CHARAKTERYSTYKA FENOTYPOWA I GENOTYPOWA KRAJOWYCH IZOLATÓW YERSINIA RUCKERI W ASPEKCIE ICH PATOGENNOŚCI DLA RYB AUTOR: mgr Agnieszka Pękala PROMOTOR: RECENZENCI: prof. dr hab. Jerzy Antychowicz prof. dr hab. Antonina Sopińska, prof. dr hab. Józef Pilaszek STRESZCZENIE Choroba czerwonej gęby (ERM - Enteric Red Mouth), nazywana inaczej jersiniozą, jest groźną jednostką chorobową ryb łososiowatych, wywoływaną przez Yersinia ruckeri. Po raz pierwszy bakterię tą wyizolowano w 1955 roku od chorych pstrągów tęczowych w miejscowości Hagerman w stanie Idaho (USA). ERM wciąż rozprzestrzenia się w populacji ryb i obecnie diagnozowana jest na obu kontynentach amerykańskich, Australii, a także prawie wszystkich krajach Europy, w tym w Polsce. Jersinioza jest wciąż aktualnym problemem w hodowlach ryb łososiowatych. Straty spowodowane wystąpieniem tej jednostki chorobowej mogą sięgać 30 70% obsady rocznie. W latach 2000-2007 ogółem zgromadzono 126 izolatów Yersinia ruckeri pochodzących z obiektów hodowli ryb zlokalizowanych na terenie całego kraju. Najwięcej, 102 (80,9%) izolaty pochodziło z północnej i północno-zachodniej części Polski, pozostałe 24 (19%) z części centralnej i południowej. Przeważającą część izolatów, bo aż 113, pozyskano od pstrągów tęczowych, które wykazywały objawy ERM i/lub śnięcia. Pozostałe 8 izolatów Y. ruckeri pochodziło od ryb klinicznie zdrowych: pstrągów - 4 izolaty, karpi - 1 izolat oraz szczupaków, od których, po raz pierwszy na świecie, wyosobniono 3 izolaty Y. ruckeri. Do badań wykorzystano również pięć izolatów znajdujących się w kolekcji szczepów bakteryjnych Zakładu Chorób Ryb PIWet-PIB. Wszystkie zgromadzone izolaty Y. ruckeri były Gram-ujemnymi pałeczkami, w większości nie wykazującymi ruchu (74,6% zgromadzonych izolatów). Określenie profili biochemicznych izolatów Y. ruckeri wykonano przy użyciu zestawu API 20E wraz z testami komplementarnymi. Wyniki odnoszono do danych literaturowych. Niektóre izolaty różniły się między sobą w reakcjach w testach na produkcję β-galaktozydazy, dekarboksylazę lizyny, wykorzystanie cytrynianu, reakcji V-P, hydrolizy żelatyny i wytwarzania sorbitolu.
Jako metodę potwierdzającą identyfikację izolatów Y. ruckeri wybrano technikę PCR, w której zastosowano specyficzne startery umożliwiające powielenie fragmentu DNA regionu konserwatywnego małej podjednostki (16S) rybosomalnego RNA. Przed przystąpieniem do badań zoptymalizowano warunki reakcji poprzez określenie temperatury przyłączania starterów oraz dobór ich stężenia, a także koncentrację jonów Mg +2. Próg wykrywalności dla PCR ustalono na 5 x 10 2 komórek bakterii/ml. Charakterystykę fenotypową zgromadzonych izolatów Y. ruckeri przeprowadzono określając biotypy na podstawie różnic w profilach biochemicznych izolatów Y. ruckeri. Podział na biotypy opierał się na zdolności ruchu bakterii oraz reakcjach w testach na hydrolizę Tween 80, hydrolizę żelatyny i kazeiny, reakcje V-P, β-galaktozydazę oraz wytwarzanie kwasu z sorbitolu. Na podstawie analizy tych reakcji, wszystkie 126 izolaty Y. ruckeri podzielono na biotypy: 32 izolaty zaklasyfikowano do biotypu 1, a 94 do biotypu 2. Dodatkowo, w obrębie biotypu 1 wyróżniono dwie biogrupy: biogrupę 1, do której zaliczono 24 izolaty oraz biogrupę 2 z 8 izolatami. Izolaty pozyskane od karpi, szczupaków, a także 4 izolaty pozyskane od klinicznie zdrowych pstrągów zostało zaliczone do biotypu 2 biotypu 1. Izolaty zaklasyfikowane do biotypu 2 pochodziły natomiast od pstrągów wykazujących charakterystyczne objawy jersiniozy połączone ze śnięciami. Do określenia serotypów izolatów Y. ruckeri wykorzystano reakcję aglutynacji. Badano zdolność aglutynacji izolatów Y. ruckeri ze specyficznymi surowicami poliklonalnymi skierowanymi na określony serotyp bakterii Y. ruckeri. Wykazano, że na terenie Polski występują trzy serotypy: O1, O5 i O7, przy czym serotyp O1 stanowi najliczniejszą grupę (93,6%). Serotyp O5 reprezentowany był przez izolaty wyosobnione od szczupaków, a do serotypu O7 zaliczono izolaty pozyskane od karpi oraz klinicznie zdrowych pstrągów. Określano wrażliwość Y. ruckeri na najczęściej stosowane w ichtiopatologii chemioterapeutyki, takie jak oksytetracyklina, flumechina, enrofloksacyna, sulfonamidy potencjonowane trimetoprimem oraz kwas oksolinowy. Wykazano skuteczność działania oksytetracykliny, flumechini i enrofloksacyny, jak również