Program Badań Biegłości POLMICRO 2016 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2017; 53(1): 23-32 ISSN 0867-4043 Praca oryginalna Original Article Program Badań Biegłości POLMICRO 2016 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej Proficiency testing program POLMICRO 2016 Polish External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics Elżbieta Stefaniuk 1,2, Karolina Bosacka 1, Ewa Młodzińska 1, Anna Mikołajczyk 1, Waleria Hryniewicz 1,2 1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa Streszczenie W roku 2016 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) zorganizował XXIII edycję Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności w Diagnostyce Mikrobiologicznej Program POLMICRO, zgodnie z wymaganiami normy PN-EN ISO/IEC 17043:2011. Celem programu POLMICRO 2016 była ocena biegłości laboratoriów w identyfikacji drobnoustrojów, oznaczaniu i klinicznej interpretacji wrażliwości bakterii na antybiotyki, wykrywaniu różnych mechanizmów oporności, oceny mikroskopowej preparatów barwionych metodą Grama. Praca przedstawia wyniki XXIII edycji Programu POLMICRO 2016. Summary In 2016 Centre for Quality Control in Microbiology (CQCM) conducted Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics according to the requirements of PN-EN ISO/IEC 17043:2011. The aim of the POLMICRO 2015 programme was to evaluate proficiency of laboratories in the identification of microorganisms, determination and clinical interpretation of bacterial susceptibility to antibiotics, detection of different resistance mechanisms and interpretation of Gram slides. The paper presents the results of the XXIII edition of the Programme POLMICRO 2016. Słowa kluczowe: Key words: POLMICRO, zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności, barwienie metodą Grama POLMICRO, external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance mechanisms, Gram stain Wstęp Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań Wiarygodności w Diagnostyce Mikrobiologicznej Program POLMICRO organizowany jest od roku 1997 przez Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) w Warszawie. Organizacja Programu odbywa się zgodnie z wymaganiami międzynarodowej normy dla organizatorów badań biegłości (PN-EN ISO 17043), możliwa jest dzięki kompetentnemu, o wysokich kwalifikacjach i dużym doświadczeniu personelowi jednostki, dużemu zaangażowaniu Kierownictwa Ośrodka oraz dysponowaniu przez Centralny Ośrodek specjalistycznym wyposażeniem badawczym i bardzo dobrymi warunkami lokalowo-środowiskowymi. Działania Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej są adekwatne do aktualnych wyzwań epidemiologii zakażeń człowieka, dostępności na rynku diagnostycznym nowych technologii oraz aktualnych rekomendacji diagnostyczno-terapeutyczno-profilaktycznych. Ważnym zadaniem Ośrodka jest ustawiczna edukacja personelu laboratoriów medycznych w zakresie zasad kontroli i monitorowania jakości różnych etapów diagnostyki mikrobiologicznej. Celem Programu POLMICRO w roku 2016 była, podobnie jak w latach ubiegłych, edukacja i ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych odnośnie interpretacji wstępnego etapu diagnostyki mikrobiologicznej (preparat mikroskopowy), oznaczania fenotypów lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki patogenów bakteryjnych wywołujących zakażenia człowieka. Dobór obiektów badań, formuła sprawdzianów i oczekiwania względem uczestników miały także na celu promowanie nowych metod oraz standaryzację i ujednolicenie rutynowo stosowanych metod w laboratoriach. W roku 2016 odbyła się XXIII edycja programu POLMICRO. 23

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Materiał i metody W roku 2016 COBJwDM zorganizował sześć rund Programu Badań Biegłości POLMICRO obejmujących różne obiekty badań, metody i techniki badawcze. Wykorzystane izolaty drobnoustrojów należące do różnych gatunków, o różnych fenotypach wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe przedstawiono w tabeli I. Wszystkie obiekty badań pochodziły z kolekcji COBJwDM i zostały przygotowane na potrzeby programu badań biegłości POLMICRO. Dwie rundy sprawdzianu POLMICRO 2016 (I i VI) zostały przeprowadzone w wersji elektronicznej. W I rundzie POLMICRO 2016 zadaniem Laboratoriów było udzielenie odpowiedzi na dziesięć pytań, zawartych w sześciu zadaniach, które zostały zamieszczone na stronie internetowej Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Pytania dotyczyły poszczególnych etapów diagnostyki zakażeń bakteryjnych oraz grzybiczych. Natomiast runda VI POLMICRO 2016 składała się z jedenastu pytań testowych obejmujących m.in. zdjęcia płytek antybiogramowych, dotyczących interpretacji testów lekowrażliwości. Rundy II, III i V sprawdzianu mające charakter praktyczny laboratoryjny, polegały na identyfikacji gatunku i oznaczeniu lekowrażliwości oraz wykryciu mechanizmów oporności przesłanych izolatów. W rundzie II i V uczestnicy programu otrzymali po dwa izolaty pałeczek Gram-ujemnych oznaczonych każdorazowo jako próbki A i B. Podczas, gdy w ramach rundy II każdą z próbek A i B stanowiły szczepy bakteryjne różnych gatunków (A Stenotrophomonas maltophilia PM-277, B Klebsiella pneumoniae PM-278), to w rundzie V obydwa obiekty badań A i B stanowiły pałeczki należące do gatunku Proteus mirabilis (PM-201 i PM-292), ale różniące się fenotypem wrażliwości na antybiotyki i wytwarzaniem β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym, tzw. ESBLs (ang. extended spectrum β-lactamases). Runda III, jak co roku stanowiła sprawdzian z zakresu identyfikacji i lekowrażliwości w szczególności drobnoustrojów wymagających, wrażliwych na skrajne warunki temperaturowe oraz długi czas transportu. Każdy z uczestników otrzymał zestaw czterech szczepów bakteryjnych oznaczonych literami A, B, C i D. Zestawy różniły się między sobą izolatem oznaczonym jako D. Zadaniem laboratorium było zidentyfikowanie wszystkich szczepów kontrolnych oraz oznaczenie lekowrażliwości szczepów A, B i C. Zestawy zawierały następujące izolaty: A Streptococcus pneumoniae PM-279, B Streptococcus pyogenes PM-280, C Haemophilus influenzae PM-281 oraz jako obiekt D jeden z następujących izolatów: Listeria monocytogenes PM-282, Enterococcus faecium PM-283 oraz Enterococcus faecalis PM-284. Runda IV POLMICRO 2016 była także sprawdzianem praktycznym, częściowo przypominała formułę sprawdzianu POLMICRO 2015/ IV i polegała na ocenie wstępnego etapu diagnostyki mikrobiologicznej, tj. ocenie barwienia i interpretacji bezpośredniego preparatu mikroskopowego. W ramach tej tury sprawdzianu wszystkie Laboratoria otrzymały pięć preparatów mikroskopowych opisanych jako A, B, C, D i E. Preparaty A i B wykonano z materiałów