PL B1. Sposób hodowli pierwotnej ludzkich fibroblastów do autologicznych zabiegów augmentacyjnych

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 5/071 ( ) A61C 8/00 ( ) A61K 35/32 ( ) (54) Sposób hodowli pierwotnej ludzkich fibroblastów do autologicznych zabiegów augmentacyjnych (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 12/08 (73) Uprawniony z patentu: AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/11 (72) Twórca(y) wynalazku: MARZENA DOMINIAK, Tyniec Mały, PL JOLANTA SACZKO, Wrocław, PL PL B1

2 2 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób hodowli pierwotnej ludzkich fibroblastów do autologicznych zabiegów augmentacyjnych pochodzących z tkanki łącznej dziąsła zrogowaciałego błony śluzowej jamy ustnej, znajdujących zastosowanie w zabiegach augmentacyjnych, to jest pogrubienia i poszerzenia tkanek miękkich wyrostka zębodołowego. Podstawowym problemem w zabiegach augmentacyjnych tkanek miękkich wyrostka zębodołowego jest ograniczenie w uzyskaniu wystarczającej ilości podnabłonkowej tkanki łącznej pochodzącej z miejsca dawczego z okolic zrogowaciałej błony śluzowej jamy ustnej dla rozległych augmentacji i/lub pokrycia mnogich recesji przyzębia. Ponadto po pobraniu przeszczepu z podnabłonkowej tkanki łącznej z podniebienia twardego czas potrzebny dla pełnej odbudowy miejsca dawczego wynosi około 6 miesięcy. Ogranicza to w zdecydowany sposób możliwość wykonania kilku po sobie zabiegów pozwalających na szybką odbudowę tkanek zrogowaciałych błony śluzowej wyrostka zębodołowego, wydłużając tym samym czas przewidziany na całą procedurę terapeutyczną. Poza tym występująca w znanych metodach konieczność stworzenia drugiego pola zabiegowego na podniebieniu twardym lub wyrostku zębodołowym, dla pobrania odpowiedniej ilości podnabłonkowej tkanki łącznej, dodatkowo wydłuża czas trwania podstawowego zabiegu. Dodatkowym problemem jest brak możliwości standaryzacji grubości pobranego przeszczepu podnabłonkowej tkanki łącznej, co skutkuje niejednokrotnie nieestetycznym pogrubieniem błony śluzowej wyrostka zębodołowego. Grubość pobranego przeszczepu determinuje także możliwość jego rewaskularyzacji, czyli ponownego unaczynienia w miejscu biorczym. Musi on być bowiem pokryty płatem śluzówkowym w 3/4 swojej powierzchni, co przy zbyt dużej jego grubości wpływa niekorzystnie na napięcie tkanek płata śluzówkowego. Dodatkowo przy niejednokrotnie występującej pierwotnie zbyt małej jego grubości dochodzi do zbyt dużego wzajemnego nacisku tkanek, skutkującego w niewłaściwym unaczynieniu i możliwości rozwoju martwicy lub utrudnionego wgajania przeszczepu, co z kolei warunkuje niepowodzenie zabiegu. Rolą tkanki łącznej pobranej z okolic błony śluzowej jamy ustnej jest determinowanie charakteru leżącego nad nią nabłonka jamy ustnej, czyli powstania dziąsła zrogowaciałego (Karting T et al. J Periodontol. 10, 1978, 1). Dziąsło to w warunkach prawidłowych powinno pokrywać wyrostki zębodołowe z tkwiącymi w nich zębami w minimalnej szerokości około 2-3 mm. Warunkuje to prawidłowe i wydolne funkcjonowanie aparatu narządu żucia, unikając między innymi powstanie powikłań w postaci recesji przyzębia i wszelkich konsekwencji ich obecności (Dominiak M. i wsp., Czas, Stomat., 55, 2002, 428). Dodatkowo w przypadku braku odpowiedniej szerokości dziąsła zrogowaciałego utrudnione jest leczenie implantologiczne i protetyczne