Od Gurdona do Yamanaki, czyli krótka historia reprogramowania komórek

Od Gurdona do Yamanaki, czyli krótka historia reprogramowania komórek Jacek Zbigniew Kubiak 1,* Maria Anna Ciemerych 2,* 1 CNRS, UMR 6290, University Rennes 1, Institute of Genetics and Development of Rennes (IGDR), Cell Cycle Team, UEB, IFR 140, Faculty of Medicine, Rennes, France 2 Zakład Cytologii, Instytut Zoologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa * CNRS, UMR 6290, University Rennes 1, Institute of Genetics and Development of Rennes (IGDR), Cell Cycle Team, UEB, IFR 140, Faculty of Medicine, F-35043 Rennes, France; tel.: (33) 223 23 46 98, e-mail: jacek.kubiak@ univ-rennes1.fr (prof. Jacek Z. Kubiak) lub Zakład Cytologii, Instytut Zoologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Ilji Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel.: (22) 5542216, e-mail: ciemerych@biol.uw.edu.pl (prof. Maria A. Ciemierych) Artykuł otrzymano 5 marca 2013 r. Artykuł zaakceptowano 5 kwietnia 2013 r. Słowa kluczowe: rozwój zarodkowy, klonowanie płazów i ssaków, różnicowanie, komórki ES, komórki ips Wykaz skrótów: komórki EC (ang. embryonic carcinoma) komórki raka zarodkowego; komórki ES (ang. embryonic stem) zarodkowe komórki macierzyste; komórki ips (ang. induced pluripotent stem) indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste STRESZCZENIE Artykuł przedstawia genezę odkryć, które doprowadziły do uzyskania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Osiągnięcie to zostało nagrodzone w roku 2012 nagrodą Nobla w dziedzinie Fizjologii lub Medycyny, którą otrzymali John B. Gurdon i Shinya Yamanaka. Werdykt Komitetu Noblowskiego brzmiał następująco: za odkrycie, że dojrzałe, zróżnicowane komórki mogą być reprogramowane w ten sposób, że odzyskują stan pluripotencji typowy dla komórek macierzystych. Podstawy do tego odkrycia stworzył Gurdon w latach 60. XX wieku, choć nie był pionierem w swej dziedzinie badań. Kropkę nad i postawił zaś Yamanaka na początku XXI wieku. Japończyk przyszedł na świat pięćdziesiąt lat temu, czyli dokładnie w roku, w którym Gurdon dokonał swych najważniejszych odkryć. Mimo tak dużej różnicy wieku obu naukowców ich badania doskonale się uzupełniają, a dokonane przez nich odkrycia znalazły liczne zastosowania w projektach dotyczących biologii komórki i rozwoju zwierząt, a także dają nadzieję na ich wykorzystanie w medycynie regeneracyjnej. WPROWADZENIE Początki reprogramowania Długa droga prowadząca do Nagrody Nobla dla Gurdona i Yamanaki zaczęła się od postawienia pytania czy komórki zarodkowe mające potencjał tworzenia wszystkich komórek i tkanek organizmu tracą te zdolności raz na zawsze w trakcie rozwoju osobniczego, czy też tylko blokują informację genetyczną w sposób odwracalny. Patrząc na ten problem z drugiej strony pytanie to przeformułowano tak: czy komórki w procesie różnicowania tracą informację niezbędną do ich funkcjonowania w stanie niezróżnicowanym, stanie pluripotencji. Po raz pierwszy sposób na rozwiązanie tej zagadki zaproponował niemiecki laureat Nagrody Nobla z roku 1935 i odkrywca indukcji zarodkowej, Hans Spemann. Wymyślił on fantastisch Experiment, czyli fantastyczne doświadczenie, które miało polegać na przeniesieniu jądra zróżnicowanej komórki płaza do pobudzonego do rozwoju oocytu i obserwacji czy tak zrekonstruowany zarodek będzie w stanie przeprowadzić po raz drugi cały proces rozwojowy. Spemann określał swoje hipotetyczne doświadczenie mianem fantastisch Experiment, gdyż po prostu sądził, że jest ono technicznie niewykonalne. Wielki embriolog jednak się mylił. Postęp nauki sprawił bowiem, że wykonanie fantastycznego doświadczenia okazało się w zasięgu ręki. Pod koniec lat 40. XX wieku dwaj amerykańscy embriolodzy Robert Briggs i Thomas King, przymierzając się do podjęcia spemannowskiej próby złożyli propozycję grantu w National Cancer Institute. Ich