PRACE ORYGIALE Jakub WYROBA 1 Robert JACH 1 Hubert HURAS 1 Tomasz BASTA 1 Joanna STREB 2 Wioletta HOSIAWA 1 Jacek DRABIA 1 Zachowanie się zmian o charakterze subklinicznej infekcji HPV (SPI), śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy (CI) 1 i 2. Badanie prospektywne obserwacyjne Assesment of the ongiong changes among patients diagnosed with subclinical changes of an HPV infection (SPI) as well as changes in the type of CI 1 and CI 2 1 Katedra Ginekologii i Położnictwa UJ CM w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Antoni Basta 2 Katedra Onkologii UJ CM w Krakowie Kierownik: Dr hab. n. med. Robert Jach Dodatkowe słowa kluczowe: CI1 CI2 SPI progresja regresja HPV Additional key words: CI1 CI2 SPI regression progression HPV Adres do korespondencji: Jakub Wyroba Oddział Kliniczny Kliniki Endokrynologii Ginekologicznej ul. Kopernika 23 31-501 Kraków tel. 12-424-85-71/70 e-mail: jakub.wyroba@uj.edu.pl jach@cm-uj.krakow.pl Cel pracy: Celem badania była ocena zachodzących zmian o typie regresji, progresji i stanu stacjonarnego wśród pacjentek ze zdiagnozowanymi zmianami o charakterze subklinicznej infekcji HPV, a także zmian o typie CI 1 i CI 2. Materiał i metodyka: Badanie przeprowadzono w grupie 289 kobiet w wieku 25-60 lat z CI uczestniczących w programie profilaktyki raka szyjki macicy z nieprawidłowymi wynikami badania cytologicznego. Wyniki: Okres obserwacji pacjentek wynosił 6 lat. ie stwierdzono różnic pomiędzy częstością występowania regresji zmian u pacjentek z SPI i pacjentek z CI1. Również nie stwierdzono różnic w częstości występowania regresji w grupach pacjentek z CI1 i z CI2. atomiast regresja z częściej występuje u pacjentek z SPI, niż u pacjentek z CI2. Stan stacjonarny występował częściej u pacjentek z CI1 i CI 2 niż u pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CI2 częściej występowała progresja do CI3, niż w grupie pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CI2 częściej występowała progresja do CI3, niż w grupie pacjentek z CI1. Analiza zachowania się zmian w obrębie szyjki macicy o charakterze SPI, CI1 i CI2 w zależności od obecności transkryptorów genów E6 i E7 HPV wykazała, że na 138 obserwowanych przypadków do progresji zmian doszło u 19,56% kobiet, głównie w obecności m RA E6 i E7. Do remisji zmian doszło natomiast w 56,52%, głównie w przypadkach braku obecności transkryptorów E6 i E7 HPV. Wnioski: 1. Zmiany o charakterze subklinicznej infekcji HPV, CI1 i CI2 w obrębie szyjki macicy są zmianami, mogącymi ulegać progresji do wyższych stopni CI i do raka szyjki macicy, mogącymi przez wiele lat pozostawać w stanie stacjonarnym a nawet ulegać remisji. 2. Zakażenie HPV typami o wysokim Purpose of study: The aim of the study was to assess the ongoing changes of the type of regression, progression and steady state among patients diagnosed with subclinical changes of an HPV infection as well as changes in the type of CI 1 and CI 2. Materials and methods: The study was conducted in a group of 289 women between the ages of 25-60 with abnormal cytology taking part in the CI cervical cancer prevention program. Results: The patients were observed over a period of 6 years; no detectable differences were discovered in the frequency of regression between patients with SPI in comparision to patients with CI1. In addition, no differences were identified in the frequency of regression between groups of patients with CI1 and CI2. In contrast, regression was more common in patients with SPI than in patients with CI2. Steady state was more frequent in patients with CI1 and CI 2 than in patients with SPI. The results illustrated no differences in the progression of SPI and the CI1 to CI2. The group of patients with CI2 were frequently associated with progression to CI3 more than in the group of patients with SPI. The group of patients with CI2 were frequently associated with progression to CI3 more than in the group of patients with CI1. Further investigation of cervical changes associated with SPI, CI1 and CI2 were dependent on the presence of transcription genes E6 and E7 of HPV. In 138 cases, the presence of these transcription genes lead to progression in 19.56% of women; more specifically in the introduction of me6 and E7 RA. There were changes typical of remission in 56,52% of cases primarily in the absence of transcriptor genes HPV E6 and E7. Conclusion: 1. The histological changes of the cervix observed in 622 J. Wyroba i wsp.
potencjale onkogennym ma znaczenie nie tylko w inicjacji, ale również w rozwoju procesu karcinogenezy w obrębie szyjki macicy poprzez kilka niezależnych mechanizmów. subclinical HPV infection, CI1 and CI2 may be subject to a higher degree of progression of CI. In addition, these changes may progress to cervical cancer, remain stationary in a steady state, or decline into remission. 