Ocena wybranych parametrów stresu oksydacyjnego u chorych z nadczynnością tarczycy

Ocena wybranych parametrów stresu oksydacyjnego u chorych z nadczynnością tarczycy The evaluation of selected oxidative stress parameters in patients with hyperthyroidism Grzegorz Andryskowski, Tomasz Owczarek Klinika Chorób Wewnętrznych z Oddziałem Farmakologii Klinicznej i Terapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny, Łódź Streszczenie: Wprowadzenie. Hipertyreoza powoduje przyspieszenie podstawowej przemiany materii oraz zwiększa zużycie tlenu przez komórki, a w konsekwencji prowadzi do nasilenia powstawania reaktywnych form tlenu (RFT) i zaburzenia równowagi oksydacyjno-redukcyjnej w organizmie. Cele. Celem badania była analiza wybranych parametrów stresu oksydacyjnego u chorych z nadczynnością tarczycy poprzez: ocenę aktywności enzymów neutralizujących RFT dysmutazy ponadtlenkowej (superoxide dismutase SOD), peroksydazy glutationowej (glutathione peroxidase GSHPx) i katalazy (catalase CAT), ocenę natężenia procesów wolnorodnikowych stężenie malonylodialdehydu (malondialdehyde MDA), zawartość grup tiolowych (sulfhydryl groups SH) w białkach błony komórkowej erytrocytów oraz określenie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza (total antioxidant status TAS). Pacjenci i metody. Badaniem objęto 27 pacjentów leczonych z powodu nadczynności tarczycy oraz 12 osób zdrowych stanowiących grupę kontrolną. Aktywność SOD, GSHPx, CAT, MDA oraz zawartość grup SH oznaczano w erytrocytach, a TAS w osoczu krwi. Wyniki. Osoby z nadczynnością tarczycy w porównaniu z osobami zdrowymi charakteryzowały się większą aktywnością GSHPx w erytrocytach, mniejszą TAS, mniejszą zawartością grup SH w białkach oraz mniejszym stężeniem MDA w erytrocytach. Aktywność SOD i CAT nie różniła się istotnie w obu grupach. Wnioski. Uzyskane w badaniu wyniki wskazują, że hipertyreoza nasila stres oksydacyjny powodując zaburzenie równowagi oksydacyjnoredukcyjnej organizmu. Leczenie tyreostatykami, jeśli nie prowadzi do całkowitego wyrównania metabolicznego, może zmniejszyć, lecz nie eliminuje całkowicie zaburzeń równowagi oksydacyjno-redukcyjnej wywołanych hipertyreozą. Słowa kluczowe: nadczynność tarczycy, równowaga oksydacyjno-redukcyjna, stres oksydacyjny Abstract: Introduction. Hyperthyroidism induces the acceleration of the basic metabolism and increases cellular oxygen utilization, consequently intensifies reactive oxygen species production and disturbs the oxidantantioxidant balance. Objectives. The objective of this study was to evaluate the selected oxidative stress parameters in patients with hyperthyroidism by analysis of the reactive oxygen species neutralizing enzymes activity superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSHPx) and catalase (CAT), the estimation of free radical processes intensity concentration of malondialdehyde (MDA), sulfhydryl groups (SH) in proteins and by quantification of the serum total antioxidant status (TAS). Patients and methods. Twenty-seven patients treated for hyperthyroidism and 12 healthy individuals were enrolled in the study. Enzyme activity (SOD, GSHPx, CAT), MDA and concentration of SH groups were analysed in erythrocytes, while TAS was measured in serum. Results. Patients with hyperthyroidism compared with healthy subjects were characterized by