SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI ZADANIA z wykonania badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w 2013 roku

... (pieczęć) SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI ZADANIA z wykonania badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w 2013 roku 1. Nr decyzji MRiRW: HOR hn 801-5/13 zadanie nr 24 2. Nazwa tematu: Badania nad zdolnością do androgenezy u różnych genotypów żyta 3. Podmiot realizujący temat: Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 28, 60-637 Poznań 4. Wydział/Pracownia/ Pracownie: Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Zakład Genetyki Roślin 5. Kierownik tematu (zgodnie z kartą tematu): prof. Zbigniew Broda Wykonawcy: dr inż. Sylwia Mikołajczyk, dr inż. Dorota Weigt, mgr Grażyna Dominiczak 6. Informacja o realizacji prac w roku 2013 a) Materiały i metody: Materiał roślinny androgeneza: Przedmiotem badań było 30 genotypów żyta. Wszystkie badane genotypy charakteryzowały się diploidalną liczbą chromosomów i były formami ozimymi. Zestawienie badanych genotypów znajduje się w tabeli 1. Tabela 1. Wykaz genotypów, z których izolowano pylniki w celu indukowania androgenezy i otrzymania roślin DH. L.p. Danko Hodowla Roślin Sp. z o.o. Poznańska Hodowla Roślin Sp. z o.o. 1. S1150/12 PHR1 2. S1157/12 PHR2 3. S1158/12 PHR3 4. S1159/12 PHR4 5. S1178/12 PHR5 6. S1188/12 PHR6 7. S1194/12 PHR7 8. 562/12 PHR8 9. 563/12 PHR9

10. 567/12 PHR10 11. 569/12 PHR11 12. 571/12 PHR12 13. 572/12 PHR13 14. 580/12 PHR14 15. 598/12 PHR15 Materiał roślinny krzyżowanie oddalone: Przedmiotem badań w krzyżowaniach oddalonych z kukurydzą były rośliny żyta z 6 linii męskosterylnych (SIN 2, CSIN 343, CSIN 346, NSIN 216, NSIN 217, NSIN 223). Jako zapylacze wykorzystano 3 odmiany kukurydzy: dwie cukrowe Gucio i Wazę, jedną pastewną Wilga (FAO 180), która jest najwcześniejszą z polskich odmian mieszańcowych. Metodyka androgeneza (kultura pylników in vitro): Wzrost roślin donorowych do kultur pylników odbywał się w ogrodzie doświadczalnym Katedry Genetyki i Hodowli Roślin Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. Po osiągnięciu odpowiedniej fazy rozwojowej kłosy z mikrosporami w stadium jednojądrowym ścinano i traktowano temperaturą 4 o C po uprzednim zanurzeniu w wodzie destylowanej. Stadium rozwojowe mikrospor sprawdzano za pomocą preparatów rozgniatanych barwionych metodą acetokarminową. Pylniki zawierające potencjalnie embriogenne mikrospory były długości 8 12 mm oraz charakteryzowały się zielonym lub jasnozielonym zabarwieniem. Losowo wybrane kwiatostany badanych roślin zawierające mikrospory w fazie późnojednojądrowej odkażano powierzchniowo 70% alkoholem etylowym i 6% podchlorynem sodu (NaClO), a następnie płukano w dużej ilości wody sterylnej destylowanej. Z kłosów izolowano pylniki i umieszczano w płytkach Petriego o średnicy 10 cm, zawierających 25 ml pożywki C17 z dodatkiem 2 mg/l 2,4-D oraz C17 z dodatkiem 1mg/l 2,4-D i 1mg/l dikamby (Wang i Chen, 1983) i 190-2 z dodatkiem 2 mg/l 2,4-D (Xingzhi i Han, 1984) do indukcji androgenezy. W każdej szalce umieszczano około 100 pylników pochodzących z jednego kłosa. Dla każdego z 30 badanych genotypów wyłożono pylniki z 15 kłosów. Założone kultury pylnikowe prowadzono w ciemności, w temperaturze 26 o C 28 o C przez 8 12 tygodni w celu indukowania procesu androgenezy. Otrzymane po ośmiu tygodniach prowadzenia kultur pylników struktury kalusowe przenoszono na pożywki: MS (Murashige i Skoog, 1962), MS z dodatkiem 0,5 mg/l kinetyny (Murashige i Skoog, 1962). Kalusy inkubowano w temperaturze 26 o C i 16 godzinnym fotoperiodzie przekładając na świeżą pożywkę regeneracyjną co 21 dni.