2. The types of HPV infection with high oncogenic potential are not only important in initiation of cerival changes but also in the developmental process of carcinogenesis in the cervix by several independent mechanisms. Wstęp Wieloetapowy rozwój raka szyjki macicy, tj. od śródnabłonkowej neoplazji 1 stopnia CI1 (CI Cervical Intraepithelial eoplasia), poprzez kolejne stopnie zaawansowania CI do postaci inwazyjnej raka jest zwykle procesem długotrwałym, trwającym od kilku do kilkunastu lat. Dane na temat procesu karcinogenezy w obrębie szyjki macicy i możliwości diagnostyczne stanów przedrakowych i wczesnych postaci raka szyjki macicy pozwoliły już w latach 60-tych ubiegłego stulecia na wprowadzenie w niektórych krajach Europy i USA badań profilaktycznych opartych na badaniu cytologicznym rozmazów szyjkowych. a całym świecie, w ramach prowadzenia aktywnej profilaktyki raka szyjki macicy, rocznie wykrywa się około 10 milionów przypadków śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy drugiego i trzeciego stopnia (CI2-3) i 30 milionów przypadków śródnabłonkowej neoplazji pierwszego stopnia (CI1), a więc stanów, z których część ulega progresji do raka inwazyjnego. atomiast roczna szacowana liczba zakażeń na HPV wynosi ok. 300 000 000 (Ryc. 1) [1-3]. W Klinice Ginekologii i Onkologii UJ CM, na 5 000 kobiet, u których wykonano cytologiczne badanie profilaktyczne w kierunku raka szyjki macicy wykryto 108 (2,15%) przypadków CI, w tym u 60 (56%) kobiet CI1, 31 (29%) CI2, i 17 (15%) CI3. Śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy dotyczy częściej kobiet młodszych niż kobiety z rakiem szyjki macicy [4]. Wyniki przeprowadzonych badań skriningowych wśród kobiet o niskim statusie socjoekonomicznym w USA wykazały że nieprawidłowości cytologiczne w niemal 85% przypadków dotyczyły kobiet przed 40 rokiem życia [2,3]. Według danych Benard VB całkowity odsetek nieprawidłowych wyników cytologicznych w badanej grupie obejmującejponad półtora miliona kobiet wynosił 1,8%. W grupie tej 10,3% przypadków nieprawidłowości cytologicznych dotyczyło kobiet w przedziale wiekowym 18-28 lat, a 0,8% kobiet powyżej 65 roku życia [5]. Wśród tych 1,8 % (ponad 28 000 kobiet) z nieprawidłowym wynikiem badania cytologicznego, dzięki kolposkopii z biopsją celowaną u 0,4 % kobiet rozpoznano inwazyjnego raka szyjki macicy, a u 7% o charakterze CI 2 lub CI3 w rzeczywistości okazały się także inwazyjnymi rakami szyjki macicy. Dane epidemiologiczne przeprwoadzone przez Schiffmana M. i wsp. w ramach szeroko cytowanego badania ALTS wykazują, że ponad 57% przypadków z inwazyjną postacią raka szyjki macicy stanowią kobiety powyżej 50 roku życia [6]. Przeprowadzono dotychczas niewiele prospektywnych badań dotyczących zachowania się CI, z których część miała miejsce jeszcze przed poznaniem roli zakażenia HPV w procesie karcinogenezy w obrębie szyjki macicy [7,8]. Östor AG w swojej metaanalizie [7] wykazał, że o charakterze CI1 w 58% ulegają regresji, w 32% przypadków pozostają w stanie stacjonarnym, w 11% przypadków ulegają progresji do raka in situ (CIS), a jedynie w 1% przypadków progresji do raka inwazyjnego. Zmiany o charakterze CI2 ulegają regresji w 43% przypadków, pozostają w stanie stacjonarnym w 35% przypadków, w 22% przypadków ulegają progresji do CIS, a w 5% do raka inwazyjnego. atomiast o charakterze CI3 w 32% przypadków ulegają regresji, a w stanie stacjonarnym w mniej niż 56% przypadków. atomiast progresji do raka inwazyjnego ulega ponad 12% przypadków CI3. atomiast Syrjänen [8] uwzględniając towarzyszące CI zakażenie HPV wykazał, że o charakterze CI1 w 65,1% ulegają regresji, w 20,8% przypadków pozostają w stanie stacjonarnym, a w 14,2% przypadków ulegają progresji do raka in situ (CIS). Zmiany o charakterze CI2 ulegają regresji w 58,6% przypadków, pozostają w stanie stacjonarnym w 18,6% przypadków, a w 21,4% przypadków ulegają progresji do CIS. atomiast o charakterze CI3 w 11,6% przypadków ulegają regresji, pozostają w stanie stacjonarnym w 9,3% przypadków, w 79,1% przypadków ulegają progresji do CIS, a w 0,5% przypadków progresji do raka inwazyjnego. atomiast CI nie związane z zakażeniem HPV według tego autora ulegają regresji w 79,9% przypadków, w 14,6% przypadków pozostają w stanie stacjonarnym, progresji do CIS ulega 11% a do raka inwazyjnego 1% przypadków. Tak więc prospektywne obserwacje kliniczne wykazały, że o charakterze śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy mogą w zależności od stopnia zaawansowania ulegać nie tylko progresji, ale mogą także pozostawać przez dłuższy okres czasu w stanie stacjonarnym bądź ulegać samoistnej regresji, przy czym odsetki zmian o charakterze śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy, które ulegają regresji lub utrzymują się jako stan stacjonarny bądź ulegają progresji do CI wyższych stopni bądź raka inwazyjnego są bardzo zróżnicowane. W literaturze przedmiotu nie wykazano wielu polskich prac dotyczących prospektywnej obserwacji zmian o charakterze CI1 i CI2. Materiał i metodyka Badanie przeprowadzono w grupie 289 kobiet w wieku 25-60 lat z CI i rakiem szyjki macicy w stopniu IA wyselekcjonowanych spośród kobiet uczestniczących w programie badań profilaktycznych raka szyjki macicy, a także diagnozowanych i leczonych w Klinice Ginekologii i Onkologii Katedry Ginekologii i Położnictwa Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie w latach 2005-2010 z nieprawidłowymi wynikami badania cytologicznego. Podstawą do zakwalifikowania kobiet do grupy badanej było stwierdzenie zmian o charakterze subklinicznej infekcji HPV, CI1 i CI2 zweryfikowanych badaniem histologicznym materiału tkankowego uzyskanego