Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Wydział Lekarski. lek. med. Mateusz Sporek

Transkrypt

1 Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Wydział Lekarski lek. med. Mateusz Sporek Evaluation of the diagnostic and prognostic accuracy of angiopoietin-2 (Ang-2) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as markers of the severity and complications of acute pancreatitis in the early phase of the disease. Ocena diagnostycznej i rokowniczej wartości angiopoetyny 2 (Ang-2) i lipokaliny neutrofilowej związanej z żelatynazą (NGAL) jako markerów przebiegu i powikłań ostrego zapalenia trzustki we wczesnej fazie rozwoju choroby. Praca doktorska Promotor: dr hab. n. med. Beata Kuśnierz-Cabala Pracę wykonano w Katedrze Anatomii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum Kierownik jednostki: prof. dr hab. med. Jerzy A. Walocha oraz Zakładzie Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum Kierownik jednostki: dr hab. n. med. Bogdan Solnica, prof. UJ Kraków, 2016 rok 1

2 Składam serdeczne podziękowania: Pani dr hab. n. med. Beacie Kuśnierz-Cabali za inspirację, motywację, niespotykaną życzliwość oraz merytoryczną opiekę Panu prof. dr hab. Jerzemu Walosze za nieocenioną pomoc oraz wsparcie Panu dr n. med. Tadeuszowi Bernackiemu za możliwość naukowego, jak i zawodowego rozwoju Mojej rodzinie 2

3 Spis treści: strona 1. Nota informacyjna Podsumowanie pracy doktorskiej w języku polskim Podsumowanie pracy doktorskiej w języku angielskim Artykuł numer Sporek M., Kolber W., Pędziwiatr M., Kuźniewski M., Walocha J., Kuśnierz-Cabala B.: Przewidywanie ciężkiego przebiegu ostrego zapalenia trzustki - wybrane skale i markery laboratoryjne użyteczne we wczesnej fazie rozwoju choroby. Przegląd Lekarski. 2015; 72 (5): Artykuł numer 2 45 Sporek M., Dumnicka P., Gala-Błądzińska A., Ceranowicz P., Warzecha Z., Dembinski A., Stepien E., Walocha J., Drozdz R., Kuźniewski M., Kusnierz-Cabala B.: Angiopoietin-2 is an early indicator of acute pancreatic-renal syndrome in patients with acute pancreatitis. Mediators of Inflammation. 2016; Doi: /2016/ Artykuł numer 3 54 Sporek M., Dumnicka P., Gala-Bladzinska A., Mazur-Laskowska M., Walocha J., Ceranowicz P., Warzecha Z., Dembinski A., Kuzniewski M., Olszanecki R., Kusnierz- Cabala B.: Determination of serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin at the early stage of acute pancreatitis. Folia Medica Cracoviensia Artykuł numer 4 75 Sporek M., Gala-Błądzińska A., Dumnicka P., Mazur-Laskowska M., Kielczewski S., Walocha J., Ceranowicz P., Kuźniewski M., Mituś J., Kuśnierz-Cabala B.: Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function in the early course of acute pancreatitis. Folia Medica Cracoviensia. 2016; (56) 1: Artykuł numer 5 89 Kuśnierz-Cabala B., Nowak E., Sporek M., Kowalik A., Kuźniewski M., Enguita F.J., Stępień E.: Serum levels of unique mir-551-5p and endothelial-specific mir-126a-5p allow discrimination of patients in the early phase of acute pancreatitis. Pancreatology. 2015; 15:

4 9. Potwierdzenie przyjęcia pracy do druku Spis skrótów Piśmiennictwo Zgoda współautorów Załącznik nr