Metodyka androgeneza (kultura mikrospor in vitro): Kłosy roślin donorowych dla kultur izolowanych mikrospor traktowano podobnie jak materiał roślinny wykorzystany do zakładania kultur pylnikowych. Z wysterylizowanych kłosów ekstrahowano do sterylnego moździerza poszczególne kłoski usuwając ości. Na 1 płytkę Petriego o średnicy 55mm pobierano pylniki z 25 kłosków, co pozwalało otrzymać końcową koncentrację mikrospor 3,5 5,5x10 5 w 1 ml pożywki. Następnie materiał roślinny zalewano 0,2 M mannitolem o temperaturze 4 o C. Kłoski delikatnie rozcierano w celu uwolnienia mikrospor z pylników. Roztarte w 0,2 M roztworze mannitolu tkanki przesączano przez sterylny filtr nylonowy o średnicy porów 80μm. Moździerz przepłukiwano taką ilością 0,2M mannitolu, aby otrzymać 15ml przesączu. Sterylne probówki zawierające przesącz wirowano w wirówce o obrotach 900 1000 RPMS przez 5 minut. Supernatant usuwano sterylną pipetą pasterowską, a osad zalewano świeżym roztworem 0,2 M mannitolu o temperaturze 4 o C i ponownie wirowano. Procedurę powtarzano trzykrotnie do otrzymania klarownego roztworu. Zawartość probówki zawieszano w 50 ml pożywki służącej do indukowania androgenezy (190-2, Xingzhi i Han, 1984) i otrzymaną zawiesinę mikrospor rozlewano do 10 płytek Petriego o średnicy 55 mm po 5 ml. Płytki zamykano szczelnie parafilmem i umieszczano w ciemności na wytrząsarce o 100 obrotach/minutę. Kultury inkubowano w temperaturze 27 o C przez 7 dni. Obserwacje mikrospor prowadzono bezpośrednio po izolacji, aby ocenić żywotność i odsetek mikrospor uszkodzonych oraz 3 dnia od założenia kultur, aby stwierdzić występowanie pierwszych podziałów mitotycznych. Żywotność mikrospor zbadano z wykorzystaniem mikroskopu optycznego, w 10 polach widzenia, przy powiększeniu 100x. Ocenę mikrospor po trzech dniach inkubacji na pożywce 190-2 przeprowadzono z zastosowaniem mikroskopu odwróconego w 10 polach widzenia i 7krotnym powiększeniu (okular 10 x obiektyw 0,7). Metodyka krzyżowanie oddalone (kultura zarodków in vitro): Wzrost roślin odbywał się w warunkach szklarniowych. Z każdej z 6 linii męskosterylnych żyta przygotowano minimum 15 kłosów do krzyżowań oddalonych oraz po 6 roślin z trzech odmian kukurydzy. Kłosy żyta izolowano izolatorami tomofanowymi umożliwiającymi obserwację dojrzewania znamion. Po osiągnięciu odpowiedniej fazy rozwojowej na przygotowane kwiatostany nanoszono pędzelkiem pyłek kukurydzy i ponownie izolowano. Przed naniesieniem ziaren pyłku kukurydzy na znamiona żyta sprawdzano jego żywotność stosując barwienie płynem Bellinga (acetokarmin z dodatkiem gliceryny). Następnego dnia po zapyleniu roślin z 6 linii męskosterylnych żyta wstrzykiwano do dokłosia oraz nanoszono na zalążnie kroplę wodnego roztworu dikamby w stężeniu 75 mg/l o ph 5,5. Po 14-21 dniach zapylone pyłkiem kukurydzy kłosy z widocznymi niedojrzałymi ziarniakami ścinano i umieszczano na 48 godzin w temperaturze 4 o C. Następnie niedojrzałe ziarniaki odkażano powierzchniowo w 70% roztworze etanolu 30 sekund i w 6% roztworze podchlorynu sodu 3 minuty. Materiał roślinny płukano trzykrotnie w dużej ilości sterylnej wody destylowanej. Z ziarniaków preparowano pod mikroskopem stereoskopowym zarodki i

umieszczano na pożywce zmodyfikowanej pożywce MS z dodatkiem 50.000 mg/l sacharozy i 2mg/l 2,4-D (Murashige i Skoog, 1962). Kultury zarodków prowadzono wg metodyki Wędzony (2003). Z powodu niskiej efektywności kultur zarodkowych sprawdzono każdorazowo, tuż przed zapyleniem, żywotność ziaren pyłku 3 odmian kukurydzy oraz przeprowadzono dla każdej kombinacji obserwacje kiełowania łagiewek pyłkowych ziaren pyłku kukurydzy na znamionach 6 linii męskosterylnych żyta. Materiał roślinny do analiz pobierano po 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 godzinach od zapylenia oraz utrwalano w etanolu absolutnym, chloroformie i kwasie octowym lodowatym (6 : 3 : 1), następnie przechowywano w 70% etanolu w temperaturze 4 o C. Kiełkowanie ziaren pyłku kukurydzy obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym po wybarwieniu błękitem anilinowym. b) Szczegółowe omówienie wykonanych prac i uzyskanych wyników (łącznie dla wszystkich Pracowni realizujących temat). Androgeneza kultury pylnikowe: W trakcie realizacji zadania wyłożono w sumie 49.402 pylniki, w tym 23.426 z puli materiałow PHR i 25.976 z genotypów DANKO. Liczba wyłożonych pylników mieściła się z zakresie od 380 szt. (562/12) do 957 szt. (S1194/12). Liczby pylników poddanych kulturze na 3 pożywkach indukujących androgenezę przedstawiono dla poszczególnych genotypów na wykresie 1 i 2. Wykres 1. Liczba pylników poddanych kulturze in vitro z genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z Poznańskiej Hodowli Roślin Sp. z o.o. w Tulcach k/poznania.

