POLMICRO 2014 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130 Praca oryginalna Original Article POLMICRO 2014 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej POLMICRO 2014 Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics Ewa Młodzińska 1, Elżbieta Stefaniuk 1,2, Karolina Bosacka 1, Beata Chmylak 1, Monika Fortuna 1, Waleria Hryniewicz 1,2 1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa Streszczenie W 2014 roku w ramach działania statutowego Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) przeprowadzono dwa typy sprawdzianów: jeden przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę pełnoprofilową oraz drugi oddzielny sprawdzian przeznaczony dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Celem programu POLMICRO 2014 była ocena biegłości laboratoriów w identyfikacji drobnoustrojów, oznaczaniu wrażliwości na antybiotyki i wykrywaniu mechanizmów oporności. Przesyłane w ramach Programu izolaty bakteryjne różniły się wrażliwością na antybiotyki oraz obecnością różnych mechanizmów oporności. Praca przedstawia wyniki XXI edycji POLMICRO 2014. Summary In 2014 Centre for Quality Control in Microbiology (CQCM)organized two different types of proficiency programmes: one was designed for laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics and the second was prepared for laboratories dealing with enteric infections only. The aim of the POLMICRO 2014 programme was to evaluate proficiency of laboratories in the identification of microorganisms, determination of susceptibility to antibiotics and detection of resistance mechanisms. Bacterial isolates distributed within the Programme differed in their susceptibility to antibiotics and a presence of various resistance mechanisms. The paper presents the results of the XXI edition POLMICRO 2014. Słowa kluczowe: Key words: POLMICRO, zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności POLMICRO, external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance mechanisms Wstęp Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) w Warszawie jest organizatorem Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej POLMICRO. Uczestnictwo medycznych laboratoriów mikrobiologicznych (MLM) w Programie POLMICRO jest obowiązkowe i wynika z Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 21 stycznia 2009r. zmieniającego rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych (Dz. U. Nr 22, poz. 128). Sprawdzian POLMICRO organizowany jest od roku 1997, a jego głównym celem jest ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w zakresie klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej: interpretacji wstępnego etapu diagnostyki mikrobiologicznej (bezpośredniego preparatu mikroskopowego), identyfikacji czynników etiologicznych zakażeń, oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia, a także promowanie nowych metod diagnostycznych w tym obszarze, standaryzacja i ujednolicanie rutynowo stosowanych metod w laboratoriach oraz edukacja mikrobiologów klinicznych. COBJwDM corocznie prowadzi dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO dla laboratoriów świadczących pełnoprofilową diagnostykę mikrobiologiczną (Edycja Ogólna) oraz sprawdzian POLMICRO/SSE dla laboratoriów schorzeń jelitowych. W roku 2014 przeprowadzono już XXI edycję programu POLMICRO. Łącznie w roku 2014 COBJwDM zorganizował sześć tur sprawdzianów, cztery w edycji ogólnej i dwie dotyczące identyfikacji 123

www.diagnostykalaboratoryjna.eu niem szczepów bakteryjnych przedstawionych w tabeli 1, pochodzących z kolekcji CO- BJwDM. Tury I, III i IV edycji ogólnej sprawdzianu POLMICRO 2014 polegały na identyfikacji gatunkowej drobnoustrojów izolowanych Rycina 1. Liczba laboratoriów biorących udział w poszczególnych turach POLMICRO 2014 (XXI edycja) pałeczek jelitowych odpowiedzialnych za zakażenia przewodu z zakażeń inwazyjnych i ocenie fenotypu lekowrażliwości oraz pokarmowego. Podobnie jak w latach poprzednich, przedmiotem wytwarzania mechanizmów oporności. W drugiej turze poddano sprawdzianów edycji ogólnej w roku 2014 były izolaty bakteryjne kontroli wstępny etap diagnostyki mikrobiologicznej ocenę o różnych fenotypach wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe. bezpośredniego preparatu mikroskopowego, a wyniki