drogą biopsji celowanej i wyskrobin z kanału szyjki macicy. Grupę kontrolną stanowiły 44 kobiety w wieku 28-56 lat, diagnozowane i leczone w tym samym okresie z powodu nieonkologicznych schorzeń ginekologicznych. Badania cytologiczne wykonano w Pracowni Diagnostyki Cytologicznej i Badań Molekularnych Kliniki Ginekologii i Onkologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie. Badania kolposkopowe oraz pobieranie wycinków pod kontrolą kolposkopii wykonano w Klinice Ginekologii i Onkologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie, a ocena preparatów histologicznych wykonywana była w Katedrze Patomorfologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie. Średni wiek kobiet w grupie badanej wynosił 35,2±12,8 lat i nie różnił się statystycznie istotnie od średniego wieku kobiet w grupie kontrolnej, w której wynosił 36,1±8,1 lat. U wszystkich kobiet grupy badanej i kontrolnej przeprowadzono według jednolitej metodyki badanie kolposkopowe, badanie histologiczne wycinków uzyskanych na drodze biopsji celowanej lub materiału tkankowego szyjki macicy uzyskanego w drodze operacji, badanie wirusologiczne DA HPV metodą Hybrid Capture 2 oraz badanie mra E6/E7 HPV testem uclisens firmy Biomerieux, jako wskaźnik przewlekłego zakażenia HPV i rozpoczęcia procesu transkrypcji materiału genetycznego wirusa, w keratynocytach oraz badanie mikrobiologiczne treści pochwowej. Badanie kolposkopowe Ocenę kolposkopową szyjki macicy w grupach badanej i kontrolnej dokonywano za pomocą kolposkopu Leisegang i Olympus OCS-500 z zakresem powiększeń 4-80x. Tarczę części pochwowej szyjki macicy oceniano wstępnie bez użycia odczynników kontrastujących, po uprzednim przemyciu szyjki macicy 0,9% roztworem soli fizjologicznej, a następnie po kontrastowaniu powierzchni nabłonkowej przy użyciu 3% wodnego roztworu kwasu octowego oraz w próbie Schillera, tj. przy użyciu roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola). Dokumentację badania kolposkopowego prowadzono przy pomocy aparatu cyfrowego Olympus, natomiast w opisie Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 11 623
badania posługiwano się mianownictwem Międzynarodowej Federacji Kolposkopii i Patologii Szyjki macicy IFCPC (IFCPC - International Federation of Cervical Pathology and Colposcopy) z 2002 roku [9]. Badanie wirusologiczne Badanie wirusologiczne metodą hybrydyzacji (Hybrid Capture 2). Obecność DA HPV badano testem Hybryd Capture 2 (firmy Digene/Qiagen). Treść komórkową z tarczy części pochwowej i kanału szyjki macicy pobierano przy użyciu zestawu Digene Cervical Sampler (Digene Cervical Brush and Specimen Transport Medium firmy Digene, Qiagen) w celu wykonania małopłytkowej hybrydyzacji ze wzmocnieniem sygnału z użyciem chemiluminescencji dla jakościowej oceny osiemnastu typów ludzkiego wirusa brodawczaka ludzkiego. Test Hybrid Capture2 pozwala na identyfikację materiału genetycznego wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) osobno dla typów o wysokim i średnim potencjale onkogennym (typ B) tj. typy: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 oraz o niskim potencjale onkogennym (typ A) tj. typy: 6, 11, 42, 43, 44. Pobrany materiał przechowywano w formie zamrożonej w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem badania rozmrażano próbki w temperaturze 20-25 o C przez 30 minut. Każdorazowo przygotowywano kontrolę negatywną (3 próbki) oraz kalibrator pozytywny dla wirusów o niskim potencjale onkogennym (3 próbki), jak i dla wirusów o wysokim i średnim potencjale onkogennym (3 próbki), a także dołączano po jednej próbce kontroli jakości przeprowadzonego badania. Po dodaniu do każdej próbki kontroli negatywnej i kalibratorów odczynnika denaturującego (roztwór zasady sodowej- aoh) umieszczano materiał w łaźni wodnej w temperaturze 6 o C na okres 45 minut - w trakcie inkubacji następowała denaturacja materiału biologicznego. Kolejny etap polegał na hybrydyzacji denaturowanego DA ze zbuforowanym roztworem zawierającym komplementarne RA tj. z sondami specyficznymi dla wirusów o wysokim i średnim potencjale onkogennym oraz z sondami RA dla wirusów o niskim potencjale onkogennym. Utworzone hybrydy DA-RA inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 65 o C przez kolejne 60 minut. Do kompleksu hybrydu DA-RA w badanym materiale biologicznym dodawano specyficzne dla niego przeciwciała monoklonalne znakowane fosfatazą alkaliczną w roztworze z azydkiem sodu. astępnie po wypłukaniu każdej mikropłytki dodawano do niej substrat chemiluminescencyjny (CDP-Star TM z Emerald IL). Po 15 minutach dokonywano odczytu wyników badania w luminometrze (DML2000 TM Luminometer). Ostatnim etapem procedury była walidacja testów i interpretacja wyników. Wynik podawano we względnych jednostkach światła (RLU-Relative Light Unit), których wartość jest wprost proporcjonalna do ilości DA HPV w badanym materiale. Ocena wewnątrzkomórkowej zawartości Rycina 1 Zakażenia HPV a kliniczne w obrębie szyjki macicy i dolnego odcinka narządu rodnego. HPV infection and clinical changes in the uterine cervix and lower female reproductive track. mra genów E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego (uclisens Easy Q HPV- Biomerieux). Materiał do badania pobierano od kobiet z grupy