klinicznych: preparat A pochodził z dodatniej hodowli krwi na podłożu bulionowym, tzw. dodatniej butelki (Listeria monocytogenes PM-285), natomiast preparat B wykonano z aspiratu płynu z otwartej rany od pacjenta z wypadku komunikacyjnego (Clostridium perfringens PM-286). Preparat A, wysłany w ramach IV rundy POLMICRO 2016 zawierał 100 razy więcej komórek bakteryjnych niż wyznaczona granica wykrywalności dla tego preparatu (10 5 cfu/ml). Laseczki Clostridium perfringens PM-286 były obecne w preparacie w ilości 10 6 cfu/ml (granica wykrywalności dla tego preparatu 10 4 cfu/ml). Preparaty C, D i E sporządzono z jednorodnych hodowli bakteryjnych na podłożu stałym; na potrzeby sprawdzianu przygotowano 2 zestawy preparatów, które różniły się między sobą preparatem C. Preparat D Candida albicans PM-289; preparat E Escherichia coli PM-286; preparat C Enterococcus faecalis PM-287 lub Staphylococcus aureus PM-288. Granica wykrywalności preparatu D wynosiła 10 3 cfu/ml a przygotowany w ramach IV tury POLMICRO 2016 preparat zawierał zawiesinę drożdżaków o gęstości 10 5 cfu/ml. Preparat E został wykonany z zawiesiny o gęstości 0,5 MC Farlanda (~10 7 cfu/ml) czyli 1000 krotnie większej niż granica wykrywalności dla tego preparatu (~10 4 cfu/ml). W celu jak najlepszego uwidocznienia charakterystycznego układu komórek z hodowli Enterococcus faecalis PM-287 w procesie przygotowywania preparatów kontrolnych, przygotowano zawiesinę o gęstości 0,5 McFarlanda (~10 7 cfu/ml), natomiast z hodowli Staphylococcus aureus PM-288 o gęstości 1 McFarland (~10 8 cfu/ ml). Granice wykrywalności dla obu tych preparatów zostały wyznaczone na poziomie 10 4 cfu/ml. W odróżnieniu od roku 2015, zadaniem Laboratoriów było utrwalenie wszystkich preparatów, a następnie poddanie ich barwieniu metodą Grama. W tabeli II przedstawiono liczbę laboratoriów, do których przekazano próbki kontrolne oraz liczbę laboratoriów, które wzięły czynny udział w poszczególnych rundach sprawdzianu POLMI- CRO 2016. Począwszy od roku 2015 ocena poszczególnych rund Programu Badań Biegłości POLMICRO jest przeprowadzana zgodnie z wymaganiami międzynarodowej normy dla organizatora badań biegłości: PN-EN ISO/IEC 17043:2011 Ocena zgodności Ogólne wymagania dotyczące badania biegłości [11]. Ocena wersji praktycznej sprawdzianu polega na przyznawaniu punktów za kolejne etapy diagnostyki mikrobiologicznej obiektów badań, jakimi są szczepy drobnoustrojów. Analogicznie, punktowo są oceniane także rundy programu w formie elektronicznej. Na podstawie wyników uzyskanych przez laboratoria wyliczany jest wskaźnik z-score, który stanowi kryterium przyznania uczestnikowi oceny pozytywnej bądź negatywnej. z 2,0 ocena pozytywna; 2,0 < z <3,0 ocena pozytywna ostrzegawcza; z 3,0 ocena negatywna. z jest obliczany zgodnie z równaniem: gdzie: x wynik uzyskany przez uczestnika w danej rundzie POLMICRO; X wartość przypisana w danej rundzie POLMICRO; σ odchylenie standardowe dla oceny biegłości (w danej rundzie POLMICRO). z = x X σ 24

Diagn Lab 2017; 53(1): 23-32 Tabela I. Obiekty badań wykorzystane w poszczególnych rundach Programu POLMICRO 2016 (edycja XXIII) Obiekty badań nr kolekcji POLMICRO Mechanizmy oporności / fenotyp wrażliwości / opis obiektów badań POLMICRO 2016 runda I Haemophilus influenzae PM-271 - Pyt. 1. Zdjęcie preparatu mikroskopowego z dodatniego posiewu krwi + zdjęcia podłoża agarowego z 5% krwi baraniej, podłoża czekoladowego z PolyViteX i podłoża MacConkey a Streptococcus agalactiae PM-272 - Pyt. 2. Zdjęcie preparatu mikroskopowego z dodatniego posiewu krwi Streptococcus pneumoniae PM-273 - Pyt. 3. Zdjęcia preparatu mikroskopowego z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego i dodatniego posiewu krwi + zdjęcia podłoża agarowego z 5% krwi baraniej Listeria monocytogenes PM-274 - Pyt. 4. Zdjęcie preparatu mikroskopowego z dodatniego posiewu krwi + zdjęcia podłoża agarowego z 5% krwi baraniej, podłoża czekoladowego z PolyViteX i podłoża MacConkey a Fusarium spp. PM-275 - Pyt. 5. Zdjęcia hodowli na podłożu stałym + prepatu bezpośredniego w soli fizjologicznej Alternaria spp. PM-276 - Pyt. 6. Zdjęcia hodowli na podłożu stałym + prepatu bezpośredniego w soli fizjologicznej POLMICRO 2016 runda II Stenotrophomonas maltophilia PM-277 - [SXT]=S Klebsiella pneumoniae PM-278 MBL-dodatni [AMP, AMC, TZP, CTX, CAZ, CRO, CXM, ERT, IMP, MEM, CIP, AK, GE]=R, [TGC, COL]=S POLMICRO 2016 runda III Streptococcus pneumoniae PM-279 PRP, M-fenotyp [P]=I (zakażenia inne niż ZOMR); [P]=R (zakażenia ZOMR); [CTX, MEM, LEV, CL, TET, SXT]=S, [E]=R Streptococcus pyogenes PM-280 MLS B indukcyjny [P]=S, [E, CL]=R Haemophilus influenzae PM-281 BLPAR [AMP]=R, [AMC, CXM, CTX, CIP, TET, SXT]=S Listeria monocytogenes PM-282 - Izolat tylko do identyfikacji Enterococcus faecium PM-283 - Izolat tylko do identyfikacji Enterococcus faecalis PM-284 - Izolat tylko do identyfikacji POLMICRO 2016 runda IV Preparaty mikroskopowe z dodatniej hodowli krwi Preparaty mikroskopowe z aspiratu z otwartej rany Preparaty mikroskopowe z hodowli na podłożu stałym A B Pałeczki Gram-dodatnie Laseczki Gram-dodatnie Z posiewu krwi wyhodowano Listeria monocytogenes PM-285 Z posiewu krwi wyhodowano Clostridium perfringens PM-286 Ziarenkowce Gram-dodatnie Preparat z hodowli Enterococcus faecalis PM-287 C w łańcuszkach ziarenkowce Gram-dodatnie Preparat z hodowli Staphylococcus aureus PM-288 w grupach D Komórki grzybów Preparat z hodowli Candida albicans PM-289 drożdżoidalnych E Pałeczki Gram-ujemne Preparat z hodowli Escherichia coli PM-290 POLMICRO 2016 runda V Proteus mirabilis PM-291 ESBL-dodatni [AMC]=S/I*, [CTX, CIP, GE]=R, [IMP, MEM]=S Proteus mirabilis PM-292 - [AMC]=S/I*, [CTX, IMP, MEM, CIP, GE]=S POLMICRO 2016 runda VI Enterococcus gallinarum PM-293 VanA, VanC, Pyt. 1. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na glikopeptydy + pytanie testowe Enterococcus faecium PM-294 VanB Pyt. 2. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na glikopeptydy + pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM-295 ESBL-dodatni, MBL-ujemny Pyt. 3. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku ESBL i MBL + pytanie testowe Pseudomonas aeruginosa PM-296 ESBL-ujemny Pyt. 4. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku ESBL + pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM-297 MBL-dodatni, ESBL-ujemny Pyt. 5.. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku ESBL i MBL + pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM-298 ESBL-dodatni, MBL-ujemny Pyt. 6. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku ESBL i MBL + pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM-299 MBL-ujemny Pyt. 7. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku MBL + pytanie testowe Pyt. 8. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na Staphylococcus epidermidis PM-300 MS B makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Pyt. 9. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton z 5% krwi końskiej i 20 mg/l Streptococcus pyogenes PM-301 MLS B indukcyjny β-nad oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Legenda: BLPAR szczep wytwarzający β-laktamazę, oporny na ampicylinę; ESBL β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym; M-fenotyp oporność na erytromycynę, wrażliwość na klindamycynę; MBL metalobetalaktamazy; MLS B (indukcyjny) oporność na makrolidy, linkozamidy i streptograminy; MS B oporność na erytromycynę, wrażliwość lub oporność na klindamycynę in vitro; PRP Streptococcus pneumoniae oporny na penicylinę; VanA indukcyjna oporność na wankomycynę i teikoplaninę; VanB oporność na niskie stężenia wankomycyny i wrażliwość na teikoplaninę; VanC naturalna oporność na wankomycynę przy zachowanej wrażliwości na teikoplaninę na niskie stężenia wankomycyny i wrażliwość na teikoplaninę; VanC naturalna oporność na wankomycynę przy zachowanej wrażliwości na teikoplaninę; AK-amikacyna; AMC-amoksycylina z kwasem klawulanowym; AMP-ampicylina; CAZ-ceftazydym; CIP-ciprofloksacyna; CL-klindamycyna; COL-kolistyna; CRO-ceftriakson; CTX-cefotaksym; CXM-cefuroksym; E-erytromycyna; ERT-ertapenem; GE-gentamicyna; IMP-imipenem; LEV-lewofloksacyna; MEM-meropenem; P-penicylina; SXT-trimetoprim/sulfametoksazol; TGC-tigecyklina; TEC-teikoplanina; TET-tetracyklina; TZP-piperacylina z tazobaktamem; VA-wankomycyna. S (susceptible) wrażliwy, I (intermediate) średniowrażliwy, R (resistant) -oporny * w zależności od miejsca zakażenia 25

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Tabela II. Zestawienie udziału laboratoriów w poszczególnych rundach XXIII edycji Programu POLMICRO w roku 2016 oraz zbiorczych ocen końcowych uzyskanych przez te laboratoria w poszczególnych rundach sprawdzianu. Liczba i % Liczba laboratoriów, Liczba i % laboratoriów, które laboratoriów, Runda Programu które uzyskały które wzięły POLMICRO 2016 otrzymały wynik >70% udział w danej obiekty wartości rundzie badań przypisanej [N (%)] Wartość przypisana X Odchylenie standardowe σ POLMICRO 2016/I 456 435 (95,4%) 426 (97,9%) 20 0,4 POLMICRO 2016/II 458 444 (96,9%) 444 (100%) 47 1,6 POLMICRO 2016/III 451 445 (97,2%) 445 (100%) 73 4 POLMICRO 2016/IV 446 441 (98,9%) 438 (99,3%) 20 1 POLMICRO 2016/V 447 443 (99,1%) 442 (99,8%) 44 1,6 POLMICRO 2016/VI 450 424 (94,2%) 421 (99,3%) 22 1,3 Liczba i % Liczba i % laboratoriów, laboratoriów, które otrzymały ocenę które otrzymały pozytywną ocenę lub pozytywną ostrzegawczą negatywną [liczba (%)] [liczba (%)] z 2 2< z <3 łącznie z 3 410 (94,3%) - 407 (91,7%) 17 (3,8%) 401 (90,1%) 15 (3,4%) 363 56 (82,3%) (12,7%) 396 (89,4%) 23 (5,2%) 264 131 (62,3%) (30,9%) 410 (94,3%) 25 (5,7%) 424 (95,5%) 20 (4,5%) 416 (93,5%) 29 (6,5%) 419 (95,0%) 22 (5,0%) 419 (94,6%) 24 (5,4%) 395 (93,2%) 29 (6,8%) W 2016 roku zmieniono zasady obliczania odchylenia standardowego, co było związane z koniecznością usunięcia ze zbioru danych błędów oczywistych i danych odstających, które znacząco obniżały kryteria badania biegłości [13]. Na podstawie analizy wyników uczestników w poszczególnych rundach w 2015 roku ustalono, że w roku 2016 odchylenie standardowe będzie obliczane z wyników uczestników, którzy otrzymali wynik x powyżej 70% wartości przypisanej X (tab. II). Wprowadzenie progu 70% do obliczeń odchylenia standardowego wiązało się z zaostrzeniem kryteriów otrzymania oceny pozytywnej dla uczestników, ale tylko tych, którzy otrzymali bardzo niski wynik punktowy, znacząco różniący się od innych uczestników. Ocenie podlegały wyniki testów wrażliwości (wykonane zgodnie z aktualnymi rekomendacjami) wyłącznie dla izolatów poprawnie zidentyfikowanych [1, 2, 3, 4]. Szczegółowe wyniki poszczególnych rund sprawdzianu oraz interpretacja wyników każdorazowo były zamieszczane na stronie internetowej Ośrodka www.polmicro.edu.pl; dostęp możliwy po zalogowaniu na indywidualne konto Laboratorium. Wyniki W poszczególnych rundach sprawdzianu POLMICRO w roku 2016 uczestniczyła różna liczba laboratoriów mikrobiologicznych, od 446 do 458 (tab. II). Zgodnie z obowiązującą w COBJwDM procedurą (www.polmicro.edu.pl) obiekty badań były przekazywane wyłącznie do laboratoriów, które potwierdziły chęć udziału w Programie, średnio 3% z tych laboratoriów (od 0,9% do 5,8%) nie odsyłało odpowiedzi dotyczących obiektów badań. Zjawisko to utrzymuje się na porównywalnym poziomie z rokiem 2015 (od 0,9% do 5,2%; średnia 2,6%) [14]. Z pozyskiwanych przez Ośrodek informacji wynika, że przyczyny takiej sytuacji należy upatrywać m.in. w likwidacji lub reorganizacji laboratorium, nieobecności w laboratorium w terminie sprawdzianu kierownika jednostki lub uzyskaniem w poprzednich rundach sprawdzianu co najmniej jednej oceny negatywnej i utrata szansy na przyznanie świadectwa wiarygodności za bieżący rok. W tabeli II. przedstawiono również zbiorcze oceny końcowe w poszczególnych rundach Programu uzyskane przez laboratoria. Uwagę zwraca wysoki odsetek laboratoriów, które uzyskały ponad 70% punktowej wartości przypisanej dla poprawnych odpowiedzi w poszczególnych rundach sprawdzianu w roku 2016. Aż w pięciu rundach odsetek laboratoriów wynosił ponad 99%, w tym w rundach II i III po 100%. Oceny pozytywne i pozytywne ostrzegawcze otrzymywało w zależności od rundy POLMICRO 2016 od 93,2% do 95%. Wyniki te świadczą o wysokim poziomie diagnostyki w laboratoriach mikrobiologicznych w kontrolowanym zakresie. SPRAWDZIANY W WERSJI PRAKTYCZNEJ LABORATORYJNEJ Identyfikacja drobnoustrojów W roku 2016 identyfikacji poddawane były izolaty bakteryjne stanowiące obiekty badań w ramach rund: II, III i V. Ogółem skuteczność identyfikacji w sprawdzianach praktycznych (wersja laboratoryjna) w Programie POLMICRO 2016 wyniosła 98,4%. Dla porównania, poprawność w POLMICRO 2015 identyfikacji wynosiła 97% [14]. W rundzie II Sprawdzianu POLMICRO 2016 wszystkie uczestniczące Laboratoria (n=444) prawidłowo zidentyfikowały obydwa badane szczepy bakteryjne (A Stenotrophomonas maltophilia PM-277, B Klebsiella pneumoniae PM-278). W ramach POLMICRO 2016/III czterysta dwadzieścia cztery laboratoria (95,3%) zidentyfikowały prawidłowo wszystkie cztery przesłane szczepy. Błędy w identyfikacji popełniło 21 uczestników, co stanowiło 4,7% wszystkich laboratoriów. Nie odnotowano błędnych odpowiedzi dla izolatów: S. pneumo- 26