a higher GSHPx activity in erythrocytes, lower serum TAS, the lower content of SH groups in proteins and the lower MDA concentration in erythrocytes. Conclusions. Our results suggest that hyperthyroidism increases oxidative stress and disturbs oxidant-antioxidant balance in the body. Thyreostatic treatment, if it does not lead total metabolic correction, can only reduce oxidant-antioxidant disorder, but it does not eliminate it entirely. Key words: hyperthyroidism, oxidant-antioxidant balance, oxidative stress Ocena wybranych parametrów stresu oksydacyjnego u chorych z nadczynnością tarczycy 285

WPROWADZENIE Wiele badań klinicznych i doświadczeń na modelach zwierzęcych wskazuje, że stres oksydacyjny jest ważnym elementem patogenezy licznych zmian chorobowych oraz fizjologicznego procesu starzenia się tkanek [1,2]. Stres oksydacyjny to według Siesa nadmierne przesunięcie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej w kierunku reakcji utleniania [3]. Bartosz eksponuje rolę zwiększenia stężenia reaktywnych form tlenu (RFT) jako głównego czynnika odpowiedzialnego za utlenianie biomolekuł [1]. Naturalnym źródłem reaktywnych form tlenu w organizmie człowieka jest mitochondrialny łańcuch oddechowy. Około 1 4% tlenu zużywanego przez mitochondria ulega jednoelektronowej redukcji na skutek zjawiska przecieku elektronów z łańcucha oddechowego, tworząc rodnik ponadtlenkowy. Na procesy utleniania tkankowego istotny wpływ regulacyjny wywierają hormony tarczycy. Nadmierne ich stężenie prowadzi do przyspieszenia podstawowej przemiany materii oraz zwiększonego zużycia tlenu przez komórki [4]. Konsekwencją hipertyreozy jest więc nasilenie endogennej syntezy RFT prowadzącej do stresu oksydacyjnego [4,5]. Celem pracy było określenie wpływu nadczynności tarczycy na parametry stresu oksydacyjnego poprzez analizę aktywności enzymów antyoksydacyjnych w erytrocytach dysmutazy ponadtlenkowej (superoxide dismutase SOD), peroksydazy glutationowej (glutathione peroxidase GSHPx) i katalazy (catalase CAT), analizę wskaźników ilustrujących nasilenie procesów wolnorodnikowych w organizmie stężenie malonylodialdehydu (malondialdehyde MDA), zawartość grup tiolowych (sulfhydryl groups SH) w białkach oraz oznaczenie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza (total antioxidant status TAS). PACJENCI I METODY Badaniem objęto 39 osób (25 kobiet i 14 mężczyzn) w wieku 27 78 lat. U 27 osób z tej grupy stwierdzono nadczynność tarczycy (choroba Gravesa-Basedowa, wole guzkowe nadczynne, pojedynczy guzek autonomiczny). Wszyscy chorzy z tej grupy zostali zakwalifikowani do leczenia radiojodem i w okresie poprzedzającym radiojodoterapię byli leczeni tiamazolem w dawce 5 mg/d. Tiamazol odstawiano na 3 dni przed podaniem radiojodu. Grupa kontrolna liczyła 12 osób zdrowych, u których stężenie tyreotropiny (TSH) w surowicy mieściło się w granicach normy. Adres do korespondencji: lek. Tomasz Owczarek, Klinika Chorób Wewnętrznych z Oddziałem Farmakologii Klinicznej i Terapii Monitorowanej, Uniwersytet Medyczny, ul. Kniaziewicza 1/5, 91-347 Łódź, tel./fax: 042-651-10-59, e-mail: owczarek.tomasz@wp.pl Praca wpłynęła: 22.05.2007. Przyjęta do druku: 10.08.2007. Nie zgłoszono sprzeczności interesów. Pol Arch Med Wewn. 2007; 117 (7): 285-289 Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 2007 Tabela 