Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży Zalecenia polskiej grupy ekspertów, 2014

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168 Rekomendacje Recommendations Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży Zalecenia polskiej grupy ekspertów, 2014 Laboratory diagnostics of parvovirus B19 in pregnant women. Recommendations of Polish group of experts, 2014 Piotr Grabarczyk 1 Aleksandra Kalińska 1 Bogumiła Litwińska 2 Marzena Dębska 3 Zbigniew Celewicz 4 Dorota Nowakowska 5 Elżbieta Puacz 6 1 Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie 2 Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie 3 II Klinika Położnictwa i Ginekologii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego, Pracownia Diagnostyki Prenatalnej Szpitala Bielańskiego w Warszawie 4 Klinika Medycyny Matczyno-Płodowej i Ginekologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie 5 Klinika Medycyny Matczyno-Płodowej i Ginekologii Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi, III Katedra Ginekologii i Położnictwa Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 6 Krajowa Izba Diagnostów Laboratoryjnych Zalecenia są owocem wieloletniej współpracy naukowej zespołu polskich diagnostów laboratoryjnych i lekarzy oraz analizy aktualnego piśmiennictwa. Uwzględniają one obowiązujące przepisy prawa. Analiza wyników badań epidemiologicznych zakażeń B19V, ryzyka powikłań w kontekście dostępu do właściwej diagnostyki oraz liczby zlecanych badań wskazuje, że zakażenie B19V jest problemem mało znanym i często nierozpoznawanym. Niniejsze opracowanie jest oparte na pierwotnym dokumencie Rekomendacji stworzonym z inicjatywy Krajowej Izby Diagnostów Laboratoryjnych (KIDL) [1] i kierowanym przede wszystkim do diagnostów laboratoryjnych. W obecnej wersji został on opatrzony obszernym wstępem przedstawiającym najważniejsze informacje dotyczące B19V, które są istotne dla zrozumienia znaczenia klinicznego wirusa oraz prowadzenia w sposób prawidłowy diagnostyki laboratoryjnej. W oparciu o aktualne piśmiennictwo przedstawiono również merytoryczne uzasadnienie zlecania badań oraz więcej szczegółów praktycznych dotyczących ich realizacji. Dlatego autorzy mają nadzieję, że niniejsze opracowanie będzie przydatne w lepszym zrozumieniu wskazań do diagnostyki zakażenia B19V oraz znaczenia uzyskanych wyników badań. W opracowaniu zwrócono uwagę na te parametry testów diagnostycznych, które mają kluczowe znaczenie dla wiarygodności uzyskiwanych wyników i które są istotne zarówno dla laboratorium jak i zleceniodawcy. W zaleceniach szczegółowo przedstawiono sposób zlecania badań, pobierania, transportu i przyjmowania materiału biologicznego. Szczegółowo opisano wymagania dotyczące stosowanej aparatury i testów diagnostycznych oraz sposób zapewnienia jakości badań laboratoryjnych, formułowania, interpretowania i wydawania wyników. W artykule przedyskutowano przyczyny występowania wyników fałszywych oraz zaproponowano sposoby ich unikania. Centralnym elementem rekomendacji jest algorytm postępowania diagnostycznego oraz ogólne zasady interpretacji wyników badań. Dotychczasowe doświadczenia pokazują, że diagnostyka zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży winna łączyć badania swoistych przeciwciał, zarówno klasy IgG jak i IgM, metodami immunoenzymatycznymi oraz DNA B19V metodami biologii molekularnej, najlepiej ilościowymi. Postępowanie diagnostyczne u płodów z podejrzeniem zakażenia B19V należy opierać na badaniu real-time PCR. Autorzy zalecają, aby w przypadku stwierdzenia zakażenia B19V na sprawozdaniu z badań laboratoryjnych umieszczać komentarz wskazujący na konieczność wykonania dalszej specjalistycznej diagnostyki i objęcia kobiety w ciąży odpowiednią opieką medyczną. Diagnostyka zakażeń parvowirusem B19 została szczegółowo omówiona w odniesieniu do kobiet w ciąży, ponieważ konsekwencje zakażenia mogą być poważne i stanowić zagrożenie dla zdrowia a nawet życia płodu. Przedstawione zasady prowadzenia badań diagnostycznych B19V i interpretacji wyników mogą być stosowane również w przypadku innych grup chorych z prawidłową odpornością. Diagnostyka laboratoryjna zakażeń parvowirusem B19 u chorych z obniżoną odpornością nie powinna 157

www.diagnostykalaboratoryjna.eu opierać się na ocenie odpowiedzi immunologicznej metodami immunoenzymatycznymi, ponieważ istnieje możliwość otrzymania nieadekwatnych wyników badań. W takich przypadkach postępowanie diagnostyczne powinno opierać się przede wszystkim na wykrywaniu DNA wirusa. Zasady rozpoznawania zakażeń B19V u chorych z obniżoną odpornością będą przedmiotem oddzielnego opracowania. 1. Biologia parvowirusa B19 (B19V) Parvowirus B19 (B19V) należy do rodziny Parvoviridae, rodzaju Erythrovirus [2]. Replikacja B19V zachodzi w prekursorowych komórkach erytroidalnych w szpiku. Receptorem jest antygen P (globozyd) erytrocytów. Wirus wykazuje powinowactwo również do innych komórek, np. megakariocytów, miocytów mięśnia sercowego, fibroblastów, endothelium, hepatocytów czy błony maziowej stawów. Bezosłonkowy B19V jeden z najmniejszych wirusów wywołujących zakażenia u ludzi jest oporny na termiczne i chemiczne metody inaktywacji stosowane przy produkcji preparatów krwi. W transfuzjologii do najskuteczniejszych sposobów eliminacji tego patogenu z osocza zaliczana jest metoda nanofiltracji [4, 10, 28]. Jednoniciowy DNA parvowirusa B19 koduje białka kapsydu VP1 i VP2 oraz niestrukturalne NS1. Białko VP1 odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej, tropizm wirusa determinuje białko VP2, natomiast białko NS1 jest odpowiedzialne za śmierć zakażonej komórki [4]. Do chwili obecnej wyróżniono trzy główne formy polimorficzne B19V genotypy 1, 2, 3. Najbardziej rozpowszechniony jest genotyp 1 występujący na całym świecie. Genotyp 2 jest sporadycznie wykrywany w Europie, natomiast Afryka Zachodnia to miejsce endemicznego występowania genotypu 3 [5]. Zdiagnozowane dwa przypadki genotypu 2 w Polsce u osób z obniżoną odpornością wskazują na krążenie tej formy polimorficznej w naszym kraju [6]. U osób z prawidłową odpornością zazwyczaj nie obserwuje się objawów klinicznych w przebiegu zakażenia B19V. U dzieci może wystąpić rumień zakaźny ( choroba piąta czy objawy infekcji wirusowej z towarzyszącą wysypką), natomiast u dorosłych powiększenie węzłów chłonnych, złe samopoczucie, gorączka, bóle stawów oraz w rzadkich przypadkach objawy zapalenia mięśnia sercowego [3]. Kobiety nie posiadające przeciwciał anty-b19v są narażone na zakażenie parvowirusem B19 w okresie ciąży, które w konsekwencji może prowadzić do poronienia czy nieimmunologicznego obrzęku płodu (szczególnie w I i II trymestrze ciąży) oraz do niedokrwistości płodu czy noworodka. Zakażenie płodu parvowirusem B19 może być także przyczyną zapalenia mięśnia sercowego, zapalenia wątroby oraz uszkodzenia łożyska. W większości przypadków rokowania długoterminowe u dzieci, które przeżyją wewnątrzmaciczną infekcję B19V są dobre [7, 8, 13, 25, 29]. Szczególną grupę chorych, u których mogą wystąpić istotne problemy kliniczne w przebiegu zakażenia parvowirusem B19 stanowią osoby z niedoborem odporności (np. zakażone wirusem HIV, chorzy otrzymujący leki immunosupresyjne, chemioterapię). W wyniku reaktywacji B19V bądź infekcji de novo może dojść u nich np. do przewlekłej niedokrwistości. U pacjentów z pobudzonym układem czerwonokrwinkowym w szpiku