badanej i kontrolnej z tarczy części pochwowej szczoteczką CervexBrush zawieszając go następnie w buforze Thin- Prep PreservCyt. Zabezpieczony materiał przechowywano w temperaturze -20 o C i poddawano analizie w przeciągu 14 dni. Kwasy nukleinowe izolowano z użyciem automatycznego ekstraktora easymag (biomerieux) metodą Booma, zgodnie z instrukcją producenta. Próbki materiału zawieszone w roztworze ThinPrep PreservCyt poddawano lizie komórkowej w temperaturze pokojowej przez okres 10 minut z buforem lizującym (uclisens Lysis Buffer, biomerieux). Tak przygotowane próbki materiału umieszczano w aparacie wraz z mieszaniną roztworu silikonowego (uclisens easymag Magnetica Silica, biomerieux) i poddawano automatycznej ekstrakcji. Objętość eluatu stanowiła 55 μl. Uzyskane eluaty umieszczano natychmiast w temperaturze -20 o C. Detekcję transkryptorów genów E6 i E7 ludzkich wirusów brodawczaka przeprowadzono za pomocą komercyjnych testów (uclisens EasyQ HPV, biomerieux) opartych na metodzie Real-time PCR (ASBA). ASBA jest metodą izotermalnej amplifikacji RA osiągniętej przez jednoczasową aktywność odwrotnej transkryptazy wirusa AMV( avian myoblastosis virus), polimerazy T7 RA oraz Razy H. W reakcji zastosowano startery oraz sondy MB (Molecular Beacon) komplementarne do transkryptów genów E6 i E7 wirusów HPV typ: 16, 18, 31, 33 i 45 (biomerieux). Stężenie sond MB użytych w reakcji wynosiło 2,5 mm. Reakcja ASBA została przeprowadzona w końcowej objętości 20 μl przez 2 godziny w temperaturze 41 0 C. Do reakcji użyto 5 ul eluatu kwasów nukleinowych. W celu uniknięcia wyników fałszywie ujemnych związanych z degradacją kwasów nukleinowych zastosowano startery oraz sondy komplementarne do ludzkiego genu metabolizmu podstawowego U1A mra. Dla każdej próbki przeprowadzono jednoczesną reakcję dla HPV 16/ U1A, HPV 18/31 oraz HPV 33/45. Jako kontrole dodatnie posłużyły sondy ss DA komplementarne do analizowanych typów wirusów oraz genu U1A. Metodyka badania histopatologicznego Badanie histopatologiczne przeprowadzono w sposób rutynowy z zastosowaniem automatycznych procesorów tkankowych do barwienia metodą hematoksylina-eozyna, oraz do wykonania odczynów immunohistochemicznych. Ocena histologiczna obejmowała określenie typu zmian śródnabłonkowych, ich rozległości metodą morfometryczną, obecności ewentualnej wczesnej inwazji i wielkości obszaru inwazyjnego. Pomiary morfometryczne zostały dokonane z użyciem systemu analizy obrazu AnalySIS, za pomocą metod planimetrycznych oraz stereologicznych. Przekroje oceniano za pomocą pomiaru liniowego oraz metody liczenia punków, natomiast objętość zmian metodą Cavallieri. Barwienie hematoksyliną i eozyną przeprowadzono w sposób rutynowy. Procedura barwienia skrawków nałożonych na szkiełka podstawowe składała się z następujących etapów: kąpiel w kuwecie z hematoksyliną ałunową przez 7-10 min, kąpiel w kuwecie z wodą destylowaną, płukanie bieżącą wodą przez 15 minut, kąpiel w kuwecie z wodą destylowaną, kąpiel w kuwecie z 1% eozyną Y z dodatkiem jednej kropli kwasu octowego, kąpiel w kuwecie z wodą destylowaną. atomiast w 44 przypadkach z grupy kontrolnej, składającej się z kobiet diagnozowanych i leczonych w tym samym okresie z powodu nieonkologicznych schorzeń ginekologicznych nie wykazano zmian patologicznych w obrębie szyjki macicy. Metodyka obserwacji klinicznej kobiet ze zmianami o charakterze SPI, CI1 i CI2 U 138 kobiet grupy badanej przeprowadzono obserwację zachowania się sub- 624 J. Wyroba i wsp.
Rycina 2 Subkliniczna infekcja HPV. Subclinical HPV infection. klinicznej infekcji HPV- SPI (n=50), CI 1 (n=50) i CI 2 (n=38) przez okres 6 lat. Badania kontrolne cytologiczno-kolposkopowe przeprowadzano co 6 miesięcy. W przypadkach nieprawidłowych wyników kolposkopowo- cytologicznych pod kontrolą kolposkopii pobierano wycinki do badania histopatologicznego. atomiast badanie wirusologiczne (HC2 i mra E6/E7 HPV) na początku obserwacji, w przypadkach stwierdzenia progresji lub regresji zmian, oraz po co najmniej 6 letniej obserwacji zmian utrzymujących się jako proces stacjonarny. Uzyskane wyniki porównywano w grupach kobiet, u których uległy progresji, remisji lub utrzymywały się jako stan stacjonarny. Metody statystyczne W analizie statystycznej zebranego materiału zastosowano test u-manna-whitneya dla porównywania parametrów ilościowych w grupie badanej i kontrolnej. Wyniki ie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy częstością występowania regresji w 6 letniej obserwacji u pacjentek z SPI i pacjentek z CI1. Również nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania regresji w grupach pacjentek z CI1 i z CI2. atomiast regresja znamiennie częściej występuje (p=0,038) u pacjentek z SPI, niż u pacjentek z CI2. Stan stacjonarny w trakcie 6-letniej obserwacji występował znamiennie (p=0,050) częściej u pacjentek z CI1 niż u pacjentek z SPI. Również u pacjentek z CI2 stan stacjonarny występował znamiennie (p=0,022) częściej, niż u pacjentek z SPI. ie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania stanu stacjonarnego w grupach pacjentek z CI1 i z CI2. Porównanie 6-letnich obserwacji dotyczących wyników leczenia pacjentek z SPI i z CI1 wskazuje na brak istotnych różnic pomiędzy tymi grupami w zakresie występowania progresji do CI2. W grupie pacjentek z CI2 znamiennie (p=0,027) częściej występowała progresja do CI3, niż w grupie pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CI2 znamiennie (p=0,027) Tabela I Subkliniczna infekcja HPV. Subclinical HPV infection. 