IMMUNOGENETYKA Anna Werner Efekt końcowy Po zakończeniu seminarium powinieneś umieć: zdefiniować pojęcie antygenu oraz przedstawić budowę i proces powstawania przeciwciał, wyjaśnić na czym polega odporność humoralna i komórkowa, określić typy i rodzaje przeszczepów oraz omówić antygeny transplantacyjne, opisać mechanizmy odrzucania przeszczepu oraz wyjaśnić na czym polega reakcja przeszczep przeciwko biorcy, opisać zjawisko immunosupresji, przedstawić kierunki rozwoju transplantologii. Wraz z postępem rozwoju technik biologii molekularnej znacząco wzrosła wiedza o genetycznych uwarunkowaniach działania układu immunologicznego. Obszarem zainteresowań immunogenetyki są genetyczne uwarunkowania mechanizmów odpowiedzi immunologicznej organizmu. Odpowiedź immunologiczna Zasadniczym elementem, dzięki któremu układ odpornościowy rozpoznaje i neutralizuje intruzów (bakterie, wirusy, pasożyty), jest duża cząsteczka białkowa przeciwciało (immunoglobulina). Każdy rodzaj immunoglobulin rozpoznaje tylko jeden antygen, a właściwie jedną z determinant antygenowych (epitopów) znajdujących się na powierzchni antygenu. Antygenem jest każdy związek chemiczny, który charakteryzuje się następującymi cechami: immunogennością, czyli wywołaniem swoistej odpowiedzi immunologicznej, przejawiającej się wytworzeniem przeciwciał i uczulonych limfocytów oraz antygenowością, czyli zdolnością do reakcji z produktami odpowiedzi immunologicznej. Po stymulacji antygenem może powstawać wiele rodzajów przeciwciał, dostosowanych do różnych epitopów. Pomimo tej dużej różnorodności wszystkie immunoglobuliny zbudowane są według jednego schematu. Każde przeciwciało składa się z 2 łańcuchów lekkich L (κ lub λ) i 2 łańcuchów ciężkich H, połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi (ryc. 1). V L J L C L V H D H J H C H C H C H V H D H J H C H C H C H V L J L C L Rycina 1. Struktura immunoglobuliny. Każdy łańcuch (L i H) składa się z części zmiennej V (odpowiednio V H i V L ) i stałej C (C H i C L ). Część stała jest wspólna dla wielu immunoglobulin, natomiast przeciwciała wiążące różne antygeny mają różne części zmienne. Część zmienna łańcucha L jest kodowana 1
przez dwie grupy genów V i J, a część stała przez gen C. Na chromosomie 2 są geny kodujące łańcuchy lekkie κ, na chromosomie 22 geny kodujące łańcuch lekki λ, a na chromosomie 14 znajdują się geny kodujące łańcuch ciężki immunoglobulin. Dotychczas zidentyfikowano około 300 genów V i 5 genów J kodujących V L oraz 200 genów V, 12 genów D i 4 geny J kodujące V H. Podczas produkcji immunoglobuliny, w DNA limfocytu B, następuje zbliżenie przypadkowo wybranego genu V do jednego z genów J na drodze rekombinacji (rearanżacji). W ten sposób powstaje pojedynczy duży gen, który koduje V L i który podlega transkrypcji wraz z genem kodującym C. Informacyjny RNA (mrna) nie może być wykorzystany bezpośrednio do syntezy białka, ponieważ przepisaniu uległ również zbędny odcinek DNA leżący pomiędzy genem VJ i genem C. Dopiero po jego wycięciu powstaje dojrzały mrna, na matrycy, którego syntetyzowany jest lekki łańcuch immunoglobuliny. Łańcuch ciężki immunoglobuliny powstaje na podobnej zasadzie jak łańcuch lekki (rycina 2). Jednak główną różnicą jest obecność dodatkowej grupy genów D, zlokalizowanej pomiędzy genami V i J. W ten sposób powstaje zrekombinowany gen VDJ kodujący V H. Zarodkowe DNA V1 V2 Vn D1 D2 Dn J1 J2 J3 J4 C DNA limfocytu B Rekombinacja (rearanżacja) V1 V2 D2 J3 J4 C Transkrypcja m RNA V2 D2 J3 C Modyfikacja RNA m RNA V2 D2 J3 C Translacja Białko łańcuch immunoglobulinowy ciężki V C Rycina 2. Rekombinacja somatyczna genów immunoglobulinowych na przykładzie genów kodujących łańcuch ciężki (wg Gołąb i wsp. 2006). Geny determinujące immunoglobiny nie rekombinują równocześnie; najpierw rearanżacji i ekspresji ulegają geny kodujące łańcuch ciężki, a później geny kodujące łańcuch lekki. Zatem w cytoplazmie prekursora limfocytu B można znaleźć jedynie łańcuchy ciężkie, ponieważ dopiero na etapie limfocytu B dochodzi do powstania łańcuchów lekkich. W pełni funkcjonalna cząsteczka przeciwciała powstaje dopiero po połączeniu się łańcucha lekkiego z ciężkim. Zdolność ludzkiego układu immunologicznego do wytworzenia wielu różnych rodzajów przeciwciał jest zdumiewająca. Taka różnorodność immunoglobulin jest możliwa dzięki różnej liczbie genów V (D) J kodujących V H i V L, rekombinacji tych genów, różnym kombi- 2