tego sprawdzianu zostały przedstawione w nr 50 Diagnostyki Laboratoryjnej W obliczu coraz częściej pojawiających i rozprzestrzeniających się szczepów wielolekoopornych, prawidłowa identyfikacja gatunkowa patogenu oraz szybka i wiarygodna identyfikacja mechani- W ramach edycji POLMICRO 2014/SSE przedmiotem porównań (2014). zmów oporności mają kluczowe znaczenie w terapii zakażeń oraz międzylaboratoryjnych była identyfikacja (I tura) lub identyfikacja i oznaczenie lekowrażliwości (II tura) szczepów izolowanych w ich skutecznej kontroli. Tematem niniejszego opracowania jest przedstawienie wyników programu POLMICRO 2014. z zakażeń przewodu pokarmowego. Oceny wyników dokonywano Materiał i metody z uwzględnieniem zakresów prowadzonej diagnostyki zadeklarowanych przez poszczególne Laboratoria. Analizie poddano także Porównania międzylaboratoryjne w ramach XXI Edycji Ogólnej Programu POLMICRO 2014 zostały przeprowadzone z wykorzysta- rutynowo stosowane w laboratoriach metody oznaczania lekow- Tabela 1. Izolaty bakteryjne wykorzystane w Programie POLMICRO 2014 (edycja XXI) Gatunek drobnoustroju nr kolekcji POLMICRO Fenotyp wrażliwości/mechanizmy oporności POLMICRO 2014 tura I edycja ogólna Acinetobacter baumannii PM-223 - [AK, TOB, COL]=S [CIP, GE, IPM, MEM, SXT]=R Enterobacter cloacae PM-224 - [AK, TOB, GE, CIP, IPM, MEM, SXT]=S ERT=I, [CTX, CXM, CAZ, CRO, TZP]=R POLMICRO 2014 tura III edycja ogólna Enterococcus faecalis PM-225 HLAR [AMP, TEC, VA, TGC]=S; LZD=R Enterococcus faecium PM-226 HLAR [AMP, TEC, VA, TGC]=S; LZD=R POLMICRO 2014 tura IV edycja ogólna Streptococcus pneumoniae PM-229 M-fenotyp P=I/R, [CTX, CRO]=S/I, [LEV, MOX, TET, RF, VA]=S; SXT=R Streptococcus pneumoniae PM-230 MLSB konstytutywny P=I/R, [CTX, CRO]=I, [LEV, MOX, TET, RF, VA, SXT]=S Haemophilus influenzae PM-231 BLPAR [P, AMP]=R, [AMC, CTX, CRO, CXM, CIP, TET, SXT]=S Haemophilus influenzae PM-232 BLNAS [P, AMP, AMC, CTX, CRO, CXM, CIP, TET, SXT]=S Moraxella catarrhalis PM-233 - - Neisseria meningitidis PM-234 - - POLMICRO 2014/SSE tura I Salmonella Eko PM-221 - - Salmonella Hillingdon PM-222 - - POLMICRO 2014/SSE tura II Salmonella Muenchen PM-227 - [AMP, AMC]=I, [CTX, CAZ, CRO, PEF, CIP, SXT]=S Salmonella Thompson PM-228 - [AMP, AMC]=I, [CTX, CAZ, CRO, PEF, CIP, SXT]=S HLAR oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy, M-fenotyp oporność na erytromycynę, wrażliwość na klindamycynę; BLPAR sczep wytwarzający β-laktamazę, ampicylina oporna, BLNAS sczep β-laktamazo-ujemny, ampicylina wrażliwa AK-amikacyna, AMP-ampicylina, CAZ-ceftazydym, CIP-ciprofloksacyna, COL-kolistyna, CRO-ceftriakson, CTX-cefotaksym, CXM-cefuroksym, ERT-ertapenem, GE-gentamicyna, IPM-imipenem, LEV-lewofloksacyna, LZD-linezolid, MEM-meropenem, MOX-moksifloksacyna, PEF-pefloksacyna, P-penicylina, RF-rifampicyna, SXT-trimetoprim/ sulfametoksazol, TEC-teikoplanina, TET-tetracyklina, TGC-tigecyklina, TOB-tobramycyna, TZP-piperacylina/tazobaktam, VA-wankomycyna S (susceptible) wrażliwy, I (intermediate) średniowrażliwy, R (resistant)-oporny 124

Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130 rażliwości oraz realizację wewnętrznej kontroli jakości testów wrażliwości. Wyniki analizy miały wyłącznie charakter edukacyjny i nie miały wpływu na końcową ocenę kompetencji laboratoriów. Program POLMICRO już od kilku lat przeprowadzany jest z wykorzystaniem specjalnie przygotowanej strony internetowej www. polmikro.edu.pl. Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla izolatów poprawnie zidentyfikowanych; ocenę przeprowadzono w oparciu o kategoryzację błędnych wyników interpretacji klinicznej na małe (me minor error), duże (ME major error) i bardzo duże błędy (VME very major error). Zastosowana kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease Control and Prevention (CDC) i stosowana jest w Centralnym Ośrodku od wielu lat. Szczegółowe wyniki poszczególnych edycji sprawdzianu oraz interpretacja wyników każdorazowo były zamieszczane na stronie internetowej Ośrodka. Laboratoria, które uczestniczyły w danej edycji we wszystkich turach sprawdzianu uzyskując wyłącznie wyniki pozytywne otrzymały Świadectwa Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Świadectwa posiadają indywidualny numer i zachowują ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia. Wyniki