AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH. dr Dorota Juchno Katedra Zoologii Uniwersytet Warmińsko - Mazurski w Olsztynie

Transkrypt

1 AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH dr Dorota Juchno Katedra Zoologii Uniwersytet Warmińsko - Mazurski w Olsztynie Olsztyn, 2017

2 1. Imię i Nazwisko: Dorota Juchno 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe: doktor nauk biologicznych, specjalność zoologia, Wydział Biologii Uniwersytetu Warmińsko - Mazurskiego w Olsztynie; tytuł pracy doktorskiej: Rozwój gonad i gametogeneza kozy Cobitis taenia L. i naturalnych allopoliploidów Cobitis (Pisces, Cobitidae). Promotor: prof. dr hab. Alicja Boroń. Recenzenci: prof. dr hab. Maria Ogielska, prof. dr hab. Maria Brylińska 1995 magister biologii, specjalność biologia ogólna, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu; tytuł pracy magisterskiej: Rytmika dobowa temperatury preferowanej przez szczury hodowane w temperaturze pokojowej. Promotor: prof. dr hab. Michał Caputa. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: Od do chwili obecnej - adiunkt w Katedrze Zoologii Uniwersytetu Warmińsko- Mazurskiego w Olsztynie Od do asystent w Katedrze Zoologii Uniwersytetu Warmińsko- Mazurskiego w Olsztynie Od do technik w Katedrze Zoologii Akademii Rolniczo- Technicznej w Olsztynie (obecnie UWM Olsztyn) 2

3 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) Tytuł osiągnięcia naukowego: Potencjał rozrodczy ryb z rodzaju Cobitis (Teleostei, Cobitidae) w populacjach diploidalnych i mieszanych, diploidalno-poliploidalnych Osiągnięcie naukowe stanowi cykl pięciu oryginalnych prac naukowych opublikowanych w latach , z których cztery ukazały się w czasopismach z bazy Journal Citation Reports. Sumaryczny impact factor (zgodny z rokiem opublikowania) tych prac wynosi 4,519 (IF 2016/17 = 4,326) a sumaryczna liczba punktów MNiSW to 93 (MNiSW = 102 pkt). We wszystkich publikacjach jestem autorem pierwszym oraz korespondującym. b) Wykaz publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe: (przy publikacjach podano punkty MNiSW wg Komunikatu Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego w sprawie wykazu czasopism naukowych z roku wydania oraz za lata IF podano z roku wydania oraz z roku 2016/17). 1. Juchno D., Boroń A., Kujawa R., Szlachciak J., Szacherski Sz., Spóz A., Grabowska A Comparison of the size of eggs and offspring of karyologically identified spined loach Cobitis taenia L. and hybrid triploid Cobitis females (Pisces, Cobitidae). Archives of Polish Fisheries 21 (4): MNiSW 2013 = 8 pkt, MNiSW = 12 pkt Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu doświadczeń i wykonaniu większości analiz (pomiary oocytów i wylęgu, analiza statystyczna) oraz przygotowaniu manuskryptu, przygotowaniu odpowiedzi na recenzje i ostatecznej redakcji manuskryptu po recenzjach, jestem przy tym autorem korespondującym publikacji. Mój udział procentowy szacuję na 70%. 2. Juchno D., Jabłońska O., Boroń A., Kujawa R., Leska A., Grabowska A., Nynca A., Świgońska S., Król M., Spóz A., Laskowska N., Lao M Ploidy-dependent survival of progeny arising from crosses between natural allotriploid Cobitis females and diploid C. taenia males (Pisces, Cobitidae). Genetica 142: MNiSW 2014 = 20 pkt, IF 2014 = 1,400 MNiSW = 20 pkt. IF 2016/17 = 1,207 Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na współopracowaniu koncepcji badań i koordynacji części doświadczanej. Byłam współwykonawcą eksperymentalnych krzyżowań, dokonałam obserwacji rozwoju embrionalnego i larwalnego, analizy badanych parametrów (% wylęgu, przeżywalność) zaprezentowanych w pracy. Przygotowałam wstępną wersję 3

4 manuskryptu i przygotowałam późniejsze jego korekty. Jestem autorem korespondującym publikacji. Mój udział procentowy szacuję na 60%. 3. Juchno D., Boroń A., Szlachciak J., Kujawa R Early development and post embryonic skeletal morphology of the progeny of spined loach Cobitis taenia L. (Teleostei, Cobitidae) and its naturally occurred allotriploids. Folia Biologica Kraków 64(3): MNiSW 2016 = 15 pkt, IF 2016 = 0,581 MNiSW =20 pkt Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu doświadczeń i współwykonaniu eksperymentalnych krzyżowań oraz większości analiz prezentowanych w pracy (obserwacja, archiwizacja i analiza rozwoju embrionalnego i larwalnego, analiza statystyczna). Przygotowałam manuskrypt do druku oraz odpowiedzi na recenzje i ostateczną wersję manuskryptu po recenzjach, jestem także autorem korespondującym publikacji. Mój udział procentowy szacuję na 80%. 4. Juchno D., Arai K., Boroń A., Kujawa R Meiotic chromosome configurations in oocytes of Cobitis taenia and its polyploid hybrids. Ichthyological Research 64(2): MNiSW 2016 = 20 pkt, IF 2016/17 = 1,258 MNiSW = 20 pkt Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na współopracowaniu koncepcji badań oraz wykonaniu części doświadczalnej (preparacja jąder oocytów, przygotowaniu i analizie preparatów z chromosomami dipotenowymi oraz wykonaniu dokumentacji fotograficznej). Miałam także znaczący współudział w pisaniu i korekcie redakcyjnej artykułu. Jestem także autorem korespondującym publikacji. Mój udział procentowy szacuję na 60%. 5. Juchno D., Pecio A., Boroń A., Leska A., Jabłońska O., Cejko B.I., Kowalski R.K. Judycka S., Przybylski M Evidence of the Sterility of Allotetraploid Cobitis Loaches (Teleostei, Cobitidae) by Testes Ultrastructure. Journal of Experimental Zoology part A 327: MNiSW 2016 = 30 pkt, IF 2016/17 = 1,28 MNiSW =30 pkt Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu doświadczeń, wykonaniu eksperymentów i większości analiz prezentowanych w pracy (utrwalenie materiału, współwykonanie skrawków do analiz ultrastrukturalnych, analiza zdjęć z mikroskopii ultrastrukturalnej i świetlnej). Przygotowałam manuskrypt do druku, przygotowałam odpowiedzi na recenzje i ostateczną wersję manuskryptu po recenzjach, jestem także autorem korespondującym publikacji. Mój udział procentowy szacuję na 70%. 4