Diagn Lab 2017; 53(1): 23-32 Tabela III. Wyniki identyfikacji gatunkowej szczepów kontrolnych w ramach rund II, III i V POLMICRO 2016 POMICRO 2016 Gatunek drobnoustroju Odsetek i liczba (n) poprawnych identyfikacji Błędna identyfikacja (n) Runda II S. maltophilia PM-277 (n=444) 100% (n=444) - K. pneumoniae PM-278 (n=444) 100% (n=444) - Runda III S. pneumoniae PM-279 (n=445) 100% (n=445) - S. pyogenes PM-280 (n=445) 99,6% (n=442) S. agalactiae (n=1) S. mitis (n=1) H. influenzae PM-281 (n=445) 100% (n=445) - L. monocytogenes PM-282 (n=149) 95,3% (n=142) E. faecalis (n=4) E. faecium (n=3) E. faecium PM-283 (n=150) 95,3% (n=143) E. faecalis (n=4) E. gallinarum (n=3) E. faecalis PM-284 (n=146) 96,6% (n=141) E. faecium (n=3) L. monocytogenes (n=1) N. meningitidis (n=1) Runda V P. mirabilis PM 291 (n=443) 100% (n=443) - P. mirabilis PM-292 (n=443) 100% (n=443) - niae PM-279 i H. influenzae PM-281. Dziewiętnaście laboratoriów popełniło błąd w identyfikacji szczepu D, przy czym jedno z nich popełniło błąd w identyfikacji dwóch szczepów kontrolnych: szczep B S. pyogenes PM-280 oznaczono jako Streptococcus agalactiae oraz szczep D Enterococcus faecalis PM-284 zidentyfikowano jako Neisseria meningitidis. W rundzie V POLMICRO 2016, podobnie jak w rundzie II, nie odnotowano ani jednego błędu w identyfikacji badanych szczepów. Szczegółową analizę udzielonych odpowiedzi przedstawiono w tabeli III. Lekowrażliwość i mechanizmy oporności W praktycznych rundach Programu POLMICRO 2016 umiejętność Laboratoriów określania fenotypów wrażliwości na leki badanych szczepów bakteryjnych i wytwarzania przez nie mechanizmów oporności oceniano wyłącznie dla izolatów drobnoustrojów poprawnie zidentyfikowanych. Szczegółową charakterystykę badanych szczepów przedstawiono w tabeli I. Stenotrophomonas maltophilia PM-277 charakteryzował się wrażliwością na trimetoprim/sulfametoksazol. Czterysta szesnaście laboratoriów (93,7%) prawidłowo oznaczyło fenotyp wrażliwość badanego szczepu. Dwadzieścia siedem (6,1%) laboratoriów popełniło błąd oznaczając szczep jako oporny. Na wynik oznaczania lekowrażliwości pałeczek niefermentujących należących do gatunku S. maltophilia ma wpływ wiele czynników, takich jak: zastosowana metoda, jakość podłoża antybiogramowego Mueller-Hinton agar, warunki inkubacji oraz trudności w odczycie wielkości stref zahamowania wzrostu. Zgodnie z zaleceniami EUCAST należy zignorować wzrost w obrębie strefy i czytać 80% inhibicji w miejscu, gdzie widoczna jest jakakolwiek strefa [3]; niedostosowanie się do zaleceń może skutkować fałszywą opornością szczepów na leki. Oznaczenie lekowrażliwości szczepu S. maltophilia PM-277 metodą dyfuzyjno-krążkową wykonalo 388 laboratoriów; trzysta sześćdziesiąt cztery laboratoria, co stanowiło 93,8% tej grupy laboratoriów, uzyskały poprawne wyniki. Ze względu na stosowanie przez uczestników Programu POLMICRO podłoży Mueller-Hinton agar i krążków antybiogramowych różnych producentów i pojawianie się rozbieżności w oznaczeniach, za prawidłową przyjęto strefę zahamowania wzrostu 16 mm. Spośród pozostałych laboratoriów (n=52), które uzyskały prawidłowe wyniki wrażliwości sszczepu S. maltophilia PM-277 na trimetoprim/sulfametoksazo i oznaczyło wartość MIC (mg/l) trometoprimu/sulfametoksazolu, 36 wykonało oznaczenie metodą automatyczną, a szesnaście laboratoriów oznaczyło wartość MIC paskiem z gradientem stężeń. Z uwagi na różnice w oznaczeniach pomiędzy paskami i podłożami różnych producentów, za prawidłową wartość przyjęto MIC 4 mg/l. Klebsiella pneumoniae PM-278 to szczep wielooporny z obecnością genów kodujących beta-laktamazy: karbapenemazę NDM-1 (MBL), β laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) CTX-M-15 i SHV-39 oraz plazmidową cefalosporynazę AmpC CMY-6. Izolat charakteryzował się opornością na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, opornością wysokiego stopnia na aminoglikozydy i fluorochinolony. Większość laboratoriów uzyskało wyniki zgodne z oczekiwanymi oporny, nieliczne rozbieżności odnotowano w oznaczeniu wrażliwości na imipenem oraz meropenem: zamiast oporny laboratoria podały kategorię średniowrażliwy (imipenem n=50 (11,3%), meropenem n=12 (2,7%)). Z uwagi na występowanie wielu mechanizmów oporności oraz wysoką oporność szczepu, interpretacja fenotypowych testów pozwalających wykryć ESBL czy AmpC jest bardzo trudna. Test w kierunku OXA-48 (krążek z temocyliną 30μg), ze względu na obecność karbapenemazy NDM, był dodatni. Izolat K. pneumoniae PM-278 nie wytwarzał karbapenemazy typu KPC takiej odpowiedzi udzieliło 95% laboratoriów (n=422). Testy w kierunku ESBL, AmpC, KPC i OXA-48 nie podlegały ocenie. Obecność MBL 27

www.diagnostykalaboratoryjna.eu prawidłowo wykryło 439 laboratoriów 98,9%; pięć laboratoriów (1,1%) popełniło błąd podając, że szczep nie wytwarza MBL. Szczep K. pneumoniae PM-278 charakteryzował się wrażliwością na kolistynę (MIC 0,25 mg/l) i tigecyklinę (MIC 0,75 mg/l). Wrażliwość szczepu na kolistynę określiły 432 (97,3%) laboratoria i wszystkie uzyskały prawidłowe wyniki; laboratoria te oznaczały wartość MIC kolistyny (w większości z użyciem systemów automatycznych, ale także metodą pasków gradientowych). Pozostałe laboratoria zastosowały metodę dyfuzyjno-krążkową, co zostało odnotowane jako błąd. Do oznaczania wrazliwości na kolastynę EUCAST zaleca metodę mikrorozcienczeń w bulionie [3]. Podobnie, oznaczenie wartości MIC jest rekomendowaną metodą oznaczania wrażliwości na tigecyklinę. Wrażliwość na tigecyklinę określiło 405 (91,2%) laboratoriów, przy czym wartość MIC określiło tylko 387 laboratoriów, co stanowiło 87,2% wszystkich laboratoriów biorących udział w II rundzie POLMICRO 2016. Zaobserwowane istotne różnice w interpretacji klinicznej wrażliwości szczepu K. pneumoniae PM-278 na tigecyklinę: 259 laboratoriów uzyskało MIC 1 mg/l (kategoria wrażliwy ), n=125 MIC w kategorii średniowrażliwy, a trzy laboratoria uzyskały kategorię oporny. Zgodnie z zaleceniami EUCAST wrażliwość pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae na tigecyklinę należy określać wyłącznie na podstawie oznaczania wartości MIC (punkty odcięcia stref zahamowania wzrostu zostały zwalidowane tylko dla Escherichia coli) [3,8]. Pomimo to, 44 (10,9%) laboratoria wykonały oznaczenie metodą dyfuzyjno-krążkową, ale 29 z nich podało także wartość MIC (mg/l) tigecykliny. Oznaczenie wrażliwości na tigecyklinę szczepu K. pneumoniae PM-278 wyłącznie metodą dyfuzyjno-krążkową wykonało 15 laboratoriów (3,4%) i wszystkie te laboratoria te otrzymały 0 punktów za zastosowanie metody niezgodnej z zaleceniami EUCAST. Streptococcus pneumoniae PM-279 był szczepem o obniżonej wrażliwości na penicylinę (referencyjna wartość MIC 0,25 mg/l) i w zależności od miejsca zakażenia interpretacja kliniczna powinna być następująca: zakażenie inne niż zapalenie opon mózgowo rdzeniowych (ZOMR) kategoria średniowrażliwy taką interpretację