może wystąpić przejściowy przełom aplastyczny [4, 10, 28]. Model przebiegu zakażenia u osób z prawidłową odpornością został opisany na podstawie analizy eksperymentalnego zakażenia zdrowych ochotników. W pierwszej fazie, kiedy przeciwciała anty-b19v nie są jeszcze wykrywane (okienko serologiczne) DNA- -emia B19V we krwi obwodowej osiąga najwyższy poziom i może dochodzić nawet do 10 14 IU/ml. W tym okresie mogą pojawić się niespecyficzne objawy kliniczne, np. gorączka, ból głowy, dreszcze czy niewielki spadek parametrów hematologicznych. Po około 2 tygodniach od wniknięcia wirusa do organizmu zaczynają być produkowane przeciwciała klasy IgM. Ich pojawienie się rozpoczyna drugą fazę infekcji i koreluje z redukcją DNA-emii. W części przypadków wraz ze wzrostem stężenia swoistych przeciwciał obserwowany jest kolejny rzut objawów chorobowych: wysypka, świąd, bóle stawów oraz nieistotny klinicznie spadek stężenia hemoglobiny. Do serokonwersji dochodzi po około tygodniu od pojawienia się przeciwciał klasy IgM. Wtedy zaczynają być produkowane anty-b19v klasy IgG, natomiast anty-b19v klasy IgM zanikają. Przeciwciała klasy IgG skierowane do białka NS1 są markerem świadczącym o przebytym bądź przewlekłym zakażeniu. Przeciwciała klasy IgM są zwykle obecne w surowicy przez około 3 miesiące, ale mogą być wykrywane znacznie dłużej. Takie przedłużające się występowanie anty-b19v klasy IgM nawet powyżej roku obserwowano u polskich dawców krwi [9]. Przyjmuje się, że swoiste przeciwciała klasy IgG utrzymują się w organizmie do końca życia i skutecznie chronią przed kolejnymi infekcjami. Badania z zastosowaniem bardzo czułych metod molekularnych wykazały, że wirus może pozostać w organizmie przez wiele lat, nie dając objawów klinicznych. W takim przypadku mówi się o przewlekłym zakażeniu parvowirusem B19 [4,10,11]. Przykładowo u jednego z polskich dawców krwi udokumentowano utrzymywanie się DNA-emii B19V we krwi obwodowej przez ponad 3 lata. Przez większość tego czasu stężenie DNA wirusa utrzymywało się na poziomie 10 3 IU/ml [12]. 2. Przenoszenie zakażenia B19V, jego ograniczanie oraz epidemiologia Zakażenie parvowirusem B19 następuje zazwyczaj przez drogi oddechowe. Do transmisji wirusa może również dojść przez łożysko od matki do płodu, z przeszczepionymi tkankami (np. szpikiem), narządami (np. nerką) czy poprzez przetoczenie krwi i jej składników oraz produktów krwiopochodnych [4, 10, 13]. Zakres badań czynników zakaźnych przy produkcji preparatów osoczopochodnych, w tym wirusa B19, określają zapisy Farmakopei Europejskiej (European Pharmacopoeia 2004), zgodnie z którymi stężenie DNA B19V w puli osocza do produkcji immunoglobuliny anty-d nie może przekroczyć poziomu 10 4 IU/ml. Preparaty immunoglobulin anty-d podawane są pacjentkom w trakcie ciąży lub zaraz po porodzie w celu zapobiegania w kolejnej ciąży konfliktowi matczyno- -płodowemu w zakresie układu Rh. Dopuszczalną wartość wiremii DNA B19V w puli osocza określono na podstawie obserwacji ilości przeciwciał neutralizujących anty-b19v w puli osocza pochodzących od dawców krwi po przebytej infekcji. Stwierdzono, że ich stężenie pozwala zneutralizować wiremię DNA B19V na poziomie 158

Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168 poniżej 10 4 IU/ml i tym samym skutecznie ograniczy infekcyjność wirusa. Szacuje się, iż średnio u około 60% dawców krwi są obecne anty-b19v. W pulach osocza wykrywa się przeciętnie 60 IU anty- -B19V/ml. W Polsce badaniom w kierunku DNA B19V poddawane jest także osocze do produkcji immunoglobuliny anty-hbs [14]. Większość producentów składników leczniczych uzyskiwanych z osocza (czynniki krzepnięcia itp.) obecnie wymaga badania DNA B19V przed rozpoczęciem procesu produkcyjnego. Zakażenie B19V jest powszechne na całym świecie i ma charakter sezonowy. Zwiększoną liczbę zachorowań głównie wśród dzieci i młodzieży szkolnej obserwuje się późną zimą lub wczesną wiosną. Co 3-4 lata odnotowuje się epidemie B19V. Odsetek osób z przeciwciałami klasy IgG wzrasta wraz z wiekiem. Częstość występowania swoistych przeciwciał klasy IgG wynosi 2-15% u dzieci w wieku 1-5 lat, 30-40% wśród młodzieży (do 15 lat), 40-60% u osób do 20 roku życia, a w populacji dorosłych może przekroczyć nawet 90% [4, 15, 16]. Badania markerów serologicznych w populacji polskiej były dotychczas prowadzone w różnych grupach. W niewielkiej liczbowo populacji dawców krwi częstość anty-b19v klasy IgG wynosiła blisko 35% [17]. Częstość wykrywania markerów serologicznych B19V jest wyższa w niektórych grupach chorych, np. wśród chorych na hemofilię, co związane jest z leczeniem w przeszłości krwią i produktami krwiopochodnymi. W tej grupie chorych, która niegdyś otrzymywała wiele transfuzji nie poddawanych inaktywacji (mediana wieku 29 lat) przeciwciała występują w blisko 82% [17]. W trakcie badań dawców krwi częstość DNA-emii wynosiła 0,6 0,003% [3, 10, 18-24]. W Polsce w latach 2004-2010 DNA B19V wykryto w 0,1% donacji przeznaczonych do frakcjonowania [12]. Na podstawie dotychczasowych obserwacji uważa się, że nawet u 50% zakażonych kobiet ciężarnych następuje transmisja wirusa od matki na płód, a u blisko 10% z nich obserwuje się poważne powikłania, np. poronienie, nieimmunologiczny obrzęk płodu czy niedokrwistość płodu [8, 13, 25, 26]. Trudna jest do oszacowania liczba powikłań mających wpływ na zdrowie i rozwój dzieci urodzonych z zakażeniem B19V. Szacuje się, iż około 40% kobiet w wieku rozrodczym w Polsce jest narażona na zakażenie B19V, a u 1-2% dochodzi do infekcji [27]. Przyjmując, że w Polsce co roku rejestrowanych jest 400 tysięcy kobiet w ciąży należy szacunkowo uznać, że u 6000 dochodzi do zakażenia parvowirusem B19, a u 3000 ma miejsce transmisja wirusa na płód i wówczas u około 300 płodów należy spodziewać się istotnych powikłań klinicznych. 3. Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży Przeprowadzenie diagnostyki laboratoryjnej zakażenia parvowirusem B19 u kobiety w ciąży rozważone jest w trzech sytuacjach: a) gdy istnieje podejrzenie infekcji B19V w następstwie ekspozycji na zakażenie (kontakt kobiety w ciąży lub przed poczęciem z osobą, u której zdiagnozowano zakażenie), b) gdy istnieje podejrzenie objawowego zakażenia B19V u kobiety w ciąży w sytuacji stwierdzenia objawów klinicznych u ciężarnej lub u płodu, c) w przypadku poronienia o nieznanej przyczynie. Objawy kliniczne spotykane w trakcie infekcji B19V nie mają charakteru swoistego. Mogą być wywołane innymi przyczynami o charakterze nieinfekcyjnym, jak również mogą towarzyszyć innym zakażeniom wirusowym (np. różyczce, grypie). Dlatego w sytuacji uzasadnionej klinicznie należy wykonać badania diagnostyczne pozwalające na zróżnicowanie zakażenia parvowirusem B19 od innych infekcji wirusowych [16]. Należy zauważyć, że potwierdzenie aktywnego zakażenia B19V pozwala podjąć odpowiednie działania polegające na odizolowaniu zakażonej osoby. Szczególnie ważna jest izolacja takiej osoby od chorych z innych grup zwiększonego ryzyka wystąpienia istotnych powikłań klinicznych w następstwie zakażenia B19V, w tym od innych kobiet w ciąży. Tego typu działania mogą wymagać czasowej zmiany organizacji oddziału szpitalnego lub przychodni w przypadku przyjmowania pacjentki z potwierdzonym zakażeniem B19V. W sytuacji zdiagnozowania ostrej infekcji u kobiety ciężarnej zasadne jest zapewnienie jej oddzielnego pokoju w przypadku koniecznej