5 c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Wprowadzenie (wykaz cytowanych publikacji podano na końcu Autoreferatu) Specjacja, czyli powstawanie gatunków polega między innymi na wykształceniu mechanizmów izolacji rozrodczej zapewniających niemożność krzyżowania się osobników należących do różnych gatunków. Pomimo to, głównie u roślin, ale i wśród zwierząt obserwowane jest powstawanie mieszańców. Dotyczą one przede wszystkim bezkręgowców (Piferrer i in. 2009), a wśród kręgowców najczęściej występują u ryb doskonałokostnych Teleostei (Comber i Smith 2004; Piferrer i in. 2009). Liczne prace dostarczają danych na temat mieszańców międzygatunkowych, rzadziej międzyrodzajowych (Kirczuk i Domagała 2010; Mable i in. 2012; Choleva i Janko 2013). Pojawianie się naturalnie występujących mieszańców ma związek zarówno z charakterystycznym dla większości tych ryb zapłodnieniem zewnętrznym, jak i antropopresją, której skutkami są niekorzystne zmiany środowiska wodnego, w tym także wprowadzanie gatunków obcych i inwazyjnych (Kirczuk i Domagała 2010). Niekiedy, mieszańce mogą być płodne i wytwarzają diploidalne gamety, powstające w procesie mejozy poprzedzonej podwojeniem się materiału genetycznego, co po ich zapłodnieniu prowadzi do powstania triploidalnego potomstwa (Janko i in. 2012). Diploidalne osobniki rodzicielskie i poliploidalne potomstwo mogą występować w jednej populacji, tworząc diploidalno-poliploidalne kompleksy, w których poszczególne biotypy mogą przejawiać nowe możliwości np. w sposobach rozrodu (Arai i Fujimoto, 2013). Specjacja przez poliploidyzację, czyli powstanie nowych gatunków na drodze zwielokrotnienia genomu miała miejsce, m. in. wśród ryb należących do jesiotrokształtnych Acipenseriformes (Comber i Smith 2004), łososiokształtnych Salmoniformes (Piferrer i in. 2009) i stosunkowo często karpiokształtnych Cypriniformes, wśród których znanych jest ok. 250 poliploidalnych gatunków (Mable i in. 2011). Przykładem kręgowców ewoluujących w powyższy sposób są niektóre taksony ryb kozowatych Cobitidae, m. in. z rodzaju Cobitis. To ryby szeroko rozpowszechnione w Eurazji oraz północnej części Afryki (Banarescu 1990; Perdices i Doadrio 2001). W Europie centralnej, w tym w Polsce występują, co najmniej dwa gatunki, koza pospolita Cobitis taenia Linnaeus, 1758 i koza dunajska Cobitis elongatoides Bacescu and Maier, Według ostatniej hipotezy (Culling i in. 2006; Perdices i in. 2016) europejska polodowcowa 5

6 kolonizacja tych gatunków przebiegała z Azji Wschodniej przez Syberię do Europy Północno-Wschodniej. W efekcie tzw. wtórnego kontaktu doszło do hybrydyzacji wymienionych gatunków. Brak w pełni wykształconych mechanizmów izolacji rozrodczej spowodował, że w wyniku ich krzyżowania się powstały mieszańcowe osobniki diploidalne. Z uwagi na to, że obecnie gatunki rodzicielskie (koza pospolita i koza dunajska) nie występują sympatrycznie (Choleva i in. 2012; Janko i in. 2012) uważa się, że najprawdopodobniej diploidalne mieszańce Cobitis nie powstają de novo. Diploidalne mieszańcowe samice (samców w środowisku naturalnym nie zanotowano) aby przejść mejozę i wyprodukować gamety muszą zduplikować genom w procesie przedmejotycznej endomitozy. W efekcie, produkują diploidalne jaja, z których po zapłodnieniu rozwijają się triploidalne samice, rozmnażające się gynogenetycznie. Wykazano (Saat 1991), że 33% jaj produkowanych przez triploidalne samice ulega zapłodnieniu, prowadząc do powstania nielicznych tetraploidów obu płci, które stanowią do ok. 4% wszystkich osobników Cobitis w poznanych dotąd populacjach mieszanych, diploidalno-poliploidalnych w Polsce (Boroń 1992, 2000, 2001, 2003; Boroń i Kotusz 2000; Juchno i in. 2007). Gatunki rodzicielskie i osobniki mieszańcowe nie są odróżnialne na podstawie cech morfologii zewnętrznej i ich odróżnienie wymaga zastosowania metod cyto- lub genetycznych. Metodą od lat stosowaną w Katedrze Zoologii są badania chromosomowe, które przyczyniły się do zidentyfikowania 24 populacji ryb Cobitis, z których 20 to populacje mieszane, diploidalno-poliploidalne (Boroń 2001, 2003; Boroń i in. 2011). W populacjach mieszanych dominują triploidalne samice, niekiedy stanowiące nawet do 95% wszystkich odławianych ryb Cobitis. Ponadto, w skład takich populacji wchodzą tetraploidalne samice i samce oraz osobniki obojga płci gatunku rodzicielskiego, kozy C. taenia lub kozy dunajskiej C. elongatoides (w populacjach mieszanych, których dotyczą badania niniejszego osiągnięcia występowała koza C. taenia). Tak liczne występowanie triploidalnych samic jest związane z możliwością ich jednopłciowego (gynogenetycznego) rozrodu (Vasil ev i in. 1989; Saat 1991; Janko i in. 2007), co w przypadku populacji krajowych wymagało potwierdzenia. Uważa się, że jednopłciowe formy triploidalne są etapem prowadzącym do powstania biseksualnie rozmnażających się tetraploidów (Vasil ev i in. 1989). Taką ścieżkę ewolucji wykazano u pokrewnych gatunków azjatyckich, C. biwae i C. striata oraz piskorza Misgurnus anguillicaudatus (Saitoh i in. 2010; Arai i Fujimoto 2013). Tymczasem dane dotyczące biologii tetraploidalnych samic i samców Cobitis były nieliczne (Juchno i Boroń 2006b; Juchno i in. 2007; Vasil ev i in. 2007; Juchno i Boroń 2010) i nie określono dokładnie sposobu ich powstawania i roli jaką pełnią w rozrodzie populacji mieszanych. 6

7 Stopniowe odkrywanie dużego zróżnicowania chromosomowego populacji ryb Cobitis w Polsce (Boroń 2001, 2003; Boroń i in. 2011) i w Europie (Janko i in. 2007, 2012) oraz wyniki prowadzonych równocześnie badań histologicznych gonad w cyklu rocznym, porcyjności tarła i płodności (Juchno i Boroń 2006a, b; Juchno i in. 2007; Juchno i Boroń 2010) umożliwiły podjęcie bardziej szczegółowych analiz rozrodu tych ryb. Prezentowane osiągnięcie naukowe dotyczy potencjału rozrodczego diploidów i poliploidów Cobitis w populacjach diploidalnych i mieszanych diploidalnopoliploidalnych i obejmuje następujące problemy: 1. Przyczyny dominacji mieszańcowych triploidalnych samic Cobitis w populacjach diploidalno-poliploidalnych, poznane poprzez: a) określenie wielkości jaj i wylęgu triploidalnych samic Cobitis i porównanie ich do diploidalnych C. taenia (praca nr 1), b) wykazanie sposobu rozmnażania się tych samic poprzez określenie liczby i ploidii potomstwa uzyskanego w wyniku indukowanego rozrodu triploidalnych samic z samcami kozy pospolitej C. taenia (praca nr 2), c) udokumentowanie i porównanie etapów rozwoju embrionalnego i larwalnego potomstwa triploidalnych samic i kozy pospolitej (praca nr 3), d) określenie ploidii oocytów produkowanych w jajnikach triploidalnych samic Cobitis na podstawie liczby chromosomów mejotycznych (praca nr 4). 2. Sposoby powstawania i rozmnażania się tetraploidalnych osobników Cobitis współbytujących w populacjach diploidalno-poliploidalnych, poznane poprzez: a) określenie liczby i przeżywalności tetraploidalnego potomstwa powstałego w efekcie zapłodnienia jaj triploidalnych samic Cobitis nasieniem samców C. taenia (praca nr 2), b) określenie ploidii jaj składanych przez tetraploidalne samice Cobitis (praca nr 4), c) poznanie ultrastruktury gonad tetraploidalnych samców Cobitis (praca nr 5). 3. Rola samic i samców kozy C. taenia w populacjach mieszanych, diploidalnopoliploidalnych (prace nr 2, 3, 4 i 5). 4. Wypracowanie metod i warunków rozrodu ryb kozowatych w warunkach kontrolowanych (prace nr 1-5). 7