podały 423 laboratoria (95%), a w przypadku zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych oporny i tak podało 432 (97,1%) uczestników POLMICRO 2016/III [3, 8]. Nieprawidłową interpretację wrażliwości S. pneumoniae PM-279 na penicylinę w zakażeniu innym niż ZOMR ( wrażliwy zamiast średniowrażliwy ) podało siedemnaście laboratoriów. Błędy odnotowano również w interpretacji klinicznej wrażliwości na penicylinę w przypadku zapalenia opon mózgowo rdzeniowych cztery laboratoria podały kategorię wrażliwy, a sześć średniowrażliwy na penicylinę, zamiast oporny. Uzyskane przez laboratoria wartości MIC (mg/l) penicyliny sugerowały, że powstałe błędy interpretacji w większości mogły być wynikiem nieprawidłowego odczytywania tabel EUCAST. Szczep S. pneumoniae PM-279 charakteryzował się opornością na erytromycynę i pozostałe makrolidy 14 i 15-członowe, w wyniku tzw. M-fenotypu związanego z obecnością pompy błonowej mef(a) [5]. Czterysta czterdzieści trzy laboratoria (99,6%) prawidłowo określiło obecność M-fenotypu, oporność na erytromycynę wykryło 100% laboratoriów (n=445). Laboratoria nie miały także trudności z określeniem fenotypu wrażliwości badanego izolatu na pozostałe antybiotyki i chemioterapeutyki, za wyjątkiem oznaczenia wrażliwości na tetracyklinę (szczep wrażliwy strefa zahamowania wzrostu 28 mm, MIC 0,5 mg/l), dla której prawidłowe wyniki uzyskało poniżej 70% laboratoriów (n=310/445). Wyniki te zostały wyłączone z oceny końcowej niniejszej rundy. Streptococcus pyogenes PM-280 charakteryzował się opornością na erytromycynę, obecnością mechanizmu MLS b indukcyjnego warunkującego oporność na makrolidy, linkosamidy i streptograminyb. Laboratoria w znakomitej większości nie miały trudności z uzyskaniem prawidłowych wyników oznaczeń, a odsetek prawidłowych odpowiedzi wynosił: dla erytromycyny 99,3% (n=441), klindamycyny 97,3% (n=433) oraz mechanizmu MLS b indukcyjnego 99,3% (n=442). Jedno laboratoriim, spośród 445 bioracych udzial w III rundzie sprawdzianu, podało w formularzu odpowiedzi, że szczep S. pyogenes jest oporny na penicylinę, co stanowi bardzo poważny błąd. Haemophilus influenzae PM-281 to szczep o fenotypie BLPAR, tj. produkujący β-laktamazę, oporny na ampicylinę, charakteryzujący się wrażliwością na pozostałe leki. Wszystkie laboratoria (n=445, 100%) wykryły oporność szczepu na ampicylinę. Dwadzieścia pięć laboratoriów (5,6%) popełniło błąd w oznaczeniu wrażliwości na amoksycylinę z kwasem klawulanowym, z czego dwadzieścia trzy zastosowało wyłącznie metodą dyfuzyjno krążkową z krążkiem o zawartości 2/1 µg amoksycyliny z kwasem klawulanowym. Dwadzieścia z tych laboratoriów uzyskało wielkość strefy zahamowania wzrostu <15 mm kategoria oporny, a trzy otrzymały strefy pozwalające na interpretację wrażliwy, lecz zmieniły interpretację kliniczną na oporny. Laboratoria te (n=23, 5,2%) oznaczyły niepoprawnie fenotyp szczepu jako BLPACR. Proteus mirabilis PM-291 to szczep produkujący β-laktamazę o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL), wielolekooporny: oporny na aminopenicyliny, cefalosporyny trzeciej generacji, aminoglikozydy i ciprofloksacynę. Nie odnotowano znaczących problemów w oznaczeniu oporności szczepu na cefotaksym 100% (n=443) prawidłowych odpowiedzi. Oporność na ciprofloksacynę poprawnie oznaczyły trzysta trzydzieści dwa laboratoria (74,9%), ale jedna czwarta laboratoriów (25,1%) biorących udział w V rundzie POLMICRO 2016 błędnie określiło fenotyp wrażliwości badanego szczepu na ciprofloksacynę (średniowrażliwy n=106; wrażliwy n=5). Oporność na gentamicynę pałeczek P. mirabilis PM-291 prawidłowo oznaczyło tylko 63,2% laboratoriów (n=280). Podejrzenie o wytwarzanie ESBL przez szczep PM-291 zgłosiły wszystkie laboratoria 100% (n=443). Dodatkowo oprócz ESBL trzy laboratoria błędnie podejrzewały obecność MBL i trzy OXA-48 i te laboratoria otrzymały negatywne oceny końcowe. Szczep P. mirabilis PM-291 był wrażliwy na pozostałe leki zawarte w ankiecie amoksycylina z kwasem klawulanowym, imipenem i meropenem. Zgodnie z dokumentem: Stanowisko Zespołu Roboczego ds. oznaczania lekowrażliwości zgodnie 28

Diagn Lab 2017; 53(1): 23-32 z zaleceniami EUCAST w sprawie najczęściej zgłaszanych pytań dotyczących stosowania rekomendacji EUCAST z dnia 1 stycznia 2016 interpretacja kliniczna oznaczenia wrażliwości szczepu na amoksycylinę z kw. klawulanowym (strefa zahamowania wzrostu 19 mm, MIC 8 mg/l) jest różna w zależności od rodzaju zakażenia: w przypadku zakażenia inwazyjnego średniowrażliwy, natomiast w niepowikłanych zakażeniach układu moczowego i pozostałych przypadkach zakażeń wrażliwy [8]. Ponieważ Laboratoria nie otrzymały od organizatora Programu informacji o rodzaju zakażenia, za prawidłową uznawano więc interpretację wrażliwy i średniowrażliwy. Interpretację wrażliwy podało 49,6% laboratoriów, a średniowrażliwy 42,9%. Trzydzieści jeden laboratoriów (7%) nieprawidłowo oznaczyło szczep jako oporny na amoksycylinę z kwasem klawulanowym. Szczep Proteus mirabilis PM 292 był wrażliwy na wszystkie leki zamieszczone w formularzu odpowiedzi i nie wytwarzał mechanizmów oporności. Czterysta czterdzieści dwa laboratoria (99,8%) zaznaczyły prawidłowe odpowiedzi dotyczące mechanizmów oporności, a tylko jedno uznało, że szczep jest podejrzany o wytwarzanie MBL i otrzymało negatywną ocenę końcową. Podobnie, jak przy szczepie PM-291, za prawidłową interpretację wrażliwości P. mirabilis PM 292 na amoksycylinę z kw. klawulanowym uznawano odpowiedzi wrażliwy i średniowrażliwy. Dwadzieścia dwa laboratoria nie podały interpretacji klinicznej dla tego leku. Nie odnotowano znaczących rozbieżności w uzyskanych przez laboratoria wynikach, poza imipenemem, w przypadku, którego czternaście laboratoriów (3,2%) uznało, że badany szczep zachowuje na ten lek średnią wrażliwość, a siedem oporność. Punkty przyznawane za mechanizmy oporności dla szczepów PM-291 i PM-292 były liczone łącznie 5 pkt. przysługiwało za prawidłowe odpowiedzi dla ESBL, MBL, KPC i OXA-48 danego szczepu. Mechanizm AmpC został wyłączony z oceny końcowej. Sprawdzian dotyczący preparatów mikroskopowych Jak podano w rozdziale Materiały i metody zadaniem laboratoriów w rundzie IV POLMICRO 2016 była ocena i interpretacja obrazów mikroskopowych w preparatach, które należało utrwalić, a następnie zabarwić metoda Grama. W laboratoriach najczęściej stosowano metodę z wykorzystaniem płomienia palnika (preparat A 89,6%; B 91,0%, C, D i E 92,1%). W pozostałych przypadkach preparaty utrwalano alkoholem metylowym lub etylowym, tylko pojedyncze Laboratoria do tego celu wykorzystały gorące powietrze 180 C. W przypadku materiałów klinicznych takich jak np. krew należało rozważyć utrwalenie preparatu bezpośredniego alkoholem, gdyż