Wykres 2. Liczba pylników poddanych kulturze in vitro z genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z DANKO H.R. Sp.z o.o. w Choryni. Przed założeniem kultur kłosy poddano stresowi termicznemu działaniu temperaturą 4 o C, które polegało na przechowywaniu ściętych kłosów w wiadrach z wodą destylowaną z w chłodni. Średni czas działania temperatury dla genotypów z PHR wynosił 16,9 dnia, a dla linii pochodzących z DANKO 22,2 dnia. Średni czas przechowywania kłosów wynosił od 11,8 dnia do 31 dni. Najkrócej przechowywano w chłodni kłosy genotypu PHR 14 średnio 1 dzień, a najdłużej PHR 13 średnio 42 dni. Czas przechowywania kłosów w chłodni dla 30 badanych genotypów przedstawiono na wykresach 3 i 4. Wykres 3. Średni czas przechowywania kłosów w temperaturze 4 o C (w dniach) z genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z Poznańskiej Hodowli Roślin Sp. z o.o. w Tulcach k/poznania.

Wykres 4. Średni czas przechowywania kłosów w temperaturze 4 o C (w dniach) z genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z DANKO H.R. Sp.z o.o. w Choryni. Obserwacje kultur pylnikowych prowadzono od 8 do 12 tygodnia inkubacji kultur. Indukcję kalusa zaobserwowano dla wszystkich 30 testowanych genotypów. Najwyższą efektywność tworzenia kalusa zaobserwowano dla pylników z genotypów PHR3 (147 kalusów), PHR1 (63 kalusy) i PHR5 (49 kalusów) oraz 572/12 (176 kalusów) i S1194/12 (119 kalusów). Kultury pylnikowe zakładano na trzech pożywkach indukujących androgenezę (C17 + 2,4-D, C17 + 2,4-D + dikamba, 190-2 + 2,4-D). Dla genotypów PHR najwyższą efektywność indukcji androgenezy zobserwowano na pożywce 190-2 + 2,4-D 256 kalusów/536 otrzymanych ogółem, na pożywce C17 + 2,4-D 139 kalusów/536 otrzymanych, C17 + 2,4-D + dikamba 141 kalusów/536 otrzymanych. Dla genotypów z Danko HR nie stwierdzono tak silnego zróżnicowania pożywek indukujących androgenezę, a liczba kalusów przedstawiała się następująco: pożywka C17 + 2,4-D 454 kalusy/1327 otrzymanych, C17 + 2,4-D + dikamba 453 kalusy/1327 otrzymanych, 190-2 + 2,4-D 420 kalusów/1327 otrzymanych. W trakcie realizacji zadania stwierdzono, że badane w kulturze pylników genotypy posiadają zróznicowane zdolności do androgenezy od form o bardzo niskiej efektywności indukcji androgenezy (PHR11, PHR12, S1150/12, S1157/12) do odpowiadajacych tworzeniem bardzo licznych kalusów i struktur zarodkopodobnych (PHR3, PHR1, 572/12, S1194/12). Porównanie efektywności indukcji androgenezy dla badanych 30 genotypów żyta na trzech pożywkach przedstawiono na wykresach 5 i 6.

Wykres 5. Liczba kalusów na trzech pożywkach w kulturze pylników 15 badanych genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z Poznańskiej Hodowli Roślin Sp. z o.o. w Tulcach k/poznania. Wykres 6. Liczba kalusów na trzech pożywkach w kulturze pylników 15 badanych genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z DANKO H.R. Sp.z o.o. w Choryni. Kalusy otrzymane na pożywce indukującej androgenezę przenoszono na dwie pożywki regeneracyjne MS+0,5 mg/l kinetyny i MS. Powstające roślinki pasażowano na pożywkę MS w kolbach Erlenmayera gdzie dalej rosły i ukorzeniały się. Obecnie rośliny są w fazie ukorzenia się w doniczkach i przed jaryzacją. Zaobserwowano także, że wysoka efektywność tworzenia kalusa