50 (100%) Rycina 3 Subkliniczna infekcja HPV. Subclinical HPV infection. Stan stacjonarny częściej występowała progresja do CI3, niż w grupie pacjentek z CI1. ie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania progresji do raka szyjki macicy pomiędzy trzema analizowanymi grupami pacjentek tj. z SPI, CI1 i z CI2. Stwierdzono również brak statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania progresji do CI3 w trakcie 6-letniej obserwacji pomiędzy grupami pacjentek z SPI i z CI1. Progresja do CI1 CI2 CI3 i nawrót n % n % n % n % n % n % 38 76 4 8 4 8 2 4 0 0 2 4 Tabela II Zachowanie się śródnabłonkowej neoplazji CI1 i CI2. Czas obserwacji 6 lat. Changes in CI 1 and CI 2 during 6 years observation. Rodzaj Progresja do Stan całkowita częściowa stacjonarny CI2 CI3 i nawrót n % n % n % n % n % n % CI1 50 26 52 0 0 8 16 6 12 3 6 7 14 CI2 38 14 36,84 3 7,89 3 7,89 - - 12* 31,57 6 15,78 * w 4 przypadkach do CIS Wyniki obserwacji przebiegu subklinicznej postaci infekcji HPV (SPI) oraz CI w stopniu 1 i 2. Zmiany kolposkopowo-cytologiczne (Tab. I) charakterystyczne dla subklinicznej infekcji HPV obserwowane przez okres 6 lat wykazały w w 38 (76%) remisję zmian, w 4 (8%) utrzymywały się jako proces stacjonarny, w 6 (12%) przypadkach uległy progresji do CI, w tym w 4 (8%) do CI1, w 2 (4%) do CI2. W 2 (4%) przypadkach po spontanicznej regresji zmian nastąpił nawrót. Obrazy kolposkopowe SPI można pokazać na kolpofotografii (Ryc. 2,3). Przeprowadzona obserwacja cytologiczno- kolposkopowa (Tab. II) zmian o charakterze CI1 i CI2 przez okres 4-5 lat bez leczenia wykazała w 26 (52%) przypadkach remisję CI1. W 8 (16%) przypadkach zmiana CI1 utrzymywała się jako stan stacjonarny. W 6 (12%) przypadkach zmiana CI1 uległa progresji do CI2 i w 3 (6%) do CI3. W 7 (14%) przypadkach obserwowano nawrót. atomiast taka obserwacja CI2 wykazała w 14 (36,84%) przypadkach całkowitą remisję do CI1, w 12 (31,57%) progresję do CI3, w tym w 4 przypadkach do CIS. W 3 (7,89%) przypadkach zmiana CI2 utrzymywała się jako stan stacjonarny i również w 3 (7,89%) przypadkach nastąpiła częściowa remisja, natomiast w 6 (15,78%) przypadkach wystąpił nawrót zmian. Porównanie odsetka remisji i progresji (Tab. III) zmian o charakterze SPI, CI1 i CI2 wykazało, że subkliniczna infekcja HPV uległa regresji w 38 (76%) przypadkach a progresji w 6 (12%) przypadkach, w tym w 4 do CI1 i w 2 do CI2. CI1 w 26 (52%) przypadkach uległa całkowitej remisji a progresji w 9 (18%) przypadkach, w tym w 6 do CI2 i 3 do CI3. CI2 w 14 (36,8%) przypadkach uległa całkowitej remisji i w 12 Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 11 625
(31,6%) przypadkach progresji do CI3, w tym w 4 przypadkach do CIS. Kolpofotografia CI1 remisja, SPIremisja, CI2 etc. Przeprowadzona analiza zachowania się zmian w obrębie szyjki macicy w zależności od typu HPV (Tab. IV) wykazała, że w 6 przypadkach zmian o charakterze SPI doszło do progresji do CI w obecności zakażenia HPV o wysokim potencjale onkogennym (4 przypadki HR i 2 przypadki LR +HR), natomiast w 26 przypadkach zakażenia typami o niskim potencjale onkogennym (LR) i 3 przypadkach mieszanej infekcji (HR+LR) doszło do spontanicznej remisji zmian o charakterze SPI. W 9 (12%) przypadkach zmian o charakterze CI 1 doszło do progresji do CI wyższego stopnia, w tym w 8 przypadkach występowania wirusów o wysokim potencjale onkogennym (5 przypadków HR i 3 przypadki mieszanej infekcji) i w jednym przypadku z zakażeniem HPV o niskim potencjale onkogennym. atomiast do spontanicznej remisji zmian o charakterze CI1 doszło w26 (52%) przypadkach, głównie przy współistniejącym zakażeniu HPV o niskim potencjale onkogennym (23 przypadki LR i 2 przypadki mieszanej infekcji). U 12 (31,6%) kobiet z CI2 w ciągu 4-5 letniej obserwacji zaobserwowano progresję do CI3 i CIS i we wszystkich tych przypadkach stwierdzano obecność DA HPV o wysokim potencjale onkogennym (9 przypadków HR i 3 przypadki postaci mieszanej infekcji HR+LR). Do remisji zmian CI2 doszło w 14 (36,8%) przypadkach, w tym w 12 przypadkach infekcji HPV o niskim potencjale onkogennym i 1 przypadku mieszanej postaci zakażenia HPV. Łącznie do remisji zmian o charakterze SPI, CI1 i CI2 doszło w 78 (56,6%) przypadków, w tym w 61 (78,2%) przypadkach zakażenia HPV o niskim potencjale onkogennym i w 7 (5,2%) przypadkach obecności HPV o wysokim potencjale onkogennym. atomiast progresję zmian obserwowano łącznie w 27 (19,6%) przypadkach, w tym w 26 (96,37%) w obecności DA HPV o wysokim potencjale onkogennym i zaledwie w 1 (3,7%) przypadku obecności DA HPV o niskim potencjale onkogennym. Analiza zachowania się zmian w obrębie szyjki macicy o charakterze SPI, CI1 i CI2 w zależności od obecności transkryptorów genów E6 i E7 HPV 16, 18, 31, 33 i 45 wykazała, że na 138 obserwowanych przypadków do progresji zmian doszło u 27 (19,56%) kobiet, głównie w obecności m RA E6 i E7-20 (74,1%) przypadków (Tab. V). Do remisji zmian doszło natomiast w 78 (56,52%), głównie w przypadkach braku obecności