pomysł został jednak odrzucony jako pozbawiony sensu. Dopiero po powtórnym zgłoszeniu grantu udało im się przełamać lody i uzyskać finansowanie na swoje badania. Pierwszy fantastisch Experiment Briggs i King wykonali w roku 1952 (Ryc. 1) [1]. Za pomocą szklanych pipet wprowadzali jądra komórkowe izolowane z komórek zarodków żaby Rana pipiens do oocytów pozbawionych ich własnej chromatyny. Następnie pobudzali tak zrekonstruowane oocyty żaby do rozwoju zarodkowego. Wyniki tych doświadczeń były bardzo zachęcające. Okazało się bowiem, że pod wpływem cytoplazmy oocytu jądra komórek zarodkowych żaby, były w stanie w stanie ponownie uruchomić już raz zrealizowany program rozwojowy. Briggs i King obserwowali w niektórych przypadkach rozwój tak sklonowanych zarodków aż do stadium kijanki. Częstość z jaką uzyskiwali tak zaawansowany rozwój była jednak niska. Kiedy jednak użyli do podobnych doświadczeń jąder komórek już zróżnicowanych, rozwoju zarodkowego nie obserwowali. Wysnuli więc wniosek, że różnicowanie jest procesem zmieniającym informację genetyczną w sposób nieodwracalny [2]. 124 www.postepybiochemii.pl

Rycina 1. Historia badań, które doprowadziły do uzyskania pierwszych sklonowanych zwierząt oraz linii pluripotencjalnych komórek macierzystych ES i ips. Nieco później John Gurdon prowadził podobne doświadczenia na innym płazie bezogoniastym, Xenopus laevis [3-5]. Badania takie były również realizowane przez Kobla i współpracowników [6], rozszerzone znów przez Gurdona [7,8], a także Wabla [9] i Di Berardino [10-12]. Okazało się, że przeszczepienie jądra komórkowego pochodzącego nawet z bardzo wyspecjalizowanych komórek, np. naskórka [8], limfocytu [9], erytrocytu lub erytroblastu [11,12] do oocytu płaza, który uprzednio został pozbawiony własnego materiału genetycznego, może doprowadzić do zakończonego sukcesem rozwoju zarodkowego. Wykazano więc, że komórki dorosłego organizmu zachowują całą informację umożliwiającą przeprowadzenie rozwoju zarodkowego. Różnicowanie komórek ssaków też jest odwracalne Wczesne próby powtórzenia u ssaków opisanych wyżej doświadczeń prowadzonych na płazach przyniosły jednak rozczarowanie. Podejrzewano, że odwracalność procesu różnicowania mogła dotyczyć wyłącznie niższych kręgowców, a nie ssaków. Do takiego wniosku doszli McGrath i Solter obserwując rozwój zarodków mysich, uzyskiwanych przez transplantacje jąder komórkowych blastomerów, do zygot pozbawionych własnego materiału genetycznego [13]. Uzyskali oni pełen rozwój zarodkowy wyłącznie gdy do doświadczeń użyli jąder komórkowych pochodzących z blastomerów zarodków dwukomórkowych. Wskazywało to, że choć jądra zróżnicowanych komórek płazów były w stanie pokierować rozwojem zarodka powstałego po ich przeszczepieniu do oocytów, to ssacze jądra komórkowe wydawały się ulegać nieodwracalnym zmianom już w trakcie rozwoju przedimplantacyjnego. Podobne badania prowadzone były także w Zakładzie Embriologii Uniwersytetu Warszawskiego. Zespół kierowany przez Andrzeja K. Tarkowskiego analizował zmiany jakim podlegają jądra komórek somatycznych wprowadzonych do oocytów myszy. Zakładano, że kluczem do sukcesu polegającego na sklonowaniu ssaka jest odpowiednie przemodelowanie jądra komórki somatycznej umożliwiające jego reaktywację, a dzięki temu rekapitulację rozwoju zarodkowego. Analizowano wprowadzane do oocytów jądra tymocytów komórek izolowanych z grasic mysich noworodków i otaczających oocyty komórek folikularnych [14-22], ale także jądra komórek pochodzących z blastomerów budujących przedimplantacyjny zarodek myszy [23,24]. Dzięki tym pracom uzyskano wiele cennych danych na temat reorganizacji chromatyny jąder wprowadzonych do oocytów myszy. Nie doprowadziły one jednak do opracowania metod pozwalających na uzyskanie rozwijających się zarodków. Pomimo, że badania Tarkowskiego nie zakończyły się sukcesem to zarówno on jak i współautor tej pracy przeglądowej (J.Z.K.) mają skromny wkład w klonowanie zwierząt. Obaj opracowali bowiem technikę elektrofuzji komórek zarodkowych [25], wykorzystaną później w doświadczeniach, które doprowadziły do klonowania owcy Dolly. Postępy Biochemii 59 (2) 2013 125