nie skutkuje wysokim odsetkiem regeneracji roślin. W bieżącym roku sprawozdawczym otrzymano 74 zielone regeneranty dla 9 z 30 testowanych genotypów żyta (47,14% regenerantów). W porównaniu z 2012 rokiem, w bieżącym roku sprawozdawczym, liczba zregenerowanych roślin była wyższa o 61 roślin. Rośliny zielone otrzymano z jednego genotypu z Poznańskiej Hodowli Roślin PHR5 (2 rośliny). Dla genotypów pochodzących z Danko HR regenerację roślin zielonych zaobserwowanoa dla 8 z 15 testowanych genotypów, a najwyższą liczbę roślin otrzymano dla S11S1188/12 26 roślin i 572/12 19 roślin. Rośliny zielone najliczniej regenerowały ze struktur kalusowych otrzymanych na pożywce C17 z dodatkiem 2,4- D i dikamby. Zaobserwowano także regenerację licznych roślin albinotycznych w sumie 83 rośliny (52,86% regenerantów). Wykres 7. Efektywność regeneracji roślin z kalusa otrzymanego na trzech pożywkach w kulturze pylników 15 badanych genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z Poznańskiej Hodowli Roślin Sp. z o.o. w Tulcach k/poznania.

Wykres 87. Efektywność regeneracji roślin z kalusa otrzymanego na trzech pożywkach w kulturze pylników 15 badanych genotypów żyta (Secale cereale L.) pochodzących z DANKO H.R. Sp.z o.o. w Choryni. Analiza ploidalności regenerantów za pomocą cytometru przepływowego Poziom ploidalności regenerantów (zawartość genomowego DNA) w bieżącym roku sprawozdawczym wynosił 1C (haploidy) 18,75% regenerantów, 2C (diploidy) 76,56% regenerantów, 4C (tetraploidy) 4,69% regenerantów. Androgeneza kultury izolowanych mikrospor: W bieżącym roku sprawozdawczym analizowano wpływ pożywki indukującej androgenezę na kultury izolowanych mikrospor żyta. Dla prowadzenia kultur izolowanych mikrospor zastosowano pożywkę 190-2. W trakcie przeprowadzania obserwacji kultur nie stwierdzono podziałów mikrospor w pierwszych siedmiu dniach inkubacji. Kultury te okazały się nieefektywne dla procesu indukcji androgenezy. Najwyższy odsetek zamierających mikrospor zaobserwowano dla genotypów: 590/12 15,1% oraz PHR8 12%. Genotypami dla których procent nieżywotnych mikrospor był najniższy były: 598/12 8,2% i PHR1 7,3. W tabeli 2 przedstawiono wyniki obserwacji kultur mikrospor badanych genotypów żyta po 7 dniach inkubacji na pożywce 190-2 Tabela 2. Wykaz genotypów, z których izolowano mikrospory w celu indukowania androgenezy. L.p. Genotyp Mikrospory niereagujące Mikrospory zamierające Genotyp Mikrospory niereagujące Mikrospory zamierające [%] [%] 1. S1150/12 90,0 10,0 PHR1 92,7 7,3 [%] [%]

2. S1157/12 89,2 10,8 PHR2 91,5 8,5 3. S1158/12 91,1 8,9 PHR3 92,1 7,9 4. S1159/12 89,7 10,3 PHR4 92,3 7,7 5. S1178/12 90,3 9,7 PHR5 90,3 9,7 6. S1188/12 88,5 11,5 PHR6 90,8 9,2 7. S1194/12 89,6 10,4 PHR7 90,5 9,5 8. 562/12 88,9 11,1 PHR8 88,0 12,0 9. 563/12 91,5 8,5 PHR9 89,9 10,1 10. 567/12 90,9 9,1 PHR10 89,7 10,3 11. 569/12 89,2 10,8 PHR11 89,2 10,8 12. 571/12 88,9 11,1 PHR12 89,0 11,0 13. 572/12 91,3 8,7 PHR13 88,5 11,5 14. 580/12 84,9 15,1 PHR14 89,9 10,1 15. 598/12 91,8 8,2 PHR15 88,8 11,2 Krzyżowanie oddalone: Z każdej z 6 linii męsko sterylnych żyta zapylaniu pyłkiem kukurydzy poddano 5 roślin (zależnie od liczby źdźbeł zapylono 3 do 5 kłosów). Żywotność ziaren pyłku 3 odmian kukurydzy wyniosła odpowiednio: Gucio 96,2%, Waza 99,1%, Wilga 96,9% (średnia dla 6 roślin). Tabela 3. Średnia liczba ziaren pyłku kukurydzy zaobserwowana na znamionach linii męskosterylnych żyta Linia męskosterylna żyta zapylacz odmiana Gucio średnia liczba ziaren pyłku na znamieniu 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h SIN2 6,3 4,7 5,4 4,7 4,1 3,7 3,3 CSIN 343 3,9 3,8 4,6 5,2 4,5 4,0 3,7 CSIN 346 1,0 1,4 1,2 1,4 1,3 1,2 1,1 NSIN 216 0,7 0,8 1,0 0,9 1,1 1,1 1,8 NSIN 217 0,2 0,4 0,4 0,7 0,6 0,6 0,8 NSIN 223 1,6 1,5 1,2 1,4 1,5 1,4 1,3 Linia męskosterylna żyta zapylacz odmiana Waza średnia liczba ziaren pyłku na znamieniu

