EnVision FLEX Mini Kit, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

EnVision FLEX Mini Kit, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. K8024 Wydanie 3. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 125-190 testów. Do aparatu Dako Autostainer/Autostainer Plus. Odczynniki opcjonalne: Nr kat. Nazwa produktu Testy K8004 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 200-430 K8005 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 200-430 K8006 EnVision FLEX Antibody Diluent 400-600 K8007 K8018 K8019 K8022 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX+ Mouse (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) 400-600 120-190 120-190 Inne opcje K8020 FLEX IHC Microscope Slides 500

Spis treści Strona Przeznaczenie... 3 Streszczenie i informacje ogólne... 3 Odczynniki... 4 A. Materiały dostarczane... 4 B. Materiały wymagane, ale niedostarczane... 4 C. Odczynniki opcjonalne... 5 Środki ostroŝności... 5 Przechowywanie... 7 Przygotowanie odczynników... 7 Pobieranie i przygotowanie próbek... 8 Procedura... 8 A. Obróbka wstępna... 8 B. Procedura barwienia... 10 Kontrola jakości... 10 Interpretacja wyników... 10 Ograniczenia metody... 11 Objaśnienie symboli... 11

Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. System detekcji Dako EnVision FLEX jest przeznaczony do stosowania w immunohistochemii, razem z aparatami do barwienia Dako Autostainer/Autostainer Plus. System wykrywa pierwotne przeciwciała mysie i królicze, a zachodząca reakcja jest wizualizowana przy uŝyciu chromogenu EnVision FLEX DAB+ Chromogen. W przypadku uŝycia z odczynnikiem EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (nr kat. K8019) lub EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (nr kat. K8022) istnieje moŝliwość wzmocnienia sygnału odpowiednio pierwotnych przeciwciał króliczych lub pierwotnych przeciwciał mysich. Odczynniki EnVision FLEX są przeznaczone do stosowania na skrawkach tkankowych utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie. Streszczenie i informacje ogólne System detekcji Dako EnVision FLEX opracowano z myślą o maksymalnej wszechstronności i optymalnym wykonywaniu odczynów w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus zgodnie z protokołem zalecanym w niniejszej ulotce. Przed przystąpieniem do wykonywania odczynu utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie skrawki tkankowe muszą zostać poddane procedurom odparafinowania, nawodnienia, a następnie cieplnego odmaskowania epitopu (HIER) przy uŝyciu metody wskazanej w ulotce dołączonej do opakowania przeciwciał pierwotnych. NaleŜy równieŝ zapoznać się z częścią Procedura przygotowania materiału 3-w-1. Produkt o nr kat. K8024 zawiera odczynnik EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (DM828). Zamiast tych odczynników moŝna uŝywać zalecanych produktów EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (nr kat. K8004) albo EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (nr kat. K8005). W przypadku niektórych pierwotnych przeciwciał zamiast cieplnego odmaskowania epitopu (HIER) naleŝy przeprowadzić trawienie enzymatyczne. Aktywność peroksydazy endogennej naleŝy zablokować odczynnikiem EnVision FLEX Peroxidase- Blocking Reagent (SM821) wchodzącym w skład zestawu. Z uwagi na zastosowanie wysoce skutecznej procedury płukania i obecność białek stabilizujących w składzie odczynników Dako nie jest konieczne wykonywanie dodatkowych procedur blokujących w celu osłabienia nieswoistego odczynu tła. Zalecany jest dostępny w zestawie rozcieńczony bufor EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (DM831) lub