Rycina 2. Schemat doświadczeń prowadzących do uzyskania sklonowanych zwierząt lub pluripotencjalnych komórek macierzystych ES lub ips. Pierwszym etapem klonowania jest usunięcie chromosomów z owulowanych oocytów. Następnie do cytoplazmy takiego oocytu wprowadzane jest jądro komórki somatycznej, np. fibroblastu, a oocyt pobudzany jest do rozwoju bodźcem partenogenetycznym. Takim bodźcem może być np. impuls prądu elektrycznego o określonym napięciu i częstotliwości. Po aktywacji rozwija się zarodek, który osiąga stadium blastocysty. Blastocystę można przeszczepić do dróg rodnych samicy biorczyni i uzyskać sklonowany organizm. W ten sposób uzyskano np. owcę Dolly. Alternatywnie, z blastocysty można uzyskać linię komórek ES. Komórki takie określane są jako ntes, od ang. nuclear transfer ES. Fibroblasty mogą zostać reprogramowane dzięki nadekspresji genów kluczowych dla utrzymania pluripotencji, np. Oct3/4, Sox2, Klf4. Zabieg taki prowadzi do uzyskania linii komórek ips. Dopiero kolejne próby klonowania, w których do oocytów przeszczepiano jądra komórek somatycznych izolowanych z zarodków owiec dały pozytywne wyniki [26]. Następnie powtórzono te doświadczenia na komórkach krowy [27]. Jednak przełomowe okazały się doświadczenia Iana Wilmuta, Keitha Campbella i ich współpracowników, którym udało się sklonować owcę Dolly. Przeprowadzone przez nich doświadczenie polegało na przeniesieniu jądra zróżnicowanej komórki nabłonkowej gruczołu mlekowego dorosłej owcy do oocytu pozbawionego własnego jądra (Ryc. 2) [28]. Wkrótce potem sklonowano pierwsze myszy [29,30]. Osiągnięcia te były doskonałym dopełnieniem badań Briggsa, Kinga i Gurdona. Zarodkowe komórki macierzyste mogą służyć jako narzędzie w badaniach różnicowania Równocześnie z pracami Kinga, Briggsa czy Gurdona, prowadzono badania, których uwieńczeniem również była Nagroda Nobla w dziedzinie Fizjologii lub Medycyny. Prace te dotyczyły komórek pluripotencjalnych (Ryc. 3), a więc takich które mogą różnicować się we wszystkie tkanki budujące organizm. Pierwsze prace, w których zwrócono uwagę na to, że nie tylko komórki przedimplantacyjnych zarodków ssaków są pluripotencjalne dotyczyły analiz guzów powstających w jądrach lub jajnikach myszy potworniaków (teratom, od gr. teratos). Już w 1941 stwierdzono, że mogą one zawierać komórki zdolne do różnicowania we wszystkie tkanki budujące organizm [31]. Kolejne analizy potwierdziły te obserwacje (praca przeglądowa [32]) i w efekcie doprowadziły do uzyskania pierwszej linii komórek pluripotencjalnych, tzw. komórek raka zarodkowego (ECC, ang. embryonic carcinoma cells) [33,34]. Wyniki doświadczeń, w których badano zdolności do różnicowania się komórek uzyskanych z potworniaków oraz stwierdzenie, że potworniaki powstają z komórek rozrodczych zainicjowały prace, które doprowadziły do uzyskania pierwszych linii mysich zarodkowych komórek macierzystych (ES, ang. embryonic stem). Komórki te otrzymali niezależnie od siebie Gail Martin [35] oraz Martin Evans i Matthew Kaufman [36]. Martin Evans został za swoje odkrycie uhonorowany Nagrodą Nobla w 2007 roku. W 1998 uzyskano zaś pierwsze ludzkie [37,38], a w 2008 szczurze linie komórek ES [39]. Od momentu uzyskania mysich komórek ES prowadzone były liczne prace mające na celu określenie podłoża molekularnego ich pluripotencji, samoodnawiania ich populacji oraz nieograniczonych zdolności różnicowania we wszystkie rodzaje komórek budujących organizm. Badania te doprowadziły do identyfikacji wielu szlaków przekazywania sygnałów, jak również czynników odpowiedzialnych za specyficzny charakter komórek ES. Wśród nich są powszechnie dziś uważane za markery pluripotencji czynniki transkrypcyjne Oct3/4, Nanog czy Sox2 (prace przeglądowe [40,41]). Ta gromadzona przez lata badań wiedza została następnie twórczo wykorzystana w badaniach, które zainicjował Shinya Yamanaka. 126 www.postepybiochemii.pl