2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h SIN2 1,6 1,5 1,2 1,4 1,5 1,4 1,3 CSIN 343 1,1 0,7 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 CSIN 346 0,7 0,4 1,0 0,9 1,0 0,9 0,9 NSIN 216 0,6 0,8 0,8 0,8 1,0 0,9 0,9 NSIN 217 0,6 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 NSIN 223 2,3 1,5 1,4 1,2 1,3 0,6 1,5 Linia męsko- zapylacz sterylna żyta odmiana Wilga średnia liczba ziaren pyłku na znamieniu 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h SIN2 3,2 2,0 2,0 2,7 2,6 2,5 4,3 CSIN 343 2,0 2,3 1,7 3,2 4,0 5,8 6,6 CSIN 346 3,1 2,1 1,5 1,5 1,7 1,7 1,9 NSIN 216 0,8 1,8 2,3 2,0 2,1 1,9 2,5 NSIN 217 1,0 1,1 3,0 1,4 1,2 1,4 1,2 NSIN 223 1,3 0,8 0,7 0,8 0,9 1,1 1,4 Tabela 4. Średnia liczba kiełkujących łagiewek pyłkowych kukurydzy zaobserwowana na znamionach linii męskosterylnych żyta Linia męskosterylna żyta zapylacz odmiana Gucio średnia liczba kiełkujących łagiewek pyłkowych na znamieniu 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h SIN2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 CSIN 343 1,7 1,8 2,4 2,7 2,3 2,0 1,8 CSIN 346 0,1 0,05 0,03 0,02 0,04 0,05 0,05 NSIN 216 0,0 0,0 0,06 0,07 0,05 0,06 0,06 NSIN 217 0,0 0,0 0,0 0,04 0,03 0,03 0,02 NSIN 223 0,2 0,6 0,4 0,6 0,4 0,4 0,3 Linia męsko- zapylacz sterylna żyta odmiana Waza średnia liczba kiełkujących łagiewek pyłkowych na znamieniu 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h SIN2 0,2 0,6 0,4 0,6 0,4 0,4 0,3 CSIN 343 0,1 0,05 0,03 0,09 0,07 0,1 0,1 CSIN 346 0,1 0,05 0,6 0,4 0,6 0,5 0,6 NSIN 216 0,1 0,1 0,1 0,2 0,5 0,4 0,5 NSIN 217 0,0 0,09 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 NSIN 223 0,7 0,1 0,3 0,0 0,0 0,3 1,1

Linia męskosterylna żyta zapylacz odmiana Wilga średnia liczba kiełkujących łagiewek pyłkowych na znamieniu 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h SIN2 0,4 0,2 0,2 0,4 0,5 0,4 1,7 CSIN 343 1,5 1,9 1,4 2,9 3,5 4,9 5,8 CSIN 346 1,5 1,2 0,9 1,0 1,2 1,2 1,5 NSIN 216 0,2 0,3 1,0 0,8 1,1 1,0 1,7 NSIN 217 0,0 0,3 1,4 0,7 0,8 0,8 0,6 NSIN 223 0,0 0,1 0,1 0,2 0,4 0,4 0,7 Pyłkiem kukurydzy zapylono ogółem 3316 kwiatków żyta. W wyniku zapylenia pyłkiem kukurydzy otrzymano łącznie 50 zarodków, które sporadycznie osiągały stadium rozwojowe umożliwiające wykładanie na pożywki regeneracyjne. Zarodki obumierały pomiędzy 8 12 dniem od zapylenia, co uniemożliwiało ich wykładanie na pożywki. Nieliczne zarodki, które osiągnęły stadium prazarodka, przenoszono do warunków in vitro. Na podstawie wstępnego rozpoznania metodycznego stwierdzono, że wykorzystane odmiany kukurydzy posiadały podobną efektywność zapylania dla każdej z nich otrzymano kilkanaście prazarodków (od 14 dla odmiany Gucio do 19 dla odmiany Waza) Linia zapylacz kukurydza męsko- odmiana Gucio odmiana Waza odmiana Wilga sterylna żyta liczba kwiatków liczba zarodków liczba roślin liczba kwiatków liczba zarodków liczba roślin liczba kwiatków liczba zarodków liczba roślin SIN2 164 4 0 214 6 0 194 4 0 CSIN 343 146 5 0 224 2 0 164 2 0 CSIN 346 194 2 0 204 3 0 184 3 0 NSIN 216 196 3 0 184 1 0 166 2 0 NSIN 217 166 1 0 196 6 0 186 4 0 NSIN 223 194 2 0 176 3 0 164 2 0 Razem: 1060 14 0 1198 19 0 1058 17 0 Celem badań jest: określenie wybranych czynników decydujących o efektywności regeneracji roślin w kulturach pylników i izolowanych mikrospor żyta. W związku z szerokim rozpoznaniem procesu androgenezy żyta oraz występującymi nadal ograniczeniami w efektywności haploidyzacji tego gatunku w bieżącym roku sprawozdawczym badania realizowano w kulturach pylników, izolowanych mikrospor żyta oraz krzyżowaniach oddalonych żyto x kukurydza (kukurydza jako induktor embriogenezy haploidalnej).