8 Wyniki prezentowanych badań mają charakter uniwersalny ponieważ poliploidy Cobitis są uznanymi organizmami modelowymi w badaniach ewolucji gatunków drogą hybrydyzacji i poliploidyzacji (Boroń 2001, 2003; Šlechtovà i in. 2008; Choleva i Janko 2013; Majtanowa i in. 2016). Przedstawione problemy są częścią badań prowadzonych w Zespole kierowanym przez prof. dr hab. Alicję Boroń, dotyczących morfologii funkcjonalnej, biologii, taksonomii i filogenezy ryb doskonałokostnych Teleostei, w zakresie powstawania, pochodzenia, identyfikacji i biologii ryb Cobitis tworzących kompleksy diploidalno-poliploidalne. Badania realizowano w ramach tematu statutowego Katedry Zoologii UWM w Olsztynie oraz dwóch grantów własnych NCN (nr N N ; nr UMO-2011/03/B/NZ8/02982) realizowanych pod kierownictwem prof. dr hab. A. Boroń. W projektach tych pełniłam funkcję głównego wykonawcy. W celu określenia potencjału rozrodczego diploidalnych i poliploidalnych ryb Cobitis przedstawianego osiągnięcia łącznie wykonano kilkadziesiąt eksperymentalnych krzyżowań triploidalnych samic Cobitis z samcami kozy C. taenia i tetraploidalnymi samcami Cobitis oraz samic i samców C. taenia. Przyczyny dominowania triploidalnych samic Cobitis w populacjach mieszanych (problem badawczy nr 1 osiągnięcia) zostały poznane na przykładzie populacji tych ryb w Bugu, gdzie wcześniej wykazano, że triploidalne samice Cobitis mają dłuższy sezon rozrodczy i składają mniej jaj niż samice C. taenia. Udowodniono również, że triploidalne samice przystępują do tarła niejednocześnie i składają co najmniej trzy porcje jaj (Juchno i in. 2007; Juchno i Boroń 2010). Wykonano porównawcze badania wielkości jaj i potomstwa (w dniu wylęgu, jeden dzień i 10 oraz 22 dni po wylęgu), które wykazały wpływ poziomu ploidii, czyli zwiększonego genomu samic na wielkość składanych jaj; triploidalne samice składały istotnie statystycznie większe jaja niż samice C. taenia. Udowodniono także, że z większych jaj rozwija się większe potomstwo ale różnice te dotyczyły wylęgu i larw tylko w okresie dwóch pierwszych tygodni życia (praca nr 1). Wykazano i udokumentowano, że w tych wczesnych, trudniejszych etapach życia potomstwo triploidalnych samic ma potencjalnie większe szanse i możliwości przeżycia w zmieniających się warunkach środowiskowych. Jaja triploidalnych samic, podobnie do triploidalnych form C. melanoleuca (Pavlov i in. 2004) gromadzą prawdopodobnie więcej żółtka, które jest używane jako pokarm we wczesnych etapach życia wylęgu. Wydaje się to szczególnie ważne u ryb o tarle porcyjnym o wydłużonym sezonie rozrodczym (Juchno i in. 2007), kiedy to potomstwo pojawia się zarówno w czerwcu jak 8

9 i w lipcu. Wiadomo bowiem, że większe potomstwo, a więc potencjalnie silniejsze jest bardziej odporne na niedobory pożywienia i ma większe szanse na przeżycie (Keckeis i in. 2000). Wykazano, że triploidalne samice składały większe jaja niż współbytujące z nimi samice C. taenia. Następnie z tych jaj rozwijało się istotnie statystycznie większe potomstwo niż potomstwo samic C. taenia (praca nr 1). Opisano dwa aspekty rozrodu triploidalnych samic, które mogły współdecydować o ich dominacji w populacjach mieszanych; składanie większych jaj, z których rozwija się większy wylęg oraz jednopłciowy, gynogenetyczny rozród. Dominację triploidalnych samic mógł zapewnić im jednopłciowy rozród (Vasil ev i in. 1989; Saat 1991; Choleva i in. 2012), co w odniesieniu do populacji krajowych należało udowodnić. W tym celu podjęto badania sposobu rozrodu triploidalnych samic poprzez analizę ploidii i liczby ich potomstwa. Do indukowanego rozrodu wykorzystano triploidalne samice Cobitis i samce kozy pospolitej odłowione odpowiednio z Bugu (populacja mieszana, diploidalno-poliploidalna) i jeziora Legińskiego (populacja diploidalna C. taenia). Ploidię osobników rodzicielskich ustalono na podstawie liczby chromosomów, natomiast ploidię otrzymanego potomstwa określono na podstawie liczby chromosomów lub na podstawie zawartości DNA w komórkach metodą cytometrii przepływowej. Wykorzystanie cytometru przepływowego do analizy ploidii wylęgu i larw wymagało podjęcia współpracy zarówno z pracownikami (dr Sylwią Świgońską i dr Anną Nyncą) Laboratorium Diagnostyki Molekularnej UWM, jak i dr hab. Magdaleną Król z Katedry Nauk Fizjologicznych SGGW w Warszawie. Na podstawie liczby i ploidii otrzymanego potomstwa wykazano, że 66% jaj składanych przez triploidalne Cobitis zostało zapłodnione w efekcie czego rozwinęło się tetraploidalne (4n = 98) potomstwo, natomiast pozostałe jaja były indukowane do rozwoju gynogenetycznego (klonalnego) (praca nr 2). Według danych wcześniejszych (Saat 1991) sądzono, że 33% jaj triploidalnych samic jest zapładnianych. Wykazano, że w warunkach kontrolowanych każda triploidalna samica, poza gynogenetycznymi, produkowała jaja, które były zapładniane i rozwijały się w tetraploidalne potomstwo. Kariotyp tetraploidalnych osobników potomnych zawierał 3n chromosomów samicy i n = 24 chromosomów samca C. taenia, natomiast kariotyp triploidalnego potomstwa składał się tylko z chromosomów samicy. Następnie wykazano, że wśród otrzymanego od triploidalnych samic potomstwa w wieku kilku miesięcy lub roku dominuje to klonalne, triploidalne, natomiast tetraploidy stanowią zaledwie ok. 6% (praca nr 2). Osiągnięciem opisywanych badań (pracy nr 2) było udokumentowanie, 9