Rycina 3. Komórki macierzyste charakteryzują odmienne zdolności do różnicowania. Reprogramowanie komórek jest możliwe poprzez manipulacje genetyczne Zakończone sukcesem badania Gurdona, Wilmuta i wielu innych badaczy udowodniły, że możliwe jest klonowanie zwierząt. A więc reprogramowanie jądra komórek somatycznych przez cytoplazmę oocytu. Czy jednak taki proces byłby możliwy bez uciekania się do transplantacji jądra komórki zróżnicowanej do oocytu? Do dziś nie wiadomo w jaki dokładnie sposób cytoplazma oocytu, do którego wprowadzono jądro zróżnicowanej komórki, powoduje jego reprogramowanie. Jest jednak oczywiste, że istotą tego procesu są zmiany w ekspresji określonych genów. Podczas rozwoju w różnicujących się komórkach wyciszeniu ulegają geny warunkujące pluripotencję, takie jak np. Oct3/4 czy Nanog. Dochodzi też wtedy do aktywacji genów charakterystycznych dla różnicujących się komórek i powstających tkanek. W pełni zróżnicowana komórka charakteryzuje się więc ekspresją unikalnego zestawu genów. Shinya Yamanaka skoncentrował swoje badania na czynnikach, które zidentyfikowano podczas wieloletnich badań komórek ES. Wybrał te czynniki, które zaangażowane są w utrzymanie pluripotencji [42-45]. Wcześniejsze badania prowadzone przez Tadę i współpracowników dokumentowały, że cytoplazma komórek ES miała zdolność indukowania ekspresji Oct4 w komórkach hybrydowych uzyskanych przez ich fuzję z dojrzałymi tymocytami [45]. Na podstawie tej obserwacji Yamanaka sformułował hipotezę, że pluripotencja takich hybrydowych komórek zależy od czynników transkrypcyjnych obecnych w jądrach komórek macierzystych, przenikających po fuzji do jąder komórki somatycznej. Przyszły noblista postanowił zbadać czy możliwa byłaby indukcja stanu pluripotencji bez uciekania się do fuzji komórkowej, a poprzez indukcję ekspresji wybranych czynników transkrypcyjnych. Yamanaka wybrał 24 geny, o których wiedział, że w komórkach ES regulują samoodnawianie, pluripotencje (np. Oct3/4., Sox2), ale także są odpowiedzialne za podtrzymanie proliferacji (np. onkogen c-myc). Przeprowadzone przez niego doświadczenia polegało najpierw na transfekcji mysich fibroblastów wirusami kodującymi pojedyncze geny. Niestety, nie przyniosło to oczekiwanych skutków. Dopiero jednoczesna ekspresja wszystkich 24 genów doprowadziła do reprogramowania fibroblastów, które przekształciły się w kolonie komórek do złudzenia przypominających komórki ES. Kluczowym było pytanie o to jakie czynniki są niezbędne potrzebne do reprogramowania fibroblastów. Ponadto, jasne było, że indukcja pluripotencji za pomocą jednoczesnej nadekspresji aż 24 genów jest zadaniem karkołomnym. Yamanka postanowił więc zbadać, czy możliwe jest ograniczenie liczby czynników. Okazało się, że do reprogramowania mysich fibroblastów wystarczy użycie jedynie czterech genów. Były to odpowiedzialne za utrzymanie pluripotencji czynniki Oct3/4 i Sox2, a także Klf4 warunkujący syntezę białka Nanog, oraz onkogen c-myc (Ryc. 2) [46]. Komórki uzyskane przez ekipę Yamanaki nazwano indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (ips, ang. induced pluripotent stem). Szybko okazało się, że mogą one różnicować się zarówno in vitro jak i in vivo, tworząc wszystkie tkanki w chimerowych myszach. Myszy takie uzyskuje się przez wprowadzenie komórek pluripotencjalnych (np. ES lub ips) do blastocyst, a więc zarodków przedimplantacyjnych. Następnie Postępy Biochemii 59 (2) 2013 127