transkryptorów E6 i E7 HPV- 76 (97,4%) kobiet. Omówienie Wheeler i wsp. w swojej analizie obejmującej populację kobiet amerykańskich wykazali, że w 70-90% przypadków CI1 ustępuje samoistnie, natomiast CI2 i CI3 ulegają progresji lub utrzymują się odpowiednio w 57 i 70% przypadków [10]. W metaanalizie badań nad zachowaniem się śródnabłonkowej neoplazji szyjki Tabela III Porównanie odsetka całkowitej remisji i progresji zmian o charakterze SPI, CI1 i CI2. Comparition of complite remission and progression of SPI, CI1 and CI2. Rodzaj Test Chi 2 Całkowita remisja Progresja p n % n % SPI 50 38 76,0 6 12,0 CI1 50 26 52,0 9 18,0 CI2 38 14 36,8 12 31,6 Σ 138 78 56,5 27 19,6 <0,005 macicy, przeprowadzonej przez Östora [7], który nie uwzględnił zakażenia wirusem ludzkiego brodawczaka, odsetki remisji zmian śródnabłonkowych szyjki macicy są nieco niższe, niż w badaniach Syrjänena [8], który oceniał obecność zakażenia HPV. ależy zaznaczyć, że w części przypadków remisja zmian nie jest na pewno wynikiem procesu spontanicznego, a może być skutkiem usunięcia całej w trakcie biopsji szyjki macicy pod kontrolą kolposkopii, jaka miała miejsce we wszystkich tych przypadkach. Osobnego komentarza wymaga obserwacja prospektywna zmian o charakterze CI3 obejmujących również przypadki raka in situ szyjki macicy, która jest nie do zaakceptowania z punktu widzenia etyki lekarskiej szczególnie, że w badaniach tych miały miejsce przypadki progresji zmian do raka inwazyjnego szyjki macicy. Według danych literatury przedmiotu i własnych obserwacji, w znakomitej większości przypadków rak szyjki macicy jest poprzedzony śródnabłonkową neoplazją szyjki macicy, trwającą od kilku do nawet kilkunastu lat. Szczegółowego wyjaśnienia wymagają jedynie przypadki tak zwanego rapid carcinoma opisywane w literaturze. Przypadki te mogą być wynikiem tzw. jednoetapowego rozwoju raka bez poprzedzających go stanów przedrakowych, co jednak wydaje się mało prawdopodobne. Przypadki te są raczej wynikiem tzw. cichego rozwoju procesu karcinogenezy, nieuchwyconego we wcześniejszym postępowaniu diagnostycznym [10,11]. Jak wynika z przeprowadzonego badania, stwierdzenie obecności DA HPV wysokiego ryzyka wiązało się z 9,9-krotnym zwiększeniem ryzyka progresji zmian o charakterze CI a stwierdzenie przetrwałego zakażenia HPV definiowanego jako obecność ekspresji transkryptorów E6/E7 mra HPV zwiększało iloraz szans wystąpienia progresji CI1 do CI wyższych stopni i do raka szyjki macicy 306,18 razy. W przeprowadzonym niniejszym badaniu nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy częstością występowania regresji w 4-5 letniej obserwacji u pacjentek z SPI i pacjentek z CI1. Również nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania regresji w grupach pacjentek z CI1 i z CI2. atomiast regresja znamiennie częściej występowała (p=0,038) u pacjentek z SPI niż u pacjentek z CI2. Stan stacjonarny w trakcie 4-5 letniej obserwacji występował znamiennie (p=0,050) częściej u pacjentek z CI1 niż u pacjentek z SPI. Również u pacjentek z CI2 stan stacjonarny występował znamiennie (p=0,022) częściej niż u pacjentek z SPI. ie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania stanu stacjonarnego w grupach pacjentek z CI1 i z CI2. Może to świadczyć o niestałym, dynamicznym charakterze SPI, w którym czynniki immunologiczne odgrywają istotną rolę. W porównaniu z CI1, w którym istnieją już cytologiczne znamiona zakażenia HPV (koilocytoza, dyskeratoza itp.), SPI cechuje się również, wyższym odsetkiem remisji w porównaniu z CI 1 gdyż w CI1 strategia unikania rozpoznania zakażenia HPV przez układ immunologiczny jest już realizowana. Porównanie 4-5 letnich obserwacji zachowania się pacjentek z SPI i z CI1 wskazuje na brak istotnych różnic pomiędzy tymi grupami w zakresie występowania progresji do CI2. Potwierdzać to może obserwacje innych autorów [12-15], że CI1 jest morfologiczną manifestacją produktywnego zakażenia HPV, ale być może czas obserwacji jest zbyt krótki. W grupie pacjentek z CI2 znamiennie częściej (p=0,027) występowała progresja do CI3 niż w grupie pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CI2 znamiennie (p=0,027) częściej występowała progresja do CI3 niż w grupie pacjentek z CI1. Świadczy to o stosunkowo dużym potencjale progresji zmian CI2, w których niektórzy patomorfolodzy doszukują się początkowych znamion morfologicznych CI3. Schiffman [14] i Rodrigez [15] na podstawie analizy blisko 10 000 kobiet znajdujących się w bazie danych arodowego Instytutu Raka w USA wysnuli podobne wnioski. Badania epidemiologiczne przeprowadzone na populacji dorosłych kobiety wykazały, że CI1 ulega regresji w 70-80% przypadków, podczas gdy u młodych dziewcząt (adolescentek) odsetek regresji CI1 sięga 90 % [12]. Z uwagi na tak wysoki odsetek spontanicznego cofania się zmian u młodych dziewcząt, w większości krajów zaleca się postępowanie zachowawcze, polegające raczej na obserwacji CI niż stosowaniu leczenia [16-19]. Stosowanie technik operacyjnych a w szczególności konizacja, dodatkowo zwiększa ryzyko wystąpienia porodów przedwczesnych, zwłaszcza w ciążach bliźniaczych [20]. atomiast o charakterze CI3, które uważa się za prawdziwe przedrakowe wykazują potencjał progresji do raka inwazyjnego wynoszący 0,2-4% w przeciągu 12 miesięcy [21]. 626 J. Wyroba i wsp.