5 1. Nota informacyjna Niniejsza rozprawa doktorska, autorstwa lek. Mateusza Sporka, pt.: Ocena diagnostycznej i rokowniczej wartości angiopoetyny 2 (Ang-2) i lipokaliny neutrofilowej związanej z żelatynazą (NGAL) jako markerów przebiegu i powikłań ostrego zapalenia trzustki we wczesnej fazie rozwoju choroby oparta jest o monotematyczny cykl artykułów, na który składają się 4 prace oryginalne i 1 praca poglądowa, opublikowane lub przyjęte do druku w czasopismach indeksowanych w bazie PubMed oraz znajdujących się na liście Journal Citation Reports (Thomson Reuters). Łączna wartość Impact Factor dla cyklu przedstawionych prac (według Thomas Reuters Journal Citation Reports 2015) wynosi 6,073 oraz 85 punktów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Część wyników została dodatkowo przedstawiona w postaci doniesień zjazdowych na konferencjach o zasięgu międzynarodowym: 1. Kusnierz-Cabala B., Stępień E.Ł, Nowak E., Kapusta M., Sporek M., Kowalik A., Kuzniewski M., Solnica B.: Endothelial specific microrna expression profile in early phase of acute pancreatitis. IFCC-EFLM EUROMEDLAB Paris Congress June [W243]. 2. Gala-Błądzińska A., Sporek M., Dumnicka P., Kuźniewski M., Mazur-Laskowska M., Chmielewski P., Kusnierz-Cabala B.: Determination of neutrophil gelatinaseassociated lipocalin as early marker of acute kidney injury in acute pancreatitis. 53 rd Congress of ERA-EDTA Vienna, Austria May, 2016 [SP 214]. Wyniki badań prezentowane podczas Konferencji EUROMEDLAB Paris Congress 2015 zostały wyróżnione i były prezentowane na wszystkich nośnikach elektronicznych w trakcie trwania Konferencji. Dodatkowo, streszczenie zostało nagrodzone przez Polskie Towarzystwo Diagnostyki Laboratoryjnej. 5

6 ENDOTHELIAL SPECIFIC microrna EXPRESSION PROFILE IN EARLY PHASE OF ACUTE PANCREATITIS. Kusnierz-Cabala B. 1, Stępień EŁ. 2, Nowak E. 3, Kapusta M. 1, Sporek M. 4, Kowalik A. 3, Kuzniewski M. 5, Solnica B. 1 1 Diagnostic Department Chair of Clinical Biochemistry, Jagiellonian University Medical College; 2 Department of Physics, M.Smoluchowski Institute of Physics, Jagiellonian University Collegium Medicum; 3 Department od Molecular Diagnostics, Holycross Cancer Center, Kielce, Poland; 4 Department of Anatomy Jagiellonian University Medical College and Surgery Department of the District Hospital, Sucha Beskidzka, Poland; 5 Department of Nephrology Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland Background: Acute pancreatitis (AP) is a self-limiting disease in most patients, but its severe form develops in up to 20-30% of cases. Early diagnosis of severe form of AP has been considered a key determinant of successful therapy and patients survival. Vascular dysfunction is a severe complication that can cause organ ischemia and damage during AP (acute pulmonary edema, abdominal compartment syndrome). Laboratory assessment of AP is based on several routine parameters and does not reflect directly endothelial injury. Figure 1. Overexpression of specific mirs in AP. p=0.003 p=0.032 p=0.005 p=0.016 Aim of the study: The aim of this study was to evaluate a hypothesis that some organabundant mirnas can be considered biomarkers of AP. Hence, we selected candidate mirnas to compare their levels in severe and moderate (SAP) patients with a control group. Methods: The study group included 64 patients with mild (MAP) and 26 patients with moderate and severe (SAP) form of disaese. Mean age of study group was 53±16.8 years. The severity was classified according to revisited Atlanta Classification (2012). Control group consisted of 10 age and sex matched subjects. Circulating mirnas were analyzed in serum using quantitative real PCR method (q-rt-pcr) by means of LNA primers. As a control mir-103a-3 was selected. Figure 2. Diagnostic values of mir-126-5p and mir-551b-5p in prediction of AP severity. mir-126-5p AUC Sensitivity 60.0% Specificity 87.1% p<0.001 mir-551b-5p AUC Sensitivity 69.2% Specificity 72.6% p<0.001 mir-216a-5p AUC Sensitivity 58.1% Specificity 41.9% p-none significant Results: In SAP patients, the significant increase of most selected mirnas was observed (mir-126-5p, -148a-3p, 216a-5p) including those of pancreatic origin: specific mir-375 and -551b-5p. In MAP patients only 3 mirnas were highly and significantly overexpressed: endothelial specific mir-216a-5p, -551b-5p and pancreatic mir-375. Conclusions: A pancreatic mrna signature can be useful for assessment of pancreas injury during early phase of AP. Early identification of patients with potential endothelial dysfunction during AP can be reflected by specific circulating mirna levels and may help in the use of appropriate therapy.