i omówienie W poszczególnych turach sprawdzianów POLMICRO w roku 2014 uczestniczyła różna liczba laboratoriów mikrobiologicznych (rycina 1). WYNIKI POLMICRO 2014 EDYCJA OGÓLNA Identyfikacja drobnoustrojów 1. Poprawną identyfikację badanych szczepów przekazanych laboratoriom w ramach I tury POLMICRO 2014 (Acinetobacter baumannii PM-223 i Enterobacter cloacae PM-224) podało aż 99,1% jednostek. Tylko 2 spośród 453 Laboratoriów błędnie zidentyfikowało obydwa badane szczepy, a cztery laboratoria popełniły błąd w identyfikacji jednego ze szczepów. Szczep A. baumannii błędnie został określony jako Pseudomonas putida, a także jako Escherichia coli, natomiast szczep E. cloacae w pięciu przypadkach zidentyfikowany został jako Enterobacter kobei lub Klebsiella pneumoniae, a nawet Enterococcus casseliflavus. Laboratoriom tym przyznano oceny negatywne i tym samym nie oceniano testów lekowrażliwości. 2. W ramach III tury edycji ogólnej 2014 laboratoria otrzymały dwa izolaty ziarenkowców Gram-dodatnich z rodzaju Enterococcus (E. faecalis PM-225 oraz E. faecium PM-226). Gatunek każdego z badanych izolatów poprawnie określiło czterysta pięćdziesiąt laboratoriów (99,6%). Tylko dwa laboratoria popełniły błędy oznaczając szczepy E. faecium jako E. faecalis. 3. W ramach IV tury POLMICRO 2014 laboratoria otrzymały zestaw sześciu szczepów bakteryjnych, należących do grupy drobnoustrojów wymagających, wyizolowanych z zakażeń inwazyjnych (tabela 1). Cztery laboratoria nie ożywiły badanych szczepów, mimo, że przygotowanie i procedura rozsyłania próbek kontrolnych przez COBJwDM gwarantowały żywotność szczepów. Brak wzrostu badanych izolatów spowodowany był nieprzestrzeganiem zasad rutynowych procedur diagnostycznych stosowanych przy tego typu drobnoustrojach: przechowywanie podłoży transportowych w lodówce, posiew na podłoża niezapewniające wymagań wzrostowych dla tych izolatów, a także inkubacja w warunkach tlenowych. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja gatunkowa wszystkich izolatów, natomiast określenie wrażliwości tylko szczepów Streptococcus pneumoniae (PM-229 i PM-230) oraz Haemophilus influenzae (PM-231 i PM-232). Czterysta dwadzieścia cztery (95,9%) laboratoria poprawnie zidentyfikowały wszystkie sześć izolatów, a trudności w identyfikacji pojedynczych izolatów miało czternaście laboratoriów (3,2%). Błędna identyfikacja dotyczyła głównie izolatów Neisseria meningitidis (PM-234) oraz Moraxella catarrhalis (PM-233). Sześć laboratoriów nieprawidłowo określiło izolaty M. catarrhalis PM-233, jako N. meningitidis i N. meningitidis PM- 234 jako M. catarrhalis. W przypadku izolatu Moraxella catarrhalis PM-233 aż osiem laboratoriów podało starą nazwę gatunkową Branhamella catarrhalis (odpowiedź oceniono wprawdzie pozytywnie, jednak opatrzono ją uwagą o obowiązku stosowania aktualnego nazewnictwa. Szczegółowe wyniki identyfikacji szczepów w tej turze sprawdzianu przedstawiono w tabeli 2. Tabela 2. Identyfikacja izolatów w kontroli POLMICRO 2014 IV tura Identyfikacja Liczba laboratoriów n=442 Streptococcus pneumoniae PM-229 Streptococcus pneumoniae 440 Streptococcus mitis 1 Brak identyfikacji 1 Streptococcus pneumoniae PM-230 Streptococcus pneumoniae 440 Brak identyfikacji 2 Haemophilus influenzae PM-231 Haemophilus influenzae 439 Haemophilus parainfluenzae 2 Brak identyfikacji 1 Haemophilus influenzae PM-232 Haemophilus influenzae 437 Haemophilus parainfluenzae 2 Brak identyfikacji 3 Moraxella catarrhalis PM-233 Moraxella catarrhalis 416 Branhamella catarrhalis 8 Neisseria meningitidis 7 Neisseria sicca 2 Neisseria gonorrhoeae 1 Staphylococcus aureus 2 Kocuria rosea 1 Brak identyfikacji 5 Neisseria meningitidis PM-234 Neisseria meningitidis 424 Moraxella catarrhalis 8 Neisseria spp. 2 Neisseria sicca 2 Neisseria gonorrhoeae 1 Staphylococcus aureus 2 Brak identyfikacji 3 125