dostępny odczynnik opcjonalny (nr kat. K8007). Zestaw nie zawiera przeciwciał pierwotnych. Zalecamy stosowanie przeciwciał z serii Dako FLEX Ready-to- Use Primary Antibodies lub stęŝonych przeciwciał pierwotnych Dako. Do rozcieńczania stęŝonych przeciwciał pierwotnych Dako zaleca się stosowanie odczynnika EnVision FLEX Antibody Diluent (nr kat. K8006). W celu opcjonalnego wzmocnienia sygnału króliczych przeciwciał pierwotnych moŝna zastosować odczynnik EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (nr kat. K8019). Informacje na temat wzmacniania sygnału mysich przeciwciał pierwotnych moŝna znaleźć w dokumentacji produktu EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (nr kat. K8022 lub nr kat. K8012). Orientacyjnie: EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) zapewnia 2- do 3-krotne wzmocnienie sygnału, a EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) zapewnia 4- do 5-krotne wzmocnienie sygnału. Odczynnik detekcyjny Dako EnVision FLEX /HRP (DM822) wchodzący w skład zestawu zawiera szkielet dekstranowy, z którym sprzęŝonych jest wiele cząsteczek peroksydazy (HRP) i przeciwciał wtórnych. Do przeprowadzenia reakcji sprzęŝenia stosowany jest specjalny odczynnik umoŝliwiający związanie do 100 cząsteczek HRP i do 20 cząsteczek przeciwciał z jednym szkieletem. System substratów w zestawie składa się z dwóch odczynników: EnVision FLEX DAB+ Chromogen (DM827) roztworu diaminobenzydyny (DAB) o wysokim stęŝeniu, oraz EnVision FLEX Substrate Buffer (SM823) zawierającego nadtlenek wodoru. Przed uŝyciem EnVision FLEX DAB+ Chromogen naleŝy rozcieńczyć w buforze EnVision FLEX Substrate Buffer. Produkt reakcji systemu substratu ma kolor intensywnie brązowy i zlokalizowany jest w miejscu występowania antygenu. Do barwienia kontrastowego zaleca się uŝycie odczynnika EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat. K8018). Odczynnik ten daje wyrazisty niebieski odczyn jądrowy. Wybarwione skrawki tkankowe moŝna zatopić w środku wodnym lub opartym na rozpuszczalniku organicznym.

Odczynniki A. Materiały dostarczane DM821 DM822 DM827 DM823 DM828 DM831 EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent 3 x 13 ml, gotowy do uŝycia Bufor fosforanowy zawierający nadtlenek wodoru, 15 mmol/l NaN 3 i detergent. EnVision FLEX /HRP 3 x 13 ml, gotowy do uŝycia Dekstran sprzęŝony z peroksydazą i wtórnymi przeciwciałami kozimi przeciwko immunoglobulinom króliczym i mysim. W buforowanym roztworze zawierającym białko stabilizujące i konserwant. EnVision FLEX DAB+ Chromogen 1 x 3 ml Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny w rozpuszczalniku organicznym. Odczynnik ten moŝe mieć róŝny kolor, od wyraźnie fioletowego do bezbarwnego, nie ma to jednak wpływu na działanie zestawu. EnVision FLEX Substrate Buffer 7 x 13 ml Roztwór buforowany zawierający nadtlenek wodoru i konserwant. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 3 x 30 ml, koncentrat 50x Bufor Tris/EDTA, ph 9 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) 2 x 1 L, koncentrat 20x Roztwór soli fizjologicznej z buforem Tris o ph 7,6, zawierający preparat Tween 20 (±0,1). B. Materiały wymagane, ale niedostarczane Aparat Dako Autostainer/Autostainer Plus Aparat Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (w razie potrzeby) Gotowe do uŝycia przeciwciała pierwotne Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies lub odpowiednio rozcieńczone stęŝone pierwotne przeciwciała królicze lub mysie dostarczone przez firmę Dako Dako FLEX Ready-to-Use Rabbit lub Mouse Universal Negative Control lub inny stosowny odczynnik kontroli ujemnej dla przeciwciał pierwotnych Przybory do aparatów Dako Szkiełka mikroskopowe, np. FLEX IHC Microscope Slides Odczynniki laboratoryjne ogólnego zastosowania do odparafinowania skrawków tkankowych zatopionych w parafinie Środek do zatapiania (wodny lub oparty na rozpuszczalniku organicznym) i szkiełka nakrywkowe