nacjom łączenia łańcuchów H i L, zmienności na złączach pomiędzy genami V-J, V-D, D-J oraz dzięki mutacjom somatycznym. Układ immunologiczny tworzy system wzajemnie powiązanych ze sobą komórek, tkanek i narządów. Zdolność rozróżniania tego co swoje od tego co nie swoje nabywana jest w czasie rozwoju embrionalnego; jest to okres adaptacyjny, który trwa u człowieka do 6 miesiąca życia płodowego. W tym okresie organizm uzyskuje trwałą tolerancję immunologiczną dla własnych antygenów (autoantygenów). Drugi okres immunogenezy (okres neutralny) trwa od około 6 miesiąca życia płodowego do około 3 miesiąca życia po urodzeniu. Indukcja tolerancji immunologicznej w tym okresie nie jest już możliwa i organizm nie jest wtedy jeszcze zdolny do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny. Do końca okresu neutralnego obce antygeny nie są niszczone np. przeszczep allogeniczny, a nawet ksenogeniczny, będzie traktowany jak własny narząd, aż do następnego okresu, w którym rozpocznie się odrzut przeszczepu. Trzeci okres immunogenezy (dojrzałości układu immunologicznego) trwa od około 3 miesiąca życia do starości. Obce antygeny zewnętrzne (wirusy, bakterie, grzyby, pasożyty, antygeny przeszczepu) oraz wewnętrzne (komórki nowotworowe), są niszczone przez układ odpornościowy. Wprowadzenie obcej substancji do organizmu powoduje wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Wyróżniamy dwa typy odpowiedzi immunologicznej: humoralną i komórkową. Odpowiedź typu humoralnego związana jest z wytwarzaniem przeciwciał przez limfocyty B we krwi, limfie i płynach tkankowych. Jest to podstawowy mechanizm obronny przeciwko zewnątrzkomórkowym mikroorganizmom i toksynom. Powstały kompleks antygen-przeciwciało aktywuje białka układu dopełniacza, które powodują lizę tego kompleksu. Odpowiedź typu komórkowego związana jest z bezpośrednią reakcją limfocytów T z antygenem. Ten typ odpowiedzi nazywa się także odpowiedzią późną, ponieważ lokalne podanie antygenu powoduje naciekanie przez komórki miejsca podania antygenu dopiero po 24 godzinach. Odpowiedź typu komórkowego zapewnia ochronę przeciwko wewnątrzkomórkowym mikroorganizmom, nieosiągalnym dla krążących przeciwciał. Cytotoksyczne limfocyty T (Tc) po przyłączeniu się do komórki zaatakowanej przez patogen, powodują jej lizę. Natomiast pomocnicze limfocyty T (T H ) wydzielają cytokiny pobudzające odpowiedź typu humoralnego i komórkowego (rycina 3). Odpowiedź humoralna Limfocyt B Limfocyt T H Komórka plazmatyczna ү ү Komplement ү ү џ џ Liza komórki Limfocyt T C Aktywny limfocyt T C Zakażona komórka Odpowiedź komórkowa Rycina 3. Schemat odpowiedzi immunologicznej humoralnej i komórkowej (wg Darell i Lodish, 1990 zmodyfikowano). 3