Tabela IV i progresja SPI oraz CI1 i CI2 a typy współistniejącej infekcji HPV. Remission and progression of SPI, CI1 and CI2 in different HPV risk groups. Charakter Zachowanie się biologiczne CI2 budzi więcej kontrowersji. Wielu klinicystów uważa CI2 za zmianę przedrakową i dlatego rutynowo poddaje ją leczeniu [22]. Roczny odsetek regresji zmian o charakterze CI 2 u kobiet dojrzałych szacuje się na 15-23%, a w perspektywie 4-5 letniej obserwacji sięga on 55% [23,24]. W naszej prospektywnej obserwacji, regresja CI2 dotyczyła 52,5% przypadków. atomiast progresja CI2 wystąpiła w 21% przypadków, w tym do CI3 w 18,42% a do raka inwazyjnego w 2,63% przypadków. U młodych dziewcząt, podobnie jak CI1, o charakterze CI2 wydają się mieć większą skłonność do regresji. W badaniu Moora i wsp. [24] odsetek regresji zmian o charakterze CI2 wyniósł 65% a progresji do CI3 13%. W dużym badaniu Fuchs i wsp. [25] wykazali, że 39% zmian CI2 ulega spontanicznej regresji w ciągu 12 miesięcy a 92% w ciągu 3 lat. iewątpliwie wyjątkowo niski odsetek inwazyjnego raka szyjki macicy w populacji młodych kobiet stanowi kolejną przesłankę do stwierdzenia, że proces karcinogenezy w obrębie szyjki macicy jest procesem wieloetapowym, trwającym kilka do kilkunastu lat i o zależnym również od pozawirusowych kofaktorów. W badaniu Moscicki i wsp. [12] spośród 95 młodych kobiet z CI2 regresję zmian stwierdzono u 70% z nich w ciągu 3 lat. Ten odsetek regresji zmian był wyższy niż w starszych badaniach klinicznych. Syrjanen i wsp. [26] stwierdzili odsetek regresji CI2 wynoszący 53% a odsetek progresji Progresja LR HR LR+HR Σ % LR HR LR+HR Σ % SPI 50 26 0 3 38* 76,0 0 4 2 6 12,0 CI1 50 23 1 2 26 52,0 1 3 5 9 18,0 CI2 38 12-1 14** 36,8 0 9 3 12 31,6 Σ 138*** 61 (78,2%) 1 6 78 56,6 1 (3,7%) 7 (5,1%) 26 (96,3%) * w 9 przypadkach, u których wystąpiła remisja SPI, techniką HC2 nie stwierdzono infekcji HPV. ** w jednym przypadku diagnostyka HPV techniką HC2 nie wykazała obecności DA HPV. *** w 33 przypadkach utrzymywały się lub uległy remisji i następnie nawrotowi. 16 10 27 19,6 Tabela V i progresja zmian o charakterze SPI oraz CI1 i CI2 a obecność transkryptorów genów E6 i E7 HPV 16, 18, 31, 33 i 45. Remission and progression in SPI, CI1 and CI 2 compared to presens of E6 i E7 HPV 16, 18, 31 and 45 genes transcriptors. Charakter Progresja mra (+) mra (-) 6 mra (-) n % n % 6 n % n % Σ SPI 50 1 2,6 37 97,4 38 4 66,7 2 33,3 6 CI1 50 1 3,8 25 96,2 26 5 55,6 4 44,4 9 CI2 38 0 0,0 14 100,0 14 11 91,7 1 8,3 12 Σ 138 2 2,6 76 97,4 78 20 74,1 7 25,9 27 p<0,001 tych zmian wyniósł 21%. To badanie obejmowało nieco starsze kobiety niż badanie Moscicki a ponadto nie u wszystkich kobiet CI potwierdzono badaniem histologicznym szyjki macicy. Odsetek ten stwierdzono dla rozpoznań cytologicznych. atomiast wśród histologicznie potwierdzonych rozpoznań CI2 odsetek regresji wyniósł 34% a odsetek progresji 20% [27]. W innym badaniu asiell i wsp. [28] również wykazali niższy odsetek regresji zmian CI wynoszący- 54% a progresji- 30%. Wszystkie ta badania sugerują, że CI2 może cechować się odmienną charakterystyką biologiczną lub, że klasyfikacja morfologiczna nie dość dokładnie odzwierciedla biologiczny potencjał tej. iektórzy badacze uważają, że nie istnieje coś takiego jak CI2. Większość zgadza się, że powtarzalność histologicznego rozpoznania CI2 jest niska [29,30]. Wciąż niejednoznaczne wnioski wynikają z badań nad koinfekcjami bakteryjnymi w progresji zmian CI. W ciekawym badaniu Moscicki i wsp. [12] zaobserwowała, że współistniejące zakażenie. gonorrhoeae wiązało się ze zwiększonym odsetkiem regresji zmian o charakterze CI2. Wysunęli oni hipotezę, że intensywny odczyn zapalny spowodowany rzeżączką wiąże się nieoczekiwanie z pozbyciem się przez organizm zakażenia wirusowego. iezależnie w cytowanym badaniu stwierdzono, że zakażenie HPV typami 16/18 wiązało się z 20-krotnym zwiększeniem ryzyka progresji CI. W badaniu Xiaolei i wsp. [31] wykazano, że koinfekcja Ureaplasma Urealiticum może nasilać efekt mutagenny HPV i tym samym prowadzić do do częstszych progresji zmian CI. ie możemy zapominać że infekcja HPV oraz o typie CI wiążą się nie tylko ze zmianami w obrębie narządów płciowych, ale także z rozwojem nowotworów innych narządów, szczególna rola infekcji HPV 16 jest podkreślana w przypadku raka odbytu [32]. Wnioski 1. Zmiany o charakterze subklinicznej infekcji HPV, CI1 i CI2 w obrębie szyjki macicy są zmianami, mogącymi ulegać progresji do wyższych stopni CI i do raka szyjki macicy, mogącymi przez wiele lat pozostawać w stanie stacjonarnym a nawet ulegać remisji. 2. Zakażenie HPV typami o wysokim potencjale onkogennym ma znaczenie nie tylko w inicjacji, ale również w rozwoju procesu karcinogenezy w obrębie szyjki macicy poprzez kilka niezależnych mechanizmów. Piśmiennictwo 1. http://globocan.iarc.fr/ 2. Alberico S, Facca MC, Di Bonito L, Millo R, Casaccia R. et al: Frequency of cervico-vaginal infections (Trichomonas vaginalis; Chlamydia trachomatis -CHL-; herpes simplex virus -HSV-; human papilloma virus -HPV-) in cervical intraepithelial neoplasia. Eur J Gynecol Oncol. 1988; 9: 252-257. 3. Smith L, Angarone MP: Sexually Transmitted Infections. Urol Clin orth Am. 2015; 42: 507-518. 