C. Odczynniki opcjonalne K8004 DM828 K8005 DM829 K8006 DM830 K8007 DM831 K8018 DM826 K8019 DM825 K8022 SM824 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 3 x 30 ml, koncentrat 50x Bufor Tris/EDTA, ph 9 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 3 x 30 ml, koncentrat 50x Bufor Citrate, ph 6,1 EnVision FLEX Antibody Diluent 120 ml, gotowy do uŝycia Bufor Tris, ph 7,2, zawierający 15 mmol/l NaN 3 i białko. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) 1 L, koncentrat 20x Roztwór soli fizjologicznej z buforem Tris o ph 7,6, zawierający preparat Tween 20 (±0,1). EnVision FLEX Hematoxylin 10 x 13 ml, gotowy do uŝycia Wodny roztwór hematoksyliny. EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) 3 x 13 ml, gotowy do uŝycia Buforowany roztwór zawierający białko stabilizujące i środek przeciwbakteryjny. Ilość odczynnika wystarcza na 110 165 testów przy załoŝeniu, Ŝe na jeden test zuŝywa się 200 300 µl. EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) 3 x 13 ml, gotowy do uŝycia Buforowany roztwór zawierający białko stabilizujące i środek przeciwbakteryjny. Ilość odczynnika wystarcza na 130 200 testów przy załoŝeniu, Ŝe na jeden test zuŝywa się 200 300 µl. Środki ostroŝności 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych uŝytkowników. 2. Produkty EnVision FLEX /HRP, EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) i EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) zawierają materiał pochodzenia zwierzęcego, a biorąc pod uwagę procedury wytwarzania, nie moŝna wykluczyć, Ŝe znajdują się w niej śladowe ilości materiału pochodzenia ludzkiego. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 3. W czasie procedury nie wystawiać odczynnika EnVision FLEX DAB+ Chromogen, EnVision FLEX Substrate Buffer lub EnVision FLEX Substrate Working Solution na działanie silnego światła.

4. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) i EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) zawiera 5-<10% Nonoxinol: H319 H411 P280 Uwaga P273 P264 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P501 Działa draŝniąco na oczy. Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. Unikać uwolnienia do środowiska. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. 5. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) zawiera 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride: H319 H315 P280 Uwaga P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Działa draŝniąco na oczy. Działa draŝniąco na skórę. Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ: Umyć duŝą ilością wody z mydłem. Zdjąć zanieczyszczoną odzieŝ. Wyprać zanieczyszczoną odzieŝ przed ponownym uŝyciem. W przypadku wystąpienia podraŝnienia skóry: Zgłosić się do lekarza po poradę. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę. 6. W przypadku EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent karta charakterystyki substancji niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie uŝytkowników. 7. EnVision FLEX DAB+ Chromogen zawiera 1 5% tetrachlorowodorku 3,3 -diaminobenzydyny i jest oznaczony jako: Niebezpieczeństwo H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P202 Nie uŝywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami.