10 że triploidalne samice Cobitis z Bugu rozradzają się głównie gynogenetycznie; ich jaja są stymulowane do rozwoju nasieniem samców C. taenia chociaż znaczna część ich jaj ulega zapłodnieniu dając tetraploidalne potomstwo. Wykonane eksperymenty krzyżowania dały możliwość poznania przebiegu rozwoju embrionalnego i larwalnego potomstwa mieszańcowych samic Cobitis oraz oszacowania liczby uzyskanego wylęgu jak i jego przeżywalności w pierwszych 21 dniach życia (praca nr 3). Wykazano, że poszczególne etapy rozwoju embrionalnego mieszańcowego, poliploidalnego potomstwa przebiegają podobnie do rozwoju kozy jak i wszystkich Teleostei. Ważnym było udokumentowanie, że rozwój embrionalny jaj uzyskanych od triploidalnych samic Cobitis zachodził wyraźnie wolniej, wylęg obserwowano dopiero 13 godzin po uzyskaniu wylęgu kozy C. taenia (praca nr 3). Podczas rozwoju mieszańców zaobserwowano asynchronię, która polegała na nierównomiernym rozwoju zarodków na etapie segmentacji oraz formowania się ogona. Dodatkowo wykazano i opisano także liczne (23% potomstwa) deformacje mieszańcowych larw, takie jak: przerost woreczka osierdziowego, skrzywienie struny grzbietowej, wykształcenie dodatkowej struny lub dodatkowego oka oraz brak skrzeli zewnętrznych. Niektóre z tych deformacji zostały dodatkowo uwidocznione i scharakteryzowane po zastosowaniu specjalistycznego barwienia chrząstki i kości (praca nr 3). Przeprowadzone porównanie zarówno sukcesu rozrodczego jak i przeżywalności potomstwa wykazało brak różnic istotnych statystycznie pomiędzy diploidami i poliploidami. Uzyskano średnio 46% i 33,5% wylęgu odpowiednio od diploidalnych samic C. taenia i triploidalnych Cobitis, natomiast przeżywalność w 21 dniu po wylęgnięciu wynosiła 71% u potomstwa diploidalnego i 53% u poliploidalnego. Wyniki zawarte w pracy nr 3 udowodniły, że zwiększony, mieszańcowy genom jaj składanych przez triploidalne samice wpływa na wydłużenie tempa rozwoju zarodkowego i powoduje dość liczne deformacje u wylęgu. Jednocześnie wydaje się, że poliploidalność nie przeszkadza w powstawaniu mieszańcowego potomstwa w podobnej liczebności i o podobnej przeżywalności jak potomstwo diploidalnej kozy. Do pełniejszego obrazu funkcjonowania i przyczyn dominacji triploidalnych samic w populacjach diploidalno-tetraploidalnych wykonano badania ploidii jaj składanych przez triploidalne samice. Po raz pierwszy w odniesieniu do ryb Cobitis wykonano preparaty chromosomów mejotycznych uzyskanych z oocytów diplotenowych (praca nr 4). Wcześniejsze takie badania dotyczyły głównie azjatyckiego piskorza Misgurnus anguillicaudatus (Itono i in. 2006; Morishima i in. 2008; Li i in. 2011, 2015). Wzorując się na metodzie opisanej w pracach Itono i in. (2006) oraz Morishima i in. (2008) oraz osobistych 10

11 wskazówkach współautora tych prac, prof. Katsutoshi Arai z Hokkaido University dokonano, stosunkowo rzadko wykonywanej w odniesieniu do ryb, analizy chromosomów diplotenowych triploidalnych samic. Wyizolowane dojrzałe oocyty umieszczano w utrwalaczu, dzięki któremu przez krótki czas widoczne było jądro, które mechanicznie, przy pomocy pęsety wyłuskiwano z oocytu, przenoszono na szkiełko podstawowe i barwiono DAPI. Następnie preparaty przeglądano w poszukiwaniu chromosomów diplotenowych. Trudność zastosowanej metody polegała na tym, że chromosomy te leżały na różnej głębokości całej masy wybarwionego jądra i w celu ich policzenia należało składać uzyskane obrazy. Określono liczbę chromosomów mejotycznych w trakcie diplotenu i policzono biwalenty. Uzyskanie chromosomów diplotenowych było także pracochłonne ponieważ wśród utrwalonych jąder oocytów były również takie z chromosomami we wcześniejszych etapach profazy pierwszego podziału mejotycznego, nie nadające się do policzenia. W oocytach triploidalnych samic najczęściej (w 60%) obserwowano 74 biwalenty, nie wykazano uniwalentów i triwalentów. Uzyskane rezultaty wskazały, że w oocytach triploidalnych samic Cobitis zachodziła mejoza, która jednak była poprzedzona podwojeniem materiału genetycznego bez cytokinezy w procesie przedmejotycznej endomitozy (praca nr 4). Proces ten umożliwia tworzenie niezredukowanych triploidalnych jaj, które są podstawą klonalnego rozrodu badanych ryb drogą gynogenezy. Podwojenie materiału genetycznego jest praktycznie wymuszone zróżnicowanym składem genomów badanych samic. W trakcie tego procesu każdy homologiczny chromosom, który nie może znaleźć odpowiedniego do pary chromosomu jest duplikowany przed rozpoczęciem mejozy i formowaniem biwalentów, które zachodzi pomiędzy chromosomami siostrzanymi tego samego chromosomu (Arai i Fujimoto 2013). Uważa się, że konflikt genomowy będący wynikiem hybrydyzacji może wywoływać nietypowy sposób reprodukcji. Proces ten wyjaśnia hipoteza równowagi zgodnie, z którą wystarczająco duże międzygatunkowe zróżnicowanie genetyczne jest przyczyną wytwarzania niezredukowanych jaj, podczas gdy umiarkowane różnice genetyczne powodują mniejszą żywotność i płodność mieszańców (Moritz i in. 1989). Podobny cytologiczny mechanizm prowadzący do powstania jaj o niezredukowanej liczbie chromosomów wykazano u klonalnych diploidalnych i triploidalnych M. anguillicaudatus (Itono i in. 2006; Morishima i in. 2008; Li i in. 2011, 2015) oraz u międzygatunkowych mieszańców ryżówki Oryzias (Shimizu et al., 2000). Wyniki badań zawarte w pracy nr 4 udowodniły po raz pierwszy, że triploidalne samice Cobitis składają triploidalne, a zatem niezredukowane jaja, powstające w procesie mejozy, którą poprzedza przedmejotyczna endomitoza umożliwiająca zduplikowanie genomu przed mejozą. 11