7 DETERMINATION OF NEUTROPHIL GELATINASE-ASSOCIATED LIPOCALIN AS EARLY MARKER OF ACUTE KIDNEY INJURY IN ACUTE PANCREATITIS Agnieszka Gala-Błądzińska, Mateusz Sporek 2, Paulina Dumnicka 3, Marek Kuźniewski 4, Małgorzata Mazur-Laskowska 5, Przemysław Chmielewski 2, Beata Kuśnierz-Cabala 6 1. Department of Internal Medicine, Nephrology & Endocrinoplogy, St` Queen Jadwiga Clinical District Hospital No 2, Rzeszów, Poland, 2. Department of Anatomy, Jagiellonian University Medical College, Kraków, Poland, 3. Department of Medical Diagnostics, Jagiellonian University Medical College, Kraków, Poland, 4. Department of Nephrology, Jagiellonian University Medical College, Kraków Poland, 5. Diagnostic Department, University Hospital, Kraków, Poland, 6. Department of Diagnostics, Chair of Clinical Biochemistry, Jagiellonian University Medical College, Kraków, Poland OBJECTIVES METHODS In patients with acute kidney injury (AKI) in the course of acute pancreatitis (AP) the mortality rate reaches 70-80%. Serum NGAL (sngal) is a 25kDa protein, freely filtered by the glomerulus, and physiologically almost completely absorbed by the proximal tubule. Urinary NGAL (ungal) expression significantly increases in the distal tubule in response to renal ischemia or toxic injury [1]. The aim of this study was to analyse the diagnostic value of sngal and ungal as prognostic markers of kidney injury at the early phase of AP. The study group consisted of 65 patients (34 men and 31 women), aged 62.2±16.0, treated in the surgery department during the first 72 hours after the onset of the AP. We analysed the correlations between serum and urine NGAL concentrations and clinical and laboratory parameters used for the assessment of AKI, as well as AP severity according to the revised Atlanta classification (2012). AKI was diagnosed according to KDIGO guideline. The sngal concentration was measured by BioVendor ELISA kit and ungal using Abbott ARCHITECT NGAL assay. RESULTS At the early phase of AP, 11 patients (17%) developed AKI according to the KDIGO criteria. AKI stage 1 was Table 1. Simple correlations between sngal and the selected variables at admission and on days 2 and 3 of hospital stay. diagnosed in 10 patients and stage 2 in one. Patients with AKI had significantly higher sngal and ungal at 24 hours as compared to those without AKI [median (IQR): 276 ( ) vs. 105 (68-137) ng/ml and 550 Variable At admission Day 2 Day 3 R p R p R p (73-856) vs. 26 (145-44) ng/ml, respectively; p<0.001]. In addition, significantly higher sngal and ungal concentrations were observed in patients with severe AP and BISAP 3 (p<0.001). Both sngal and ungal at 24 hours correlated significantly with the increase in serum creatinine during the first 72 hours of AP (R=0.43, R=0.45; p<0.001). Also, sngal and ungal positively correlated with CRP and WBC count (p<0.001). In addition, the concentrations of sngal were significantly Duration of hospital stay < <0.001 BISAP score < <0.001 WBC 0.46 < < <0.001 CRP 0.66 < < <0.001 Fibrinogen 0.51 < < Albumin < < <0.001 correlated with the duration of hospital stay (p<0.002) [Table 1]. CONCLUSIONS Determination of both sngal and ungal is useful in diagnosis of AKI developing in the early phase of severe AP. In patients with sngal above 137ng / ml and ungal above 44 ng/ml on the first AP day, treatment should be more intensive to prevent AKI. REFERENCES CONTACT 1. Gala-Błądzińska A., Kuźniewski M. Performance neutrophil gelatinase-associated lipocalin in clinical settings. Przegląd Lekarski 2013/70/6 A. Gala-Błądzińska, Department of Internal Medicine, Nephrology & Endocrinoplogy, St` Queen Jadwiga Clinical District Hospital No 2, Lwowska 60 street, Rzeszów, Poland. bladzinscy@wp.pl