wpływające na rehabilitację narządu żucia. Jak wynika z piśmiennictwa były już izolowane i badane pod względem ich użyteczności w hodowlach pierwotnych głównie dwa typy komórek, flbroblasty i keratynocyty, stosowane dla uzupełniania uszkodzonych przez choroby takie jak infekcje bakteryjne czy grzybicze lub urazy np. oparzenia fragmentów tkanek (Green et al. Proc Natl Acad Sci 76/1979/,5665; Bell et al. Proc Natl Acad Sci 76/1979/,1274; Dembowska i wsp. Czas Stomat 58/2005/,3). Green i współpracownicy opracowali podłoże i metodę pozwalającą na wzrost i różnicowanie keratynocytów in vitro. Keratynocyty poddawano trypsynizacji i zawieszeniu w pożywce hodowlanej, a następnie przesianiu na monowarstwę fibroblastów linii 3T3Balb napromieniowanych letalną dawką promieniowania. Spełniają one wyłącznie funkcję warstwy odżywczej i podłoża wzrostu. Warstwa naskórka rozwija się bardzo gwałtownie tworząc tkankę o grubości 3-5 warstw komórek, która może być przeszczepiana pacjentowi. Posługując się techniką Greena można otrzymać z biopsji 2 cm 2 skóry 1 m 2 naskórka w ciągu trzech tygodni. Pierwszą tkanką, którą udało się częściowo odtworzyć in vitro była skóra właściwa (Bell et al. Proc Natl Acad Sci 76/1979). Otrzymane w wyniku biopsji skóry fibroblasty namnażano w hodowli, początkowo w monowarstwie, następnie po kilkakrotnym pasażowaniu w zawiesinie komórek w płynnym podłożu z kolagenem wyekstrahowanym ze ścięgien ogona szczura, tworzącym po pewnym czasie żel umożliwiający trójwymiarowy wzrost kolonii. W takich hodowlach fibroblasty oddziaływują ze zrębem kolagenowym, organizując go i obkurczając jak w normalnej skórze właściwej. Tak odtworzona tkanka in vitro znana jest jako skóra zastępcza. Może być przeszczepiana pacjentom, niestety nie spełnia funkcji bariery oddzielającej od środowiska zewnętrznego. Dembowska i współtwórcy (Czas. Stomat., 58, 2005, 3) po pobraniu fragmentu błony śluzowej z zachyłka jamy ustnej przepłukiwali ją trzykrotnie w PBS w/o Ca i Mg z dodatkiem 100 jed-

3 3 nostek lu/ml penicyliny krystalicznej i 10 μg/ml streptomycyny. Następnie mechanicznie rozdrabniali i kawałki wkładali do naczyń hodowlanych. Inkubacje przeprowadzano w ściśle określonym medium hodowlanym przez około 2-3 dni uzyskując hodowlę pierwotną. Po zmianie medium hodowlanego namnażano komórki, które po osiągnięciu 70% powierzchni dna naczynia hodowlanego, to jest po około 7 dniach, pasażowano stosując 0,05% trypsynę z dodatkiem 0,01% EDTA. Aktywność jej hamowano stosując sojowy inhibitor trypsyny. Pożywkę hodowlaną w hodowlach wtórnych zmieniano co 48 godzin. Uzyskaną zawiesinę komórek w pożywce hodowlanej wlewano w wypreparowane nadokostnowo tak zwane okienko błony śluzowej wykonane poniżej dziąsła zrogowaciałego. W ten sposób, po zabezpieczeniu rany gąbką fibrynową i kolagenową, po 14 dniach uzyskiwano wygojenie rany. Po 3 miesiącach widoczna była linijna blizna, a poniżej wzrost szerokości dziąsła zrogowaciałego, bez wpływu na stan recesji przyzębia. Z polskiego opisu patentowego nr znany jest sposób wytwarzania hodowli ludzkich keratynocytów płodowych lub dorosłych albo tkanki zastępczej zdolnej do odtworzenia, przeniesienia i dającej się zastosować jako przeszczep, który polega na tym, że składniki podłoża biologicznego miesza się z wytworzeniem jednolitej błony na szalce hodowlanej i na błonę tę wysiewa się zawiesinę