1. Charakterystyka badanych grup Grupa kontrolna n = 12 Grupa badana n = 27 wiek (lata) 47,7 ±15,4 56,9 ±14,1 TSH (norma: 0,3 5,0 μiu/ml) 1,14 ±0,79 0,24 ±0,32* FT 3 (norma: 2,3 6,0 pg/ml) 3,79 ±1,29 FT 4 (norma: 8,5 17 pg/ml) 18,01 ±4,24 choroba Gravesa-Basedowa 13 wole guzkowe nadczynne 8 pojedynczy guzek nadczynny 6 nadciśnienie tętnicze 2 8 choroba niedokrwienna serca 2 3 migotanie przedsionków 1 3 niewydolność serca NYHA I-II 1 * p <0,005 FT 3 wolna trijodotyronina, FT 4 wolna tyroksyna, TSH tyreotropina Z badania wyłączone zostały osoby z ciężką niewydolnością krążenia, cukrzycą, ostrym zespołem wieńcowym przebytym w ciągu ostatniego roku, chorobą nowotworową, niewydolnością wątroby, niewydolnością nerek, schorzeniami wymagającymi leczenia przeciwzapalnego (niesteroidowe leki przeciwzapalne, glikokortykosteroidy) oraz licznymi schorzeniami wymagającymi polifarmakoterapii. Charakterystykę badanych grup przedstawiono w tabeli 1. Od osób biorących udział w badaniu pobrano po 4 ml krwi żylnej, w której oznaczano następujące parametry: 1) aktywność SOD (EC 1.15.1.1.) w erytrocytach metodą Misra i Fridovich [6] 2) aktywność CAT (EC 1.11.1.6.) w erytrocytach metodą Beersa i Sizera [7] 3) aktywność GSHPx (EC 1.11.1.9.) w erytrocytach metodą Little i O Brien [8] 4) stężenie MDA w erytrocytach metodą Placera i wsp. [9] 5) stężenie grup SH białek za pomocą odczynnika Ellmana według Rice-Evansa i wsp. [10] 6) TAS według Benzie i Strain [11] w modyfikacji Bartosza [1]. Wyniki opracowano statystycznie wyznaczając średnią arytmetyczną, odchylenie standardowe i medianę. Testem Kołmogorowa i Smirnowa sprawdzano, czy rozkład wartości był zgodny z rozkładem normalnym. Znamienność statystyczną oceniano testem U Manna i Whitney a gdy rozkład wartości nie spełniał warunków rozkładu normalnego. Na przeprowadzenie eksperymentu medycznego uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Nr RNN/42/04/KB. 286 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)

Tabela 2. Porównanie wybranych parametrów stresu oksydacyjnego u chorych z nadczynnością tarczycy i u osób zdrowych Parametr Jednostka Grupa kontrolna dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) peroksydaza glutationowa (GSHPx) średnia n = 12 odchylenie standardowe Grupa badana n = 27 mediana średnia odchylenie standardowe mediana U/g Hgb 2819 651 2954 3139 583 3107 0,45* U/g Hgb 1,61 1,55 0,88 11,21 10,20 8,38 <0,001** katalaza (CAT) U/g Hgb 20,59 5,31 19,42 18,17 4,21 18,53 0,77* malonylodialdehyd (MDA) grupy tiolowe w białkach (SH) całkowita zdolność antyoksydacyjna osocza (TAS) μmol/g Hgb 0,190 0,045 0,198 0,138 0,040 0,14 <0,05* nmol/mg 1,04 0,14 1,06 0,88 0,14 0,89 <0,05* jednoelektrodowe równoważniki Troloksu * Znamienność statystyczną oceniano testem Kołmogorowa-Smirnowa. ** Znamienność statystyczną oceniano testem U Manna-Whitney a. Hgb hemoglobina 2,14 1,58 1,38 1,09 0,77 0,85 <0,05** p WYNIKI U chorych z nadczynnością tarczycy, pomimo leczenia tyreostatykiem (tiamazolem) powodującym uzyskanie stężeń hormonów tarczycy oraz TSH zbliżonych do wartości prawidłowych, zaobserwowano wyraźne zaburzenie równowagi oksydacyjno-redukcyjnej w porównaniu z osobami zdrowymi. Chorzy z nadczynnością tarczycy mieli względem osób zdrowych większą aktywność GSHPx w erytrocytach (11,21 ±10,20 vs 1,61 ±1,55 U/g hemoglobiny [Hgb]; p <0,001), zmniejszoną zawartość grup SH w białkach (0,88 ±0,14 vs 1,04 ±0,14 nmol/mg; ) oraz mniejszą TAS (1,09 ±0,77 vs 2,14 ±1,58; ). Stężenie MDA u chorych z nadczynnością tarczycy wynosiło 0,138 ±0,040 μmol/g Hgb, podczas gdy w grupie porównawczej 0,190 ±0,045 μmol/g Hgb (). Wszystkie wymienione różnice w parametrach stresu oksydacyjnego były statystycznie znamienne. Różnice aktywności SOD oraz CAT w erytrocytach pomiędzy badanymi grupami nie osiągnęły istotności statystycznej (tab. 2). OMÓWIENIE Stan równowagi oksydacyjno-redukcyjnej w organizmie jest uzależniony od wielu czynników. Z jednej strony od destrukcyjnego wpływu reaktywnych form tlenu, takich jak anionorodnik ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru czy rodnik hydroksylowy, oraz innych czynników utleniających. Z drugiej od efektywności szeregu mechanizmów chroniących organizm przed wpływem wolnych rodników. Istnieje system enzymów katalizujących neutralizację wolnych rodników (SOD, CAT, GSHPx); oprócz tego istnieje wiele związków o właściwościach antyoksydacyjnych. Z uwagi na ich charakter dzielimy je na: hydrofilowe (chroniące środowisko wodne organizmu) askorbiniany, kwas moczowy, glutation, albumina, kreatynina, oraz hydrofobowe (chronią błony białkowo-lipidowe) tokoferole, karotenoidy, bilirubina, pochodne estradiolu. Mogą one dezaktywować wolne rodniki, wiązać kwasy tłuszczowe, jony metali lub same reagować z rodnikami powodując wytworzenie nietoksycznych produktów. Głównym źródłem RFT w organizmie jest mitochondrialny łańcuch oddechowy, w którym na drodze cyklu reakcji dochodzi do czteroelektronowej redukcji cząsteczki tlenu z wytworzeniem porcji energii magazynowanej w postaci ATP. Kilka procent cząsteczek tlenu jest jednak redukowanych jednoelektronowo, czego konsekwencją jest powstanie anionorodnika ponadtlenkowego. Hormony tarczycy wykazują wielokierunkowy wpływ na ustrój człowieka. Między innymi wpływają na poziom podstawowej przemiany materii nadprodukcja hormonów tarczycy powoduje zwiększenie się szybkości przemian metabolicznych i zużycia tlenu przez komórki. Ilustracją tych procesów jest obserwowany u osób z hipertyreozą wzrost ilości mitochondriów w komórkach, zwiększenie ich rozmiarów oraz liczby grzebieni, a także zmiany degeneracyjne mitochondriów [4,12,13]. W przebiegu tyreotoksykozy badacze obserwowali zarówno zwiększone stężenie RFT w organizmie anionorodnika ponadtlenkowego [14] oraz nadtlenku wodoru [15], jak również zwiększoną aktywność enzymów biorących udział w eskalacji procesów wolnorodnikowych, takich jak oksydaza ksantynowa [16] czy oksydaza NADPH [17]. Wiele badań poświęcono ocenie pośrednich wykładników równowagi oksydacyjno-redukcyjnej w stanie hipertyreozy, takich jak stężenie produktów Ocena wybranych parametrów stresu oksydacyjnego u chorych z nadczynnością tarczycy 287

% 600 500 400 300 200 100 0 100 SOD 11 p = 0,45 GSHPx 596 p <0,001 CAT MDA SH TAS 12 p = 0,77 27 15 49 Ryc. Różnice procentowe badanych parametrów u pacjentów z nadczynnością tarczycy w porównaniu do grupy kontrolnej. CAT katalaza, GSHPx peroksydaza glutationowa, MDA malonylodialdehyd, SH grupy tiolowe w białkach, SOD dysmutaza ponadtlenkowa, TAS całkowita zdolność antyoksydacyjna osocza peroksydacji lipidów, stężenie związków o własnościach antyoksydacyjnych, aktywność enzymów neutralizujących RFT