8 Do cyklu artykułów składających się na rozprawę doktorską włączono: 1. Sporek M., Kolber W., Pędziwiatr M., Kuźniewski M., Walocha J., Kuśnierz-Cabala B.: Przewidywanie ciężkiego przebiegu ostrego zapalenia trzustki - wybrane skale i markery laboratoryjne użyteczne we wczesnej fazie rozwoju choroby. Przegląd Lekarski. 2015; 72 (5): 1-5. (MNiSW 10 punktów) 2. Sporek M., Dumnicka P., Gala-Błądzińska A., Ceranowicz P., Warzecha Z., Dembinski A., Stepien E., Walocha J., Drozdz R., Kuźniewski M., Kusnierz-Cabala B.: Angiopoietin-2 is an early indicator of acute pancreatic-renal syndrome in patients with acute pancreatitis. Mediators of Inflammation. 2016; Doi: /2016/ (IF=3,236: MNiSW 30 punktów) 3. Sporek M., Dumnicka P., Gala-Bladzinska A., Mazur-Laskowska M., Walocha J., Ceranowicz P., Warzecha Z., Dembinski A., Kuzniewski M., Olszanecki R., Kusnierz- Cabala B.: Determination of serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin at the early stage of acute pancreatitis. Folia Medica Cracoviensia. 2016; 56 (2) (MNiSW 10 punktów) 4. Sporek M., Gala-Błądzińska A., Dumnicka P., Mazur-Laskowska M., Kielczewski S., Walocha J., Ceranowicz P., Kuźniewski M., Mituś J., Kuśnierz-Cabala B.: Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function in the early course of acute pancreatitis. Folia Medica Cracoviensia. 2016; 56 (1): (MNiSW 10 punktów) 5. Kuśnierz-Cabala B., Nowak E., Sporek M., Kowalik A., Kuźniewski M., Enguita F.J., Stępień E.: Serum levels of unique mir-551-5p and endothelial-specific mir-126a-5p allow discrimination of patients in the early phase of acute pancreatitis. Pancreatology. 2015; 15: (IF=2,837: MNiSW 25 punktów) 8

9 Na końcu pracy zamieszczono list do Redakcji potwierdzający przyjęcie do druku Artykułu nr 3. Prace, które zostały opublikowane przed zakończeniem opracowania rozprawy doktorskiej zamieszczono w wersji ostatecznej (PDF), właściwej dla każdego z czasopism. Zgoda Komisji Bioetycznej Projekt pracy doktorskiej posiadał zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum - nr KBET/247/B/2013. Źródła finansowania Na realizację pracy doktorskiej autor uzyskał finansowanie ze środków pochodzących z dotacji celowej dla młodych naukowców Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum - nr K/DSC/ Badania zamieszczone w czasopiśmie Pancreatology zostały dodatkowo dofinansowane z projektów badań statutowych nr K/ZDS/ oraz K/ZDS/

10 2. Podsumowanie pracy doktorskiej w języku polskim Wstęp Ostre zapalenie trzustki (OZT) jest to ostry stan zapalny gruczołu związany z przedwczesną aktywacją proenzymów trzustkowych i uszkodzeniem sąsiadujących tkanek o różnym nasileniu, a niekiedy również odległych narządów [1-3]. W większości przypadków OZT nie sprawia istotnych trudności na etapie rozpoznania schorzenia, a śmiertelność związana z łagodną postacią choroby (mild acute pancreatitis-map) zwykle nie przekracza 2% [4-5]. Jednak u około 20% chorych z OZT dochodzi do rozwoju ciężkiej postaci schorzenia (severe acute pancreatitis SAP), która związana jest z występowaniem powikłań miejscowych oraz uogólnionych i obarczona jest wysoką śmiertelnością [6-7]. Istnieje zatem wyraźna potrzeba poszukiwania nowych parametrów diagnostycznych użytecznych w prognozowaniu i wczesnym rozpoznaniu ciężkiego przebiegu OZT. W 2012 roku, po ponad 20 latach zmodyfikowano kryteria rozpoznania i klasyfikacji OZT. Obecnie obowiązująca zmodyfikowana klasyfikacja Atlanta 2012 [2] w sposób szczególny podkreśla związek pomiędzy niewydolnością narządową, a rokowaniem i śmiertelnością chorych. Wprowadzono pojęcia przemijającej (ustępującej w ciągu 48 godzin) i przetrwałej (utrzymującej się ponad 48 godzin) niewydolności narządowej. Zdefiniowano także średniociężką postać OZT (moderately severe acute pancreatitis - MSAP) [2]. W przebiegu OZT wyróżniono dwie fazy: wczesną, obejmującą pierwszy tydzień oraz późną, która następuje po upływie tygodnia i może trwać przez kolejne kilka tygodni lub miesięcy [2,8]. Wczesne rozpoznanie OZT o ciężkim przebiegu, umieszczenie chorych na oddziale intensywnej opieki oraz podjęcie adekwatnej terapii (tj. resuscytacja płynowa, profilaktyka antybiotykowa u pacjentów z martwicą, pilne ERCP w przypadku niedrożności dróg żółciowych) stanowią jak dotąd jedyny skuteczny sposób postępowania u tych chorych [6,9-11]. Już samo OZT jest 10