8. Odczynniki opcjonalne EnVision FLEX Antibody Diluent (nr kat. K8016) zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3 ), w czystej postaci. StęŜenie azydku sodu występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji azydku sodu z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 9. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 10. Niewykorzystany odczynnik naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. Przechowywanie Odczynniki EnVision FLEX i EnVision FLEX+ naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Odczynnik EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat. K8018) przechowywać w temperaturze pokojowej. Nie naleŝy uŝywać odczynników po upływie terminu waŝności podanego na fiolce. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane na ulotce dołączanej do opakowania, UŜytkownik powinien je zweryfikować. Przygotowany roztwór roboczy substratów powinien być przechowywany w miejscu bez dostępu światła w temperaturze 2 8 C, i zuŝyty w ciągu 5 dni. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z produktem, naleŝy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie odczynników A.1 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (DM828, nr kat. K8004) NaleŜy rozcieńczyć roztwór EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) w stosunku 1:50 w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, w ilości wystarczającej do wykonania planowanej procedury. NieuŜywany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. Jeśli aparat Dako PT Link jest uŝywany do obróbki wstępnej, naleŝy przygotować rozcieńczenie, przelewając zawartość fiolki roztworu Target Retrieval Solution (50x) do zbiornika aparatu Dako PT Link i dopełniając wodą destylowaną lub dejonizowaną do linii oznaczenia (Fill Line). W przypadku zmętnienia roztwór nie nadaje się do uŝycia. W przypadku wykorzystania w aparacie PT Link do przygotowania preparatu 3-w-1 i przechowywania w temperaturze pokojowej, rozcieńczonego roztworu moŝna uŝywać 3 razy dziennie przez 5 dni. A.2 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (DM829, nr kat. K8005) NaleŜy rozcieńczyć roztwór EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) w stosunku 1:50 w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, w ilości wystarczającej do wykonania planowanej procedury. Jeśli aparat Dako PT Link jest uŝywany do obróbki wstępnej, naleŝy przygotować rozcieńczenie, przelewając zawartość fiolki roztworu Target Retrieval Solution (50x) do zbiornika aparatu Dako PT Link i dopełniając wodą destylowaną lub dejonizowaną do linii oznaczenia (Fill Line). NieuŜywany rozcieńczony bufor moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia roztwór nie nadaje się do uŝycia. W przypadku wykorzystania w aparacie PT Link do przygotowania preparatu 3-w-1 i przechowywania w temperaturze pokojowej, rozcieńczonego roztworu moŝna uŝywać 3 razy dziennie przez 5 dni. A.3 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (DM831, nr kat. K8007) NaleŜy rozcieńczyć bufor EnVision FLEX Wash Buffer (20x) w stosunku 1:20 w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, w ilości wystarczającej do wykonania planowanej procedury. Rozcieńczyć przez dodanie stęŝonego roztworu buforu do wstępnie odmierzonej ilości wody destylowanej lub dejonizowanej, aby zminimalizować tworzenie piany. Mieszać delikatnie do momentu otrzymania jednorodnego rozcieńczonego roztworu. NieuŜywany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia roztwór nie nadaje się do uŝycia. W przypadku wykorzystania w aparacie PT Link procedury do przygotowania preparatu 3-w-1 i przechowywania w temperaturze pokojowej, rozcieńczonego roztworu moŝna uŝywać 3 razy dziennie przez 5 dni. A.4 EnVision FLEX Substrate Working Solution Roztwór roboczy substratów DAB EnVision FLEX Substrate Working Solution przygotowuje się, dokładnie mieszając 1 kroplę odczynnika EnVision FLEX DAB+ Chromogen (DM827) na 1 ml