keratynocytów w pożywce hodowlanej. W sposobie tym można mieszać dwa składniki podłoża biologicznego z zawiesiną keratynocytów lub stosując zawiesinę keratynocytów otrzymaną przez rozproszenie świeżej, wcześniej założonej warstwy komórek lub stosując zawiesinę keratynocytów otrzymaną z banku tkanek. Istotnym problemem w hodowlach pierwotnych uzyskiwanych z fragmentów tkanki jest możliwość otrzymania niejednorodnej mieszaniny komórek. Pobrane od pacjenta fragmenty tkanki mogą zawierać obok fibroblastów inne typy komórek np. keratynocyty. Istotne jest dobranie takich warunków izolacji i hodowli, które pozwoliłyby na uzyskanie i namnażanie w hodowlach pierwotnych tylko fibroblastów. Ważne jest również zabezpieczenie komórek przed infekcjami bakteryjnymi i grzybiczymi. Ludzkie fibroblasty izolowano już z fragmentów dziąsła przy użyciu metod wymagających enzymów - kolagenazy. (Prato 20/2000/553). Procedura ta składa się z czterech odrębnych części: biopsji dziąsła, hodowli komórek in vitro, zabiegu chirurgicznego przeniesienia komórek pacjentowi, obserwacji po zabiegu chirurgicznym. Pobiera się fragmenty tkanki nabłonkowo-łącznotkankowej dziąsła o wielkości 2 x 1 x 1 mm. Fibroblasty izoluje się z fragmentu tkanki przy użyciu enzymu kolagenazy. Komórki gotowe są do przeniesienia na pacjenta w zabiegu chirurgicznym po 15 dniach hodowli. W hodowlach tych oprócz standartowych antybiotyków, takich jak penicylina czy streptomycyna, nie stosuje się antybiotyków przeciwgrzybiczych, co zwiększa ryzyko infekcji hodowli grzybami. Wiadomo także, że metoda polegająca na mechanicznej izolacji komórek z tkanki jest efektywniejsza niż enzymatyczna i zmniejsza ryzyko zmian w komórkach, do jakich może dojść pod wpływem enzymów. Wynalazek dotyczy sposobu hodowli pierwotnej ludzkich fibroblastów do autologicznych zabiegów augmentacyjnych pochodzących z tkanki łącznej dziąsła zrogowaciałego błony śluzowej jamy ustnej z użyciem szalek hodowlanych i płynu hodowlanego. Istota wynalazku polega na tym, że pobrane znaną techniką medyczną w sposób jałowy fragmenty tkanki łącznej dziąsła zrogowaciałego o powierzchni 1-2 mm 2 umieszcza się na szalkach Petriego w płynie hodowlanym z dodatkiem 10% surowicy płodowej oraz 0,03% L-glutaminy i Amfoterycyny B 100 μg/ml, po czym materiał ten rozdrabnia się mechanicznie na fragmenty o wielkości około 0,4 mm 2 i prowadzi hodowlę przez 3-5 dni, w temperaturze około 37 C, w atmosferze 5% CO 2. Po osiągnięciu pełnej monowarstwy komórki przenosi się na nośnik, którym jest siatka kolagenowa zbudowana z wysoko oczyszczonego kolagenu świńskiego w postaci trójwymiarowej o kształcie i powierzchni dostosowanych do wielkości ubytku tkanek miękkich dziąsła zrogowaciałego i zawiesza się ponownie w płynie hodowlanym pozostawiając na okres do 5 dni, po czym nośnik z komórkami przenosi się w miejsce biorcze pacjenta. Korzystne jest stosowanie do odklejania komórek, w celu ich przeniesienia na siatki kolagenowe, trypsyny, której działanie następnie inaktywuje się, wirując komórki z dodatkiem tego samego płynu hodowlanego. Sposobem według wynalazku uzyskuje się możliwość przeprowadzenia szybkiego i mało inwazyjnego zabiegu augmentacyjnego, przy optymalnym i estetycznym efekcie terapeutycznym. Uzyskanie na drodze izolacji pojedynczych fibroblastów z pobranych od pacjenta bardzo małych fragmentów tkanki łącznej dziąsła zrogowaciałego błony śluzowej jamy ustnej, pozwala na ich szybkie namnożenie i możliwość implantacji w miejscu ubytku tkankowego w takim zakresie i ilo-