www.diagnostykalaboratoryjna.eu prawidłową odpowiedź: Szczep jest podejrzewany o wytwarzanie MBL. Laboratoriom tym przyznano oceny negatywne. Szczep Enterobacter cloacae PM-224 to szczep z derepresją cefalosporynazy AmpC. Szczep był wrażliwy na aminoglikozydy amikacyna, gentamicyna i tobramycyna wszystkie podane przez laboratoria wyniki, z jednym wyjątkiem, były prawidłowe jedno laboratorium popełniło błąd oznaczając szczep jako oporny Rycina 2. Rozkład wielkości stref zahamowania wzrostu (mm) E. cloacae PM-224/ ertapenem 10 µg na gentamicynę. Nie odnotowano także znaczących Lekowrażliwość i mechanizmy oporności rozbieżności w wynikach oznaczeń wrażliwości szczepu na ciprofloksacynę i trimetoprim z sulfametoksazolem 99,8% 1. W ramach I tury POLMICRO 2014 ocenie poddano wyniki prawidłowych wyników (szczep wrażliwy na oba leki). oznaczeń 447 laboratoriów, które poprawnie zidentyfikowały Szczep E. cloacae PM-224 nie był producentem ESBL obydwa badane izolaty (Acinetobacter baumannii PM-223 (β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym), i Enterobacter cloacae PM-224). natomiast obecność mechanizmu ESBL stwierdziło osiem Wrażliwość szczepu Acinetobacter baumannii PM-223 na laboratoriów (1,8%). Wszystkie te laboratoria otrzymały negatywne oceny końcowe. kolistynę, amikacynę i tobramycynę prawidłowo określiło blisko 100% laboratoriów. Dwa spośród 447 laboratoriów Szczep PM-224 był wrażliwy na imipenem i meropenem, zastosowało niezgodną z europejskimi zaleceniami (EUCAST; wykazywał natomiast obniżoną wrażliwość na ertapenem, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) w związku z czym, zgodnie z zaleceniami KORLD (Krajowy metodę oznaczania wrażliwości na kolistynę, co zostało potraktowane jako bardzo duży błąd (VME) i zadecydowało z roku 2013, kwalifikował się do wykonania testów w kierunku Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów) o przyznaniu tym Laboratoriom negatywnej oceny końcowej. Zgodnie z zaleceniami wrażliwość na kolistynę należy wykrywania karbapenemaz. oznaczać wyłącznie na podstawie wartości MIC (ang. minimal Na rycinach 1 i 2 przedstawiono rozkład stref zahamowania inhibitory concentration najmniejsze stężenie hamujące), wzrostu (mm) i rozkład wartości MIC (mg/l) ertapenemu pomimo tego, cztery laboratoria wykonały oznaczenie metodą dyfuzyjno-krążkową; ale dwa z nich oznaczyły również sprawdzianu POLMICRO. uzyskane przez laboratoria uczestniczące w niniejszej edycji MIC kolistyny. Szczep PM-223 był oporny na pozostałe leki zawarte w ankiecie; po przeanalizowaniu wyników oznaczeń dla ciprofloknak wytwarzanie MBL wykryło osiem laboratoriów, w tym Szczep Enterobacter cloacae PM-224 nie wytwarzał MBL, jedsacyny, gentamicyny i trimetoprimu z sulfametoksazolem jedno laboratorium, które popełniło wcześniej błąd w wykrywaniu mechanizmie ESBL. Laboratoriom tym zostały przy- stwierdzono 99,8-100% prawidłowych odpowiedzi. Wartości MIC imipenemu i meropenemu mieściły się w kategorii oporny MIC >32 mg/l. Dwanaście laboratoriów (2,7%) Szczep E. cloacae PM-224 nie wytwarzał także karbapenemaznane oceny negatywne. popełniło błąd przy oznaczaniu wrażliwości na imipenem, zy KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase); czterdzieści określając szczep jako średniowrażliwy mały błąd. Jedno jeden laboratoriów udzieliło właśnie takiej odpowiedzi. Jednak 406 laboratoriów uznało szczep E. cloacae za podejrzany laboratorium określiło szczep jako wrażliwy na meropenem, co jest uznawane za bardzo duży błąd najpoważniejszy o wytwarzanie KPC. Z uwagi na fakt, że w przypadku szczepu z klinicznego punktu widzenia. wykazującego derepresję AmpC, fenotypowy test na obecność KPC daje wynik fałszywie pozytywny, odpowiedź taka Omawiany szczep nie wytwarzał MBL (metalo-β-laktamaz). Czterysta trzydzieści dwa laboratoria (96,6%) udzieliły prawidłowej odpowiedzi Szczep nie wytwarza MBL. Piętnaście Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2014 uzy- uznana była za prawidłową. laboratoriów 3,4% miało trudności w interpretacji testów skało 418 (92,2%) laboratoriów. wykrywania mechanizmu MBL, laboratoria te wybrały nie- 126

Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130 2. Przekazane Laboratoriom w ramach III tury edycji ogólnej POLMICRO 2014 szczepy Enterococcus PM-225 i PM-226 były wrażliwe na glikopeptydy, oporne na linezolid i wykazywały oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy (HLAR). Wszystkie laboratoria poprawnie określiły wrażliwość szczepów na wankomycynę, natomiast tylko jedno laboratorium błędnie oznaczyło wrażliwość szczepów na teikoplaninę (jako oporne). Blisko 100% laboratoriów prawidłowo wykryło oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy HLAR obu szczepów E. faecalis PM-225 i E. faecium PM-226 (n=450). Oporność na linezolid szczepów E. faecalis PM-225 i E. faecium PM-226 określiło ponad 98% laboratoriów. Pojedyncze duże i małe błędy odnotowano w oznaczaniu wrażliwości szczepów na ampicylinę. Pozytywny wynik III tury sprawdzianu POLMICRO 2014 uzyskało 440 (97,3%) laboratoriów. 3. Różnice w testach wrażliwości szczepów wymagających, w ramach IV tury POLMICRO 2014, dotyczyły wartości MIC (mg/l), czy też wielkości stref zahamowania wzrostu (mm) w metodzie Kirby-Bauer, nie dotyczyły natomiast kategorii wrażliwości. Odsetek prawidłowych wyników oznaczania wrażliwości na leki badanych izolatów wyniósł ponad 98%, odnotowano tylko pojedyncze błędy. Trzy laboratoria oznaczyły wrażliwość szczepów S. pneumoniae PM-229 i PM 230 na antybiotyki β-laktamowe (penicylina, cefotaksym i ceftriakson) tylko i wyłącznie metodą dyfuzyjno-krążkową, co zgodnie z wytycznymi EUCAST (wersja 4.0) jest niedopuszczalne. Laboratoria te otrzymały ocenę negatywną. Znaczne różnice wielkości stref zahamowania wzrostu (mm) w metodzie dyfuzyjno-krążkowej między poszczególnymi laboratoriami odnotowano dla szczepów H. influenzae PM-232 i PM 232. Różnice te nie miały jednak wpływu na interpretację kategorii wrażliwości tych szczepów. Z przeprowadzonych przez Centralny Ośrodek badań przedstawionych w Tabeli 3. wynika, że rozbieżności te najprawdopodobniej wynikały ze stosowania przez laboratoria podłoży antybiogramowych różnych producentów. Pozytywny wynik IV tury sprawdzianu POLMICRO 2014 uzyskało 408 (92,3%). Stosowane metody oznaczania lekowrażliwości W codziennej pracy laboratoria wykorzystują różne metody oznaczania wrażliwości na leki w zależności od potrzeb diagnostycznych. 1. Spośród 452 laboratoriów uczestniczących w I turze sprawdzianu tylko siedemdziesiąt pięć podmiotów (16,6%) wskazało, że jedyną stosowaną metodą oznaczania lekowrażliwości była metoda dyfuzyjno-krążkowa. Sto czterdzieści trzy laboratoria (31,6%) dodatkowo stosowały metodę pasków gradientowych, a sto dwadzieścia sześć laboratoriów (27,8%) wspomagało się ponadto metodą automatyczną. 2. Podczas IV tury sprawdzianu metodę dyfuzyjno-krążkową stosowało 437 laboratoriów spośród 442 (98,9%), paski z gradientem stężeń antybiotyku 400 laboratoriów (90,5%), metody automatyczne 181 laboratoriów (40,9%). WYNIKI POLMICRO 2014/SSE Wszystkie laboratoria otrzymały zestawy zawierające dwa szczepy izolowane z zakażeń przewodu pokarmowego wymienione w Tabeli 1. Zadaniem ośrodków była identyfikacja (I tura) lub identyfikacja i oznaczenie lekowrażliwości (II tura) szczepów na poziomie zadeklarowanym przez każde z laboratoriów. Zakres identyfikacji (poziom identyfikacji) rodzaju Salmonella deklarowany przez laboratoria: pięćdziesięciu dziewięciu uczestników (51,3%) zadeklarowało identyfikację szczepów Salmonella do serowaru, czterdziestu jeden (35,6%) do grupy serologicznej, piętnastu (13,1%) do rodzaju. Poprawność identyfikacji oceniano zgodnie z zakresem podanym przez każdego z uczestników programu POLMICRO/SSE, natomiast, w sytuacji rozszerzenia zakresu, ocenie podlegała wskazana w ankiecie odpowiedź. W poszczególnych turach POLMICRO 2014/SSE uczestniczyły laboratoria stacji sanitarno-epidemiologicznych (WSSE wraz z Oddziałami, PSSE), laboratoria mikrobiologiczne spoza PIS (laboratoria szpitalne, Wojskowe Ośrodki Medycyny Prewencyjnej) oraz laboratorium weterynaryjne. Liczby laboratoriów uczestniczące w obu turach zostały przedstawione Tabela 3. Oznaczenie lekowrażliwości szczepów H.influenzae PM-231 i PM-232 metodą dyfuzyjno-krążkową z wykorzystaniem podłoży antybiogramowych różnych producentów (1,2,3,4) inokulacja wszystkich płytek tą samą zawiesiną o gęstości 0,5 McFarlanda; inkubacja warunki 5% CO 2, 35±1 C, 18±2 godz. szczep H. influenzae PM 231 H. influenzae PM 232 Mueller-Hinton agar +5% krwi końskiej +20mg/L β-nad Producent nr 1 Producent nr 2 Producent nr 3 Producent nr 4 Różnica stref [mm] Cefotaksym (5 µg) 27 S 33 S 25 R 32 S 8 Ceftriakson (30 µg) 32 S 37 S 27 R 29 R 10 Ciprofloksacyna (5 µg) 30 S 39 S 37 S 32 S 9 Trimetoprim /sulfametoksazol (25 µg) 31 S 37 S 22 I 27 S 15 Cefotaksym (5 µg) 27 S 27 S 24 R 30 S 6 Ceftriakson (30 µg) 33 S 30 S 30 S 32 S 3 Ciprofloksacyna (5 µg) 33 S 32 S 35 S 37 S 5 Trimetoprim /sulfametoksazol (25 µg) 39 S 34 S 30 S 32 S 9 S (susceptible) wrażliwy, I (intermediate) średniowrażliwy, R (resistant)-oporny 127