metoda ta zapobiega lizie krwinek czerwonych, tworzących tło preparatu i wypłukaniu się drobnoustrojów [12, 15, 16]. Preparat C, bez względu na otrzymany zestaw, ziarenkowce Gram-dodatnie, pochodzący z hodowli Enterococcus faecalis PM-287 lub Staphylococcus aureus PM-288 okazał się najbardziej kontrowersyjny w ocenie. Problematyczna okazała się głównie ocena kształtu komórek bakteryjnych 12,0% (n=53) błędnych odpowiedzi. Nieprawidłowe odpowiedzi związane z barwieniem metodą Grama stanowiły 5,0% (n=22). Najłatwiejsze w ocenie były preparaty B (aspirat z rany zawierający Clostridium perfringens PM-286) oraz D (hodowla Candida albicans PM-289) 100% pozytywnych odpowiedzi. Ocena preparatów mikroskopowych jest bardzo ważnym elementem diagnostyki mikrobiologicznej. W 2015 roku pozytywną ocenę otrzymało 77,7% a w 2016 aż 95% Laboratoriów [10, 14]. Doskonalenie to dotyczyło głównie wykonania i oceny barwienia metodą Grama. SPRAWDZIANY TEORETYCZNE W WERSJI ELEKTRONICZNEJ I runda POLMICRO 2016 składała się z dziesięciu pytań dotyczących poszczególnych etapów diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych oraz grzybiczych., zawartych w sześciu zadaniach, które zostały zamieszczone na stronie internetowej Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Za każdą prawidłową odpowiedź, zgodnie z PO-02 wersja I, uczestnicy otrzymali po dwa punkty, a więc wartość przypisana X wynosiła 20, odchylenie standardowe 1. Średnia liczba punktów zdobytych przez uczestników wynosiła 19,8 pkt., natomiast mediana 20 pkt., co pokazuje, że zdecydowana większość laboratoriów (n= 410; 94,3%) prawidłowo odpowiedziała na wszystkie pytania zamieszczone w teście. W Zadaniu I. podano przypadek niemowlęcia z zapaleniem tkanki podskórnej (cellulitis) z towarzyszącą bakteriemią o etiologii Haemophilus influenzae. Pytanie I-1 dotyczyło interpretacji obrazu mikroskopowego. W preparacie z dodatniej hodowli krwi dodatnia butelka krwi (zdjęcia I-1, I-2) widoczne były pałeczki Gram-ujemne. Trzy laboratoria błędnie odpowiedziały, że są to ziarenkowce Gram-ujemne, a jedno pałeczki Gram-dodatnie. W kolejnej części zadania (pytanie I-2), uwzględniając obraz mikroskopowy z części pierwszej, oraz dodatkowe informacje dotyczące wzrostu bakterii na podłożach stałych i warunków hodowli, należało zadecydować w jakim kierunku powinna być prowadzona dalsza diagnostyka. Właściwa odpowiedź brzmiała: w kierunku pałeczek Haemophilus spp., ponieważ jako jedyna spośród wymienionych rodzajów bakterii nie wykazuje wzrostu na podłożu krwawym. Pozostałe drobnoustroje wymienione w odpowiedziach, pałeczki jelitowe i Pasteurella spp. (pałeczki Gram-ujemne), Listeria monocytogenes (pałeczki Gram-dodatnie) oraz Neisseria spp. (ziarenkowce Gram-ujemne) rosną na podłożu czekoladowym oraz podłożu krwawym. Błędną odpowiedź zaznaczyło 5 (1,1%) uczestników: Pasteurella spp. dwa Laboratoria, Listeria monocytogenes trzy, a Neisseria spp. jedno. W Zadaniu III. pytanie III-3 dotyczyło doboru testów diagnostycznych przydatnych w ustaleniu czynnika etiologicznego W tym pytaniu pojawiły się cztery błędne odpowiedzi: trzy z nich dotyczyły zastosowania testu z optochiną w przypadku Streptococcus pyogenes, a jedna zdolności redukcji TTC przez Streptococcus pneumoniae. Najwięcej błędnych odpowiedzi pojawiło się w Zadaniu IV. Zadanie polegało na podaniu czynnika etiologicznego (Listeria monocytogenes) zakażenia pacjentki z immunosupresją i objawami 29

www.diagnostykalaboratoryjna.eu zakażenia łożyska naczyniowego. W treści zadania podano także, że pacjentka pracowała w zakładach mięsnych. W pytaniu IV-1 zadaniem uczestników było, na podstawie obrazu mikroskopowego dodatniej próbki krwi, udzielenie odpowiedzi na pytanie o prawdopodobny czynnik etiologiczny zakażenia. Na związanych z tym pytaniem zdjęciach IV-1 i IV-2 widoczne były pałeczki Gram-dodatnie. Dwanaście (2,8%) laboratoriów błędnie oceniło przedstawiony obraz mikroskopowy: dziewięć laboratoriów uznało, że są to laseczki Gram-dodatnie; trzy ziarenkowce Gram-dodatnie. W zadaniach dotyczących diagnostyki mikologicznej (zadania V i VI) pojawiło się tylko kilka nieprawidłowych odpowiedzi. Obraz mikroskopowy, w Zadaniu V, wykonany z hodowli grzyba na podłożu stałym (zdjęcie V-2) był charakterystyczny dla rodzaju Fusarium. Jedno laboratorium błędnie podało, że zarodniki należą do rodzaju Alternaria, a jedno do rodzaju Aspergillus. Widoczne w zadaniu VI na zdjęciach mikroskopowych (zdjęcia VI-2, VI-3) zarodniki Alternaria również nie przysporzyły Laboratoriom większych problemów. Tylko czterech uczestników podało błędną interpretację: dwa laboratoria zakwalifikowało grzyb do rodzaju Aspergillus, trzecie do rodzaju Fusarium, a czwarte do rodzaju Rhizopus. W VI rundzie POLMICRO 2016 zadaniem laboratoriów było udzielenie odpowiedzi na jedenaście pytań, dotyczących interpretacji testów lekowrażliwości. Ocenę pozytywną otrzymały te laboratoria, które prawidłowo odpowiedziały minimum na 10 z 11 pytań. Wartość przypisana X wynosiła 22. Średnia liczba punktów zdobytych przez uczestników wynosiła 20,9 pkt., natomiast mediana 22 pkt., co pokazało, że zdecydowana większość laboratoriów (n= 264; 62,3%) prawidłowo odpowiedziała na wszystkie pytania zamieszczone w teście. Trzysta dziewięćdziesiąt pięć (93,2%) laboratoriów otrzymało ocenę pozytywną. Dwadzieścia dziewięć (6,8%) laboratoriów otrzymało ocenę negatywną z 3,0, z czego 20 laboratoriów udzieliło nieprawidłowych odpowiedzi na dwa spośród jedenastu pytań, 6 ośrodków na trzy pytania, a trzy laboratoria na cztery pytania. W pytaniu 1. dotyczącym naturalnej oporności Stenotrophomonas maltophilia pojawiło się 20 błędnych odpowiedzi. Szesnaście laboratoriów (3,8%) nieprawidłowo podało, że Stenotrophomonas maltophilia jest naturalnie oporny na tikarcylinę z kwasem klawulanowym, a 4 uczestników, że wykazuje naturalną oporność na ciprofloksacynę. W pytaniu 5. należało wybrać prawidłowe stwierdzenia dotyczące wykrywania karbapenemaz zgodnie ze Stanowiskiem Zespołu Roboczego ds. oznaczania lekowrażliwości zgodnie z zaleceniami EUCAST w sprawie najczęściej zadawanych pytań dotyczących stosowania rekomendacji EUCAST 1 stycznia 2016 roku [8]. Dziewięciu uczestników (2,1%) udzieliło nieprawidłowych odpowiedzi wybierając tylko informacje dotyczące pałeczek Enterobacteriaceae. W pytaniu 7. przedstawiono zdjęcia płytek antybiogramowych z oznaczeniem wrażliwości na glikopeptydy szczepów A Enterococcus gallinarum PM-293 i B Enterococcus faecium PM-294. Identyczne pytanie pojawiło się już w VI rundzie PO- LMICRO/2015 [14]. W 2015 roku nieprawidłowej odpowiedzi udzieliło aż 23,9% laboratoriów, natomiast w tej rundzie tylko 6,8% (n=29). Dwudziestu sześciu uczestników (6,1%) nieprawidłowo podało, że szczep A (E. gallinarum PM-293) prezentuje tylko fenotyp VanC, z czego sześć laboratoriów popełniło ten sam błąd w roku 2015 i 2016. Dwóch uczestników błędnie zaznaczyło, że szczepy A i B prezentują fenotyp VanB, a jeden nieprawidłowo określił fenotypy oporności na glikopeptydy obu szczepów. Najwięcej, bo aż 28% uczestników błędnie odpowiedziało na pytanie 9., które dotyczyło wykrywania mechanizmu MBL w czterech szczepach Klebsiella pneumoniae A-PM-295, B-PM- 297, C-PM-298 i D-PM-299 (uczestnikom przedstawiono zdjęcia czterech płytek antybiogramowych z testem fenotypowym pozwalającym wykryć mechanizm MBL). Tylko szczep B K. pneumoniae PM-297 wytwarzał metalo-β-laktamazę. W szczepie D można było zaobserwować delikatne wydłużenie się strefy zahamowania wzrostu przy krążku z imipenemem (10µg) od strony krążka z EDTA (10µg 0,5 M EDTA ph 7,3-7,5), ale zgodnie z zaleceniami KORLD wykrywanie karbapenemaz zalecenia 2015 za wynik dodatni testu uznaje się wyraźne powiększenie strefy wokół krążka z ceftazydymem i/lub karbapenemem od strony krążka zawierającego EDTA (inhibitor MBL), obraz ten jest podobny do dodatniego wyniku oznaczania ESBL metodą dwóch krążków [17]. Trzy laboratoria niepoprawnie uznały także za MBL-dodatni szczep A (K. pneumoniae PM-295, widoczne delikatne wydłużenie strefy), natomiast jedno laboratorium odpowiedziało, że mechanizm ten wytwarzają szczepy A i B (K. pneumoniae PM-295 i PM-297) Pytanie 10. dotyczyło wykrywania oporności gronkowców na makrolidy, linkozamidy i streptograminy. Dziesięciu uczestników (2,4%) błędnie podało, że przedstawiony na zdjęciu fenotyp to M-fenotyp. M-fenotyp to oporność na makrolidy przy zachowanej wrażliwości na streptograminy, ale wśród paciorkowców. Podobne zadanie pojawiło się w VI rundzie Sprawdzianu w 2015 roku, wtedy procent błędnych odpowiedzi wynosił 11,7% (n=50) [14]. Trzy laboratoria z tej grupy popełniły ten sam błąd dwukrotnie, w 2015 i 2016 roku. Pozostałe pytania nie przysporzyły Uczestnikom większych problemów. Błędnych odpowiedzi udzieliły tylko nieliczne laboratoria. Jak co roku, Laboratoriom, które uczestniczyły we wszystkich rundach programu POLMICRO 2016 i w każdej z nich uzyskały wynik pozytywny, COBJwDM przyznał Świadectwa Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Świadectwa te posiadają indywidualny numer i zachowują ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia. Ogółem w roku 2016 przyznano 366 świadectw, co stanowi 82,2% wszystkich 445 laboratoriów, które uczestniczyły w POLMICRO 2016. WEWNĘTRZNA KONTROLA TESTÓW LEKOWRAŻLIWOŚCI Zgodnie z rekomendacjami EUCAST, szczepem przeznaczonym do kontroli jakości lekowrażliwości Streptococcus pneumoniae 30

Diagn Lab 2017; 53(1): 23-32 i Streptococcus pyogenes służy szczep Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 [5]. Tylko trzysta siedemdziesiąt osiem laboratoriów z czterystu czterdziestu pięciu (84,9 %) w rundzie III POLMICRO 2016 zadeklarowało stosowanie tego szczepu w kontroli jakości. Do rutynowej kontroli jakości oznaczania lekowrażliwości Haemophilus influenzae EUCAST zaleca szczep H. influenzae ATCC 49766 [5] zastosowanie tego szczepu zadeklarowały trzysta trzydzieści dwa laboratoria (74,6%). Dwadzieścia osiem laboratoriów wskazało szczep H. influenzae ATCC 49247 służący do kontroli jakości wykrywania mechanizmów oporności. Zgodnie z rekomendacjami EUCAST, szczepem przeznaczonym do kontroli jakości lekowrażliwości Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella pneumoniae oraz Proteus mirabilis jest szczep Escherichia coli ATCC 25922 [5]. Czterysta trzy laboratoria (90,8 %) zadeklarowały stosowanie tego szczepu w kontroli jakości testów lekowrazliwości w ramach II rundy i czterysta dwadzieścia siedem laboratoriów (96,4%) w ramach V rundy POLMICRO w roku 2016. Dyskusja i podsumowanie Głównym zadaniem statutowym Centralnego Ośrodka badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej w Warszawie jest promowanie aktualnych standardów diagnostyki mikrobiologicznej i ujednolicanie metod badawczych w polskich laboratoriach medycznych. Program POLMICRO ma charakter badań biegłości poprzez porównania międzylaboratoryjne, a ponadto odgrywa ważną dla jakości diagnostyki mikrobiologicznej w Polsce, a tym samym dla zapewnienia bezpieczeństwa pacjentów role edukacyjną. Wzorem lat ubiegłych, w ramach poszczególnych rund POLMICRO 2016 główny nacisk położono na identyfikację drobnoustrojów oraz prawidłowe oznaczanie fenotypów wrażliwości na antybiotyki badanych izolatów bakteryjnych z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechanizmów oporności. Właściwa identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia oraz kompetencje laboratorium w oznaczaniu fenotypów wrażliwości patogenów umożliwiają podejmowanie odpowiednich decyzji terapeutycznych i działań związanych z kontrolą zakażeń. Ponownie w roku 2016 poddano także ocenie wstępny etap diagnostyki, jakim jest ocena preparatów mikroskopowych, bezpośrednich z materiałów klinicznych oraz wykonanych z hodowli drobnoustrojów. Sprawdziany POLMICRO organizowane w roku 2016 miały zarówno charakter praktyczny, wymagały odpowiedniego warsztatu laboratoryjnego, ale także zorganizowano sprawdziany czysto teoretyczne, wspomagane obrazami preparatów mikroskopowych, zdjęciami hodowli materiałów klinicznych, a także zdjęciami testów lekowrażliwości. Trzy rundy praktyczne dotyczyły głównie Gram-ujemnych pałeczek, zarówno z rodziny Enterobacteriaceae, ale także pałeczek niefermentujących. Istotne epidemiologicznie jest wykrywanie w szczepach pałeczek Gram-ujemnych nabytych enzymów takich jak: β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) i karbapenemazy [17]. Spośród ważnych klinicznie bakterii Gram-dodatnich ocenie poddano takie szczepy jak S. pneumoniae oporny na penicylinę, makrolidy i cefalosporyny III generacji, czy też S. pyogenes. Bardzo niepokojące jest określenie przez jednego z uczestników POLMICRO oporności S. pyogenes na penicylinę, gdyż jest to drobnoustrój o 100% wrażliwości na ten lek, który stanowi lek z wyboru w terapii zakażeń S. pyogenes [6]. S. pyogenes stanowi wyzwanie w opiece zdrowotnej, w większości przypadków odpowiedzialny jest za paciorkowcowe zapalenie gardła i migdałków, ale coraz częściej stanowi etiologię poważnych, o gwałtownym przebiegu i wysokiej śmiertelności zakażeń skóry i tkanki podskórnej [9]. Objawy zakażenia często związane są z wytwarzaniem przez S. pyogenes toksyn. W laboratorium tym konieczne jest wdrożenie działań zmierzających do wykrycia przyczyny tego błędu i zwiększenia nadzoru nad diagnostyką. W rundzie III POLMICRO 2015 poddano ocenie szczep kontrolny PM-245 H. influenzae o fenotypie BLNAR, który