czy TAS. Kilka z wymienionych parametrów było przedmiotem oceny również w badaniu własnym. Podstawową linią obrony organizmu przed szkodliwym działaniem reaktywnych form tlenu są: SOD, GSHPx oraz CAT. Aktywność SOD w erytrocytach pacjentów leczonych z powodu nadczynności tarczycy była o 11% większa niż w zdrowej populacji, różnica ta nie osiągnęła jednak znamienności statystycznej (ryc.). Istotnie większa była natomiast aktywność GSHPx w erytrocytach osób z hipertyreozą (11,21 U/g Hgb vs 1,61 U/g Hgb, p <0,001). Nie stwierdzono natomiast znamiennej różnicy pod względem aktywności CAT w obu badanych grupach. Analizując dostępną literaturę należy zauważyć, że wyniki badań aktywności enzymów antyoksydacyjnych w nadczynności tarczycy są sprzeczne. Część badaczy oceniających aktywność SOD w erytrocytach osób z nadczynnością tarczycy notowało jej zmniejszenie [18,19], inni natomiast obserwowali zwiększenie aktywności SOD [20,21]. Aktywność GSHPx u pacjentów z nadczynnością tarczycy oceniała Komosinska-Vassev i wsp. [20] obserwując jej zwiększenie, podczas gdy inni badacze stwierdzali zmiejszoną aktywność tego enzymu w podobnych grupach [18,22,23]. Również aktywność CAT obserwowana u pacjentów z hipertyreozą w jednych badaniach była zwiększona [20,23], a w innych zmniejszona [24] w porównaniu z populacją osób zdrowych. Autorzy badań, podczas których chorzy leczeni byli tyreostatykami podkreślali, że po uzyskaniu eutyreozy aktywność badanych enzymów osiągała poziom porównywalny z aktywnością obserwowaną w grupach porównawczych, bez względu na to, czy aktywności wyjściowe enzymów były zwiększone, czy też zmniejszone [20,22,23]. Kolejnym elementem bariery antyoksydacyjnej w organizmie są związki drobnocząsteczkowe. Stężenie tych związków możemy oznaczać oddzielnie (askorbiniany, tokoferole, glutation), bądź też bez wyodrębniania składowych bariery jako TAS. Głównym elementami stanowiącymi o aktywności przeciwutleniającej osocza są: stężenie kwasu moczowego w surowicy oraz zawartość grup SH w białkach osocza [1]. W badaniu własnym TAS u osób z nadczynnością tarczycy była o 49% mniejsza niż w grupie porównawczej. Inni badacze również obserwowali redukcję całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza w warunkach hipertyreozy [18,20]. Często ocenianymi parametrami w badaniach ilustrujących natężenie stresu oksydacyjnego w organizmie są produkty peroksydacji lipidów. RFT utleniając lipidy głównie fosfolipidy błon komórkowych powodują utratę ich fizjologicznej funkcji, a ponadto prowadzą do powstawania licznych, toksycznych dla organizmu nadtlenków lipidów oraz ich metabolitów, które same również zdolne są do uszkadzania białek i DNA [1]. Jednym ze związków chemicznych, który powstaje w procesie peroksydacji lipidów, jest MDA. Uważa się, że istnieje silna zależność między stężeniem hormonów tarczycy a nasileniem peroksydacji lipidów zarówno u ludzi, jak i u zwierząt [25] świadczą o tym obserwowane duże stężenia MDA u osób z nadczynnością tarczycy [20-22,26]. Badanie własne nie potwierdziło tej zależności stężenie MDA u pacjentów z nadczynnością tarczycy było znamiennie mniejsze o 37% niż u osób zdrowych (0,190 μmol/g Hgb vs 0,138 μmol/g Hgb, ). Należy jednak podkreślić, iż w wyniku terapii tyreostatykami stężenie hormonów tarczycy u osób chorych tylko nieznacznie przekraczało zakres