12 Kolejne zaplanowane badania potencjału rozrodczego ryb w populacjach diploidalnopoliploidalnych dotyczyły sposobów powstawania i rozmnażania się tetraploidalnych mieszańcowych Cobitis (problem badawczy nr 2 osiągnięcia). Ryby z rodzaju Cobitis w swoim euroazjatyckim zasięgu występowania reprezentują różne etapy ewolucji, odbywającej się m.in. drogą hybrydyzacji i poliploidyzacji. Od populacji diploidalnopoliploidalnych zdominowanych przez triploidalne samice z niewielką liczbą tetraploidalnych samic i samców (Janko i in. 2007b; Juchno i in. 2007; Vasil`ev i in. 2007) do biseksualnie rozmnażających się tetraploidalnych gatunków (Kim i Lee 2000; Saitoh i in. 2010; Arai i Fujimoto 2013). W podjętych we współpracy badaniach (praca nr 2) próbowano określić potencjał rozrodczy tetraploidalnych Cobitis występujących w krajowych populacjach, tj. czy są płodne, a jeśli, to czy są zdolne do wydania żywotnego potomstwa. W ten sposób starałam się określić na jakim etapie ewolucji znajdują się te tetraploidy oraz poznać ich rolę w funkcjonowaniu populacji mieszanych, tzn. udział tetraploidalnych samic i samców w rozrodzie ryb Cobitis z populacji mieszanych, w których stanowią zaledwie od 2 do 4% (w Bugu) (Boroń 2001; Juchno i in. 2007). Wykonano badania mające na celu weryfikację dwóch hipotez dotyczących sposobów powstawania tetraploidów. Pierwsza z nich zakładała, że tetraploidy powstają poprzez zapłodnienie triploidalnych jaj składanych przez triploidalne samice. Hipotezę tę potwierdzono w prezentowanych w osiągnięciu badaniach (praca nr 2). Obserwacja rozwoju i analizowanie ploidii osobników potomnych otrzymanych od triploidalnych samic i samca C. taenia przyniosło kolejne istotne rezultaty. Wykazano bowiem, że liczba tetraploidalnych osobników potomnych zmniejszała się w ciągu życia tych ryb i wiek miesięcy osiągało zaledwie 6%. Uzyskane wyniki mają odzwierciedlenie w warunkach naturalnych, gdyż w populacjach mieszanych udział osobników tetraploidalnych wynosi zaledwie 2-4% wszystkich odławianych ryb Cobitis (Boroń 2001; Juchno i in. 2007). W wyniku przeprowadzonych doświadczeń po raz pierwszy udowodniono, że tetraploidalne potomstwo charakteryzuje się bardzo niską przeżywalnością w ciągu pierwszych miesięcy życia (praca nr 2). Druga hipoteza zakładała, że tetraploidy powstają na drodze rozrodu gynogenetycznego tetraploidalnych samic. Również tę hipotezę potwierdzono w prezentowanych badaniach (praca nr 4), w których udowodniono, że tetraploidalne samice składały tetraploidalne jaja. Wykazano, że tetraploidalne, podobnie jak triploidalne, samice składają jaja, których powstanie poprzedza przedmejotyczna endomitoza. Liczba biwalentów określona dla oocytów diplotenowych pozyskanych od tetraploidalnych samic wynosiła 96 lub 99 (czyli tyle samo co diploidalna 12

13 liczba chromosomów w komórkach somatycznych) i nie obserwowano uniwalentów ani kwadriwalentów, co wyklucza autopoliploidalne pochodzenie tych samic. Opisane w pracy nr 4 rezultaty udowodniły po raz pierwszy, że tetraploidalne samice Cobitis składają tetraploidalne jaja, powstające w procesie mejozy, którą poprzedza przedmejotyczna endomitoza umożliwiająca zduplikowanie genomu. Z uwagi na skład/zróżnicowanie chromosomowe ryb Cobitis w populacjach mieszanych, diploidalno-poliploidalnych wydaje się, że tetraploidalne samce mogą powstawać w wyniku zapłodnienia triploidalnych jaj, natomiast samice mogłyby powstawać zarówno w wyniku rozrodu gynogenetycznego jak i biseksualnego. Wyniki badań uzyskane wcześniej wskazujące na bardzo niską płodność tetraploidalnych samic (Juchno i in. 2007) jak i obniżoną przeżywalność tetraploidalnego potomstwa (praca nr 2) zapewne są przyczyną niskiego udziału osobników tetraploidalnych w populacjach mieszanych. Ponadto, uprzednie badania histologiczne (Juchno i in. 2006b) wykazały, że w gonadach tetraploidalnych samców nie obserwowano plemników. Przeprowadzone w ramach przygotowania niniejszego osiągnięcia badania ultrastrukturalne wymagały dużego doświadczenia w przygotowaniu próbek oraz w interpretacji elektronogramów. Wiedzę i umiejętności w tym zagadnieniu nabywałam podczas staży u ś. p. prof. Janusza Kubrakiewicza (Uniwersytet Wrocławski), u prof. Teresy Szklarzewicz (Uniwersytet Jagielloński) i u prof. Marca Thiry (Uniwersytet w Liège, Belgia). Badania ultrastruktury gonad zawarte w pracy nr 5 wykonane zostały w ramach współpracy z dr hab. Anną Pecio (Uniwersytet Jagielloński). Dowiodły one, że w jądrach tetraploidalnych samców znajdowały się jedynie prawidłowo zbudowane wczesne stadia spermatogenezy (spermatogonia i spermatocyty), natomiast nie obserwowano spermatyd i plemników (praca nr 5). Ponadto w ich gonadach obserwowano bardzo dużo degenerujących komórek płciowych. Przyczyny degeneracji zostały w pracy wnikliwie przedyskutowane i były to: apoptoza, nekroza, pyknoza, fragmentacja chromatyny, katastrofa mitotyczna i liza komórek. Procesów tych nie obserwowano w komórkach somatycznych jąder, czyli w komórkach Sertolego i Leydiga. Jednym z powodów niekompletnej mejozy podczas spermatogenezy, a dokładnie podczas pierwszego podziału mejotycznego, może być niedopasowanie chromosomów pochodzących od różnych genomów tworzących osobniki tetraploidalne. Wiadomo, że skład genomowy osobników tetraploidalnych w różnych populacjach jest nieco odmienny (Boroń 2003; Boroń i in. 2015). Tetraploidy z Bugu (4n = 98) charakteryzują się genomem, który zawiera dwa genomy C. taenia oraz genom C. elongatoides i genom C. tanaitica/taurica (praca nr 2), natomiast genomy tetraploidów z Kortówki (dorzecze Łyny, 13

14 Pregoły) (4n = 99) zawierały genom C. taenia i C. tanaitica oraz dwa genomy C. elongatoides (Boroń i in., niepublikowane). Analizie ultrastrukturalnej poddano gonady samców pochodzących z trzech populacji mieszanych z Bugu, Kortówki oraz Pilicy. U wszystkich badanych osobników obserwowano podobne procesy degeneracyjne w jądrach oraz brak spermatyd i plemników (praca nr 5). Przyczyną sterylności tetraploidalnych samców może być także brak właściwej kontroli genetycznej i w konsekwencji hormonalnej. Regulacja hormonalna rozrodu poliploidalnych ryb Cobitis jest zagadnieniem badawczym, które zostało rozpoczęte w Katedrze Zoologii i jest aktualnie poznawane. Osiągnięciem prezentowanych badań (praca nr 5) było udowodnienie, na podstawie analizy ultrastrukturalnej, dysfunkcji jąder tetraploidalnych samców. Powodem sterylności tych samców jest niewytwarzanie plemników oraz występowanie w ich komórkach płciowych licznych procesów degeneracyjnych. Dodatkowym wynikiem prowadzonych badań (praca nr 5) było przedstawienie dokładnej charakterystyki kolejnych etapów spermatogenezy kozy C. taenia i kozy dunajskiej C. elongatoides z uwzględnieniem budowy ich plemników. W badaniach prowadzonych wcześniej wykazano, że tetraploidalne samice Cobitis, występujące w krajowych populacjach mieszanych, osiągają dojrzałość płciową i produkują niewielką liczbę dojrzałych oocytów (Juchno i in. 2007). Badania dojrzałych oocytów tych samic, określające liczbę chromosomów diplotenowych zaprezentowane w pracy nr 4 potwierdziły, że tetraploidalne samice są płodne i mogą przystępować do rozrodu. Dotychczas nie wykazano aby osobniki tetraploidalne różniły się składem genomowym w zależności od płci (Boroń 2003; Boroń i in. 2015). Stąd, pytanie badawcze do dalszych poszukiwań: dlaczego u tetraploidalnych samic z Bugu, Kortówki i Pilicy dochodzi do zakończenia procesu mejozy i wyprodukowania niewielkiej liczby ale dojrzałych oocytów (Juchno i in. 2007; praca nr 4) a w gonadach tetraploidalnych samców przebieg mejozy jest zaburzony. Uzyskane wyniki badań (prace nr 2, 4 i 5) szeroko określają i dokumentują rolę tetraploidów Cobitis w populacjach mieszanych. Pozwalają na sformułowanie hipotezy, że tetraploidy występujące w polskich populacjach są w trakcie formowania nowych, biseksualnych gatunków a najprawdopodobniej tymczasowa bezpłodność samców może być rozpatrywana jako ewolucyjna dalekowzroczność. Poza tym dotychczas nie ustalono eksperymentalnie czy tetraploidalne samce, mimo, że są sterylne biorą udział w symulowanym rozrodzie ponieważ one także mają, charakterystyczną dla samców kozy, kostną płytkę Canestriniego na płetwach piersiowych, która służy do przytrzymywania samicy podczas specyficznego zachowania tarłowego. W wyniku przeprowadzonych 14