4 4 ści, jakiej wymaga wielkość ubytku. Sposób izolacji ludzkich fibroblastów według wynalazku polega na izolacji mechanicznej, bez ingerencji enzymatycznej, a stosowanie odpowiednio dobranego medium oraz dodatków w postaci surowicy, L-glutaminy i Amfoterycyny B - zabezpiecza hodowlę przed zakażeniem bakteriami i grzybami, wpływa korzystnie na proliferację i wzrost fibroblastów w hodowli. Tak opracowana prosta, szybka i powtarzalna metoda izolacji i hodowli ludzkich fibroblastów pozwala skrócić czas hodowli do 5 dni, w porównaniu do znanych sposobów trwających powyżej 10 dni, co tym samym skraca czas oczekiwania pacjenta na zabieg chirurgiczny. Zastosowanie fibroblastów komórek tkanki łącznej, namnożonych w hodowli pierwotnej i przeniesionych na odpowiednich nośnikach w miejsce biorcze, zapewnia zniwelowanie wszelkich trudności w augmentacji błony śluzowej wyrostka zębodołowego. P r z y k ł a d. Przykład dotyczy hodowli fibroblastów celu augmentacji dziąsła zrogowaciałego błony śluzowej jamy ustnej. Etap 1. Postępowanie antyinfekcyjne. Postępowanie to rozpoczyna się od kwalifikacji i przygotowania samego pacjenta. Warunkiem przystąpienia do zabiegu jest wykluczenie stosowania w czasie ostatnich 3 miesięcy doustnej antybiotykoterapii, sterydoterapii lub innej suplementacji lekowej, wpływającej na stan przyzębia. Wykluczeniem jest również aktualnie trwająca infekcja wirusowa, nałogowe palenie tytoniu, zły stan higieny jamy ustnej określonej wskaźnikiem higieny jamy ustnej PI1 powyżej 20%. Dla eliminacji możliwości nadkażenia grzybiczego hodowli, uniemożliwiającej jej kontynuowanie, poleca się pacjentowi wykonanie badań mykologicznych. W przypadku otrzymania wyniku o obecności mnogich kolonii grzybiczych w posiewie zleca się pacjentowi stosowanie przez 14 dni miejscowo do pędzlowania jamy ustnej antymitotyku w postaci Nystatyny w zawiesinie lub preparatu Daktarin gel. Etap 2. Pobranie tkanki. Pobranie niewielkiej ilości tkanki odbywa się w znieczuleniu nasiękowym w warunkach aseptycznych. Po wykonaniu znieczulenia miejsca biorczego poleca się pacjentowi przepłukanie jamy ustnej wodnym roztworem antyseptyku, a samo miejsce biorcze dodatkowo przemywa się 96% alkoholem przez 5 sekund. Zależnie od warunków miejscowych pobiera się fragmenty nabłonkowołącznotkankowe, o powierzchni około 1-2 mm 2, z okolicy dziąsła zrogowaciałego wyrostka zębodołowego lub podniebienia twardego. Uzyskany fragment dziąsła umieszcza się na około 1 minutę w roztworze kwasu bornego celem eliminacji ewentualnej flory bakteryjnej. Po tym czasie bioptat przekłada się do odżywczego płynu transportowego, w którym w ciągu 2 godzin przewozi się do laboratorium. Etap 3. Hodowla fibroblastów. Po usunięciu tkanek towarzyszących, z pobranych fragmentów wielkości 1-2 mm 2 fibroblasty izoluje się mechanicznie tnąc skalpelem i nożyczkami na kawałki wielkości 0,2-0,4 mm 2 bez udziału enzymów. Izolację fibroblastów i hodowlę pierwotną prowadzi się następująco: Dzień po założeniu hodowli oczyszcza się ją, zmieniając płyn hodowlany w celu pozbycia się martwych komórek. Hodowlę prowadzi się w butelkach hodowlanych w medium hodowlanym z dodatkiem 10% cielęcej surowicy płodowej, penicyliny (100 Ul/ml), streptomycyny (100 