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Rycina 3. Rozkład wartości MIC (mg/l) ertapenemu dla E. cloacae PM-224 na Rycinie 1. Sto osiem (93,9%) laboratoriów, biorących udział w sprawdzianie POLMICRO/SSE w 2014 roku, posiadało akredytację Polskiego Centrum Akredytacji na zgodność z normą PN-EN ISO/IEC 17025:2005. Identyfikacja drobnoustrojów 1. W ramach I tury sprawdzianu POLMICRO 2014/SSE laboratoria otrzymały następujące izolaty: a. szczep Salmonella Eko PM-221, należący do grupy O:4 (B), antygen somatyczny O 4,12; antygen rzęskowy H I faza e,h; II faza 1,6. Szczep prawidłowo zidentyfikowało sto trzynaście laboratoriów (98,3%). Dziewięć ośrodków (7,8%) rozszerzyło deklarowany zakres identyfikując badany szczep do poziomu serowaru, a jedno określając grupę serologiczną. Trzy laboratoria (2,6%) wykonały oznaczenie w zakresie węższym niż deklarowany podały identyfikację wyłącznie do grupy zamiast do serowaru. Dwa laboratoria (1,7%) błędnie zidentyfikowały szczep jako Salmonella Typhimurium i jako Salmonella Enteritidis. b. szczep Salmonella Hillingdon PM-222 należący do grupy O:9,46 (D 2 ), antygen somatyczny O 9,46; antygen rzęskowy H I faza g,m; Salmonella Hillingdon został prawidłowo zidentyfikowany przez 112 ośrodków (97,4%). Siedemdziesiąt osiem laboratoriów (67,8%) określiło typ serologiczny szczepu, w tym trzynaście (11,3%) rozszerzyło deklarowany zakres identyfikacji. Trzy laboratoria (2,6%) błędnie zidentyfikowały szczep jako Salmonella Typhimurium (jedno laboratorium) i jako Salmonella Enteritidis (dwa ośrodki). 2. W ramach II tury sprawdzianu POLMICRO 2014/ SSE wszystkie laboratoria otrzymały: a. szczep Salmonella Muenchen PM-227, należący do grupy O:8 (C2-C3), antygen somatyczny O 6, 8; antygen rzęskowy H I faza d; II faza 1, 2; inne [z 67 ] Szczep prawidłowo zidentyfikowało sto dwanaście laboratoriów (97,4%). Trzy ośrodki podały niepoprawną identyfikację szczepu. Pierwszy określił badany izolat jako Salmonella Duesseldorf, drugi jako Salmonella Albany, a trzeci scharakteryzował szczep jako Salmonella grupy O:7 (C 1 ). Dwa laboratoria podały identyfikację w zakresie węższym niż deklarowany podały identyfikację wyłącznie do grupy zamiast do serowaru. Pięć ośrodków rozszerzyło deklarowany zakres identyfikując szczep do poziomu serowaru, a dwa określając grupę serologiczną. b. szczep Salmonella Thompson PM-228 należący do grupy O:7 (C1), antygen somatyczny O 6, 7, 14; antygen rzęskowy H I faza k; II faza 1, 5; inne [R1...]. Szczep został prawidłowo zidentyfikowany przez 108 ośrodków (93,9%). Siedem laboratoriów błędnie zidentyfikowało izolat jako Salmonella Isangi (n=6) lub jako Salmonella Tennessee (n=1). Szesnaście laboratoriów (13,9%) wykonało identyfikację w zakresie węższym niż deklarowany identyfikacja wyłącznie do grupy. Trzy laboratoria rozszerzyły deklarowany zakres identyfikacji (dwa laboratoria określając serowar szczepu, a jedno laboratorium identyfikując izolat do grupy). Kilkanaście laboratoriów (n=15) zgłaszało problem z identyfikacją szczepu do typu serologicznego związane z trudnością zahamowania II fazy rzęskowej. Błędy związane z identyfikacją szczepu do serowaru wynikały najprawdopodobniej z nieprawidłowego oznaczenia I fazy rzęskowej. Salmonella Thompson i Isangi należą do grupy O:7 (C 1 ), antygen somatyczny O 6, 7, 14. Salmonella Thompson posiada antygen rzęskowy w I fazie k, natomiast Salmonella Isangi antygen rzęskowy w I fazie d; oba szczepy mają w II fazie rzęskowej antygen 1, 5. Lekowrażliwość (w ramach II tury POLMICRO 2014/SSE) Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2014/SSE uzyskało 110 laboratoriów (96%). Niewielka grupa laboratoriów (n=20) przeprowadziła badanie lekowrażliwości przesłanych izolatów Salmonella zgodnie z dekla- 128

Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130 rowanym zakresem badań. Wszyscy uczestnicy prawidłowo oznaczyli wrażliwość szczepu Salmonella Muenchen oraz Salmonella Thompson na ampicylinę oraz amoksycylinę z kwasem klawulanowym (wrażliwy n=16, średniowrażliwy n=4). Poprawnie została oznaczona także wrażliwość na cefotaksym, ceftazydym, ceftriakson, trimetoprim/ sulfametoksazol. Siedemnaście z dwudziestu laboratoriów (70%) wykonało bada- Rycina 4. Wrażliwości szczepu S. pneumoniae PM-229 na cefalosporyny III generacji nia przesiewowe w kierunku oporności na fluorochinolony szczepów z rodzaju Salmonella spp. 8468 do kontroli jakości krążków oraz H. influenzae ATCC 49766 z zastosowaniem krążka z pefloksacyną (5 µg). Oba szczepy były do kontroli oznaczania wartości MIC. Stosowanie szczepu NCTC wrażliwe na tę grupę leków. Jedenaście laboratoriów (55%) wnioskowało o wrażliwości szczepów na ciprofloksacynę na podstawie szczepu ATCC 49766 trzydzieści trzy laboratoria. 8468 zadeklarowało dwieście siedem laboratoriów, natomiast oznaczenia strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z ciprofloksacyną 5 µg. Według najnowszych wytycznych EUCAST wersja Dyskusja i podsumowanie 4.0 z 01.01.2014 badania przesiewowe w kierunku oporności na Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności fluorochinolony szczepów z rodzaju Salmonella spp. należy przeprowadzać z zastosowaniem krążka z pefloksacyną (5 µg). pełni przede wszystkim rolę edukacyjną. Założeniem organiza- Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej Program POLMICRO Pozytywny wynik II tury sprawdzianu POLMICRO 2014/SSE uzyskało 99 laboratoriów (86,1%). gnostyki mikrobiologicznej i ujednolicanie metod badawczych tora Sprawdzianu jest promowanie aktualnych standardów dia- w polskich laboratoriach medycznych. Jak co roku, główny nacisk WEWNĘTRZNA KONTROLA TESTÓW LEKOWRAŻLIWOŚCI położono na identyfikację drobnoustrojów oraz prawidłowe oznaczanie fenotypów wrażliwości na antybiotyki badanych izolatów Zgodnie z wytycznymi EUCAST do oceny jakości krążków antybiogramowych i pasków z gradientem stężeń pozwalających ocezmów oporności. Biegłość laboratorium w oznaczaniu fenotypów bakteryjnych z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechaninić lekowrażliwość szczepów Acinetobacter spp. należy stosować wrażliwości patogenów umożliwia podejmowanie odpowiednich szczep Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ok 80 % (n=365) decyzji terapeutycznych i działań związanych z kontrolą zakażeń. laboratoriów zadeklarowało stosowanie tego szczepu. Natomiast Kluczowym elementem diagnostyki mikrobiologicznej jest właściwa identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia. Laboratoria do kontroli jakości (QC, ang. quality control) oznaczeń szczepów z rodziny Enterobacteriaceae szczep Escherichia coli ATCC 25922, wykorzystują obecnie szereg różnych metod identyfikacji, od który zastosowało 95,6 % (n=433) uczestników. klasycznych, po spektrometrię masową. Kompetentne laboratorium potrafi odpowiednio stosować nowe techniki diagnostyczne Pozostałe laboratoria biorące udział w I turze POLMICRO 2014 do QC pałeczek Gram-ujemnych zastosowały inne szczepy wzorcowe i właściwie interpretować uzyskiwane wyniki. Dlatego też Laboratoria, które w przedstawionych sprawdzianach posługiwały np.: Staphylococcus aureus ATCC 29213 cztery laboratoria; S. aureus ATCC 25923 cztery laboratoria; Enterococcus faecalis ATCC się starymi nazwami drobnoustrojów, powinny samodzielnie 29212 jedno laboratorium. zidentyfikować przyczynę tej sytuacji. Być może przyczyna leży po QC lekowrażliwości enterokoków (bez względu na stosowaną metodę oznaczenia lekowrażliwości), należało przeprowadzić z wy- Nie stanowi to jednak usprawiedliwienia, gdyż ostateczną decyzję stronie systemu identyfikacyjnego stosowanego w laboratorium. korzystaniem szczepu Enterococcus faecalis ATCC 29212. Szczep o treści wyniku podejmuje mikrobiolog. ten był wykorzystany w QC przez 93,8% laboratoriów (n=424). Wśród bakterii Gram-dodatnich wytwarzających mechanizmy Szczep Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 stosowany, zgodnie oporności szczególnie niebezpieczne są szczepy Staphylococcus z wytycznymi EUCAST, do QC testów lekowrażliwości pneumokoków, użyło czterysta osiemnaście laboratoriów (94,6%). z rodzaju Enterococcus oporne na wankomycynę, teikoplaninę, aureus oporne na meticylinę, wankomycynę czy linezolid, gatunki We wrześniu 2014 roku pojawiły się zmienione wytyczne EUCAST aminoglikozydy i linezolid oraz izolaty Streptococcus pneumoniae oporne na penicylinę, makrolidy i cefalosporyny III genera- odnośnie kontroli jakości wersja 4.0 obowiązująca od 05.09.2014. Zgodnie z nimi, do kontroli jakości oznaczeń izolatów z rodzaju cji. Istotne epidemiologicznie jest także wykrywanie szczepów Haemophilus należało zastosować szczepy: H. influenzae NCTC pałeczek Gram-ujemnych, zarówno jelitowych z rodziny Entero- 129