Immunologia transplantacyjna W procesie odrzucania przeszczepów dużą rolę odgrywają antygeny transplantacyjne. Reakcja odrzucenia jest pod kontrolą skupiska genów leżących obok siebie, zwanych głównym kompleksem zgodności tkankowej (MHC), które kodują antygeny zgodności tkankowej (antygeny transplantacyjne). Wszystkie kręgowce wyższe mają podobne zespoły genów zgodności tkankowej. U człowieka jest to zespół HLA znajdujący się na krótkim ramieniu chromosomu 6. Antygeny transplantacyjne są to glikoproteiny, które biorą udział w procesie różnicowania własnych komórek organizmu i w mechanizmie rozpoznawania obcych antygenów oraz w inicjacji odpowiedzi immunologicznej. Antygeny transplantacyjne klasy I występują na wszystkich komórkach jądrzastych, a także w mniejszej liczbie na niedojrzałych erytrocytach. Do antygenów tej klasy należą antygeny HLA- A, B i C. Cząsteczka antygenu HLA klasy I składa się z glikoproteinowego łańcucha ciężkiego α (produkt genów HLA- A, B lub C) i z β-2-mikroglobuliny; geny kodujące mikroglobulinę są na chromosomie 15. Antygeny tej klasy umożliwiają rozpoznanie i zniszczenie przez cytotoksyczne limfocyty T komórek nowotworowych lub zakażonych wirusami. Są to także silne antygeny transplantacyjne powodujące odrzucanie przeszczepów allogenicznych. Antygeny transplantacyjne klasy II występują niemal wyłącznie na powierzchni komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej (limfocytach B, makrofagach, komórkach dendrytycznych, niektórych limfocytach T i granulocytach). Do tej klasy należą antygeny HLA DP, DQ i DR kodowane przez geny HLA-D składające się z blisko położonych loci DR, DQ, DP. Antygeny tej klasy są zbudowane z 2 łańcuchów glikoproteinowych (α i β); biorą udział we współpracy pomiędzy limfocytami, a komórkami prezentującymi antygen oraz są odpowiedzialne za reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi (GvH). Antygeny transplantacyjne klasy III to głównie składniki układu dopełniacza (komplementu). Ich rolą jest usuwanie kompleksów immunologicznych oraz obrona przeciwzakaźna. Niezrównoważenie sprzężeń jest ciekawym zjawiskiem związanym z kompleksem MHC, które polega na nieprzypadkowym sprzężeniu 2 lub więcej alleli znajdujących się w różnych loci; tzn., że w danej populacji niektóre alelle występują razem częściej niż wynika to z częstości występowania danych alleli każdego z osobna. W odmiennych grupach etnicznych, a nawet w populacjach istnieją znaczne różnice w częstości występowania takich sprzężeń. Przyczyna tego zjawiska nie jest jeszcze ostatecznie wyjaśniona. Obecność określonych antygenów HLA w dużym stopniu można wiązać z podatnością osoby na daną chorobę. Siłę tej podatności wyraża wskaźnik względnego ryzyka: względne ryzyko = axb : cxd a liczba chorych z określonym antygenem, b liczba zdrowych z określonym antygenem, c liczba chorych bez określonego antygenu, d liczba zdrowych bez określonego antygenu Jeśli wskaźnik względnego ryzyka jest > 1, to posiadanie określonego antygenu HLA wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na daną chorobę. Przykłady związku zapadalności na wybrane choroby z obecnością określonych antygenów kompleksu zgodności tkankowej przedstawiono w tabeli. 4
Tabela 1. Przykłady powiązania występowania antygenów HLA z ryzykiem rozwoju wybranych chorób. Choroba Antygen układu HLA Względne ryzyko Celiakia (choroba trzewna) DR3 DR7 B8 73 8 8 Choroba Gravesa-Basedowa DR3 3,7 Cukrzyca typu I DR3 DR4 DR2 Łuszczyca Cw6 7,5 Mononukleoza zakaźna Bw35 3,5 Narkolepsia DR2 130 Reumatoidalne zapalenie stawów DR4 5 Stwardnienie rozsiane DR2 4,1 Zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (choroba Bechterewa) 3,3 6,4 0,2 B27 87,4 Poznanie mechanizmów immunologicznych oraz występowanie różnic genetycznych pomiędzy dawcą a biorcą pozwoliło na następującą klasyfikację przeszczepów (rycina 4): autologiczny (autoprzeszczep) przeszczep tkanek w obrębie jednego organizmu (transplantacja skóry); syngeniczny (izoprzeszczep) - przeszczep tkanek lub narządów między genetycznie identycznymi osobnikami (np. transplantacja nerki między bliźniakami jednojajowymi); allogeniczny (alloprzeszczep) - przeszczep tkanek lub narządów między genetycznie różnymi osobnikami tego samego gatunku; ksenogeniczny (ksenoprzeszczep) - przeszczep tkanek lub narządów między osobnikami różnych gatunków; przeszczepy wykonywane między ewolucyjnie zbliżonymi do siebie gatunkami (np. człowiek małpa, pies - wilk) są bardziej zgodne niż przeszczepy między gatunkami ewolucyjnie od siebie oddalonymi (np. świnia - człowiek). Uwzględniając miejsce transplantacji u biorcy można wyróżnić przeszczepy: ortotropowe do miejsca anatomicznie prawidłowego (ubytek skóry pokrywa się własnym płatem skórnym biorcy); hetrotropowe do miejsca anatomicznie odmiennego (przeszczepy nerki pod skórę szyi). Alloprzeszczep Autoprzeszczep Izoprzeszczep Ksenoprzeszczep Bardziej zgodny Mniej zgodny Rycina 4. Schemat klasyfikacji przeszczepów. 5