sulfonamidów potencjonowanych trimetoprimem na wszystkie (100%) izolaty Y. ruckeri. Natomiast kwas oksolinowy wykazywał skuteczność w stosunku do 80% izolatów. Rozdział SDS-PAGE nie wykazał różnic na poziomie białkowym pomiędzy zgromadzonymi izolatami Y. ruckeri. Technika Western blot z wykorzystaniem surowic królików immunizowanych poszczególnymi serotypami bakterii Y. ruckeri wykazała charakterystyczne reakcje antygenprzeciwciało, specyficzne dla konkretnych serotypów tej bakterii. Wykryto pięć specyficznych reakcji dla białek serotypu O1 o masach molekularnych 18 kda, 65 kda, 80 kda, 90 kda i 100 kda, z przeciwciałami skierowanymi przeciwko serotypowi O1. Wykryto trzy specyficzne reakcje białek
izolatów należących do serotypu O5 z przeciwciałami skierowanymi przeciwko serotypowi O5. Masy molekularne tych białek wynosiły 50 kda, 66 kda i 68 kda. Specyficzne sygnały dla białek o masie molekularnej 18 kda oraz z zakresu 60 80 kda wykryto w reakcji izolatów Y. ruckeri należących do serotypu O7 z przeciwciałami skierowanymi przeciwko serotypowi O7. W oparciu o analizę komputerową obrazów elektroforetycznych uzyskanych przy zastosowaniu metody ERIC-PCR, wygenerowano dendrogram, który wyróżnił trzy grupy izolatów Y. ruckeri o stosunkowo niskim pokrewieństwie względem siebie. Izolaty reprezentujące serotyp O5, wraz z izolatami z serotypu O7, utworzyły oddzielną grupę filogenetyczną. Referencyjne szczepy reprezentujące serotyp O5 i O7 również utworzyły własną grupę, ale znajdującą się na odrębnej gałęzi. Izolaty zaklasyfikowane do serotypu O1 zostały rozmieszczone głównie w obrębie jednej gałęzi. Metoda PCR-RFLP nie wykazała żadnych różnic pomiędzy izolatami Y. ruckeri oraz szczepami referencyjnymi. Eksperymentalnie zakażano pstrągi tęczowe izolatami Y. ruckeri należącymi do serotypu O1, a dodatkowo zaklasyfikowane do biotypu 2. Izolaty te były chorobotwórcze dla ryb i wywołały u nich objawy kliniczne jersiniozy połączone ze śnięciami. Wykazano, że objawy choroby są zależne od wieku ryb i temperatury wody, w której są one przetrzymywane. Najbardziej wrażliwy na zakażenie były narybek pstrąga tęczowego o masie jednostkowej wynoszącej od 10 do 100 g, bez względu na temperaturę wody. Pstrągi o masie jednostkowej wynoszącej 220 g nie wykazywały objawów chorobowych w temperaturze wynoszącej 22ºC. Zakażenia pstrągów izolatami należącymi do serotypu O5 i O7 nie powodowały rozwoju choroby. Tylko u wylęgu żerującego pstrąga, przetrzymywanego w temperaturze wody wynoszącej 8ºC, obserwowano śnięcia, które wyniosły 73%. SUMMARY Enteric redmouth (ERM), called yersiniosis, caused by Yersinia ruckeri, is a serious disease of salmonids. The bacterium was initially isolated from diseased rainbow trout in the Hagerman valley of Idaho, USA, in the 1955. ERM is still spreading in fish populations and now it is identified throughout other parts of North and South America, Australia, Europe including Poland. Yersiniosis is still a topical problem in trout farms. The mortality caused by this disease amounted to about 30 70% of stock per year. During 2000 2007, 126 isolates of Y. ruckeri were collected from trout farms located in different areas of Poland. Much more isolates (102-80,9%) were found from the
northern and the north-western part of Poland than from the central and southern part of our country (24 isolates - 19%). The predominating number of isolates (113) has originated from the rainbow trout s showing the ERM symptoms, the rest isolates (8 isolates) from clinically healthy fish i.e. 4 from rainbow trouts, 1 from carps and, for the first time in the world, 3 isolates from pikes. Also 5 isolates from the Department of Fish Diseases of NVRI own strain collections were used in the investigations. All isolates of Y. ruckeri were Gram-negative and 74,6% of them were nonmotile rods. Biochemical tests were performed by API 20E system with complementary tests and the achieved results were compared with the published data. The different reactions were observed in some of the isolates in production of β-galactosidase, lysine decarboxylase, citrate utilisation, Voges-Proskauer reaction, gelatin degradation and acid production from srobitol. A PCR test has been used to determine the identification of Y. ruckeri isolates by utilizing partial 16S rrna sequences of a species-specific 16S rrna oligonucleotide. Certain