4. Rotkin K, King W: Relation of adolescent coitus to cervical cancer risk. JAMA. 1962; 179: 486-491. 5. Singer A: Circumcision and cervical cancer. Lancet 1966; 1: 137. 6. Schiffman M, Solomon D: Findings to date from the ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS). Arch Pathol Lab Med. 2003; 127: 946-949. 7. Östor AG: atural history of cervical intraepithelial neoplasia- a critical review. Inr J Gynecol Pathol. 1993; 12: 186-192. 8. Syrjänen E: atural history of cervical HPV infection and CI. Chapter 6 In Syrjänen K, Syrjänen S. Papillomavirus infection in human pathology. J. Willey & Sons ew York. 2000: 142-166. 9. Hammes LS, aud P, Passos EP, Matos J, Brouwers K. et al: Value of the International Federation for Cervical Pathology and Colposcopy (IFCPC) Terminology in predicting cervical disease. J Low Genit Tract Dis. 2007; 11: 158-165. 10. Wheeler CM: atural history of human papillomavirus infections, cytologic and histologic abnormalities, and cancer. Obstet Gynecol Clin orth Am. 2008; 35: 519-536. 11. Stoler MH: The virology of cervical neoplasia: an HPV- associated malignancy. Cancer J. 2003; 9: 360-367. 12. Moscicki AB, Shiboski S, Hills K, Powell KJ, Jay. et al: Regression of low-grade squamous intra-epithelial lesions in young women. Lancet 2004; 364: 1678-1683. 13. Johnson, Khalili M, Hirschowitz L, Ralli F, Porter R: Predicting residual disease after excision of cervical dysplasia. BJOG 2003; 110: 952-955. 14. Lu CH, Liu FS, Kuo CJ, Chang CC, Ho ES: Prediction of persistence or recurrence after conization for cervical intraepithelial neoplasia 3. Obstet Gynecol. 2006; 107: 830-835. 15. Manu af Heurlin (81,82 Dokt Ingii). 16. Cox JT, Schiffman M, Solomon D: ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS) Group. Prospective follow-up suggests similar risk of subsequent cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 among women with cervical intraepithelial neoplasia grade 1 or negative colposcopy and directed biopsy. Am J Obstet Gynecol. 2003; 188: 1406 1412. 17. assiel K, assiel M, Vaclavinkova V: Behavior of moderate cervical dysplasia during long term followup. 1983; 61: 609 614. 18. Syrjanen K, Kataja V, Yliskoski M, Chang F, Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 11 627
Syrjanen S: atural history of cervical human papillomavirus lesions does not substantiate the biologic relevance of the bethesda system. 1992; 79: 675 682. 19. Wright TC, Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, Solomon D: 2006 consensus guidelines for the management of women with cervical intraepithelial neoplasia or adenocarcinoma in situ. Am J Obstet Gynecol. 2007; 197: 340 345. 20. Pinborg A, Ortof G, Loft A, Rasmussen SC, Ingerslev HV: Cervical conization doubles the risk of preterm and very preterm birth in assisted reproductive technology twin pregnancies. Hum Reprod. 2015; 30: 197-204. 21. Goldie SJ, Kohli M, Grima D, Weinstein MC, Wright TC. et al: Projected clinical benefits and cost-effectiveness of a human papillomavirus 16/18 vaccine. J atl Cancer Inst. 2004; 96: 604 615. 22. Castle PE, Schiffman M, Wheeler CM, Solomon D: Evidence for frequent regression of cervical intraepithelial neoplasia-grade 2. 2009; 113: 18 25. 23. Insinga RP, Dasbach EJ, Elbasha EH: Epidemiologic natural history and clinical management of human papillomavirus (HPV) disease: a critical and systematic review of the literature in the development of an HPV dynamic transmission model. BMC Infect Dis. 2009; 9: 119. 24. Moore K, Cofer A, Elliot L, Lanneau G, Walker J, Gold MA: Adolescent cervical dysplasia: histologic evaluation, treatment, and outcomes. Am J Obstet Gynecol. 2007; 197: 141, e1 6. 25. Fuchs K, Weitzen S, Wu L, Phipps MG, Boardman LA: Management of cervical intraepithelial neoplasia 2 in adolescent and young women. J Pediatr Adolesc Gynecol. 2007; 20: 269 274. 26. Syrjanen K, Kataja V, Yliskoski M, Chang F, Syrjanen S: atural history of cervical human papillomavirus lesions does not substantiate the biologic relevance of the bethesda system. 1992; 79: 675 682. 27. Kataja V, Syrjanen K, Mantyjarvi R, Vayrynen M, Syrjanen S. et al: Prospective follow-up of cervical HPV infections: life table analysis of histopathological, cytological and colposcopic data. Eur J Epidemiol. 1989; 5: 1 7. 28. assiel K, assiel M, Vaclavinkova V: Behavior of moderate cervical dysplasia during long term followup. 1983; 61: 609 614. 29. Castle PE, Schiffman M, Wheeler CM, Solomon D: Evidence for frequent regression of cervical intraepithelial neoplasia-grade 2. 2009; 113: 18 25. 30. Dalla Palma P, Giorgi Rossi P, Collina G, Buccoliero AM, Ghiringhello B. et al: The reproducibility of CI diagnoses among different pathologists: data from histology reviews from a multicenter randomized study. Am J Clin Pathol. 2009; 132: 125 132. 31. Xiaolei C, Taot H, Zongli S, Honrying Y: The role of ureaplasma urealiticum infection in carvical intraepithelial neoplasia and cervical cancer. Eur J Gynaecol Oncol. 2014; 35: 571-575. 32. Sehnal B, Dusek L, Cibula D, Zima T, Halaska M. et al: The relationship between the cervival and anal HPV infection in women with cervical intraepitelial neoplasia. J Clin Virol. 2014; 59: 18-23. 628 J. Wyroba i wsp.