Przeżycie przeszczepów autologicznych i syngenicznych zapewnia genetyczna zgodność dawcy i biorcy. Przeszczepy allogeniczne są z reguły odrzucane, co wynika z ogólnych tendencji układu odpornościowego do zachowania integralności ustroju. Natomiast przeszczepy ksenogeniczne są stosunkowo szybko odrzucane, ze względu na duże różnice antygenowe, niezależnie od stosowanej immunosupresji. Reakcja na przeszczep u biorcy może przebiegać w postaci nadostrej, ostrej lub przewlekłej. Odrzucanie nadostre rozpoczyna się w ciągu kilku minut do kilku godzin po transplantacji i jest wynikiem obecności swoistych przeciwciał skierowanych głównie przeciwko antygenom HLA klasy I dawcy. Przeciwciała te mogą powstawać w wyniku uprzednich transfuzji krwi, przebytych ciąż lub odrzuconych przeszczepów. Ryzyko nadostrego odrzucania przeszczepu wyklucza się przed transplantacją poprzez rutynowe stosowanie próby krzyżowej (surowica biorcy + limfocyty T dawcy w obecności dopełniacza) oraz przez rygorystyczne przestrzeganie doboru dawcy i biorcy w zakresie układu ABO. Odrzucanie ostre może wystąpić w przeciągu kilku tygodni i miesięcy po transplantacji. Za tę reakcję odpowiedzialne są głównie cytotoksyczne limfocyty T i w mniejszym stopniu przeciwciała. Wczesne rozpoznanie rozwijającej się reakcji pozwala na zwiększenie dawek leków immunosupresyjnych (szczególnie kortykosterydów). Przewlekłe odrzucanie przejawia się klinicznie narastającą niewydolnością przeszczepionego narządu lub tkanki. W odróżnieniu od ostrego odrzucania, ten typ reakcji jest oporny na immunosupresję farmakologiczna i najczęściej prowadzi do nieodwracalnych zmian w przeszczepionym narządzie. Intensywność reakcji odrzucania przeszczepu może zależeć od stopnia zgodności między dawcą a biorcą, rodzaju przeszczepionego narządu oraz od sposobu i intensywności leczenia immunosupresyjnego. Dawca i biorca powinni być dobrani pod względem zgodności antygenów HLA oraz antygenów układu grupowego krwi ABO. W szczególnych przypadkach transplantacji dochodzi do ujawnienia się reakcji przeszczep przeciwko biorcy (GvH Graft versus Host), która jest uwarunkowana: (1) obecnością w przeszczepie komórek, które rozpoznają i reagują z antygenami biorcy; (2) obecnością u biorcy antygenów transplantacyjnych nie występujących u dawcy; (3) brakiem lub znacznym osłabieniem reakcji biorcy na przeszczep. Aby nie doszło do odrzucenia przeszczepu biorcę należy poddać immunosupresji (wywołanie osłabienia odpowiedzi immunologicznej). Są trzy grupy immunosupresorów: fizyczne (drenaż przewodu piersiowego, naświetlania promieniami rentgenowskimi, usunięcie narządów układu limfatycznego); chemiczne (cyklosporyna, glikokortykosterydy); biologiczne (surowica antylimfocytarna, przeciwciała monoklinalne antylimfocytarne). Zalecane piśmiennictwo: 1. Gołąb J., Jakóbsiak M., Lasek W., Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN, wyd. IV, 2006. 2. Lydyard P. M., Whelan A., Fanger M. W. Immunologia. Krótkie wykłady. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2001. 3. Zembala M., Górski A.. Zarys immunologii klinicznej. Wydawnictwo Lekarskie, 2001. 4. Drewa G., Ferenc T. Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy. Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, wydanie II, 2003. 6