powinien być traktowany jako klinicznie oporny także na amoksycylinę z kwasem klawulanowym oraz cefuroksym, pomimo, iż in vitro może wykazywać wrażliwość na wymienione leki [14]. W roku 2016 włączono do Programu POLMICRO inny szczep H. influenzae PM-281, tym razem o fenotypie BLPAR. Błędy w określaniu fenotypów wrażliwości, mające przełożenie na ocenę negatywną, w większości przypadków związane były z nieprawidłową interpretacją kliniczną odczytywanych wielkości stref zahamowania wzrostu (mm) i wartości MIC (mg/l); mogły być także wynikiem nieprzestrzegania zalecanych warunków inkubacji testów antybiogramowych, użycia niskiej jakości podłoży antybiogramowych, czy też nieprawidłowo prowadzonej wewnętrznej kontrolą jakości testów lekowrażliwości. Wyniki porównań międzylaboratoryjnych POLMICRO 2016, podobnie jak w latach ubiegłych [5, 14], wykazały pewne niedoskonałości procedur wewnętrznej kontroli jakości u niektórych uczestników Programu POLMICRO. Stosowanie w kontroli jakości antybiogramów szczepów innych gatunków niż rekomendowane przez EUCAST jest nieprawidłowe, może zagrażać wiarygodności oznaczeń i wymaga pilnego wdrożenia działań mających na celu weryfikację procedur laboratoryjnych. Każda runda Programu POLMICRO 2016, wzorem ubiegłych edycji Sprawdzianu, kończyła się szczegółową analizą wyników oznaczeń oraz szeregiem wskazówek odnośnie stosowanych metod i technik diagnostycznych. Ważnym elementem diagnostyki mikrobiologicznej, wskazującym dalsze postępowanie laboratoryjne jest ocena bezpośrednich preparatów mikroskopowych z materiałów klinicznych, jak również preparaty mikroskopowe z hodowli [7, 10, 17]. Zarówno wersje elektroniczne, jak i wersje praktyczne laboratoryjne w zakresie oceny preparatów mikroskopowych, mają duże znaczenie edukacyjne i podnoszą kompetencje personelu laboratorium. Sprawdzian mikroskopowy w roku 2015 dowiódł potrzeby doskonalenia tego obszaru badawczego i dlatego, ponowne poddanie kontroli tego etapu badania mikrobiologicznego miało miejsce w I i IV rundzie POLMICRO 2016. Opis różnorodnych przypadków klinicznych w połączeniu z odpowiednimi parametrami hematologicznymi, biochemicznymi i analitycznymi, w połączeniu z wynikami badań mikrobiologicznych pozwala właściwie zinterpretować stan pacjenta i podjąć odpowiednie postepowanie diagnostyczno-terapeutyczne. Ze względu na rolę edukacyjną Programu POLMICRO w roku 2015 w ocenie rocznej pominięto wyniki końcowe rundy IV POLMICRO 2015 dotyczącej oceny preparatów mikroskopowych. Jednakże, zestawienie wyników tur POLMICRO z 2015 i 2016 roku, których przedmiotem była ocena preparatów mikroskopowych, 31

www.diagnostykalaboratoryjna.eu wskazała jednoznacznie na znaczną poprawę diagnostyki w tym zakresie. Procent prawidłowych wyników uzyskiwanych przez laboratoria w kolejnych turach Programu POLMICRO w roku 2015 był zróżnicowany i wynosił od 79,7% do 96,8% [14], podczas gdy w roku 2016 wynosił od 93,2% do 95,5%. Postęp, w porównaniu z rokiem 2015, zaobserwowano także w liczbie przyznanych świadectw uczestnictwa i uzyskania pozytywnych wyników w Ogólnopolskim Zewnątrzlaboratoryjnym Sprawdzianie Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. I tak, w POLMICRO 2015 świadectwa otrzymało 314 (tj. 70,6%) laboratoriów [13, 14], podczas gdy w roku 2016 przyznano 366 świadectw, co stanowi 82,2% wszystkich laboratoriów uczestniczących w POLMICRO 2016. Piśmiennictwo: 1. Eksperckie zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zalecenia EUCAST, wersja 2.0, Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz http://www.korld.edu.pl 2. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance. Version 1.0, July 2013. http://www.eucast.org 3. Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST). Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu; wersja 6.0, 2016; Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz. http://www.korld.edu.pl 4. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 6.0, 2016. http:// www.eucast.org 5. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST. Version 6.1, 2016. http://www.eucast.org 6. Gracia M, Díaz C, Coronel P, Gimeno M, García-Rodas R, Rodrí guez-cerrato V, et al. Antimicrobial susceptibility of Streptococcus pyogenes in Central, Eastern, and Baltic European countries, 2005 to 2006: the cefditoren surveillance program. Diagn Microbiol InfectDis2009;64(1):52-56. 7. Hryniewicz W., Szczypa K., Krzysztoń-Russjan J., Chmylak B., Matynia B. VI Krajowy Zewnętrzny Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych PO- LMICRO 99. Diagn. Lab. 2000; 36, 57-65. 8. Hryniewicz W. Żabicka D. Stanowisko Zespołu Roboczego ds. oznaczania lekowrażliwości zgodnie z zaleceniami EUCAST w sprawie najczęściej zadawanych pytań dotyczących stosowania rekomendacji EUCAST 1 stycznia 2016 roku. http://www.korld.edu.pl 9. Lopardo HA, Vidal P, Sparo M, Jeric P, Centron D, Facklam RR, et al. Six-month multicenter study on invasive infections due to Streptococcus pyogenes and Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in Argentina. J Clin Microbiol 2005; 43(2): 802-807. 10. Młodzińska E., K. Bosacka, E. Stefaniuk, M. Fortuna, W. Hryniewicz. Bezpośredni preparat mikroskopowy kontrola jakości pierwszego etapu diagnostyki mikrobiologicznej. Diagn. Lab. 2014; 50(4): 299-306. 11. Norma PN-EN ISO/IEC 17043:2011 Ocena zgodności Ogólne wymagania dotyczące badania biegłości. 12. Sogaard M., Norgaard M., Schonheyder H.C. First notification of positive blood cultures and high accuracy of the Gram stain report. J Clin Microbiol. 2007; 1113-1117 13. Stefaniuk E. Kryteria oceny porównań międzylaboratoryjnych. Laboratorium. Przegląd Ogólnopolski. 2016; 11-12:35-38 14. Stefaniuk E., Bosacka K., Młodzińska E., Mikołajczyk A., Fortuna M., Hryniewicz W. POLMICRO 2015 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Diagn Lab 2016, 52(1): 29-38. 15. Strand C.L. Positive blood cultures. Can we always trust the Gram stain? Am J Clin Pathol 2006; 126:671-672 16. Uehara Y., Yagoshi M., Tanimichi Y., Yamada H., Shimoguchi K., Yamato S., Yanari M., Kumasaka K. Impact of reporting gram stain results from blood culture bottles on the selection of antimicrobial agents. Am J Clin Pathol 2009; 132(1):18-25. doi: 10.1309/AJCP0H2DAMBXZUSS 17. Żabicka D., Baraniak A., Literacka E., Gniadkowski M., Hryniewicz W. Wykrywanie karbapenemaz zalecenia 2015. http://www.antybiotyki.edu.pl Adres do korespondencji: dr n. med. Elżbieta Stefaniuk Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej 01-793 Warszawa, ul. Rydygiera 8 bud. 20A tel. +48 22 8415834 e-mail: estefaniuk@cls.edu.pl, sprawdzian@polmicro.edu.pl Otrzymano: 19.03.2017 Akceptacja do druku: 31.03.2017 Konflikt interesów: nie zgłoszono 32