hospitalizacji, szczególnie jeżeli została przyjęta na oddział, na którym przebywają pacjentki w ciąży. W ten sposób chroni się przed zakażeniem i potencjalnymi powikłaniami kobiety seronegatywne należące do grupy wysokiego ryzyka powikłań klinicznych ze względu na brak przeciwciał anty-b19v klasy IgG. Uzasadnione jest również takie organizowanie przyjmowania kobiet z infekcją B19V w przychodniach, aby chronić przed ekspozycją innych potencjalnie B19V seronegatywnych pacjentów z grup ryzyka, a w szczególności kobiety ciężarne. Należy rozważyć wykonanie badania przeciwciał anty-b19v u kobiety w ciąży, która z racji wykonywanego zawodu (np. nauczyciel, pracownik służby zdrowia) czy sytuacji rodzinnej (małe dzieci w gospodarstwie domowym) może być szczególnie narażona na infekcję B19V. Takie postępowanie pozwoli określić status serologiczny B19V kobiety ciężarnej i w konsekwencji ocenić ryzyko zakażenia. Swoista diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 oparta jest na metodach immunoenzymatycznych oraz biologii molekularnej. W pierwszym przypadku wykrywane są przeciwciała anty-b19v, natomiast w drugim DNA wirusa. Badaniem pomocniczym w diagnozowaniu zakażenia B19V jest ocena cytologiczna szpiku [28, 29, 30, 31]. 3.1. Badania diagnostyczne metodami serologicznymi Metody serologiczne mają zastosowanie w badaniach przeciwciał anty-b19v klasy IgM oraz IgG, ich stężenia i typów konformacyjnych. Na rynku dostępne są testy immunoenzymatyczne (ELISA) oraz testy Western blot. W teście ELISA, dzięki zastosowaniu płytek opłaszczonych antygenami białek strukturalnych VP1 i VP2 wirusa, które tworzą kompleksy immunologiczne z właściwymi przeciwciałami anty- -B19V klasy IgM i IgG, można ocenić stężenie przeciwciał obecnych we krwi chorego. W niektórych przypadkach wskazana jest ocena przebiegu infekcji B19V przez badanie przeciwciał w kolejnych próbkach. Analiza wyników pozwala ocenić dynamikę zmian ich stężenia oraz dostrzec serokonwersję. Z punktu widzenia diagnostycznego badania serologiczne są przydatne szczególnie u osób immunokompetentnych (np. w dia- 159

www.diagnostykalaboratoryjna.eu gnozowaniu rumienia zakaźnego, objawów poliartralgii, u kobiet w ciąży). 3.2. Badania diagnostyczne metodami biologii molekularnej Metody molekularne oparte na wykrywaniu kwasu nukleinowego wirusa stanowią nowoczesne i czułe narzędzie w diagnozowaniu zakażenia parvowirusem B19. Obecnie stosowane testy oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych generują wyniki jakościowe bądź ilościowe. Nowoczesną metodą, współcześnie najczęściej stosowaną, jest reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR), która wykrywa pojedyncze kopie wirusa w różnym materiale, np. pełnej krwi, osoczu, surowicy, płynie owodniowym, tkankach. Metoda ta przy wykorzystaniu technik fluorescencyjnych pozwala ocenić ilość zamplifikowanego produktu w trakcie trwania reakcji PCR. Jej zastosowanie umożliwia ilościową analizę DNA B19V oraz monitorowanie przebiegu zakażenia w czasie. Dzięki temu możliwe jest rozgraniczenie infekcji istotnych (zazwyczaj w ostrej fazie zakażenia, manifestujące się wysoką wiremią oraz powiązane z objawami klinicznymi) i nieistotnych klinicznie (przeważnie charakteryzujące się niską DNA- -emią oraz niezwiązane z objawami klinicznymi). W przypadku zastosowanego postępowania ograniczającego infekcję ilościowe metody molekularne pozwalają ocenić jego skuteczność. 3.3. Inne metody diagnostyczne Test Western blot może być uzupełnieniem testu ELISA. Pozwala on zróżnicować odpowiedź immunologiczną chorego wobec białek VP1, VP2 i NS1 parvowirusa B19. Dzięki temu można ocenić fazę zakażenia, a więc czy jest to zakażenie ostre, przewlekłe czy reinfekcja. Dodatkowym, pomocniczym badaniem szacującym czas trwania zakażenia jest test do oznaczania awidności przeciwciał klasy IgG. Badanie jest przydatne w sytuacji, gdy w surowicy chorego nie są obecne przeciwciała klasy IgM. Wysoka awidność przeciwciał pozwala wykluczyć infekcję w ostatnich kilku tygodniach i wskazuje na fazę przewlekłą infekcji. Badanie cytologiczne szpiku stanowi cenne poszerzenie diagnostyki zakażenia parvowirusem B19, w szczególności w przypadku pacjentów w klinikach i poradniach hematologicznych. U osób zakażonych B19V w obrazie mikroskopowym szpiku można zaobserwować olbrzymie pronormoblasty. Jednakże należy pamiętać, iż badanie to nie może być jedynym kryterium rozstrzygającym, bowiem komórki te są często nieobecne, np. u pacjentów z HIV czy z innymi przewlekłymi infekcjami. Stwierdzenie wspomnianego typu komórek jest wskazaniem do przeprowadzenia diagnostyki wirusologicznej. Badanie polimorfizmu genomu parvowirusa B19 z zastosowaniem metod sekwencjonowania pełni ważną rolę poznawczą, szczególnie w trakcie analiz epidemiologicznych, ustalaniu dróg przenoszenia zakażenia czy modyfikacji istniejących testów diagnostycznych o nowo wykrywane warianty wirusa [4, 10, 28]. 4. Trudności i ograniczenia diagnostyki laboratoryjnej Posługiwanie się zarówno badaniami metodami serologicznymi jak i molekularnymi niosie ze sobą trudności i ograniczenia. Badania immunoenzymatyczne obarczone są błędem związanym z istniejącym prawdopodobieństwem uzyskania wyników ujemnych oraz fałszywie dodatnich. Przeciwciała anty-b19v nie są wykrywane w pierwszej fazie zakażenia podczas gwałtownej replikacji wirusa, która prowadzi do osiągnięcia maksymalnego stężenia DNA B19V. Szacuje się, że okres okienka serologicznego trwa nie dłużej niż 14 dni i jest to parametr specyficzny dla testów różnych producentów. W niektórych sytuacjach, zwłaszcza gdy stężenie wirusa jest bardzo wysokie, okres, w którym nie są wykrywane swoiste przeciwciała ulega wydłużeniu. Zjawisko to ma miejsce np. w początkowej fazie zakażenia, kiedy dochodzi do całkowitego związania przeciwciał neutralizujących z wirionami parvowirusa B19. Aktywne domeny przeciwciał, które determinują ich swoistość mogą być w takiej sytuacji trudno dostępne i w rutynowym badaniu można uzyskać wynik fałszywie ujemny [32]. Zaobserwowanie serokonwersji umożliwia rozpoznanie zakończenia wczesnej fazy infekcji oraz może wskazywać na rozpoczęcie przewlekłej fazy zakażenia B19V. Wykrycie wyłącznie przeciwciał klasy IgG nie zawsze pozwala zróżnicować aktualną infekcję od zakażenia przebytego. Badania anty-b19v nie są wystarczającym narzędziem diagnostycznym u osób z upośledzoną odpornością, leczonych immunosupresją czy w diagnozowaniu zakażenia B19V u płodu [6, 33]. Diagnostyka zakażenia parvowirusem B19 oparta na technikach biologii molekularnej również niesie ze sobą pewne trudności. Niektóre testy zarówno komercyjne jak i tzw. home- -made charakteryzują się obniżoną czułością kliniczną wykrywania niektórych form polimorficznych, w szczególności genotypu 2 i 3 lub w ogóle ich nie wykrywają. Dlatego też, podejmując decyzje o zastosowaniu danego testu, należy mieć pewność, że wykrywa wszystkie formy polimorficzne B19V z taką samą czułością [33 37]. Istotne trudności diagnostyczne związane są także z ryzykiem otrzymania wyników fałszywie ujemnych w próbkach z wysoką wiremią. Z taką sytuacją możemy mieć do czynienia we wczesnej fazie zakażenia lub u osób z osłabioną odpornością, gdy wiremia może osiągnąć poziom 10 14 IU/ml. Wówczas w trakcie badań metodą real-time PCR, aby uniknąć wydania wyniku fałszywie ujemnego konieczna jest wnikliwa analiza wykresu fluorescencji. Należy podejrzewać, że mamy do czynienia z wynikiem fałszywie ujemnym, gdy cała linia krzywej fluorescencji w próbce badanej przebiega powyżej tzw. linii odcięcia (ang. treshold). Taka sytuacja może mieć miejsce wówczas, gdy stężenie wirusowego DNA jest skrajnie wysokie (m.in. powyżej zakresu liniowości testu). W związku z tym nie można wyznaczyć wartości Ct. W przypadku podejrzenia zakażenia B19V ze skrajnie wysoką wiremią ostateczną interpretację wyniku należy oprzeć na analizie rozcieńczonej próbki [38, 39]. Ze względu na możliwość wystąpienia wysokiej wiremii szczególnie ważne jest zachowanie procedur ograniczających możliwość kontaminacji. Wygenerowanie wyniku fałszywie dodatniego może nastąpić nie tylko na skutek zanieczyszczenia ujemnej próbki 160

Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168 produktem amplifikacji, ale także cząsteczkami wirusa obecnymi w badanym materiale. Do kontaminacji może dojść zarówno w fazie przedanalitycznej, jak i podczas izolacji DNA czy nastawiania reakcji real-time PCR. Samo wykrycie DNA B19V nie zawsze wskazuje na wczesną fazę infekcji. Niska DNA-emia może utrzymywać się miesiącami, a nawet latami przy braku jakichkolwiek objawów klinicznych [11, 40, 41]. Analiza markerów B19V u 19 zakażonych dawców krwi bez jakichkolwiek objawów klinicznych wykazała utrzymywanie się DNA B19V na niskim poziomie (średnio 400 IU/ml) przez okres powyżej 1 roku (dane IHiT, 2014 r.). Dlatego badanie ilościowe pozwala na zróżnicowanie zakażenia ostrego o potencjalnym znaczeniu klinicznym i przewlekłego, do którego mogło dojść nawet wiele lat wcześniej. W pierwszej fazie zakażenia liczba cząsteczek wirusa B19 jest bardzo wysoka, a następnie spada. Należy przy tym pamiętać, iż u osób z obniżoną odpornością wysoka wiremia B19V może utrzymywać się dłużej niż u osób immunokompetentnych. Zmniejszenie ilości wirusa może nastąpić w wyniku terapii mającej na celu podniesienie odporności chorego, zwłaszcza odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego, poprzez zmniejszenie immunosupresji czy podanie immunoglobulin. Do oceny przebiegu zakażenia, w tym skuteczności postępowania terapeutycznego, zaleca się monitorowanie stężenia DNA B19V [6, 33]. REKOMENDACJE DOTYCZĄCE PROWADZENIA DIAGNOSTYKI LABORATORYJNEJ ZAKAŻENIA PARVOWIRUSEM B19 U KO- BIET W CIĄŻY 1. ZLECANIE BADANIA LABORATORYJNEGO 1.1. Laboratorium diagnostyczne opracowuje, wdraża i stosuje procedurę zlecania badań laboratoryjnych oraz udostępnia formularz zlecenia badania laboratoryjnego zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia o standardach jakości w medycznym laboratorium diagnostycznym. Laboratorium diagnostyczne wykonujące badania dostarcza zleceniodawcy formularz zlecenia badania laboratoryjnego oraz przekazuje informacje dotyczące sposobu pobierania materiału do badań, jego przechowywania i transportu, a następnie zleceniodawca potwierdza pisemnie zapoznanie się z nimi. 1.2. Laboratorium diagnostyczne prowadzi dokumentację medyczną (w tym zlecenia badań laboratoryjnych), przechowuje i przetwarza zgodnie z przepisami dotyczącymi dokumentacji medycznej. 2. POBIERANIE I PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ LABORATORYJNYCH 2.1. Należy ściśle przestrzegać zaleceń producentów odczynników, probówek i systemów pobrań stosowanych do pozyskania materiału do badań (stosowanych antykoagulantów) oraz parametrów wirowania. Systemy służące do pobierania próbek pochodzące od różnych producentów różnią się między sobą, dlatego przestrzeganie warunków postępowania z materiałem biologicznym może mieć istotny wpływ na uzyskane wyniki. 2.2. W przypadku badań serologicznych należy pobierać krew na skrzep (najlepiej do probówki próżniowej z żelem separującym, którą trzeba odwirować) i przesłać do laboratorium wykonującego badanie. Laboratorium diagnostyczne informuje, jaka objętość próbki jest wymagana, uwzględniając: 1/ wymagania producenta stosowanego testu, 2/ potencjalne powtórzenie badania w przypadku uzyskania nieważnego wyniku badania oraz 3/ dostępność materiału (objętość krwi pobranej od dziecka/płodu powinna być mniejsza niż od osoby dorosłej). W przypadku braku dostępu do próbki surowicy dopuszcza się wykonanie badania w osoczu (krew pobrana na EDTA w systemie zamkniętym). 2.3. Krew na badania molekularne należy pobierać na skrzep wyłącznie do probówek próżniowych z żelem separującym w systemie zamkniętym i przesłać po odwirowaniu. Otwarcie probówek powinno nastąpić dopiero w laboratorium diagnostycznym wykonującym badanie z zachowaniem najwyższych procedur chroniących próbki przed zanieczyszczeniem. Takie postępowanie zmniejsza ryzyko kontaminacji na etapie przedanalitycznym i ogranicza prawdopodobieństwo otrzymania wyników fałszywie dodatnich. Dopuszcza się wykonanie badania w osoczu, przy czym należy stosować probówki z antykoagulantem EDTA. Nie wolno pobierać krwi do probówek z antykoagulantami będącymi inhibitorami PCR (np. heparyną). Objętość pobranego materiału powinna uwzględniać czynniki podane w pkt. 2.2. W przypadku zlecenia na wykonanie badania serologicznego i molekularnego w jednej próbce pacjenta należy wyłącznie pobierać krew (na skrzep lub EDTA) do probówek próżniowych. 2.4. Probówka z pobranym materiałem powinna zawierać następujące dane pacjenta: 1) imię i nazwisko 2) PESEL 3) datę pobrania lub 4) kod paskowy. 3. TRANSPORT MATERIAŁU DO BADAŃ 3.1. Informacje dotyczące pobierania materiału do badań, jego przechowywania i transportu. Należy pamiętać, iż rodzaj badanego materiału (surowica lub osocze), system pobierania i transport muszą być zawsze zwalidowane ze stosowanym testem diagnostycznym w celu uniknięcia błędów przedanalitycznych oraz zapewnienia wiarygodnych wyników zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 23.03.2006 w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych [Dz.U. nr 61 poz. 435 z późn. zm.]. Warunki i czas transportu pobranej krwi muszą spełniać zalecenia laboratorium diagnostycznego wykonującego badania. 3.2. Materiał do badań laboratoryjnych jest traktowany jako potencjalnie zakaźny i musi być przesłany do laboratorium zgodnie z zasadami transportu tego typu materiału. W skrócie szczelny pojemnik z materiałem biologicznym powinien być umieszczony w większym pojemniku zabezpieczającym przed zgnieceniem i zawierającym absorbent wchłaniający 161