11 poważną chorobą, jednak śmiertelność znacznie zwiększają powikłania ciężkiej postaci OZT, związane m.in. ze zwiększeniem przepuszczalności naczyń krwionośnych, takie jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (acute respiratory distress syndrome ARDS), ostre uszkodzenie nerek (AKI acute kidney injury), zaburzenia krzepnięcia czy zaburzenia hemodynamiczne. Wobec faktu, że uszkodzenie śródbłonka naczyń oraz niewydolność narządowa stanowią o ciężkości OZT, markery związane z tymi zaburzeniami badane są w kontekście prognozowania SAP. Wśród najlepiej zbadanych markerów AKI wymienia się lipokalinę neutrofilową związaną z żelatynazą (neutrophil gelatinase-associated lipocalin - NGAL). W AKI wzrost stężenia NGAL obserwowany jest przede wszystkim w moczu (ungal), natomiast pomiar stężenia NGAL w surowicy (sngal) bywa uznawany za wczesny marker ciężkości przebiegu OZT [9,15-16]. Zauważono również, że pomiary stężenia NGAL mogą mieć lepszą wartość prognostyczną od stosowanych aktualnie prognostycznych wskaźników klinicznych SAP tj. skala APACHE II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II), czy Ranson a [9]. NGAL jest białkiem złożonym ze 178 aminokwasów o masie cząsteczkowej 25-kDa wydzielanym do moczu przez komórki grubego odcinka ramienia wstępującego pętli Henlego i cewki zbiorcze, znanym również w literaturze pod nazwą lipokalina-2 oraz syderokalina. Białko to produkowane jest ponadto przez komórki przewodu pokarmowego, układu oddechowego i immunologicznego, biorąc udział w ostrych i przewlekłych procesach zapalnych [15]. Uważa się, że NGAL uczestniczy w reakcji chelatowania kompleksów żelazowych zwiększających wzrost bakterii oraz w procesie recyrkulacji kompleksów żelazowych drogą endocytozy, przez co działa protekcyjnie na narażone na niedokrwienie cewki nerkowe [9]. W przypadku uszkodzenia nerek związanego z niedokrwieniem, stężenie ungal wzrasta wielokrotnie w ciągu 4-6 godzin od zadziałania czynnika nefrotoksycznego, 11