odczynnika EnVision FLEX Substrate Buffer (SM823). Roztwór roboczy substratów EnVision FLEX Substrate Working Solution naleŝy zuŝyć w ciągu 5 dni (przechowywać bez dostępu światła, w temperaturze 2 8 C). Pobieranie i przygotowanie próbek Próbki mogą mieć postać skrawków utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Czas utrwalania zaleŝy od substancji utrwalającej i typu/grubości tkanki. Na przykład bloczki preparatów o grubości 3 4 mm naleŝy utrwalać w obojętnej zbuforowanej formalinie przez okres 18 24 godzin. Optymalna grubość skrawków zatopionych w parafinie wynosi około 4 µm. Próbki naleŝy zatapiać na szkiełkach mikroskopowych, np. FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Próbki powinny być umieszczone na szkiełkach maksymalnie płasko i bez fałdowania. Zbyt duŝe pofałdowanie będzie miało wpływ na wynik odczynu. UWAGA: NaleŜy uŝywać szkiełek mikroskopowych o szerokości odpowiedniej dla aparatu Dako Autostainer/Autostainer Plus. Informacje na temat wymaganych parametrów szkiełek mikroskopowych moŝna znaleźć w instrukcji obsługi uŝywanego aparatu Dako. Skrawki parafinowe naleŝy zatapiać z podgrzanej łaźni wodnej z wodą destylowaną lub dejonizowaną. Łaźnia wodna nie powinna zawierać Ŝadnych dodatków (takich jak Ŝelatyna, poli-l-lizyna itp.). Skrawki powinny być suszone przez ogrzewanie, zasadniczo w temperaturze nieprzekraczającej 60 C przez co najmniej 60 minut. Aby zapewnić właściwe przyleganie skrawków do szkiełek, waŝne jest osuszenie wody spod skrawków przed rozpoczęciem suszenia. Procedura W automatach Dako Autostainer/Autostainer Plus stosowane są róŝne techniki umoŝliwiające uzyskanie optymalnych wyników barwienia. Przed uŝyciem wybranego protokołu w automacie Dako Autostainer/Autostainer Plus naleŝy dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi tego automatu Dako. W celu zapewnienia powtarzalności odmaskowywania epitopu zaleca się kaŝdorazowo wypełniać uchwyt na szkiełka szkiełkami mikroskopowymi. UmoŜliwia to jednakowe ogrzewanie sekcji w poszczególnych przebiegach. A. Obróbka wstępna Zalecana procedura przygotowania preparatu 3-w-1 przy uŝyciu aparatu PT Link: Odparafinowanie, ponowne nawodnienie i cieplne odmaskowanie epitopu (HIER) moŝna wykonać na utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkankowych przy uŝyciu procedury 3-w-1: 1. Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając koncentrat EnVision FLEX Target Retrieval Solution wodą destylowaną lub dejonizowaną w proporcji 1:50. 2. Wypełnić zbiorniki aparatu PT Link odpowiednią ilością (1,5 L) roztworu roboczego, tak aby zakrył on skrawki tkankowe. 3. Ustawić w aparacie PT Link wstępne podgrzewanie roztworu w temp. 65 C. 4. Zanurzyć zamocowane, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie preparaty tkankowe we wstępnie podgrzanym roztworze EnVision FLEX Target Retrieval Solution (roztworze roboczym) w zbiornikach aparatu PT Link, a następnie inkubować przez 20 40 minut w temperaturze 97 C. Określenie optymalnego czasu inkubacji naleŝy do uŝytkownika. 5. Pozostawić preparaty w aparacie PT Link, dopóki temperatura nie opadnie do 65 C. 6. Usunąć statywy na szkiełka ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX FLEX Wash Buffer (20x) o temperaturze pokojowej. 7. Przez 1 5 minut trzymać szkiełka w rozcieńczonym buforze EnVision FLEX Wash Buffer (20x) o temperaturze pokojowej. 8. Umieścić szkiełka na aparacie Dako Autostainer/Autostainer Plus i przeprowadzić barwienie. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury barwienia immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. 9. Po zabarwieniu zaleca się przeprowadzenie odwodnienia, oczyszczenia oraz trwałego zatopienia.