W trakcie realizacji tematu w bieżącym roku sprawozdawczym (2013) przeprowadzona została ocena zdolności do androgenezy w powierzonych materiałach hodowlanych (30 genotypów żyta) oraz oceniono możliwość wykorzystania krzyżowań z kukurydzą w celu haploidyzacji żyta dla 6 linii męskosterylnych. W bieżącym roku realizacji zadania zakres prac dotyczących androgenezy poszerzono o testowanie 3 pożywek indukujących androgenezę (tworzenie struktur kalusowych z wyłożonych pylników oraz indukowanie androgenezy w kulturach izolowanych mikrospor). Celem krzyżowania oddalonego jest w tym przypadku uzyskanie haploidów o gametycznej liczbie chromosomów. Gatunek, który jest zapylaczem indukuje embriogeneze haploidalną i otrzymanie roślin haploidalnych. Biorąc pod uwagę przesłanki metodyczne oraz genotypowe uwarunkowania zdolności do regeneracji haploidów ważnym elementem postępu badań nad haploidyzacją żyta, jest zaplanowane w bieżącym roku realizacji tematu, poszerzenie zakresu prac o obserwacje kiełkowania łagiewek pyłkowych ziaren pyłku kukurydzy na znamionach 6 linii męskosterylnych żyta. Krzyżowanie międzygatunkowe Secale cereale L. ssp. cereale x Zea mays L. oraz eliminacja chromosomów u mieszańców mają za zadanie zwiększenie wskaźnika frekwencji uzyskanych haploidów żyta szczególnie dla genotypów opornych na haploidyzację drogą androgenezy w kulturze pylników. W bieżcym roku realizacji zadania zakres prac poszerzono o obserwacje procesu zapylenia i zapłodnienia testowanych 6 linii męskosterylnych żyta i 3 odmian kukurydzy ponieważ w poprzednim roku nie otrzymano w wyniku krzyżowań regeneracji roślin haploidalnych z zarodków, których liczba była niewielka w stosunku do liczby zapylonych kwiatków żyta (0,6 zarodka/100 zapylonych kwiatków żyta). Harmonogram prac w bieżącym roku sprawozdawczym był realizowany w całości, zgodnie z harmonogramem. W jakim stopniu cel badania został osiągnięty: W tym etapie badań rozpoznano genotypową efektywność tworzenia kalusa mikrosporowego w pulach genowych materiałów roślinnych pochądzących z firm hodowlanych Danko H.R Choryń 4,8% (maksymalnie 33,2% na pożywce C17 z dodatkiem 2,4-D i dikamby), a dla Poznańskiej Hodowli Roślin Tulce 2,18% (maksymalnie 23,9% na pożywce 190-2 z dodatkiem 2,4-D). Wyniki te stanowią podstawę do badań metodycznych nad indukcją androgenezy w kolejnej fazie, która dotyczy regeneracji roślin z kalusa mikrosporowego. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że badane genotypy reagują odmiennie na pozywki indukujące tworzenie kalusa mikrosporowego w kulturze pylników dla puli roślin PHR korzystniejsza była pożywka 190-2 z dodatkiem 2,4-D, a dla genotypów Danko pożywka C17 z dodatkiem 2,4-D i dikamby. Z przetestowanych pożywek regeneracyjnych w 2012 roku