μl/ml) i Amfoterycyny B (100 μg/ml). Butelki hodowlane umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37 C, w atmosferze 5% CO 2. Komórki osiągają pełną monowarstwę po pięciu dniach. Płyn hodowlany zmienia się 3 razy w tygodniu. Po osiągnięciu pełnej monowarstwy, fibroblasty przenosi się na nośnik. Jako nośnik stosuje się trójwymiarową błonę kolagenową pochodzącą z osierdzia świńskiego o grubości 0,2-0,4 +/- 0,1 mm. Kształt i powierzchnię błony z monowarstwą komórek dostosowuje się do wielkości ubytku tkanek miękkich dziąsła zrogowaciałego. W ten sposób przygotowane i umieszczone komórki na siatce do przeszczepu stanowią cienką warstwę doskonale adaptującą się w miejscu biorczym, tj. na wyrostku zębodołowym. Nie pogrubiają nadmiernie błony śluzowej wyrostka zębodołowego, wpływając tym samym na prawidłowe napięcie płata śluzówkowego. Położone z jednej strony na okostnej, a drugiej strony pokryte płatem są doskonale odżywione, co umożliwia prawidłowe wgojenie i osiągnięcie pożądanej i estetycznej keratynizacji, czyli grubości i szerokości dziąsła zrogowaciałego, nawet na dużym obszarze w miejscu biorczym. Nowo powstała tkanka nie ma charakteru i koloru przerostu bliznowatego. O wielkości augmentowanego obszaru decyduje wyłącznie pierwotny ubytek tkankowy. Namnożone na siatkach fibroblasty przewożone są w płynie hodowlanym w warunkach sterylnych na salę zabiegową, na której w ciągu jednej godziny wykonuje się zabieg.

5 5 Etap 4. Postępowanie zabiegowe dla aplikacji namnożonych komórek w miejsce biorcze. Procedura zabiegowa rozpoczyna się od znieczulenia nasiękowego miejsca biorczego i przepłukania jamy ustnej roztworem antyseptyku. Następnie prowadzi się cięcia poziome przez szczelinę dziąsłową i zależnie od typu brodawek dziąsłowych albo przez szczyty albo u ich podstawy oraz pionowo-rozbieżne. Umożliwiają one odwarstwienie płata śluzówkowego, z pozostawieniem okostnej na wyrostku zębodołowym. Następnie wprowadza się nośnik z fibroblastami w miejsce biorcze. Umieszcza się go na obnażonej okostnej w miejscu pozbawionym lub o niewielkiej wysokości dziąsła zrogowaciałego oraz po stronie bliższej i dalszej zębów operowanych. Ponieważ nośnik również częściowo pokrywa dehiscencje kostne, nie więcej niż 1/3 poza podłożem kostnym i okostną, dla odżywienia fibroblastów pokrywa się go płatem śluzówkowym przesuwanym dokoronowo. Płat stabilizuje się za pomocą nici nieresorbowalnych. Etap 5. Postępowanie pozabiegowe W postępowaniu pozabiegowym stosuje się leki przeciwbakteryjne, osłonę przeciwgrzybiczą oraz środki przeciwbólowe. Ponadto poleca się płukanie jamy ustnej wodnym roztworem antyseptyku, stosowanie miękkich szczoteczek pooperacyjnych oraz miękkiej diety. Szwy zdejmuje się po 14 dniach od zabiegu. Etap 6. Ocena skuteczności augmentacji tkanki dziąsła Ocena dokonywana jest w miejscu zabiegowym i przy zębach w badanym obszarze, na podstawie pomiaru: szerokości i grubości dziąsła zrogowaciałego, odległości granicy szkliwnocementowej od połączenia śluzówkowo-dziąsłowego, wysokości i szerokości recesji dziąsłowych w badaniu klinicznym przedzabiegowo i w 2 tygodnie oraz co 1, 3, 6 miesięcy pozabiegowo. Dla optymalizacji pomiaru klinicznego wykonuje się pomiar ultrasonograficzny grubości dziąsła zrogowaciałego przedzabiegowo i w 6 miesięcy po zabiegu, za pomocą aparatu ultrasonograficznego o wielkości głowicy 5 mm. Ocenia