UWAGA: Jeśli w aparacie PT Link stosowana jest procedura przygotowywania preparatów 3-w-1, a roztwory przechowywane są w temperaturze pokojowej, rozcieńczony roztwór Target Retrieval Solution i rozcieńczony bufor Wash Buffer mogą być uŝyte 3-krotnie w ciągu 5 dni. Procedura HIER przy uŝyciu aparatu PT Link: Po odparafinowaniu i nawodnieniu buforem (wodą) skrawki tkankowe powinny być poddane cieplnemu odmaskowaniu epitopu (HIER): 1. Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając koncentrat EnVision FLEX Target Retrieval Solution (50x) wodą destylowaną lub dejonizowaną w proporcji 1:50. 2. Wypełnić zbiorniki aparatu PT Link odpowiednią ilością (1,5 L) roztworu roboczego, tak aby zakrył on skrawki tkankowe. 3. Ustawić w aparacie PT Link wstępne podgrzewanie roztworu w temp. 65 C. 4. Ręcznie odparafinować i ponownie nawodnić skrawki tkankowe osadzone na szkiełkach. W celu uzyskania lepszego przylegania tkanki do szkiełka zaleca się stosowanie szkiełek powlekanych sylanizowanych. 5. Zanurzyć preparaty tkankowe o temperaturze pokojowej we wstępnie podgrzanym roztworze EnVision FLEX Target Retrieval Solution (roztworze roboczym), a następnie inkubować przez 20 40 minut w temperaturze 97 C. Określenie optymalnego czasu inkubacji naleŝy do uŝytkownika. 6. Pozostawić preparaty w aparacie PT Link, dopóki temperatura nie opadnie do 65 C. 7. Usunąć statywy na szkiełka ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) o temperaturze pokojowej. 8. Przez 1 5 minut trzymać szkiełka w rozcieńczonym buforze EnVision FLEX Wash Buffer (20x) o temperaturze pokojowej. 9. Umieścić szkiełka na aparacie Dako Autostainer/Autostainer Plus i przeprowadzić barwienie. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury barwienia immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. 10. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŝy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania. UWAGA: Jeśli w aparacie PT Link stosowana jest procedura HIER, a roztwory przechowywane są w temperaturze pokojowej, rozcieńczony roztwór Target Retrieval Solution i rozcieńczony bufor Wash Buffer mogą być uŝyte 3-krotnie w ciągu 5 dni. Procedura HIER przy uŝyciu naczyń Coplin: Po odparafinowaniu i nawodnieniu buforem (wodą) skrawki tkankowe powinny być poddane cieplnemu odmaskowaniu epitopu (HIER): 1. Umieścić naczynia do barwienia z rozcieńczonym roztworem EnVision FLEX Target Retrieval Solution (50x) w łaźni wodnej. 2. Doprowadzić łaźnię wodną i naczynia z roztworem EnVision FLEX Target Retrieval Solution (roztworze roboczym) do temperatury 95 99 C. Osłonić naczynia pokrywkami w celu ustabilizowania temperatury i eliminacji parowania. 3. Zanurzyć skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym roztworze EnVision FLEX Target Retrieval Solution (roztworze roboczym) znajdującym się w naczyniach do barwienia. 4. Ponownie podnieść temperaturę łaźni wodnej z roztworem EnVision FLEX Target Retrieval Solution do 95 99 C. Inkubować przez 20 (±1) minut w temperaturze 95 99 C. 5. Wyjąć całe naczynie zawierające preparaty z łaźni wodnej. Odczekać 20 (±1) minut w temperaturze pokojowej, dopóki nie nastąpi schłodzenie w roztworze EnVision FLEX Target Retrieval Solution. 6. Przelać roztwór EnVision FLEX Target Retrieval Solution i przepłukać w ciągu 1 5 minut skrawki rozcieńczonym buforem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) o temperaturze pokojowej. 7. Umieścić statyw z wypłukanymi skrawkami w aparacie Dako Autostainer/Autostainer Plus. Niezwłocznie rozpocząć zaprogramowany cykl barwienia. UWAGA: Jeśli w naczyniach Coplin stosowana jest procedura HIER, rozcieńczony roztwór Target Retrieval Solution i rozcieńczony bufor Wash Buffer moŝe być uŝyty tylko jeden raz.