15 eksperymentów krzyżowania, nawet po stymulacji hormonalnej nie uzyskano nasienia od tetraploidalnych samców (praca nr 2). Stąd ich udział w rozrodzie mógłby być tylko matrymonialnym oszustwem. W prezentowanym osiągnięciu dotyczącym sposobów powstawania i rozmnażania się tetraploidalnych osobników Cobitis współbytujących w populacjach diploidalno-poliploidalnych (problem badawczy nr 2) wykazano, że tetraploidalne potomstwo jest mniej żywotne, co może mieć odzwierciedlenie m. in. w ich bardzo niskim udziale w populacjach mieszanych (praca nr 2). Ponadto, udokumentowano, że tetraploidalne samice składają tetraploidalne jaja (praca nr 4), a tetraploidalne samce są sterylne (praca nr 2 i 5). Ustalono również, że tetraploidalne osobniki w populacjach mieszanych mogą powstawać zarówno w wyniku zapłodnienia triploidalnych jaj składanych przez triploidalne samice jak i w wyniku rozrodu gynogenetycznego (prace nr 2 i 4). W prezentowanym osiągnięciu spróbowano również ustalić rolę samic i samców kozy C. taenia w populacjach mieszanych, diploidalno-poliploidalnych (problem badawczy nr 3 osiągnięcia). Wydaje się, że samce kozy są jedynymi skutecznymi dawcami plemników, zarówno w rozrodzie biseksualnym jak i gynogenetycznym, w omawianych populacjach mieszanych. Tarło ryb kozowatych odbywa się w wyniku skomplikowanego behawioru polegającego na spiralnym owinięciu ciała samicy przez samca, co powoduje uwolnienie gamet (Lodi i Malacarne 1990). W zbadanych populacjach mieszanych, diploidalnopoliploidalnych (Bug, Pilica i Kortówka) zanotowano jedynie kilkuprocentowy udział osobników kozy C. taenia, który musi wystarczyć aby ryby Cobitis w tych populacjach mogły ewoluować rozmnażając się zarówno gynogenetycznie jak i płciowo (praca nr 2). Pozostaje zagadką w jaki sposób niewielka liczba samców kozy rozradza się z wszystkimi samicami Cobitis odbywającymi tarło, przestrzegając opisanego powyżej zachowania tarłowego. Wiadomo, że samce kozy produkują prawidłowe plemniki (praca nr 5), a samice kozy prawidłowe haploidalne jaja wymagające zapłodnienia (praca nr 4). Ustalono również, że rozwój embrionalny i larwalny diploidalnego potomstwa przebiega prawidłowo (praca nr 3). Wydaje się więc, że potencjał rozrodczy samic i samców kozy C. taenia jest prawidłowy, typowy dla gatunku. Stąd pytania do rozważenia w przyszłych badaniach, dlaczego samce C. taenia biorą udział w gynogenetycznym rozrodzie mieszańcowych poliploidalnych samic, które stanowią dla nich konkurencję pokarmową i niszową? Czy rozpoznają mieszańcowe samice, które przecież nie przekazują ich genomu do potomstwa? Jeśli nie, to dlaczego ewolucja zmusza je do nieefektywnego udziału w rozrodzie. 15

16 Aspektem praktycznym prezentowanego osiągnięcia naukowego było wypracowanie metod rozrodu ryb kozowatych w warunkach kontrolowanych (problem badawczy nr 4 osiągnięcia). Wykonanie w omówionych eksperymentach licznych krzyżowań, początkowo pod kierunkiem specjalisty prof. Romana Kujawy z Katedry Rybactwa Jeziorowego i Rzecznego UWM, pozwoliło na opracowanie szczegółowego protokołu dotyczącego kontrolowanego rozrodu ryb Cobitis. Przede wszystkim dotyczył on ustalenia stosowania dawek hormonów w celu indukcji dojrzewania gamet w zależności od płci. Dobre rezultaty otrzymano po zastosowaniu Ovopelu (analog gonadoliberyn GnRH zawierający ssaczy LHRHa i metoklopramid) oraz hcg (gonadotropina kosmówkowa). Pierwszy z hormonów wymagał dwukrotnej iniekcji dootrzewnowej samic i samców, na 24 i 12 godzin przed planowanym tarłem drugi natomiast wymagał tylko jednej iniekcji, 24 godziny przed tarłem. Pobierane po lekkim masażu brzucha gamety (ikra i nasienie) mieszano na szalkach Petriego, polewając wodą z akwarium i inkubowano w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj po uzyskaniu stadium blastuli zarodki przekładano do małych, przepływowych akwariów w celu dalszej inkubacji. Po ok. tygodniu, po całkowitej resorpcji woreczka żółtkowego, rozpoczynano karmienie wylęgu żywymi larwami solowca Artemia sp. Opracowane warunki rozrodu i podchowu ryb Cobitis obecnie są rutynowo stosowane w innych badaniach. PODSUMOWANIE Wyniki badań stanowiących osiągnięcie naukowe pozwoliły na ujawnienie nowych faktów dotyczących potencjału rozrodczego ryb Cobitis: - triploidalne samice Cobitis dominują w populacjach mieszanych, diploidalnopoliploidalnych ponieważ rozradzają się głównie gynogenetycznie wytwarzając triploidalne, klonalnie rozwijające się jaja, - triploidalne samice Cobitis rozmnażają się także biseksualnie; jaja zostają zapłodnione i rozwijają się tetraploidy, - rozwój embrionalny kozy pospolitej i mieszańcowych poliploidów Cobitis przebiega prawidłowo, podobnie jak innych Teleostei; jedynie w trakcie rozwoju larwalnego u mieszańcowego, poliploidalnego wylęgu pojawia się dużo deformacji ciała. Przypuszczalnie, większość z tych deformacji to te występujące u potomstwa tetraploidalnego, którego przeżywalność, co wykazano, znacznie maleje wraz z wiekiem, - tetraploidy Cobitis różnią się od triploidów przede wszystkim obniżoną przeżywalnością; 16