www.diagnostykalaboratoryjna.eu materiał biologiczny w przypadku ewentualnego uszkodzenia probówki. Ten pojemnik należy następnie umieścić w opakowaniu oznakowanym materiał zakaźny z odpowiednimi wkładami chłodzącymi umożliwiającymi zachowanie wymaganej temperatury w czasie transportu. 4. PRZYJMOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ 4.1. Laboratorium opracowuje, wdraża i stosuje procedury przyjmowania, rejestrowania i oznakowania materiału do badań. 4.2. Laboratorium sprawdza zgodność danych ze zlecenia z oznakowaniem materiału oraz przydatność materiału do badania. 4.3. W przypadku stwierdzenia przez laboratorium niezgodności otrzymanego materiału z wymaganiami dotyczącymi pobierania, transportu lub innych nieprawidłowości powodujących, że materiał nie może być wykorzystany do badania pracownik zgłasza ten fakt kierownikowi laboratorium lub osobie przez niego upoważnionej, którzy w razie potwierdzenia niezgodności mogą zakwalifikować materiał jako niezdatny do badania i odmówić wykonania badania. Odmowę wykonania badania odnotowuje się w dokumentacji. Dalsze postępowanie laboratorium uzgadnia ze zleceniodawcą. 4.4. Laboratorium prowadzi dokumentację dotyczącą sposobu postępowania z materiałem biologicznym przed i po wykonaniu badania. W przypadku archiwizacji próbek uwzględnia się miejsce, czas oraz temperaturę ich przechowywania. 5. WYMAGANIA DOTYCZĄCE STOSOWANEJ APARATURY I TESTÓW DIAGNOSTYCZNYCH 5.1. Do diagnostyki medycznej in vitro należy stosować wyroby medyczne, tj. aparaturę i testy diagnostyczne spełniające wymagania określone w ustawie o wyrobach medycznych. W związku z powyższym aparatura i odczynniki muszą posiadać deklarację zgodności z dyrektywą 98/79/EC. Tego rodzaju certyfikat, jak również inne certyfikaty renomowanych instytucji zajmujących się ochroną zdrowia (np. FDA) służą potwierdzeniu jakości produktu przeznaczonego do laboratoryjnych badań markerów zakażenia B19V. 5.2. Stosowane testy diagnostyczne powinny spełniać wymagania zasadnicze określone przez Ministra Zdrowia. Powyższe musi być potwierdzone wpisem do bazy danych o wyrobach medycznych przeznaczonych do używania w Rzeczpospolitej Polskiej prowadzonej przez Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych. Prezes tego urzędu udziela informacji publicznej o zawartości bazy na wniosek producenta lub laboratorium, stąd zaleca się weryfikację czy usługodawca spełnia wymagania gwarantujące jakość oferowanego produktu. 5.3. Stosowanie testów PCR wytworzonych przez laboratorium (typu home-made) jest możliwe wyłącznie po przeprowadzeniu pełnej walidacji metody ze szczególnym uwzględnieniem czułości i swoistości. 5.4. Wyroby medyczne (aparaty i/lub odczynniki) powinny być właściwie dostarczone, prawidłowo zainstalowane i utrzymywane oraz używane zgodnie z przewidzianym zastosowaniem, a użytkownik jest obowiązany do przestrzegania instrukcji użytkowania. Badania należy wykonywać i interpretować ich wyniki zgodnie z instrukcją producenta testów diagnostycznych. 5.5. Wymagania dotyczące testów wykrywających DNA parvowirusa B19 Badania metodami biologii molekularnej charakteryzują się bardzo wysoką czułością i wykorzystywane są do wykrywania DNA parvowirusa B19 w surowicy lub osoczu. Niektóre testy są dopuszczone do wykonywania badań w pełnej krwi oraz płynie owodniowym. Do wykrywania DNA B19V zaleca się stosowanie metody ilościowej. Ten rodzaj badania umożliwia odróżnienie przewlekłego zakażenia relatywnie częstego w populacji, zazwyczaj charakteryzującego się niską DNA-emią (<10 4 IU/ ml), któremu nie towarzyszą objawy kliniczne od zakażenia w ostrej fazie z wysoką DNA-emią i współwystępującymi objawami chorobowymi. Czułość analityczna testu oraz wynik badania powinny być wyrażane w jednostkach międzynarodowych na mililitr (IU/ ml). Taki sposób charakteryzowania testu oraz wyrażania wyniku umożliwia zarówno porównywanie testów, jak i wyników uzyskiwanych różnymi testami w różnych laboratoriach. Test stosowany do wykrywania DNA B19V musi wykrywać wszystkie znane genotypy wirusa (1-3) z taką samą czułością. Czułość analityczna wykrywania form polimorficznych wyrażona w 95% LOD (limit of detection granica wykrywalności) w IU/ml musi być potwierdzona przez producenta testu odpowiednimi dokumentami. Ocena czułości analitycznej i określenie wykrywalności genotypów 1-3 parvowirusa B19 dokonywane są poprzez badanie specjalnie zaprojektowanego panelu rozcieńczeń standardu międzynarodowego o ściśle określonym stężeniu DNA parvowirusa B19 wyrażonym w jednostkach międzynarodowych [42, 43]. W przypadku monitorowania DNA-emii B19V konieczne jest analizowanie tego samego rodzaju materiału biologicznego (np. tylko surowicy lub tylko pełnej krwi) ze względu na różnice stężenia B19V w różnych materiałach klinicznych. Stężenie DNA B19V jest najwyższe w pełnej krwi, niższe w surowicy i osoczu [40]. Porównanie wyników uzyskanych w próbkach jednocześnie pobranych od zakażonej matki i płodu wykazuje większą DNA-emię o kilka rzędów wielkości, we krwi zakażonego płodu aniżeli we krwi matki. Należy stosować wyłącznie testy wyposażone w kontrolę wewnętrzną (IC internal control). W przypadku uzyskania wyniku negatywnego IC konieczne jest wdrożenie postępowania wskazanego przez producenta testu. Analiza wyników kontroli wewnętrznej pozwala na ocenę prawidłowości wykonania całego badania od ekstrakcji kwasów nukleinowych po uzyskanie wyniku reakcji real-time PCR. Taka procedura umożliwia wykluczenie obecności w badanej próbce inhibitorów reakcji enzymatycznych zachodzących w trakcie procedury diagnostycznej. Wykonanie badania rozcieńczonej próbki (eluatu otrzymanego w procesie ekstrakcji kwasów nukleinowych) umożliwia identyfikację zakażenia i określenie 162

Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168 rzeczywistego poziomu DNA-emii w przypadku otrzymania wyniku fałszywie ujemnego B19V przy równocześnie uzyskanym wyniku ujemnym IC. Takie wyniki spowodowane są wysoką wiremią B19V. W przypadku każdego wyniku, a zwłaszcza ujemnego należy przeprowadzać analizę krzywej fluorescencji. Takie działanie umożliwia identyfikację wyników fałszywie ujemnych będących następstwem wiremii przekraczającej górny próg liniowości testu ilościowego [38]. Laboratorium jest zobowiązane do wykonywania minimum 100 badań ilościowych DNA B19V na rok w celu zapewnienia wymaganej jakości wykonywanych badań molekularnych. Należy ściśle zachować procedury ograniczające kontaminację. Zalecenie to podyktowane jest specyfiką metody PCR, która polega na namnażaniu fragmentów genomu wirusa. Dodatkowo, w przypadku B19V istnieje znaczące prawdopodobieństwo badania próbek ze skrajnie wysoką wiremią. W szczególności wskazane jest wykonywanie ekstrakcji kwasów nukleinowych i przygotowywanie reakcji real-time PCR oraz jej przeprowadzanie w termocyklerze w różnych pomieszczeniach (oddzielenie w części preamplifikacyjnej i postamplifikacyjnej). Również ważne jest stosowanie rękawiczek beztalkowych (talk zwiększa ryzyko przeniesienia amplikonów), a także dekontaminacja powierzchni przy pomocy roztworów podchlorynu sodu (bielinki) lub preparatów typu DNA-away oraz naświetlanie pomieszczeń lampami UV. Należy stosować wyłącznie drobny sprzęt jednorazowego użytku (m.in. końcówki z filtrem do pipet, probówki, pipetki). 6.2. Kierownik laboratorium lub wyznaczony przez niego pracownik odpowiada za prowadzenie wewnętrznej kontroli jakości oraz uczestnictwo w programach zewnętrznej oceny jakości laboratorium diagnostycznego. 6.3. Dokumentacja kontroli jakości badań jest przechowywana 20 lat zgodnie z przepisami dotyczącymi dokumentacji medycznej. 7. ALGORYTM POSTĘPOWANIA DIAGNOSTYCZNEGO ORAZ OGÓLNE ZASADY INTERPRETACJI WYNIKÓW 7.1. Diagnostyka zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży winna łączyć badania: swoistych przeciwciał, zarówno klasy IgG jak i IgM, metodami immunoezymatycznymi oraz DNA B19V metodami biologii molekularnej. 7.2. Sposób prowadzenia laboratoryjnej diagnostyki zakażenia B19V u kobiet w ciąży został przedstawiony na Schemacie 1. 