Rycina 4. Metody pozwalające na stwierdzenie, czy komórki macierzyste są pluripotencjalne. A. Otrzymywanie chimer. Testowane komórki zwierzęce, np. mysie, wprowadzane są do jamy blastocysty, a następnie zarodek przeszczepiany jest do dróg rodnych samicy myszy. Jeżeli z komórek macierzystych powstaną wszystkie tkanki i narządy będzie to świadczyło o tym, że są one pluripotencjalne. W wyniku takiego doświadczenia powstanie zwierzę chimerowe. B. Tetraploidalna komplementacja. Tetraploidalną blastocystę uzyskuje się w wyniku fuzji blastomerów zarodka dwukomórkowego, a następnie jego hodowli in vitro. Komórki macierzyste wprowadzane są do jamy takiej blastocysty. Ponieważ komórki tetraploidalne mogą tworzyć jedynie struktury pozazarodkowe - błony płodowe, ciało zarodka powstanie jedynie z diploidalnych komórek macierzystych. W wyniku tetraploidalnej komplementacji uzyskuje się więc organizm zbudowany wyłącznie z tkanek powstałych z analizowanych komórek macierzystych, pod warunkiem że są one pluripotencjalne. C. Uzyskiwanie potworniaków. Komórki wprowadzone pod skórę myszy różnicują spontanicznie tworząc guzy, potworniaki (teratomy). Jeżeli guzy zbudowane są z tkanek wywodzących się z ekto-, endo- i mezodermy możemy uznać, że testowane komórki są pluripotencjalne. D. Różnicowanie in vitro. Przesłanką za tym, że testowane komórki są pluripotencjalne może być także ich zdolność do różnicowania in vitro w różnego rodzaju komórki. Jednak jedynie różnicowanie in vivo (tworzenie chimer, potworniaków), prowadzące do uzyskania funkcjonalnych tkanek, może stanowić niepodważalny i ostateczny dowód pluripotencji. zarodki takie przeszczepia się do dróg rodnych samicy biorczyni. Jeżeli w rozwijającym się zarodku i myszy, która w efekcie przyjdzie na świat z testowanych komórek powstaną wszystkie rodzaje komórek, łącznie z płciowymi, będzie to świadczyło, że są one pluripotencjalne. W tym miejscu należałoby dodać, że pierwsze chimerowe myszy uzyskał Andrzej K. Tarkowski. W 1961 roku opublikował on wyniki swoich pionierskich doświadczeń, podczas których łączył ze sobą zarodki pochodzące od różnych myszy i po raz pierwszy uzyskał eksperymentalnie organizm zbudowany z komórek pochodzących od dwóch różnych dawców [47]. Technika uzyskiwania myszy chimerowych jest do dziś stosowana nie tylko w doświadczeniach mających na celu testowanie pluripotencji komórek macierzystych (Ryc. 4), ale także tych prowadzących do uzyskania myszy zmodyfikowanych genetycznie, np. typu knock-out [48]. W roku 2007, grupy badawcze Shinyi Yamanaki i Jamesa Thomsona uzyskały niezależnie od siebie po raz pierwszy ludzkie komórki ips [19,20,49]. W przypadku zróżnicowanych komórek ludzkich efekt przywracania pluripotencji uzyskać można było stosując nieco inny zestaw czynników trakskrypcyjnych niż w przypadku komórek mysich. Yamanaka użył kombinacji genów Myc, Oct4, Sox2 i Klf4, podobnie jak w przypadku fibroblastow mysich. Ale grupa Thomsona zastosowała ekspresję zestawu innych genów: Lin28, Nanog, Oct4 i Sox2. Kolejne badania wykazały, że reprogramować można nie tylko fibroblasty, ale także inne rodzaje komórek (praca przeglądowa [50]). Udokumentowano także, że procedurę tę można przeprowadzić z pominięciem onkogenu c-myc, którego ciągła aktywność prowadziła do rozwoju nowotworów u myszy uzyskanych z pierwszych komórek ips. Doskonalone są także techniki reprogramowania, a główny nacisk położony jest na opracowanie metod, które opierałyby się na wektorach innych niż wirusowe. Idealny wektor dostarczający do komórki aktywne geny pluripotencji nie powinien integrować do DNA komórki, a aktywność wprowadzanych genów powinna być regulowana w odpowiedni sposób. Prowadzone są także próby reprogramowania nie wektorami kodującymi dane białka ale samymi białkami. Należy jednak pamiętać, że w każdym przypadku wydajność uzyskiwania komórek ips jest bardzo niska. 128 www.postepybiochemii.pl