17 u wylęgu udział tetraploidów to ok. 66%, podczas gdy u potomstwa w wieku ok. roku wynosi zaledwie 6%, - tetraploidalne samce są bezpłodne, w ich jądrach nie powstają plemniki, jednak licznie występują degenerujące komórki płciowe. Natomiast tetraploidalne samice są płodne, wytwarzają dojrzałe, tetraploidalne jaja, które najprawdopodobniej są zdolne do rozwoju gynogenetycznego ale ich sukces rozrodczy wydaje się być znikomy, - najprawdopodobniej jedynymi dawcami plemników, zarówno w rozrodzie biseksualnym jak i gynogenetycznym, w populacjach mieszanych, diploidalno-poliploidalnych są samce kozy C. taenia, - ryby Cobitis są znanym modelem do badań procesów hybrydyzacji i poliploidyzacji, dlatego uzyskane doświadczenie w ich hodowli i rozrodzie w ustalonych warunkach kontrolowanych, które dobrze znoszą, umożliwia planowanie dalszych badań wymagających krzyżowania tych ryb. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych (wykaz cytowanych publikacji podano na końcu Autoreferatu; cytowania prac z własnym udziałem pogrubiono) Przed uzyskaniem stopnia doktora nauk biologicznych moje zainteresowania naukowe, jeszcze w czasie studiów, koncentrowały się wokół biologii i fizjologii zwierząt. Pracę magisterską na temat termoregulacji behawioralnej u szczurów wykonałam w Zakładzie Fizjologii Zwierząt UMK w Toruniu, pod opieką prof. dr hab. Michała Caputy. Po rozpoczęciu pracy zawodowej w Katedrze Zoologii Akademii Rolniczo- Technicznej w Olsztynie (obecnie Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie) na stanowisku technika, potem asystenta, a następnie adiunkta moje zainteresowania naukowe skupiły się na rozrodzie zwierząt, początkowo bezkręgowych, potem ryb. W okresie przed uzyskaniem stopnia doktora prowadziłam badania dotyczące rozrodu mięczaków, głównie winniczka Helix pomatia L. i gatunku hodowlanego, ślimaka szarego H. aspersa Müller (obecnie Cornu aspersum Müller). Badania te realizowałam we współpracy z prof. Andrzejem Łysakiem i dr hab. Maciejem Ligaszewskim, pracownikami Instytutu Zootechnicznego w Balicach. Celem badań było określenie wpływu stymulacji hormonalnej na liczbę jaj składanych przez wymienione gatunki ślimaków (Łysak i in. 2002; Juchno i in. 2005), które były hodowane zarówno w tunelach foliowych, jak i systemem otwartym. W tym 17

18 okresie poznałam warunki i sposoby hodowli ślimaków jadalnych, a zdobytą wiedzę i doświadczenie wykorzystuję do dziś w pracy ze studentami podczas prowadzenia wykładów i ćwiczeń z przedmiotu Malakologia. Moje zainteresowania rozrodem bezkręgowców zaowocowały propozycją współpracy, z dr Łucjanem Chybowskim z Instytutu Rybactwa Śródlądowego w Olsztynie. Współpraca ta dotyczyła badań histologicznych gonad samic i samców raka pręgowatego Orconectes limosus Raf., gatunku inwazyjnego w Polsce, w cyklu rocznym, których wyniki zawarto w dwóch publikacjach (Chybowski i Juchno 2002; Juchno i Chybowski 2003). Posiadane przeze mnie umiejętności w zakresie wykonywania i analizowania preparatów histologicznych gonad zwierząt oraz badania biologii rozrodu ryb prowadzone ówcześnie w Katedrze Zoologii były podstawą rozpoczęcia realizacji pracy doktorskiej pt. Rozwój gonad i gametogeneza kozy Cobitis taenia L. i naturalnych allopoliploidalnych Cobitis (Pisces, Cobitidae), którą wykonywałam pod kierunkiem prof. Alicji Boroń. W pracy tej m.in. przy pomocy podstawowych metod histologicznych dokonano porównania czasu trwania i terminu tarła, liczby porcji składanych jaj w sezonie rozrodczym, budowy gonad, wielkości oocytów oraz płodności kozy pospolitej i mieszańcowych (allopoliploidalnych) samic Cobitis z populacji diploidalno-poliploidalnej. Udowodniono, że triploidalne samice Cobitis w porównaniu do samic kozy C. taenia charakteryzują się wydłużonym sezonem rozrodczym, produkują mniej ale większych oocytów i stanowią przeważającą większość (nawet do 95%) wśród ryb z rodzaju Cobitis odławianych z populacji w Bugu (Juchno i Boroń 2006a; Juchno i in. 2007; Juchno i Boroń 2010). Ponadto, w preparatach histologicznych gonad tetraploidalnych samców nie obserwowano plemników (Juchno i Boroń 2006b), a w jajnikach tetraploidalnych samic wykazano nieliczne ale dojrzałe oocyty (Juchno i in. 2007). Niektóre z wymienionych publikacji ukazały się kilka lat po doktoracie ponieważ w omawianym czasie przebywałam na urlopie macierzyńskim. Po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych tematyka badawcza, w której aktywnie uczestniczyłam związana była głównie z morfologią funkcjonalną i biologią kozy C. taenia, poliploidalnych, mieszańcowych ryb Cobitis oraz gatunków pokrewnych (Teleostei, Cobitidae). Moje zainteresowania naukowe dotyczyły głównie różnych aspektów taksonomii i biologii ryb Cobitis z różnych, zróżnicowanych chromosomowo, populacji w Polsce. Brałam udział w zespołowych badaniach dotyczących wybranych cech biologii (wiek, tempo wzrostu i osiągane rozmiary ciała) oraz cech morfologicznych (jakościowe, ilościowe; policzalne i mierzalne) kozy pospolitej C. taenia, jedynego gatunku, który 18

19 w Polsce występuje zarówno w populacjach jednogatunkowych (nieliczne), jak i mieszanych. Badania te dotyczyły kozy z populacji diploidalnej z jez. Klawój. Wykazano, że podobnie do innych kozowatych, jest to gatunek krótko żyjący; maksymalny wiek samic to 5+ a samców 4+. W badanej populacji najwięcej samców (ok. 60%) było w czwartym roku życia (3+) a najwięcej samic (ok. 45%) w piątym roku życia (4+) (Jeleń i in. 2004; Boroń i in. 2008). Wyniki te nie odbiegały od opublikowanych wcześniej (m.in. Marconatto i Rasotto 1989; Przybylski i Valladolid 2000) ale, co warto podkreślić, po raz pierwszy dotyczyły osobników C. taenia zidentyfikowanych na podstawie liczby (2n=48) i morfologii chromosomów (kariotypu). Samce były mniejsze niż samice, co jest typowe dla gatunków należących do tego rodzaju (Przybylski i Valladolid 2000). Wykazano, że maksymalna długość ciała (Sl) samców kozy pospolitej wynosiła 72,5 mm, a samic 91,7 mm (Boroń i in. 2008). Z analizy tempa wzrostu wynikało, że samice rosną nieco szybciej niż samce, ale wszystkie osobniki charakteryzowały się wzrostem allometrycznym (Boroń i in. 2008). Prowadzone w Katedrze Zoologii intensywne badania cytogenetyczne umożliwiły identyfikację coraz liczniejszych populacji mieszanych, diploidalno-poliploidalnych, w których samce i samice kozy pospolitej stanowiły zdecydowaną mniejszość i niezbędne było znalezienie cech morfologicznych charakterystycznych dla osobników C. taenia. Badania porównawcze wykazały, że samice i samce kozy z populacji diploidalnej charakteryzowały się dymorfizmem płciowym, który przejawiał się obecnością płytki Canestriniego, czyli kostnej płytki na płetwach piersiowych, dłuższymi płetwami parzystymi i płetwą ogonową, większą odległością międzyoczną i większą wysokością płetwy odbytowej i grzbietowej u samców. Natomiast cechy merystyczne (policzalne), zwłaszcza liczba promieni w płetwach, nie były dobrymi cechami taksonomicznymi (Jeleń i in. 2008). W okresie po uzyskaniu stopnia doktora zajmowałam się także problemem wpływu ploidii na funkcjonowanie organizmów. W ramach współpracy naszego Zespołu z prof. Wincentym Kilarskim z Uniwersytetu Jagiellońskiego oznaczono i porównano zawartości DNA w hepatocytach (komórkach wątroby) i erytrocytach kozy pospolitej i poliploidalnych osobników Cobitis za pomocą cytometrii przepływowej (Juchno i in. 2009). Wyniki tych badań były bardzo istotne w określaniu poliploidalnych Cobitis ponieważ wcześniej ploidię oznaczano na podstawie liczby chromosomów w komórkach tylko jednego narządu, czyli nerki. W pracy wykazano, że zawartość DNA koreluje pozytywnie z poziomem ploidii analizowanych ryb. Opisane zróżnicowanie zawartości DNA w badanych komórkach mogło być spowodowane różnym stopniem kondensacji chromatyny w erytrocytach, w porównaniu do hepatocytów. Uczestniczenie w tych badaniach umożliwiło mi wraz z Zespołem na 19