5.6. Wymagania dotyczące testów wykrywających przeciwciała skierowane przeciwko parvowirusowi B19 W przypadku badań serologicznych bardzo istotna jest jakość stosowanych testów diagnostycznych. Polskie doświadczenia wykazały, że używanie nieodpowiednich testów prowadzi do otrzymywania większej liczby wyników fałszywych/nieinformatywnych. W doborze odpowiednich testów pomocne jest śledzenie aktualnego piśmiennictwa naukowego, w którym na podstawie badań prowadzonych w niezależnych ośrodkach naukowych publikowane są analizy dotyczące charakterystyki/ porównania dostępnych na rynku zestawów do oznaczania przeciwciał anty-b19v [44]. Przy wyborze testu należy brać pod uwagę swoistość, czułość oraz powtarzalność i odtwarzalność uzyskiwanych wyników. Jest to bardzo istotne w badaniu przeciwciał klasy IgM, które są markerem ostrego zakażenia. W przypadku badania przeciwciał klasy IgG, wynik ilościowy pomaga w różnicowaniu zakażenia przewlekłego i niedawno przebytego. 6. ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH 6.1. Laboratorium diagnostyczne prowadzi wewnętrzną kontrolę jakości badań i uczestniczy w zewnętrznej kontroli jakości zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia co najmniej raz w roku. Schemat 1. Algorytm postępowania diagnostycznego u kobiet w ciąży z podejrzeniem zakażenia parvowirusem B19 W sytuacji, kiedy przeciwciała anty-b19v nie są wykrywane w surowicy kobiety ciężarnej jedynym instrumentem diagnostycznym potwierdzającym infekcję jest badanie metodą molekularną. Ma to szczególne znaczenie u kobiet krótko po ekspozycji na zakażenie w okienku serologicznym. Badanie przeciwciał anty-b19v należy wykonywać nie wcześniej niż 2 tygodnie po kontakcie z osobą zakażoną, np. z rumieniem zakaźnym. W przypadku wykrycia przeciwciał anty-b19v klasy IgM bądź jednocześnie IgM i IgG badanie real-time PCR pozwala potwierdzić aktualną infekcję, a tym samym może być pomocne w podjęciu decyzji co do dalszego postępowania terapeutycznego. Swoistość pierwotnego wyniku dodat- 163

www.diagnostykalaboratoryjna.eu niego w klasie IgM musi być potwierdzona wykryciem DNA B19V lub/i udokumentowaniem serokonwersji. Wobec wykrytych przeciwciał anty-b19v klasy IgG u kobiety ciężarnej aktualną infekcję można wykluczyć wykonując badanie metodą molekularną. W przypadku potwierdzenia obecności DNA B19V wynik badania ilościowego pomaga rozstrzygnąć czy mamy do czynienia z zakażeniem, do którego doszło w ciągu ostatnich kilku miesięcy czy też z zakażeniem przewlekłym. Tabela I. Markery wirusologiczne u kobiet ciężarnych w momencie zdiagnozowania zakażenia B19V (IHiT, 2014 r.) N Średnie stężenie DNA B19V Markery serologiczne (%) [IU/ml] IgM (-) IgG (-) 2 (6,7) 7,2x10 8 IgM (+) IgG (-) 1 (3,3) 5,8x10 7 IgM (+) IgG (+) 20 (66,7) 7,9x10 5 IgM (-) IgG (+) 7 (23,3) 9,6x10 3 W tabeli I przedstawiono charakterystykę markerów wirusologicznych B19V u kobiet w ciąży zakażonych parvowirusem B19 (dane IHiT, 2014 r.). Wśród 30 ciężarnych największy odsetek stanowiły pacjentki z jednocześnie wykrytymi przeciwciałami klasy IgM i IgG, mniejszy ze specyficznymi przeciwciałami jednej lub drugiej klasy. W przedstawionych przypadkach badanie metodą molekularną potwierdziło zakażenie, a ilościowy wynik był pomocny w ocenie przebiegu/fazy infekcji. Dwa przypadki (6,7%), gdzie jedynym markerem zakażenia było DNA wirusa ilustrują znaczenie metod biologii molekularnej w diagnostyce zakażenia u kobiet ciężarnych bez wykrywalnych przeciwciał. Zarówno obserwacje dotyczące pacjentów, jak i zdrowych dawców krwi wykazują, że DNA B19V po okresie bardzo wysokiej wiremii może utrzymywać się na niskim, jednak wciąż wykrywalnym poziomie we krwi przez wiele lat. Takiej przewlekłej infekcji z niską DNA-emią, która jest w pełni kontrolowana przez układ odpornościowy zazwyczaj nie towarzyszą objawy kliniczne i nie wymaga ona leczenia [11, 12, 18, 41]. 7.3. Postępowanie diagnostyczne u płodów z podejrzeniem zakażenia parvowirusem B19 powinno opierać się na badaniu real-time PCR. Wiremię u płodu można określić jedynie na podstawie badania krwi płodu uzyskanej drogą kordocentezy (nakłucie żyły pępowinowej pod kontrolą USG). Zabieg kordocentezy jest działaniem Tabela II. Potwierdzenie przeniesienia zakażenia B19V od matki na płód metodą real-time PCR oraz porównanie statusu serologicznych markerów diagnostycznych u kobiet ciężarnych i płodów (IHiT, 2014 r.) Numer przypadku Matka IgG IgM DNA B19V [IU/ml] Płód IgG IgM DNA B19V [IU/ml] 1 (+) (-) 2,1x10 7 (-) (-) 2,3x10 9 2 (+) (+) 4,3x10 4 (-) (-) 1,7x10 8 3 (+) (+) 8,6x10 6 (-) (-) 3,9x10 8 inwazyjnym i jest obarczony około 1% ryzykiem powikłań. Wskazaniem do kordocentezy może być podejrzenie niedokrwistości u płodu, ale zabieg ten jest również wykonywany z innych wskazań, na przykład w celu oceny kariotypu płodu. Po potwierdzeniu niedokrwistości rozpoczyna się leczenie transfuzjami dopłodowymi specjalnie do tego celu przygotowanych KKCZ (krwinki O Rh minus, niereagujące z surowicą matki, filtrowane, napromieniane). Ze względu na niedojrzałość układu immunologicznego płodu, zwłaszcza w pierwszej połowie ciąży, podstawą diagnostyki zakażenia u płodu nie jest ocena przeciwciał, ale bezpośrednie wykrywanie wirusa. W przypadku wykrycia przeciwciał klasy IgG u płodu nie ma możliwości potwierdzenia czy zostały one wytworzone przez płód czy ich obecność jest wynikiem biernego przeniesienia przeciwciał matki przez barierę łożyskową. Wykryte we krwi matki przeciwciała anty-b19v nie zawsze są wykrywane we krwi płodu, co świadczy o wybiórczym transporcie przeciwciał neutralizujących przez łożysko. W tabeli II przedstawiono trzy przypadki zdiagnozowania przeniesienia zakażenia B19V od matki na płód za pomocą metody real-time PCR. Porównano status markerów serologicznych zakażenia B19V u kobiety ciężarnej i płodu. We wszystkich przypadkach u płodu obserwowano wiremię wyższą o przynajmniej dwa rzędy wielkości w porównaniu do matki. 7.4. W sytuacji wystąpienia powikłań u płodu monitorowanie DNA-emii B19V może być pomocne w podjęciu decyzji o postępowaniu leczniczym, np. podaniu transfuzji dopłodowej czy immunoglobulin [45]. 8. FORMUŁOWANIE, INTERPRETACJA I WYDAWANIE WYNI- KÓW 8.1. Formularz sprawozdania z badań parvowirusa B19 musi być zgodny z rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 21 grudnia 2010 r. w sprawie dokumentacji medycznej. 8.2. Wyniki badania markerów zakażenia B19V muszą być autoryzowane przez diagnostę laboratoryjnego posiadającego odpowiednią specjalizację lub/i co najmniej dwuletnie doświadczenie w tej dziedzinie diagnostyki lub lekarza będącego jednocześnie diagnostą laboratoryjnym czy też posiadającego wiedzę i umiejętności w zakresie wykonywania czynności diagnostyki laboratoryjnej uzyskanych w ramach specjalizacji zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 11.12.2012 roku w sprawie wykazu specjalizacji uprawniających lekarza do samodzielnego wykonywania czynności diagnostyki laboratoryjnej w medycznym laboratorium diagnostycznym [Dz.U. 2012 poz. 1420] i posiadającego co najmniej dwuletnie doświadczenie w tej dziedzinie diagnostyki. W przypadku badań DNA B19V osoba autoryzująca wynik powinna legitymować się doświadczeniem w diagnostyce molekularnej wirusów. 8.3. Interpretacja uzyskanych wyników badań przeciwciał anty- -B19V klasy IgM i IgG oraz formułowanie wyniku na sprawozdaniu muszą być zgodne z zaleceniami producenta dostępnymi w ulotce załączonej do testu. Wyniki mają format jakościowy lub ilościowy (wyrażane są w jednostkach na mililitr [U/ml]) i interpretowane są w następujący sposób: 164

Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168 dodatni (+) (odpowiednio w klasie IgM lub IgG) co oznacza: stwierdzono obecność przeciwciał (odpowiednio w klasie IgM lub IgG), ujemny (-) nie stwierdzono obecności przeciwciał (odpowiednio w klasie IgM lub IgG), wątpliwy (+/-) (odpowiednio w klasie IgM lub IgG) przeciwciała na granicy wartości wyniku dodatniego i ujemnego (odpowiednio w klasie IgM lub IgG). Wynik ilościowy najlepiej wyrażać w jednostkach międzynarodowych, gdyż wówczas możliwe jest porównanie rezultatów badań różnymi testami oraz interpretowanie ich w oparciu o piśmiennictwo światowe posługujące się tymi samymi jednostkami. W przypadkach stosowania innych jednostek te same wartości mogą być nieporównywalne. 8.4. Wyniki badań ilościowych DNA B19V muszą zawierać informację o rodzaju badanego materiału, a także muszą być podawane w jednostkach międzynarodowych [IU/ml]. Są one interpretowane w następujący sposób: wykryto DNA B19V parvowirus B19 we krwi kobiety ciężarnej wartość stężenia podana w IU/ml (aktualne zakażenie B19V poziom DNA-emii pomaga w rozstrzygnięciu czy mamy do czynienia z zakażeniem toczącym się od niedawna czy ma ono charakter przewlekły), nie wykryto DNA B19V brak parvowirusa B19 we krwi kobiety ciężarnej (brak aktualnego zakażenia B19V). 8.5. Formularz sprawozdania z badania laboratoryjnego może być przekazany w formie elektronicznej z zachowaniem wymagań prawnych. 8.6. Medyczne laboratorium diagnostyczne archiwizuje wyniki przez czas określony w przepisach dotyczących dokumentacji medycznej [rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21 grudnia 2010 r. w sprawie dokumentacji medycznej]. W tabeli III dodatkowo przedstawiono postępowanie diagnostyczne w sytuacji szczególnej gdy badanie DNA B19V nie jest dostępne. 9. POSTĘPOWANIE W PRZYPADKU STWIERDZENIA ZAKA- ŻENIA B19V U KOBIETY W CIĄŻY 9.1. W przypadku stwierdzenia zakażenia (patrz schemat 1, tabela III) na sprawozdaniu z badania należy umieścić komentarz Pacjentka w ciąży, u której potwierdzono zakażenie powinna zostać skierowana do ośrodka położniczego na III poziomie referencyjności w celu przeprowadzenia dalszej specjalistycznej diagnostyki oraz monitorowania dobrostanu płodu. W ośrodku położniczym na III poziomie referencyjności płód będzie monitorowany w kierunku objawów niedokrwistości poprzez wykonanie badania ultrasonograficznego, w tym MCA-PSV (zazwyczaj 1 raz w tygodniu aż do 20 tygodnia po ekspozycji). 9.2. Prenatalne podejrzenie niedokrwistości u płodu postawione na podstawie nieprawidłowych przepływów w tętnicy środkowej mózgu płodu (MCA PSV wzrost MCA PSV > 1,5 krotności mediany MoM) z towarzyszącym lub nie obrzękiem płodu) jest wskazaniem do pobrania krwi płodu. U płodów monitorowanych z powodu podejrzenia zakażenia/infekcji B19V pobiera się próbkę krwi w celu oznaczenia parametrów morfologicznych (stężenie hemoglobiny, liczba płytek krwi oraz retikulocytów) oraz wykonania badania DNA B19V i potwierdzenia przeniesienia zakażenia B19V od matki na płód. Potwierdzenie przeniesienia zakażenia od matki na płód oraz monitorowanie stężenia wirusa we krwi płodu należy wykonywać jedynie w przypadku dostępu do materiału pobranego w trakcie kordocentezy wykonanej celem leczenia niedokrwistości u płodu (transfuzja dopłodowa), stosując wyłącznie metodę ilościowego oznaczania DNA wirusa. Dalsze postępowanie uzależnione jest od stanu płodu i wyników badań laboratoryjnych. Najczęściej, w przypadku niedokrwistości spowodowanej zakażeniem B19V wystarczającym postępowaniem jest jedna dwie transfuzje dopłodowe. Istotnym czynnikiem rokowniczym wydaje się być liczba erytroblastów we krwi obwodowej, ponieważ wysoka erytroblastoza wskazuje na możliwość samoistnej regeneracji układu czerwonokrwinkowego. U płodów z ciężkim obrzękiem uogólnionym, kardiomegalią oraz z objawami niewydolności serca można dodatkowo rozważyć leczenie wspomagające digoksyną. 9.3. Kobiety ciężarne leczone z powodu poważnych następstw parwowirozy u płodu powinny znajdować się pod ścisłym nadzorem lekarskim, ponieważ obrzęk uogólniony płodu może stanowić zagrożenie dla kobiety w ciąży w mechani- Tabela III. Zasady interpretacji wyników badania markerów serologicznych zakażenia B19V u kobiet w ciąży oraz dalsze postępowanie diagnostyczne w przypadku braku dostępu do badania DNA B19V (sytuacja szczególna) IgM IgG Wstępna interpretacja wyniku - - Brak zakażenia, pacjentka nie przechodziła zakażenia lub wczesny etap zakażenia (okienko serologiczne) + - Wczesny etap zakażenia + + Wczesny etap zakażenia - + Aktualne zakażenie lub zakażenie przebyte w przeszłości Dalsze postępowanie diagnostyczne w przypadku braku dostępu do badania DNA B19V (sytuacja szczególna) Wykluczenie/potwierdzenie zakażenia powtórzenie za 2 tygodnie badania swoistych IgM i IgG Potwierdzenie zakażenia powtórzenie za miesiąc badania swoistych IgM i IgG (powinny pojawić się IgG) Potwierdzenie zakażenia powtórzenie za miesiąc badania swoistych IgM i IgG w celu obserwacji serokonwersji (zanik IgM przy wzroście stężenia IgG) Brak możliwości wykluczenia/potwierdzenia zakażenia bez wykonania badania DNA B19V 165

www.diagnostykalaboratoryjna.eu zmie rozwoju tzw. zespołu lustrzanego (ang. mirror syndrome) [46]. Wystąpienie objawów tego zespołu u kobiety ciężarnej przy utrzymywaniu się objawów u płodu (obrzęki uogólnione, w krańcowym stadium niewydolność oddechowo-krążeniowa) stanowi zagrożenie życia i jest uważane za wskazanie do zakończenia ciąży niezależnie od okresu ciąży. PODSUMOWANIE Parvowirus B19 jest patogenem, który u osób immunokompetentnych rzadko wywołuje groźne powikłania poinfekcyjne. Kobiety w ciąży są narażone na ryzyko wystąpienia powikłań, które stanowią istotne zagrożenie dla płodu. Prawidłowa diagnostyka zakażenia parvowirusem B19 (metodami serologicznymi i molekularnymi) polega na badaniu swoistych przeciwciał oraz na ilościowej ocenie DNA wirusa we krwi. W sytuacji braku dostępu do metod biologii molekularnej potwierdzenie ostrego zakażenia w przypadku wyniku dodatniego w klasie IgM wymaga kolejnego oznaczenia metodami immunoenzymatycznymi oraz udokumentowania serokonwersji. Potwierdzenie przeniesienia zakażenia u płodu winno być oparte na badaniu DNA parvowirusa B19. Również ważne jest monitorowanie zakażenia B19V metodą real-time PCR przy wskazaniach do kontrolowania obrazu klinicznego czy skuteczności leczenia płodu. Ze względu na ryzyko poważnych powikłań, włącznie z zagrożeniem dla życia płodu, ostateczny wynik potwierdzający zakażenie zawsze powinien zawierać komentarz wskazujący na konieczność wykonania dalszej specjalistycznej diagnostyki i objęcia kobiety w ciąży odpowiednią opieką medyczną. Piśmiennictwo 1. Diagnostyka laboratoryjna zakażenia parvowirusem B19 u kobiet w ciąży. Rekomendacje polskiej grupy ekspertów, 2014, http://kidl.org.pl/uploads/rekomendacje/06_ciaza%20z%20okladka.pdf 2. Fauquet CM, Mayo MA. Maniloff J et al. Virus Taxonomy: VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier/ Academic Press, London, 2005. 3. Zaaijer HL, Koppelman M, Farrington CP. Parvovirus B19 viraemia in Dutch blood donors. Epidemiol Infect 2004; 132(6): 1161-1166. 4. Young NS, Brown KE. Mechanisms of disease Parvovirus B19. N Engl J Med 2004; 350(6): 586-597. 5. Ekman A, Hokynar K, Kakkola L et al. Biological and immunological relations among human parvovirus B19 genotypes 1 to 3. J Virol 2007; 81(13): 6927-6935. 6. Grabarczyk P, Kalinska A, Kara M et al. Identification and Characterization of Acute Infection With Parvovirus B19 Genotype 2 in Immunocompromised Patients in Poland. J Med Virol 2011; 83: 142-149. 