normy. Ponadto obserwacja ta nie jest zupełnie odosobniona Mano i wsp. [27] wykazali redukcję stężenia produktów peroksydacji lipidów u zwierząt z indukowaną jatrogennie nadczynnością tarczycy. Ostatnim ocenianym parametrem była zawartość grup tiolowych w białkach osocza, które są szczególnie podatne na działanie wolnych rodników. Grupy SH w wyniku utlenienia tworzą mostki disulfidowe, co może zmienić strukturę i funkcje fizjologiczną białka. Białka osocza zawierające grupy SH pełnią funkcję ochronną względem innych, cenniejszych molekuł, gdyż grupy SH łatwo ulegają naprawie w procesie redukcji, zaś silnie uszkodzone przez wolne rodniki białka bez uszczerbku dla organizmu ulegają proteolitycznej degradacji. Zmniejszenie zawartości grup tiolowych w białkach osocza jest wyznacznikiem nasilenia procesów wolnorodnikowych [1]. Takie właśnie wyniki uzyskano w niniejszym badaniu. Grupa chorych z nadczynnością tarczycy charakteryzowała się mniejszą o 15% zawartością grup SH w białkach w porównaniu do osób z eutyreozą (1,04 nmol/mg vs 0,88 nmol/mg, ). Podobną obserwację poczynili Ademoglu i wsp. [28], obserwując zmniejszenie się o 37% zawartości grup SH w surowicy u osób z chorobą Gravesa-Basedowa w odniesieniu do grupy kontrolnej. 288 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)

Podsumowując, uzyskane wyniki wskazują, że: 1) hipertyreoza nasila stres oksydacyjny powodując zaburzenie równowagi oksydacyjno-redukcyjnej organizmu, czego ilustracją jest zwiększenie aktywności peroksydazy glutationowej, zmniejszenie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza oraz zmniejszenie zawartości grup tiolowych w białkach osocza 2) leczenie tyreostatykami, jeśli nie prowadzi do całkowitego wyrównania metabolicznego, może zmniejszyć, lecz nie eliminuje zupełnie zaburzeń równowagi oksydacyjno-redukcyjnej wywołanych hipertyreozą. PODZIĘKOWANIA Praca była finansowana z grantu przyznanego przez Urząd Miasta w Łodzi (nr 502-15-634). 20. Komosinska-Vassev K, Olczyk K, Kucharz EJ, et al. Free radical activity and antioxidant defense mechanisms in patients with hyperthyroidism due to Graves disease during therapy. Clin Chim Acta. 2000; 300: 107-117. 21. Seven A, Tasan E, Hatemi H, et al. The impact of propylthiouracil therapy on lipid peroxidation and antioxidant status parameters in hyperthyroid patients. Acta Med Okayama. 1999; 53: 27-30. 22. Ademoglu E, Gokkusu C, Yarman S, et al. The effect of methimazole on the oxidant and antioxidant system in patients with hyperthyroidism. Pharmacol Res. 1998; 38: 93-96. 23. Bednarek J, Wysocki H, Sowinski J. Oxidative stress peripheral parameters in Graves disease: the effect of methimazole treatment in patients with and without infiltrative ophthalmopathy. Clin Biochem. 2005; 38: 13-18. 24. Guerra LN, Moiguer S, Karner M, et al. Antioxidants in the treatment of Graves disease. IUBMB Life. 2001; 51: 105-109. 25. Costantini F, Pierdomenico SD, De Cesare D, et al. Effect of thyroid function on LDL oxidation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998; 18: 732-737. 26. Bianchi G, Solaroli E, Zaccheroni V, et al. Oxidative stress and anti-oxidant metabolites in patients with hyperthyroidism: effect of treatment. Horm Metab Res. 1999; 31: 620-624. 27. Mano T, Sinohara R, Sawai Y, et al. Changes in lipid peroxidation and free radical scavengers in the brain of hyper- and hypothyroid aged rats. J Endocrinol. 