(MS, MS+kinetyna, 190-2+kinetyna) wybrano jako pożywki otymalne dla regeneracji roślin MS + 0,5 mg/l kinetyny i MS bez dodatku regulatorów wzrostu. W porównaniu z poprzedmin rokiem realizacji badań zaobserwowano znacząco wyższą regenerację roślin (157 roślin), w tym roślin zielonych (74 rośliny). W bieżącym roku realizacji zadania zakres prac poszerzono o żywotność ziaren pyłku 3 odmian kukurydzy i kiełowanie łagiewek pyłkowych kukurydzy na znamionach 6 linii męskosterylnych żyta co pozwoli w przyszłości rozpoznać źródła niskiej efektywności kultur embrionów haploidalnych w haploidyzacji żyta. Doskonalono metodycznie technikę krzyżowania oraz izolacji zarodków w różnych stadiach rozwojowych. 7. Najważniejsze osiągnięcia. W procesie androgenezy żyta udoskonalono metodykę badań, szczególnie zoptymalizowano skład pożywek indukujących androgenezę dla otrzymania kalusa mikrosporowego kulturach pylnikowych. W porównaniu z rokiem ubiegłym indukcja androgenezy powiodła się dla wszystkich 30 badanych genotypów żyta (w roku 2012 dla 53% genotypów). W stosunku do poprzednich lat realizacji zadania znacząco podniesiono efektywność regeneracji roślin, w roku bieżącym otrzymano 74 rośliny zielone oraz 83 rośliny albinotyczne razem 157 roślin; gdzie w roku 2011 nie otrzymano roślin, w roku 2012 zregenerowało 13 roślin. Przeprowadzono wstępne rozpoznanie źródeł niepowodzenia w krzyżowaniach międzygatunkowych Secale cereale L. ssp. cereale x Zea mays L., w aspekcie biologii zapylenia i zapłodnienia oraz zbadano żywotność ziaren pyłku odmian kukurydzy wykorzystywanych jako zapylacze. Doskonalono technikę krzyżowania oraz metodykę prowadzenia kultur zarodkowych na wczesnych etapach rozwoju embrionów haploidalnych. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że dla otrzymania zarodków haploidalnych konieczne byłoby poszerzenie prac o kultury zalążni po zapyleniu pyłkiem kukurydzy w celu ograniczenia zamierania haploidalnych prazarodków. Wytypowano genotypy o wysokiej indukcji androgenezy (PHR3, PHR5, 572/12, S1194/12) oraz zdolności do regeneracji roślin zielonych (PHR5, 572/12, S1188/12, S1194/12). 8. Forma upowszechnienia wyników Wyniki są i będą dostępne przez okres 5 lat na stronie internetowej http://bip.puls.edu.pl/?q=content/dotacje-ministra-rolnictwa

9. Wykaz prac opublikowanych w roku sprawozdawczym dot. danego tematu: nie dotyczy 10. Wykaz prac złożonych do druku. Zgłoszenie na Ogólnopolską konferencję Naukową pt. Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych. Zakopane 4 8 luty 2013. Plakat pt. Zdolność do androgenezy żyta a markery RAPD związane z odpowiedzią w kulturze pylników praca jest w końcowym etapie opracowania redakcyjnego. 11. Przyczyny ewentualnych odstępstw od harmonogramu zapisanego w karcie realizacji tematu. nie dotyczy 12. Informacja o wynikach współpracy naukowo-technicznej krajowej i z zagranicą (przy współpracy z zagranicą podać kraj, firmę, temat). nie dotyczy 13. W przypadku udziału w konferencjach, sympozjach, szkoleniach i warsztatach itp., w szczególności zagranicznych: a) cel i korzyści oraz stopień wykorzystania do realizacji zadania: Udział w Konferencji Naukowej Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych miał na celu prezentację wyników otrzymanych w trakcie realizacji zadania. b) w jaki sposób wyjazd podniósł wartość merytoryczną realizowanego zadania. W wyniku udziału w Konferencji Naukowej Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych zostanie przygotowana publikacja pt. Zdolność do androgenezy żyta a markery RAPD związane z odpowiedzią w kulturze pylników

Podsumowanie realizacji zadania za lata 2008 2013 Przedmiotem badań w trakcie realizacji zadania było: genotyp rośliny warunkujący zdolność do indukcji androgenezy i regeneracji roślin lub jej brak, optymalizacja metodyki kultury pylników (modyfikacje składu pożywek indukujących androgenezę i regenerację roślin, traktowanie wstępne kłosów i warunki prowadzenia kultury). Głównymi problemami w trakcie realizacji zadania w latach 2008 2013 były: genotyp rośliny warunkujący zdolność do indukcji androgenezy i regeneracji roślin, spontaniczne podwojenie liczby chromosomów, ubytki na poszczególnych etapach androgenezy (kolchicynowanie, nie przeżywanie jaryzacji, brak kłoszenia, rośliny poliploidalne, razem: ok 40% regenerantów), zmiany w morfologii regenerantów (głównie przypominające depresję wsobną), samoniezgodność roślin DH, zaburzenia płodności (nieprawidłowa mejoza, obniżenie żywotności ziaren pyłku). Zestawienie modyfikacji metodyki kultur pylnikowych żyta w latach realizacji zadania Modyfikacja metodyki Rok 2008 2009 2010 2011 2012 2013 C17 C17 Pożywka indukująca androgenezę 190-2 (Xingzhi i Han, 1984) C17 (Wang i Chen, 1983) C17 (Wang i Chen, 1983) (Wang i Chen, 1983) N6 (Wenzel i in., 1977) C17 (Wang i Chen, 1983) (Wang i Chen, 1983) 190-2 (Xingzhi i Han, 1984) Pożywka regeneracyjna MS (Murashige i Skoog, 1962) MS MS+1,5 mg/l kinetyny+0,5mg/l 2,4-D MS MS MS+0,5 mg/l kinetyny 190-2+0,5 mg/l kinetyny MS MS+0,5 mg/l kinetyny