component concentration and conditions like the temperature used in the primers annealing step and their concentration, and Mg 2+ concentration in the reaction mixture were optimizing. The detection limit of PCR was determined on 5 x 10 2 cells/ml level. Phenotypic characteristic of Y. ruckeri isolates was carried out by comparing the different biochemical profiles of isolates Y. ruckeri for biotypes determination. Motility, Tween 80 hydrolysis, gelatin and caseine hydrolysis, Voges-Proskauer reaction, production of β-galactosidase and acid production from srobitol were taken into consideration to distinguish biotypes. After analysis of these reactions, all of 126 isolates were classified to biotypes: 32 isolates were classified to biotype1 and 94 isolates to biotype 2. Additionally, biotype 1 was divided on two biogroups: biogroup 1 with 24 bacteria isolates and biogroup 2 with 8 bacteria isolates. The bacteria isolates collected from carps, pikes and four isolates collected from healthy trouts were classified to biogroup 2 biotype 1. All bacteria isolates belonging to biotype 2 were collected from diseased trout. The agglutination tests have been used to determine the serotypes of isolates. The bacterial cultures of isolates of Y. ruckeri were examined for ability to agglutinate polyclonal antisera raised against all serotypes of Y. ruckeri strains. The presence of three serotypes i. e.: O1, O5 and O7 have been determined in Poland. Serotype O1 showed to be the most popular (93,6%) in our country. The bacteria isolates collected from pikes belonged to serotype O5. Serotype O7 was represented by Y. ruckeri isolates collected from carps and healthy trout s. The Y. ruckeri isolates were tested for antimicrobial susceptibility. The following chemotherapeutic agents were used: oxytetracycline, flumequine, enrofloxacine, sulphonamide/trimethoprim and oxolinic acid. All isolates appeared to be highly sensitive (100%) to
oxytetracycline, flumequine, enrofloxacine and sulphonamide/trimethoprim. The majority i. e. 80% of Y. ruckeri isolates was sensitive to oxolinic acid. No protein differences among all the bacteria isolates were determined by SDS-PAGE. Serums from rabbits immunized by reference strains belonging to each serotypes were used in Western blott. Serotypes-specific antigen-antibodies reactions were discriminated. Five proteins of molecular weight of 18 kda, 65 kda, 80 kda, 90 kda and 100 kda were serotype-specific for reaction of proteins of isolates belonging to serotypes O1 with antibodies anty-o1. Antibodies anty- O5 reacted specific to three proteins of the isolates belonging to O5 serotypes. The molecular weights of these proteins were discriminated on 50 kda, 66 kda and 68 kda molecular weight. Specific reactions between the isolates belonging to serotypes O7 and anty-o7 antibodies were detected as well. The serotypes specific signals were distinguished for proteins of the range of molecular weight from 60 to 80 kda and 18 kda of isolates belonging to O7 serotype with antybodies anty-o7. Dendrogram based on the computer analysis data of agarose gels of ERIC-PCR products was generated. Three groups were discriminated denoting a low degree of genetic variability among the isolates of Y. ruckeri. The isolates classified to serotypes O5 and O7 shared the same group. The reference strains of serotypes O5 and O7 formed the own group but on the other cluster. The isolates belonging to serotypes O1 mostly shared the same group. PCR-RFLP methods showed no difference between the isolates and references strains of Yersinia ruckeri. The isolates belonging to serotype O1 and additionally to biotype 2 were pathogenic for rainbow trout in laboratory-based infectivity experiments. The clinical signs of ERM and dead fish were observed. It occurred the clinical signs are the age and water temperature dependent. Juvenile rainbow trout of body s weight about 10 100 g were the most susceptible for bacteria inoculations without dependence on water temperature. The rainbow trout at about 220 g of body s weights, maintained in water temperature about 22 C showed no clinical signs. Groups of the rainbow trout inoculated by isolates of Yersinia ruckeri belonging to serotypes O5 and O7 showed no clinical signs. Only group of rainbow trout fry maintained in water temperature about 8 C showed 73% mortalities.