20 planowanie i realizację kolejnych badań, które dotyczyły poziomu ploidii larw triploidalnych samic Cobitis, określonej także z wykorzystaniem cytometrii przepływowej (Juchno i in. 2014; praca należąca do osiągnięcia naukowego). Doświadczenie w zakresie indukowania rozrodu ryb Cobitis i możliwość uzyskiwania w warunkach kontrolowanych potomstwa o różnej ploidii spowodowało nawiązanie współpracy z dr Sebastianem Maciakiem z Uniwersytetu w Białymstoku oraz zespołem naukowców z Czeskiej Akademii Nauk: dr Karelem Janko i dr Lukasem Cholevą. Współpraca ta dotyczyła badań porównawczych tempa metabolizmu kozy (osobników diploidalnych) i poliploidów Cobitis (Maciak i in. 2011). Wykazano pozytywny związek między wielkością erytrocytów, ich jąder oraz genomu (ploidalnością) osobników trzech gatunków Cobitis (kozy pospolitej C. taenia, kozy dunajskiej C. elongatoides i C. strumicae) oraz ich mieszańców. Ponadto, wykazano, że tempo metabolizmu (mierzone jako poziom konsumpcji tlenu) było istotnie niższe u ryb triploidalnych niż diploidalnych, co może mieć związek z odmiennymi możliwościami adaptacyjnymi klonalnych triploidów i biseksualnych diploidów występujących w tej samej populacji (Maciak i in. 2011). Poza rybami Cobitis moje zainteresowania badawcze dotyczyły także innych gatunków, w tym pokrewnego, jakim jest koza złotawa Sabanejewia baltica Witkowski, 1994 o stosunkowo słabo poznanej biologii. Podczas realizacji badań związanych z rozrodem kozy złotawej wykorzystałam warsztat metodyczny, który opanowałam podczas realizacji badań w ramach rozprawy doktorskiej. Głównym celem podjętych analiz było określenie stadiów dojrzałości gonad samic i samców oraz oszacowanie płodności absolutnej i względnej tego gatunku. Wykazano, że koza złotawa, podobnie jak koza i jej poliploidalne mieszańce, ma tarło porcyjne i charakteryzuje się asynchroniczną budową jajnika. Samica w ciągu sezonu rozrodczego, najprawdopodobniej w dwóch porcjach, składa łącznie ok jaj (Juchno i Boroń 2012). W ostatnich latach uczestniczyłam, jako główny wykonawca, w realizacji grantu (nr UMO-2011/03/B/NZ8/02982) "Potencjał rozrodczy naturalnych tetraploidalnych i diploidalnych samców ryb Cobitis (Pisces, Cobitidae)". Uzyskane wyniki w części dotyczącej budowy ultrastrukturalnej gonad samców Cobitis zostały zaprezentowane jako praca nr 5 osiągnięcia naukowego. Projekt ten miał wiele aspektów i dotyczył także m.in. parametrów i jakości nasienia kozy pospolitej (Cejko i in. 2016). W wymienionej pracy porównano skuteczność stymulacji spermacji za pomocą dwóch hormonów, hcg (gonadotropina kosmówkowa) i Ovopelu (analog gonadoliberyn GnRH zawierający ssaczy LHRHa i metoklopramid). Okazało się, że po stymulacji hcg uzyskano nasienie od 20

21 wszystkich samców, natomiast po stymulacji Ovopelem od mniejszej liczby, ok. 67% samców. W tych badaniach zespół ekspercki pod kierunkiem dr Beaty Cejko dokonał analizy parametrów nasienia przy pomocy programu CASA (Computer Assisted Sperm Analisys). Dzięki mikroskopowi sprzęgniętemu z kamerą cyfrową wykonano serię zdjęć nasienia, a obrazy przekazywane drogą elektroniczną do komputera umożliwiły dokładną analizę ruchu plemnika. Zbadano próbki nasienia po zastosowaniu czterech różnych rozcieńczalników - aktywatorów. Okazało się, że nasienie uzyskane po stymulacji hcg wykazywało szybszą ruchliwość po zastosowaniu trzech z czterech aktywatorów w porównaniu z nasieniem po Ovopelu (Cejko i in. 2016). Uzyskane wyniki zostały wykorzystane do realizacji kolejnych badań w ramach tego projektu oraz zostaną zastosowane w planowanych dalszych badaniach dotyczących rozrodu ryb Cobitis o różnej ploidii i różnym składzie genomowym. W wymienionym powyżej grancie NCN podjęto także badania stężenia hormonów i ekspresji ich receptorów u ryb Cobitis. Dotąd opublikowano część tych badań (Leska i in. 2016). Androgeny, a spośród nich szczególnie 11-ketotestosteron (11KT) i testosteron (T), odgrywają znaczącą rolę w powstawaniu drugorzędowych cech płciowych i w dojrzewaniu komórek rozrodczych (Schulz 2010). Stąd, nasze badania skupiły się na określeniu poziomu tych hormonów, poznaniu częściowej sekwencji oraz wykazaniu ekspresji receptora androgenowego w wybranych tkankach samic i samców kozy C. taenia. Opisano i zdeponowano w Banku Genów (KJ623315) częściową sekwencję (459pz) genu receptora androgenowego u C. taenia. Wykazano sezonową zmienność w stężeniu testosteronu i 11- ketotestosteronu jak również dynamiczną, zmieniającą się w trakcie sezonu rozrodczego ekspresję genu receptora androgenowego w różnych tkankach (gonada, mięśnie, wątroba) u samic i samców C. taenia. Wykazano sezonowo zmienną zależność między stężeniem androgenów a ekspresją mrna receptora androgenowego, opartą w większości badanych tkanek na zjawisku up- and down-regulation (regulacja liczby receptorów w górę i w dół). Ponadto, stwierdzono, że ekspresja genu AR może odgrywać znaczącą rolę w modulacji wrażliwości tkanek na androgeny, a tym samym stanowić istotny czynnik w regulacji procesów rozrodczych C. taenia (Leska i in. 2016). Problemem badawczym, którym zajmuję się w ostatnim czasie jest biologia i taksonomia ryb z rodzaju Carassius (Teleostei, Cyprinidae) występujących w populacjach jednopłciowych i mieszanych, diploidalno-poliploidalnych. Są to ryby, które mają poliploidalne pochodzenie i/lub tworzą formy poliploidalne. Karaś srebrzysty Carassius gibelio (Bloch, 1782), uważany jest za najbardziej inwazyjny wśród ryb słodkowodnych 21