Czas trwania stresu termicznego min. 2 dni min. 2 dni 7 dni optymalne dla DANKO - indukcja kalusa 4,3%; Kontrola bez stresu termicznego, optymalne dla PHR indukcja kalusa 3,38% Optymalne dla wysokiej żywotności mikrospor od 0 do 7 dni 87,2% Średni czas przechowywania kłosów: PHR 7,2 dnia Danko 10,1 dnia Średni czas przechowywania kłosów: PHR 11,8-25,4 dnia Danko 16,8-31,1 dnia Zestawienie efektywności indukcji androgenezy w kulturze pylników w latach realizacji zadania Cecha Procent genotypów DANKO z indukcją androgenezy Procent genotypów PHR z indukcją androgenezy Średnia i maksymalna efektywność indukcji androgenezy DANKO Średnia i maksymalna efektywność indukcji androgenezy PHR Rok 2008 2009 2010 2011 2012 2013 100% 100% 66% 66% 80% 80% średnia 1,4% max 20,1% średnia 1,2% max 16,9% średnia 14,5% max 41,5% średnia 3,1% max 17,3% średnia 1,9% max 15,9% średnia 1,1% max 5,9% C17 80% N6 40% C17 100% N6 86% C17 - średnia 8,7% C17 - max 49,2% N6 - średnia 2,8% N6 - max 12,8% C17 - średnia 3,6% C17 - max 8,0% N6 - średnia 2,4% N6 - max 7,4% 66% 40% średnia 0,7% max 41,5% średnia 3,1% max 12% I C17 80% II C17 73% 190-2 80% I C17 73% II C17 53% 190-2 80% I C17 średnia 4,42% max 14,3% II C17 średnia 5,5% max 33,2 190-2 średnia 4,48% max 20,8% I C17 średnia 1,6% max 9,2% II C17 średnia 1,9% max 14,7% 190-2 średnia

2,9% max 23,9% Regeneracja roślin - DANKO 22 rośliny średnio 0,06% 229 roślin średnio 1,42% brak roślin brak roślin 7 roślin średnio 0,04% 155 roślin 72 rośliny zielone średnio 0,27% Regeneracja roślin - PHR 9 roślin średnio 0,05% 1 roślina (albinos) średnio 0,02% brak roślin brak roślin 5 roślin średnio 0,03% 2 rośliny średnio 0,008% Poziom ploidalności regenerantów (zawartość genomowego DNA) wynosił 1C (haploidy) 30,4%, 2C (diploidy) 65,6%, 3C (triploidy) 2,4%, 4C (tetraploidy) 1,6%. Podwojone haploidy (DH) żyta (Secale cereale L.) stanowią potencjalne narzędzie dla badań podstawowych oraz dla hodowli roślin. Metody otrzymywania haploidów żyta, obejmują androgenezę oraz kultury zalążków lub haploidalnych zarodków po zapyleniu pyłkiem kukurydzy. Efektywność haploidyzacji żyta jest silnie uzależniona od genotypu i wymaga badań podstawowych z zakresu genetycznego uwarunkowania zdolności do androgenezy dla szerokiego spektrum genotypów oraz opracowania metodologii indukowania linii DH. Dotychczasowe badania realizowane w ramach Dotacji przedmiotowej MRiRW na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w latach 2008 2013 wskazują na konieczność pogłębienia badań dotyczących androgenezy żyta w aspekcie diagnostyki molekularnej genotypów oraz metodologii prowadzenia kultur pylników, izolowanych mikrospor i haploidalnych zarodków w warunkach in vitro. Powyższe badania mają istotne walory

poznawcze jak i w perspektywie aplikacyjne w wytworzeniu materiałów wyjściowych dla hodowli odmian heterozyjnych żyta. Dalsze prace powinny podejmować następujące problemy z zakresu badań podstawowych w niniejszym temacie: optymalizacja czynników egzogennych i endogennych wpływających na efektywność haploidyzacji żyta, optymalizacja stresu abiotycznego indukującego androgenezę, poszukiwanie genotypów o wysokiej efektywności embriogenezy haploidalnej wspomagane markerami molekularnymi. prof. dr hab. Zbigniew Broda Data: 10 grudnia 2013 r.. Podpis Kierownika zadania