się również estetykę pozabiegową wg 3-stopniowej klasyfikacji Boucharda i współtwórców (J Periodontol 65,1994,929) jako dobrą - estetyka po zabiegu lepsza niż przed zabiegiem; prawidłową - estetyka nie poprawiła się do stanu sprzed zabiegu; oraz słabą - estetyka po zabiegu gorsza niż przed zabiegiem. Ocenia się ponadto stopień pokrycia powierzchni korzeni zębów; dobór koloru dziąsła do otaczających tkanek: błony śluzowej wyrostka zębodołowego, dziąsła zrogowaciałego; wygląd tkanek miękkich: przerost grubości dziąsła zrogowaciałego, blizny lub zwłóknienia; dobór napięcia i konsystencji dziąsła oraz położenia linii śluzówkowo-dziąsłowej. WYKAZ LITERATURY 1. Karring T., Lang N.P., Löe H.: The role of gingival connective tissue in determining epithelial differentiation. J. Periodontol., 1978, 10, Dominiak M., Konopka T.: Porównanie skuteczności klinicznej chirurgicznych metod leczenia recesji dziąsła. Czas. Stomat., 2002, 55, Green H., Kehinde O., Thomas J.: Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, 76, Bell E., Ivarsson Dembowski., Merrill C: Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, 76, Dembowska E., Banach J., Sporniak-Tutak K., Czuryszkiewicz-Cyrana J., Kowalska E.: Transplantacja wyhodowanych in vitro autogennych komórek nabłonka błony śluzowej policzka do rekonstrukcji wąskiej strefy dziąsła zębodołowego- wstępne wyniki badań klinicznych. Czas. Stomat., 2005, 58, 1, Houpliness H.B., Lambeersart V.R.: Sposób wytwarzania hodowli ludzkich keratynocytów. Opis patentowy PL B1, WUP 10/95, Pini Prato G.P., Rotundo R., Magnani C, Soranzo C: Tissue engineering technology for gingival augmentation procedures: a case report. Int. J. Periodontics Restorative Dent, 2000, 20, Bouchard P., Etienne D., Outhayoun J-P., Nileveus R.: Subepithelial connective tissue grafts in the treatment of gingival recessions. A comparative study of 2 procedures. J Periodontol., 1994, 65,

6 6 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób hodowli pierwotnej ludzkich fibroblastów do autologicznych zabiegów augmentacyjnych pochodzących z tkanki łącznej dziąsła zrogowaciałego błony śluzowej jamy ustnej pobranych od pacjenta, z użyciem szalek hodowlanych i płynu hodowlanego, znamienny tym, że pobrane znaną techniką medyczną w sposób jałowy fragmenty tkanki łącznej dziąsła zrogowaciałego o powierzchni 1-2 mm 2 umieszcza się na szalkach Petriego w płynie hodowlanym z dodatkiem 10% surowicy płodowej oraz 0,03 % L-glutaminy i Amfoterycyny B 100 μg/ml, po czym materiał ten rozdrabnia się mechanicznie na fragmenty o wielkości około 0,4 mm 2 i prowadzi hodowlę przez 3-5 dni, w atmosferze 5% CO 2, natomiast po osiągnięciu pełnej monowarstwy komórki przenosi się na nośnik, którym jest siatka kolagenowa zbudowana z wysoko oczyszczonego kolagenu świńskiego w postaci trójwymiarowej o kształcie i powierzchni dostosowanych do wielkości ubytku tkanek miękkich dziąsła zrogowaciałego i zawiesza się ponownie w płynie hodowlanym, pozostawiając na okres do 5 dni, po czym nośnik z komórkami przenosi się w miejsce biorcze pacjenta. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed przeniesieniem komórek na siatki kolagenowe, odkleja się je za pomocą trypsyny, której działanie następnie inaktywuje się, wirując komórki z dodatkiem tego samego płynu hodowlanego.

7 Rysunki 7

8 8 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)