UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedra Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 4 i 5 OCENA EKOTOKSYCZNOŚCI TEORIA Chemia zanieczyszczeń środowiska Gdańsk, 2014
Ocena ekotoksyczności teoria 2 Źródło: T. M. Traczewska, Biologiczne metody oceny skażenia środowiska, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław, 2011, s. 27-33 METODY TESTOWE BADANIA TOKSYCZNOŚCI PRZYDATNE W INŻYNIERII ŚRODOWISKA Metody badania toksyczności można sklasyfikować w odniesieniu do czasu trwania testu, miejsca jego prowadzenia, kryteriów oceny efektów oraz organizmów, jakie mają być wykorzystane. Obiektem badań może być cały organizm, wybrany narząd, hodowla komórek lub reakcja enzymatyczna. Negatywny wpływ badanych substancji jest oceniany za pomocą biologicznych mierzalnych efektów końcowych (ang. end points), które są wybierane ze względu na znaczenie dla przeżycia, wzrostu, zachowania organizmów, czy przetrwania gatunku. Efekty te różnią się w zależności od typu testu, użytych gatunków i przyjętego modelu badań. Zależność dawka odpowiedź Wiele grup substancji chemicznych zarówno pochodzenia naturalnego, jak i antropogenicznego wykazuje toksyczność środowiskową. Jednakże nie oznacza to, że każda ekspozycja organizmu na dany czynnik musi powodować efekt toksyczny. To, że substancja w określonym stężeniu stanowi zagrożenie jest determinowane przez zależność między dawką czy stężeniem, na jakie eksponowany jest organizm, a wywołanym efektem toksycznym. Ujawnienie się tego efektu następuje dopiero wtedy, gdy ilość, na jaką narażony jest organizm jest dostatecznie duża. Najważniejsza jest dawka lub ilość składnika, która wniknęła do organizmu i ona determinuje skutki biologiczne. Najczęstszym efektem końcowym w testach toksyczności ostrej jest śmierć organizmu. Małe dawki substancji aktywnej w rezultacie stymulującego działania mogą skutkować lepszym rozwojem czy poprawą czynności fizjologicznych. Wynika stąd, że poniżej dawki progowej określonego stężenia nie obserwuje się negatywnego wpływu związku chemicznego na organizm. Relacje między dawką substancji lub stężeniem, na które narażony jest organizm, a obserwowanym efektem biologicznym określa się mianem zależności dawka odpowiedź (Wayne i in., 1995).
Ocena ekotoksyczności teoria 3 W toksykologii środowiskowej używa się pojęcia stężenia substancji w środowisku. Jest to substytut nieznanej dawki lub stężenia, które faktycznie wniknęły do organizmu w efekcie pobrania. Wynika to z faktu, że stopień absorpcji związku chemicznego przez organizm zależy od wielu parametrów, jak np. od stosunku powierzchni do objętości, kształtu, rodzaju pokrycia ciała, rodzaju układu oddechowego itp. Dlatego zależność obserwowanego efektu od dawki/stężenia nie jest wprost proporcjonalna i jest odmienna dla różnych gatunków. Graficzny opis odpowiedzi (enzymatycznej, organizmu, populacji czy biocenozy) w odniesieniu do ksenobiotyku określa się mianem krzywej zależności dawka odpowiedź. Zależnością tą może być opisywana inhibicja enzymów, uszkodzenia DNA, śmierć, zmiana zachowania i in. W zależności od cech organizmów krzywa ta może mieć różny kształt. Po połączeniu linią ciągłą punktów mierzonego efektu działania określonej dawki/stężenia badanej substancji otrzymuje się tzw. krzywą sigmoidalną (Rys. 1). Krzywą tę opisują takie parametry, jak stężenie lub dawka wywołująca efekt w 50 % oraz nachylenie w części liniowej krzywej przechodzącej przez punkt efektu połowicznego. Rys. 1. Kumulowana śmiertelność w efekcie stężenia środowiskowego lub dawki substancji toksycznej Punkt efektu połowicznego (ang. mid point) zwykle przedstawia się w postaci wartości LC 50, LD 50, EC 50, ED 50 lub IC 50, których definicje są następujące: LC 50 (ang. lethal concentration) medialne stężenie śmiertelne, statycznie wyznaczona wielkość stężenia substancji, po narażeniu na które można oczekiwać, że w czasie ekspozycji lub w trakcie określonego, umownego okresu po ekspozycji nastąpi zgon 50 % organizmów narażonych na tę substancję. Wartość LC 50 wyraża się w jednostkach wagowych danej substancji na jednostkę objętości (mg/l).