1995; 147: 361-365. 28. Ademoglu E, Ozbey N, Erbil Y, et al. Determination of oxidative stress in thyroid tissue and plasma of patients with Graves disease. Eur J Intern Med. 2006; 17: 545-550. PIŚMIENNICTWO 1. Bartosz G. Druga twarz tlenu. PWN. Warszawa 2003. 2. Slater TF, Cheeseman KH, Davies MJ, et al. Free radical mechanisms in relation to tissue injury. Proceedings of the Nutrition Society. 1987; 46: 1-12. 3. Sies H. Oxidative Stress. New York, Academic Press, 1985. 4. Wiktorska JA, Sewerynek E, Lewinski A. Wpływ stanu tyreometabolicznego na proces peroksydacji lipidów (I): hipertyreoza. Clin Exp Med Lett. 2006; 47: 9-15. 5. Videla LA. Energy metabolism, thyroid calorigenesis, and oxidative stress: functional and cytotoxic consequences. Redox Report. 2000; 5: 265-275. 6. Misra HP, Fridovich J. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay superoxide dismutase. J Biol Chem. 1972; 247: 3170-3175. 7. Beers RF Jr, Sizer IW. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 1952; 195: 133-140. 8. Little C, O Brien P. An intracellular GSH peroxidase with a lipid peroxide substrate. Biochem Biophys Res Commun. 1968; 31: 145-150. 9. Placer ZA, Cushman LL, Johnson BC. Estimation of product of lipid peroxidation (malonyl dialdehyde) in biochemical systems. Anal Biochem. 1966; 16: 359-364. 10. Rice-Evans CA, Diplock AT, Symons MCR. Techniques in free radicals research. In: Burdon RH, van Knippenberg PH, eds. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Amsterdam, London, New York, Tokyo, Elsevier, 1991. 11. Benzie IF, Strain JJ. Ferric reducing/antioxidant power assay: direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration. Methods Enzymol. 1999; 299: 15-27. 12. Paget GE, Torp JM. An effect of thyroxin on the fine structure of the rat liver cell. Nature. 1963; 199: 1307-1308. 13. Wajdowicz A, Dąbroś W, Zaczek M. Myocardial damage in thyrotoxicosis ultrastructural studies. Pol J Pathol. 1996; 47: 127-133. 14. Nishizawa Y, Fushiki S, Amakata Y, et al. Thyroxine-induced production of superoxide anion by human alveolar neutrophils and macrophages: a possible mechanism for the exacerbation of bronchial asthma with the development of hyperthyroidism. In Vivo. 1998; 12: 253-257. 15. Bednarek J, Wysocki H, Sowinski J. The effect of one-month antithyroid therapy on peripheral metabolism of reactive oxygen species in Graves disease with infiltrative ophthalmopathy. Przegl Lek. 2004; 61: 841-844. 16. Huh K, Kwon TH, Kim JS, et al. Role of the hepatic xanthine oxidase in thyroid dysfunction: effect of thyroid hormones in oxidative stress in rat liver. Arch Pharm Res. 1998; 21: 236-240. 17. Fernandez V, Barrientos X, Kipreos K, et al. Superoxide radical generation, NADPH oxidase activity, and cytochrome P-450 content of rat liver microsomal fractions in an experimental hyperthyroid state: relation to lipid peroxidation. Endocrinology. 1985; 117: 496-501. 18. Mayer L, Romic Z, Skreb F, et al. Antioxidants in patients with hyperthyroidism. Clin Chem Lab Med. 2004; 42: 154-158. 19. Wilson R, Chopra M, Bradley H, et al. Free radicals and Graves disease: the effects of therapy. Clin Endocrinol (Oxf). 1989; 30: 429-33. Ocena wybranych parametrów stresu oksydacyjnego u chorych z nadczynnością tarczycy 289