www.diagnostykalaboratoryjna.eu bacteriaceae, jak i pałeczek niefermentujących, wytwarzających enzymy nabyte takie jak: β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) i karbapenemazy. W ramach Sprawdzianów POLMICRO 2014 ocenie podlegały więc znane laboratoriom już od lat bakteryjne mechanizmy oporności, takie jak HLAR, ESBL, ale także stosunkowo nowe: MBL i KPC. Trudność diagnostyczna Gram-ujemnych pałeczek opornych na karbapenemy może wynikać z różnorodnych podstaw takiej oporności: wytwarzania β-laktamaz hydrolizujących karbapenemy, tzw. karbapenemaz (klasy A, B i D), zmniejszenia przepuszczalności osłon komórkowych i ograniczania transportu leku do komórki. Wiele laboratoriów mikrobiologicznych w procesie diagnostyki wykorzystywało systemy automatyczne do identyfikacji i lekowrażliwości drobnoustrojów. Wzrosła też liczba laboratoriów określających wartości MIC z użyciem pasków z gradientem stężeń antybiotyku. Uwagę zwrócił również fakt coraz częstszego wprowadzania do rutynowej diagnostyki nowoczesnych i szybkich metod diagnostycznych. Jednak to mikrobiolog ostatecznie interpretuje wyniki lekowrażliwości uzyskane różnymi metodami oraz decyduje o formie wyniku przekazywanego lekarzowi. Nieodłącznym elementem wiarygodnej diagnostyki mikrobiologicznej jest wewnętrzna i zewnętrzna kontrola jakości. Uzyskane wyniki porównań międzylaboratoryjnych wykazały pewne niedoskonałości procedur wewnętrznej kontroli jakości u niektórych uczestników Programu POLMICRO. Nieprawidłowości te muszą być przeanalizowane i zweryfikowane przez laboratoria, co zostało opisane przy poszczególnych turach sprawdzianu. Stosowanie w kontroli jakości antybiogramów szczepów innych gatunków niż rekomendowane przez EUCAST jest nieprawidłowe, może zagrażać wiarygodności oznaczeń i wymaga pilnego przeanalizowania procedur laboratoryjnych. Procent prawidłowych wyników uzyskiwanych przez laboratoria w kolejnych turach Programu POLMICRO w roku 2014 był wysoki i wyniósł blisko 93%. Przedstawione na Rycinie 1 różnice w liczbie laboratoriów biorących udział w poszczególnych turach sprawdzianu wynikały z sytuacji na rynku diagnostycznym, tj. likwidacji laboratoriów, czy też przejmowaniem laboratoriów szpitalnych przez zewnętrzne firmy diagnostyczne. 4. Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST), Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu; wersja 4.0, 2014; Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz www.korld.edu.pl 5. Grimont Patrick A.D., Weill Francois-Xavier; Antigenic formulae of the Salmonella serovars, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, 2007, 9 th edition. 6. Młodzińska Ewa, Bosacka K., Stefaniuk E., Fortuna M., Hryniewicz W. Bezpośredni preparat mikroskopowy kontrola jakości pierwszego etapu diagnostyki mikrobiologicznej. Diagn. Lab. 2014; 50(4): 299-306. 7. Rekomendacje European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST, Version 4.0, 2014 www.eucast.org Adres do korespondencji: dr n. med. Elżbieta Stefaniuk Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej 01-793 Warszawa, ul. Rydygiera 8 tel/fax: +48 22 8415834 e-mail: estefaniuk@cls.edu.pl, sprawdzian@cls.edu.pl Zaakceptowano do druku: 30.06.2015 Ogółem w roku 2014 świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo dobrych wyników Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej otrzymały 454 laboratoria spośród 577 (78,7%): 356 podmiotów w edycji ogólnej (spośród 460; 77,4%) i 98 z 117 w edycji w zakresie schorzeń jelitowych (83,8%). Piśmiennictwo: 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty Fourth Informational Supplement, CLSI document M100-S24,Wayne PA, 2014. 2. Eksperckie zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zalecenia EUCAST, wersja 2.0, Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz www.korld.edu.pl 3. Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing Methods, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 2000, 54, 3; Supp. TR33 130