Ocena ekotoksyczności teoria 4 LD 50 (ang. lethal dose) medialna dawka śmiertelna, statycznie wyznaczona wielkość pojedynczej dawki substancji, po podaniu której można oczekiwać śmierci 50 % narażonych organizmów testowych. Wartość LD 50 jest wyrażana w jednostkach wagowych podanej substancji na jednostkę masy ciała badanych zwierząt (mg/kg). EC 50 (ang. effective concentration) medialne stężenie skuteczne, statystycznie obliczone stężenie, które indukuje w medium środowiskowym określony efekt u 50 % organizmów doświadczalnych w określonych warunkach (np. działanie hamujące lub stymulujące procesy fizjologiczne, takie jak aktywność enzymatyczna, bioluminescencja, fotosynteza itp.). Parametr ten jest używany w przypadku efektów innych niż śmierć organizmów. ED 50 (ang. effective dose) medialna dawka skuteczna, statystycznie obliczona dawka substancji wywołująca określony skutek u 50 % organizmów doświadczalnych w określonych warunkach testu. IC 50 (ang. inhibitory concentration) medialne stężenie inhibitora hamujące w 50 % funkcje biologiczne i biochemiczne organizmów. Parametr ten stosowany jest do opisu ograniczenia wzrostu bakterii, glonów i innych organizmów. Do opisu stężeń minimalnych lub niewywołujących efektów ocenianych metodami graficznymi lub statystycznymi używa się wielkości zdefiniowanych następująco: NOEC (ang. no observed effects concentration) największe stężenie, dla którego nie występuje istotny wzrost częstości lub nasilenia skutków działania danej substancji u badanych organizmów NOEL (ang. no observed effects level) największa dawka, dla której nie występuje istotny wzrost częstości lub nasilenia skutków działania danej substancji u badanych organizmów NOAEC (ang. no observed adverse effects concentration) największe stężenie umożliwiające wyznaczenie zależności dawka odpowiedź, gdy nie występuje statystycznie lub biologicznie istotny wzrost częstości lub nasilenia szkodliwych skutków działania substancji u badanych organizmów NOAEL (ang. no observed adverse effects level) dawka umożliwiająca wyznaczenie zależności dawka odpowiedź, gdy nie występuje statystycznie lub biologicznie istotny wzrost częstości lub nasilenia szkodliwych skutków działania substancji u badanych organizmów
Ocena ekotoksyczności teoria 5 LOEC (ang. lowest observed effects concentration) najmniejsze stężenie, dla którego występuje istotny wzrost częstości lub nasilenia skutków działania danej substancji u badanych organizmów LOEL (ang. lowest observed effects level) najmniejsza dawka, dla której występuje istotny wzrost częstości lub nasilenia skutków działania danej substancji u badanych organizmów LOAEC (ang. lowest observed adverse effects concentration) najmniejsze stężenie zastosowane w badaniach, umożliwiające wyznaczenie zależności dawka odpowiedź na organizmach doświadczalnych, dla którego jeszcze występuje statystycznie i biologicznie istotny wzrost częstości występowania szkodliwych skutków działania substancji u badanych organizmów LOAEL (ang. lowest observed adverse effects level) najmniejsza dawka umożliwiająca wyznaczenie zależności dawka odpowiedź na organizmach doświadczalnych, dla którego jeszcze występuje statystycznie i biologicznie istotny wzrost częstości występowania szkodliwych skutków działania substancji u badanych organizmów w stosunku do próbki kontrolnej.