Komórki ips nadzieja medycyny regeneracyjnej? Uzyskanie komórek ips może mieć przełomowe znaczenie dla rozwoju medycyny regeneracyjnej. Może bowiem umożliwić uzyskanie określonego rodzaju tkanki w wyniku reprogramowania komórek pochodzących od indywidualnego pacjenta. Przykładowo fibroblasty pochodzące ze skóry pacjenta można przekształcić w komórki ips, a następnie zaindukować je do różnicowania, np. w neurony lub komórki trzustki. Następnym krokiem byłoby przeszczepienie tak uzyskanych komórek w miejsce tych degenerujących, bez obaw o odrzucenie przeszczepu. Wykorzystanie komórek ips nie budzi także wątpliwości etycznych związanych z uzyskiwaniem i zastosowaniem ludzkich komórek ES, czy tzw. klonowaniem reprodukcyjnym, podczas którego jądro uzyskane z komórek pacjenta przeszczepiane byłoby do ludzkiego oocytu, pozbawionego uprzednio własnego materiału genetycznego. Komórki ES uzyskane z tak zrekonstruowanego zarodka byłyby również identyczne z komórkami pacjenta. Ich uzyskanie wymagałoby jednak zniszczenia ludzkiej blastocysty (Ryc. 2). Wyniki opisujące udane klonowanie ludzkiej blastocysty, a następnie analizę uzyskanych z niej komórek ntes zostały opublikowane w maju 2013 [51]. Dostępność komórek ips usuwa jednak w cień tego rodzaju eksperymenty. Hodowla komórek ips w laboratorium umożliwia także ich genetyczną modyfikację, np. usunięcie z ich genomu mutacji powodującej daną chorobę. Techniki modyfikacji genetycznych komórek pluripotentnych opracowali Cappecchi i Smithies, którzy razem z Evansem zostali nagrodzeni Nagroda Nobla w 2007 roku. Takie właśnie zastosowanie komórki ips mogłyby znaleźć w przypadku wielu chorób degeneracyjnych o podłożu genetycznym. Możliwość hodowania tych komórek w laboratorium otwiera również perspektywy szybszego i łatwiejszego poznawania przyczyn chorób genetycznych, testowania farmaceutyków i wiele innych zastosowań. Myśląc jednak o przyszłości komórek ips nie należy zapominać, że decyzja o ich wykorzystaniu w terapii ciągle zależy od perfekcyjnego opanowania metod różnicowania in vitro. Pomimo wielu lat badań poświęconych różnicowaniu komórek pluripotencjalnych perfekcji tej jeszcze nie osiągnięto. Obecny numer Postępów Biochemii ma przybliżyć nie tylko pluripotencjalne komórki macierzyste ES i ips, a więc te które mogą różnicować we wszystkie rodzaje komórek budujących organizm. Przedstawione zostaną także komórki obecne w tkankach płodowych, np. we krwi pępowinowej, a także w tkankach dorosłych organizmów. O ile bowiem komórki ES i ips pozwalają badać mechanizmy pluripotencji i różnicowania, dają nadzieję na rozwój medycyny regeneracyjnej, to komórki macierzyste naturalnie obecne w tkankach organizmu gwarantują jego prawidłowe funkcjonowanie. PIŚMIENNICTWO 1. Briggs R, King TJ (1952) Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs eggs. Proc Natl Acad Sci USA 38: 455-463 2. King TJ, Briggs R (1956) Serial Transplantation of Embryonic Nuclei. Cold Spring Harbor Symposia Quant Biol 21: 271-290 3. Gurdon JB (1962) Multiple genetically identical frogs. J Heredity 53: 5-9 4. Gurdon JB (1962) Developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J Embryol Exp Morph 10: 622-640 5. Gurdon JB (1962) Adult frogs derived from nuclei of single somatic cells. Develop Biol 4: 256-273 6. Kobel HR, Brun RB, Fischber.M (1973) Nuclear transplantation with melanophores, ciliated epidermal cells, and established cell-line a-8 in Xenopus Laevis. J Embryol Exp Morph 29: 539-547 7. Gurdon JB, Uehlinger V (1966) Fertile intestine nuclei. Nature 210: 1240-1241 8. Gurdon JB, Laskey RA, Reeves OR (1975) Developmental capacity of nuclei transplanted from keratinized skin cells of adult frogs. J Embryol Exp Morph 34: 93-112 9. Wabl MR, Brun RB, Dupasquier L (1975) Lymphocytes of toad Xenopus Laevis have gene set for promoting tadpole development. Science 190: 1310-1312 10. Di Berardino MA, Mizell M, Hoffner NJ, Friesendorf DG (1983) Frog larvae cloned from nuclei of pronephric adenocarcinoma. Differentiation 23: 213-217 11. Di Berardino