Niektóre, nieliczne epitopy nie są odporne na cieplne odmaskowanie (HIER), a niektóre wymagają wstępnego trawienia enzymatycznego. Odpowiednie instrukcje moŝna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania uŝywanych przeciwciał pierwotnych Dako. W trakcie przygotowywania i procedury barwienia immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). B. Procedura barwienia Przeciwciała pierwotne Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies mogą być uŝywane z systemem detekcji Dako EnVision FLEX+ do skrawków tkanek utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie. Instrukcja rozcieńczania stęŝonych przeciwciał pierwotnych Dako znajduje się w ulotce dołączonej do opakowania przeciwciał. StęŜone przeciwciała pierwotne moŝna rozcieńczać w odczynniku EnVision FLEX Antibody Diluent (DM830, nr kat. K8006). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako Autostainer/Autostainer Plus przy uŝyciu następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEX_200 (200 µl dozowanych odczynników) lub FLEX_300 (300 µl dozowanych odczynników) Programy automatyczne dla cykli barwienia: FLEX (Protokół FLEX) FLEX_Mo (Protokół FLEX+ Mouse (LINKER)) FLEX_Rb (Protokół FLEX+ Rabbit (LINKER)) W programach barwienia przy 10 szkiełek etap Auxiliary naleŝy ustawić na rinse buffer. Przy programach z 10 szkiełek dla etapu Auxiliary naleŝy wybrać ustawienie none. Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŝy równieŝ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Więcej informacji moŝna znaleźć w podręczniku uŝytkownika odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŝywanym aparacie Dako Autostainer/Autostainer Plus, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Optymalne czasy inkubacji przeciwciał pierwotnych i odczynników EnVision FLEX /HRP zaleŝą od rodzaju zastosowanych przeciwciał pierwotnych. Odpowiednie instrukcje moŝna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania uŝywanych przeciwciał pierwotnych Dako. UŜytkownik musi zweryfikować stosowany protokół. Po zakończeniu procedury wykonania odczynu próbki naleŝy zatopić. Jeśli szkiełka przygotowano przy uŝyciu procedury przygotowania preparatu 3-w-1, zaleca się przeprowadzenie odwodnienia, oczyszczania oraz trwałego zatapiania. Szkiełka przygotowane za pomocą procedury HIER moŝna zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania. W celu zatapiania przy uŝyciu środka rozpuszczalnego w wodzie zaleca się stosowanie preparatów Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563) lub Faramount Aqueous Mounting Medium (nr kat. S3025). Kontrola jakości W kaŝdej serii odczynów naleŝy uwzględnić jedną dodatnią próbkę kontrolną, co pozwoli potwierdzić prawidłowe działanie wszystkich zastosowanych odczynników. JeŜeli za pomocą kontroli dodatniej nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu, naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów badanych są niewaŝne. Do kaŝdej próbki naleŝy zastosować odczynnik kontroli ujemnej w celu wykrycia ewentualnego odczynu nieswoistego. Jeśli nie jest moŝliwe jednoznaczne odróŝnienie odczynu nieswoistego od swoistego, naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów badanych są niewaŝne. Interpretacja wyników Roztwór roboczy substratów zawierający diaminobenzydynę powoduje brązowe zabarwienie w miejscach występowania wykrywanych antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała pierwotne. Brązowe zabarwienie powinno być widoczne w dodatniej próbce kontrolnej w oczekiwanych miejscach występowania wykrywanego antygenu. Jeśli dojdzie do powstania odczynu nieswoistego, moŝna

będzie go rozpoznać jako rozmyte, brązowe odczyny na szkiełkach poddanych działaniu odczynnika kontroli ujemnej. Jądra komórkowe w barwieniu kontrastowym hematoksyliną barwią się na niebiesko. Ograniczenia metody 1. Wyłącznie do automatycznego uŝycia w aparatach Dako Autostainer. Podczas przeprowadzania ręcznego oznaczania odczynu optymalna procedura powinna zostać ustalona i zweryfikowana przez uŝytkownika, jeśli nie określono w ulotce dołączonej do opakowania danego przeciwciała pierwotnego Dako. 2. Stosować do skrawków utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Podczas uŝywania zamroŝonych skrawków lub utrwalonych rozmazach cytologicznych optymalna procedura powinna zostać ustalona i zweryfikowana przez uŝytkownika, jeśli nie określono w ulotce dołączonej do opakowania danego przeciwciała pierwotnego Dako. Zmiany w procedurach mogą mieć wpływ na liczbę testów dostarczonych z zestawem. Objaśnienie symboli Nume r katalog owy Te mpera tu ra przechowywania ZuŜyć przed Piktogram GHS (d ział środki ostroŝności) Wyr ób medyczny d o diagnostyki in vitro Za wartość wystarcza na <n> testów Producent Spraw dzić w in strukcji stosowa nia Numer serii Piktogram GHS (dział środ ki ostroŝności) Systemy Dako EnVision są chronione patentem USA nr 5,543,332 i patentem europejskim nr 594,772. Producent: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Faks+45 44 85 95 95