7. Bonvicini F, Puccetti C, Salfi NCM et al. Gestational and fetal outcomes in B19 maternal infection: a problem of diagnosis. J Clin Microbiol 2011; 49(10): 3514-3518. 8. Enders M, Weidner A, Zoellner I et al. Fetal morbidity and mortality after acute human parvovirus B19 infection in pregnancy: prospective evaluation of 1018 cases. Prenat Diagn 2004; 24: 513-518. 9. Kalińska A. Parvowirus B19 (B19V) w: Brojer E, Grabarczyk P (red.). Czynniki zakaźne istotne w transfuzjologii. Fundacja Pro Farmacia Futura, Warszawa, 2015: 127-144. 10. Parsyan A, Candotti D. Human erythrovirus B19 and blood transfusion an update. Transfus Med 2007; 17(4): 263-278. 11. Lefrere JJ, Servant-Delmas A, Candotti D et al. Persistent B19 infection in immunocompetent individuals: implications for transfusion safety. Blood 2005; 106(8): 2890-2895. 12. Grabarczyk P, Korzeniowska J, Liszewski G i wsp. Parvovirus B19 DNA testing in Polish blood donors, 2004-2010. Przegl Epidemiol 2012; 66(1): 7-12. 13. de Jong EP, Walther FJ, Kroes ACM et al. Parvovirus B19 infection in pregnancy: new insights and management. Prenat Diagn 2011; 31: 419-425. 14. Łętowska M (red.). Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. III wydanie, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa, 2014. 15. Thomas I, Di Giambattista M, Gerard C et al. Prevalence of human erythrovirus B19 DNA in healthy Belgian blood donors and correlation with specific antibodies against structural and non-structural viral proteins. Vox Sang 2003; 84(4): 300-307. 16. Siennicka J, Stefanoff P, Trzcinska A i wsp. Przegląd serologiczny w kierunku zakażenia parvowirusem B19 w Polsce. Przegl Epidemiol 2006; 60: 571-580. 17. Brojer E, Grabarczyk P, Lopaciuk S et al. Prevalence of human parvovirus B19 DNA and IgG/IgM antibodies in Polish haemophilia patients. Vox Sang 1999; 77: 107. 18. Schmidt M, Themann A, Drexler C et al. Blood donor screening for parvovirus B19 in Germany and Austria. Transfusion 2007; 47: 1775-1782. 19. Koppelman MHGM, van Swieten P, Cuijpers HTM. Real-time polymerase chain reaction detection of parvovirus B19 DNA in blood donations using a commercial and an in-house assay. Transfusion 2011; 51(6): 1346-1354 20. Kooistra K, Mesman HJ, de Waal M et al. Epidemiology of high-level parvovirus B19 viraemia among Dutch blood donors, 2003-2009. Vox Sang 2011; 100(3): 261-266. 21. Kleinman SH, Glynn SA, Lee T-H et al. Prevalence and quantitation of parvovirus B19 DNA levels in blood donors with a sensitive polymerase chain reaction screening assay. Transfusion 2007; 47: 1756-1764. 22. Ke L, He M, Li C et al. The prevalence of human parvovirus B19 DNA and antibodies in blood donors from four Chinese blood centers. Transfusion 2011; 51: 1909-1918. 23. Jordan J, Tiangco B, Kiss J et al. Human parvovirus B19: Prevalence of viral DNA in volunteer blood donors and clinical outcomes of transfusion recipients. Vox Sang 1998; 75: 97-102. 24. Gessoni G, Barin P, Marchiori G. Nucleic acids amplification technique (NAT) screening for parvovirus B19: the first Italian routine experience. Transfus Med 2007; 17: 417-419. 25. Enders M, Klingel K, Weidner A et al. Risk of fetal hydrops and non-hydropic late intrauterine fetal death after gestational parvovirus B19 infection. J Clin Virol 2010; 49: 163-168. 26. Marcinek P, Nowakowska D, Szaflik K i wsp. Analysis of complications during pregnancy in women with serological features of acute toxoplasmosis or acute parvovirosis. Ginekol Pol 2008; 79(3): 186-191. 27. Mossong J, Hens N, Friederichs V et al. Parvovirus B19 infection in five European countries: seroepidemiology, force of infection and maternal risk of infection. Epidemiol Infect2008; 136(8): 1059-1068. 28. Heegaard ED, Brown KE. Human parvovirus B19. Clin Microbiol Rev 2002; 15(3): 485-505. 29. Enders M, Schalasta G, Baisch C et al. Soderlund-Venermo M. Human parvovirus B19 infection during pregnancy Value of modern molecular and serological diagnostics. J Clin Virol 2006; 35: 400-406. 30. Lenkiewicz B, Zupanska B, Roszkowski T et al. Parvovirus B19 infection in nonimmune hydrops fetalis. Vox Sang 1998; 74: 1415. 31. Oszukowski P, Malafiej E, Pertynski T i wsp. Infection with parvovirus B19 in pregnant women. Ginekol Pol 1996; 67(3): 114-116. 32. Bredl S, Plentz A, Wenzel JJ et al. False-negative serology in patients with acute parvovirus B19 infection. J Clin Virol 2011; 51(2): 115-120. 33. Liefeldt L, Plentz A, Klempa B et al. Recurrent high level parvovirus B19/genotype 2 viremia in a renal transplant recipient analyzed by real-time PCR for simultaneous detection of genotypes 1 to 3. J Med Virol 2005; 75(1): 161-169. 34. Baylis SA, Buchheit KH. A proficiency testing study to evaluate laboratory performance for the detection of different genotypes of parvovirus B19. Vox Sang 2009; 97(1): 13-20. 35. Baylis SA, Fryer JF, Grabarczyk P. Effects of probe binding mutations in an assay designed to detect parvovirus B19: Implications for the quantitation of different virus genotypes. J Virol Methods 2007; 139(1): 97-99. 36. Baylis SA, Shah N, Minor PD. Evaluation of different assays for the detection of parvovirus B19 DNA in human plasma. J Virol Methods 2004; 121(1): 7-16. 166

Diagn Lab 2015; 51(2): 157-168 37. Cohen BJ, Gandhi J, Clewley JP. Genetic variants of parvovirus B19 identified in the United Kingdom: Implications for diagnostic testing. J Clin Virol 2006; 36(2): 152-155. 38. Grabarczyk P, Kalinska A, Sulkowska E et al. False Negative Results in High Viremia Parvovirus B19-Samples Tested with Real-Time PCR. Pol J Microbiol2010; 59(2): 129-132. 39. Koppelman MHGM, Cuijpers HTM, Wessberg S et al. Multicenter evaluation of a commercial multiplex polymerase chain reaction test for screening plasma donations for parvovirus B19 DNA and hepatitis A virus RNA. Transfusion 2012; 52(7): 1498-1508. 40. Lee T-H, Kleinman SH, Wen L et al. Distribution of parvovirus B19 DNA in blood compartments and persistence of virus in blood donors. Transfusion 2011; 51(9): 1896-1908. 41. Matsukura H, Shibata S, Tani Y et al. Persistent infection by human parvovirus B19 in qualified blood donors. Transfusion 2008; 48(5): 1036-1037. 42. Baylis SA, Ma L, Padley DJ et al. Collaborative study to establish a World Health Organization International genotype panel for parvovirus B19 DNA nucleic acid amplification technology (NAT)-based assays. Vox Sang 2012; 102(3): 204-211. 43. Baylis SA, Chudy M, Blümel J et al. Collaborative study to establish a replacement World Health Organization International Standard for parvovirus B19 DNA nucleic acid amplification technology (NAT)-based assays. Vox Sang 2010; 98: 441-446. 44. Siennicka J, Trzcinska A. Comparison of three enzyme immunoassays used to detect human parvovirus B19-specific IgM antibodies in sera of people suspected of measles. Med Sci Monitor 2010; 16(5): BR154-159. 45. Matsuda H, Sakaguchi K, Shibasaki T et al. Intrauterine therapy for parvovirus B19 infected symptomatic fetus using B19 IgG-rich high titer gammaglobulin. J Perinat Med 2005; 33: 561-563. 46. Mace G, Sauvan M, Castaigne V et al. Clinical presentation and outcome of 20 fetuses with parvovirus B19 infection complicated by severe anemia and/or fetal hydrops. Prenat Diagn 2014; 34: 1023-1030. 167

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 168