MA, Hoffner NJ (1983) Gene reactivation in erythrocytes - nuclear transplantation in oocytes and eggs of Rana. Science 219: 862-864 12. Di Berardino MA, Orr NH (1992) Genomic potential of erythroid and leukocytic cells of Rana-Pipiens analyzed by nuclear transfer into diplotene and maturing oocytes. Differentiation 50: 1-13 13. Mcgrath J, Solter D (1984) Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Science 226: 1317-1319 14. Tarkowski AK, Balakier H (1980) Nucleo-cytoplasmic interactions in cell hybrids between mouse oocytes, blastomeres and somatic cells. J Embryol Exp Morphol 55: 319-330 15. Szollosi D, Czolowska R, Soltynska MS, Tarkowski AK (1986) Remodelling of thymocyte nuclei in activated mouse oocytes: an ultrastructural study. Eur J Cell Biol 42: 140-151 16. Szollosi D, Czolowska R, Soltynska MS, Tarkowski AK (1986) Ultrastructure of cell fusion and premature chromosome condensation (PCC) of thymocyte nuclei in metaphase II mouse oocytes. Biol Cell 56: 239-249 17. Szollosi D, Czolowska R, Szollosi MS, Tarkowski AK (1988) Remodeling of mouse thymocyte nuclei depends on the time of their transfer into activated, homologous oocytes. J Cell Sci 91: 603-613 18. Szollosi D, Czolowska R, Borsuk E, Szollosi MS, Debey P (1998) Nuclear envelope removal/maintenance determines the structural and functional remodelling of embryonic red blood cell nuclei in activated mouse oocytes. Zygote 6: 65-73 19. Czolowska R, Modlinski JA, Tarkowski AK (1984) Behaviour of thymocyte nuclei in non-activated and activated mouse oocytes. J Cell Sci 69: 19-34 20. Czolowska R, Szollosi D, Szollosi MS (1992) Changes in Embryonic 8-Cell Nuclei Transferred by Means of Cell-Fusion to Mouse Eggs. Int J Develop Biol 36: 543-553 21. Borsuk E, Szollosi MS, Besomebes D, Debey P (1996) Fusion with activated mouse oocytes modulates the transcriptional activity of introduced somatic cell nuclei. Exp Cell Res 225: 93-101 22. Borsuk E, Maleszewski M (2002) DNA replication and RNA synthesis in thymocyte nuclei microinjected into the cytoplasm of artificially activated mouse eggs. Zygote 10: 229-238 23. Czolowska R, Waksmundzka M, Kubiak JZ, Tarkowski AK (1986) Chromosome condensation activity in ovulated metaphase II mouse oocytes assayed by fusion with interphase blastomeres. J Cell Sci 84: 129-138 24. Modlinski JA (1978) Transfer of embryonic nuclei to fertilized mouse eggs and development of tetraploid blastocysts. Nature 273: 466-467 Postępy Biochemii 59 (2) 2013 129

25. Kubiak JZ, Tarkowski AK (1985) Electrofusion of mouse blastomeres. Exp Cell Res 157: 561-566 26. Willadsen SM (1986) Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320: 63-65 27. Prather RS, Barnes FL, Sims MM, Robl JM, Eyestone WH, First NL (1987) Nuclear Transplantation in the Bovine Embryo - Assessment of Donor Nuclei and Recipient Oocyte. Biol Reprod 37: 859-866 28. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KHS (1997) Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813 29. Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R (1998) Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394: 369-374 30. Wakayama T, Yanagimachi R (1998) The first polar body can be used for the production of normal offspring in mice. Biol Reprod 59: 100-104 31. Jackson EB, Brues AM (1941) Studies on transplantable embryoma of the mouse. Cancer Res 1: 494-498 32. Ciemerych MA, Archacka K, Polanski Z, Kubiak JZ, Cell cycle modifications during oocyte maturation and early development of LT/Sv mice: Normal development or teratoma formation?, in Cell Cycle and Development in Vertebrates, JZ Kubiak, MA Ciemerych, L Richard- -Parpaillon, red. 2009, Research Signpost: Kerala. str. 181-202 33. Evans MJ (1972) The isolation and properties of a clonal tissue culture strain of pluripotent mouse teratoma cells. J Embryol Exp Morphol 28: 163-176 34. Martin GR, Evans MJ (1974) The morphology and growth of a pluripotent teratocarcinoma cell line and its derivatives in tissue culture. Cell 2: 163-172 35. Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634-7638 36. Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: 154-156 37. Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal PD, Huggins GR, Gearhart JD (1998) Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13726-13731 38. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145-1147 39. Li P, Tong C, Mehrian-Shai R, Jia L, Wu N, Yan Y, Maxson RE, Schulze EN, Song H, Hsieh CL, Pera MF, Ying QL (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts. Cell 135: 1299-1310 40. Evans M (2011) Discovering pluripotency: 30 years of mouse embryonic stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol 12: 680-686 41. Suwinska A, Ciemerych MA (2011) Factors regulating pluripotency and differentiation in early mammalian embryos and embryo-derived stem cells. Vitamins Hormones 87: 1-38 42. Takahashi K, Mitsui K, Yamanaka S (2003) Role of ERas in promoting tumour-like properties in mouse embryonic stem cells. Nature 423: 541-545 43. Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S (2003) The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 113: 631-642 44. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A (2003) Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 113: 643-655 45. Tada M, Takahama Y, Abe K, Nakatsuji N, Tada T (2001) Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Current Biology 11: 1553-1558 46. Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676 47. Tarkowski AK (1961) Mouse chimaeras developed from fused eggs. Naturwissenschaften 190: 857-860 48. Ciemerych MA (2008) Zarodkowe komórki macierzyste w poszukiwaniu pluripotencji. Post Biol Kom 35: 183-205 49. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872 50. Archacka K, Grabowska I, Ciemerych MA (2010) Indukowane komórki pluripotentne nadzieje, obawy i perspektywy. Post Biol Kom 37: 41-62 51. Tachibana M, Amato P, Sparman M, Gutierrez NM, Tippner-Hedges R, Ma H, Kang E, Fulati A, Lee HS, Sritanaudomchai H, Masterson K, Larson J, Eaton E, Sadler-Fredd, K, Battaglia D, Lee D, Wu D, Jensen J, Patton P, Gokhale S, Stouffer RL, Wolf D, Mitalipov S (2013) Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell doi. org/10.1016/j.cell.2013.05.006 From Gurdon to Yamanaka a brief history of cell reprogramming Jacek Z. Kubiak 1,*, Maria Anna Ciemerych 2,* 1 CNRS, UMR 6290, University Rennes 1, Institute of Genetics and Development of Rennes (IGDR), Cell Cycle Team, UEB, IFR 140, Faculty of Medicine, F-35043 Rennes, France 2 Department of Cytology, Institute of Zoology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Ilji Miecznikowa St., 02-096 Warsaw, Poland * e-mail: ciemerych@biol.uw.edu.pl or e-mail: jacek.kubiak@univ-rennes1.fr Key words: embryonic development, animal cloning, differentiation, ES cells, ips cells ABSTRACT This paper describes the genesis of discoveries that have allowed cell reprogramming and derivation of induced pluripotent stem cells. This achievement has been distinguished by the 2012 Nobel Prize in Physiology or Medicine awarded to John B. Gurdon and Shinya Yamanaka. The verdict of the Nobel Committee was as follows: for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent. The basis for the discovery was done by Gurdon in the 60s of the twentieth century, although he was not a pioneer in his field of research. The last word was pronounced, however, by Yamanaka at the beginning of the twenty-first century. The Japanese was born fifty years ago, that is exactly the year when Gurdon made his most important discoveries. Despite such a large difference in age of the two scientists their studies complement each other perfectly and promise numerous applications in regenerative medicine. 130 www.postepybiochemii.pl