli bakterii korzystałeś z płytki hodowlanej zawierającej antybiotyk. Dlaczego? 4. Czym jest kolonia bakteryjna? 5. Na której z dwóch płytek z naniesionymi bakteriami będą widoczne kolonie na płytce kontrolnej czy na płytce zawierającej stransformowane bakterie? Dlaczego? InŜynieria genetyczna - 20 -
6. W jaki sposób otrzymywanych jest wiele kopii docelowego genu z wykorzystaniem powstałych kolonii? 7. W jaki sposób wytrąca się bakteryjne DNA i docelowe DNA? Objaśnienie naleŝy podeprzeć diagramem. 8. Stosując metodę separacji o nazwie Mini-prep, wyizolowałeś wiele kopii docelowego DNA. Co naukowcy robią, gdy otrzymają takie DNA? Badacze, którzy pracowali nad przygotowaniem tego protokołu: Theresa León, Jonathan Matalonga, Uniwersytet w Barcelonie AUTOR: FINANSOWANIE PARTNERZY PROJEKTU: Niniejszy produkt jest udostępniany na licencji Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported. Kopię licencji przedstawiono na stronie http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ InŜynieria genetyczna - 21 -