12 osiągając maksimum po ok. 12 godzinach. Na podstawie dostępnego piśmiennictwa należy sądzić, że badanie NGAL w moczu pozostaje czułym i wczesnym wskaźnikiem AKI [9,17]. Z kolei uszkodzenie śródbłonka w przebiegu OZT wiąże się ze wzrostem angiopoetyny- 2 (Ang-2). Parametr ten uznano za dobry wskaźnik rokowniczy wystąpienia niewydolności narządowej m.in. w przebiegu OZT. Autorzy dotychczasowych, nielicznych jeszcze badań, sugerują wdrożenie jej pomiaru do bieżącej praktyki klinicznej [12-14]. Angiopoetyny (Ang-1 i Ang-2) stanowią nową klasę angiopoetycznych czynników wzrostowych, które działają selektywnie na komórki śródbłonka prowadząc odpowiednio do zwiększenia lub redukcji przepuszczalności naczyń. Ang-2 zlokalizowana jest w obrębie ciałek Weibel-Palade a wraz z czynnikiem von Willebranda, P-selektyną, CD63, interleukiną 8, endoteliną-1 oraz czynnikiem aktywującym plazminogen i jednocześnie z nimi uwalniana zostaje z uszkodzonych komórek śródbłonka. W krążeniu ogólnym Ang-2 pojawia się stosunkowo wcześnie, bo już po około 4,5 godzinach od zadziałania czynnika stymulującego, np. pochodzenia bakteryjnego lub wzrostu stężenia cytokin prozapalnych, w tym czynnika martwicy nowotworów (TNF- ). W związku z tym Ang-2 stanowi potencjalnie użyteczny biomarker uogólnionego procesu zapalnego oraz aktywacji śródbłonka [13]. W najnowszych badaniach, jako biomarkery uszkodzenia śródbłonka, wymieniane są również cząsteczki mikrorna. MikroRNA są niewielkimi (złożonymi z nukleotydów), niekodującymi białek, fragmentami RNA. Pełnią rolę w regulacji ekspresji genów, wiążąc się z odpowiednimi, specyficznymi sekwencjami mrna. Cząsteczki mikrorna mogą być jednak uwalniane z komórek i są wykrywane m.in. w osoczu, czy surowicy. Krążące cząsteczki mikrorna pozostają skompleksowane z białkiem argonaute-2 lub są związane z mikrocząstkami pochodzenia komórkowego, ciałkami apoptotycznymi i egzosomami. Sugeruje się udział mikrorna w komunikacji międzykomórkowej. Stężenia specyficznych krążących mikrorna, związanych z aktywacją czy uszkodzeniem różnych komórek, są w 12

13 ostatnich latach intensywnie badane jako potencjalne biomarkery diagnostyczne. MikroRNA związane z uszkodzeniem śródbłonka są oceniane jako potencjalne markery ciężkości i powikłań narządowych w OZT. Mimo intensywnych badań, prognozowanie i wczesne rozpoznanie ciężkich postaci OZT stanowi wciąż wyzwanie. W codziennej praktyce klinicznej niezastąpiona jest wnikliwa obserwacja i ocena stanu pacjentów przez lekarza prowadzącego. Obecnie rutynowo jest ona wspierana przez zaawansowaną, coraz szerzej dostępną diagnostykę obrazową, wykorzystanie skal prognostycznych (skala Ransona, Glasgow, APACHE II), oraz oznaczeń uznanych markerów laboratoryjnych, związanych głównie ze stanem zapalnym (CRP, prokalcytonina). Nowe markery laboratoryjne, takie jak np. Ang-2, NGAL, czy mikrorna, budzą duże nadzieje, jednak wciąż nie dysponujemy wystarczającymi danymi, potwierdzającymi ich użyteczność diagnostyczną. Jednocześnie metodologia oznaczeń oraz znaczne koszty związane z wykorzystaniem metod biologii molekularnej ograniczają użycie tych biomarkerów (mikrorna). Brak jest także danych dotyczących omawianego zagadnienia w populacji polskiej. 13

14 Charakterystyka prac wchodzących w skład rozprawy doktorskiej Artykuł numer 1 opublikowany w Przeglądzie Lekarskim jest wstępem do rozprawy doktorskiej, wprowadzającym w problematykę OZT, w którym szczegółowo opisane zostały definicje, skale prognostyczne i markery laboratoryjne użyteczne we wczesnej fazie rozwoju choroby. Podano również podstawowe dane z piśmiennictwa światowego dotyczące badanych w niniejszej pracy doktorskiej biomarkerów (NGAL, Ang-2). Artykuł numer 2 opublikowany w Mediators of Inflammation ocenia użyteczność angiopoetyny-2 (Ang-2) w prognozowaniu ciężkości OZT i diagnozowaniu wczesnych powikłań OZT, w szczególności ostrego uszkodzenia nerek (AKI wg KDIGO) i niewydolności nerek rozpoznawanej zgodnie ze skalą Marshalla. Opisano także korelacje Ang-2 z wybranymi wskaźnikami laboratoryjnymi stosowanymi w monitorowaniu przebiegu OZT, w tym z markerami funkcji nerek. Artykuł numer 3 opublikowany w Folia Medica Cracoviensia dotyczy użyteczności diagnostycznej sngal w rozpoznawaniu ciężkiego przebiegu OZT we wczesnej fazie choroby. W pracy pokazano jak zmienia się stężenie sngal u pacjentów w zależności od stopnia ciężkości choroby, przedstawiono korelacje z punktacją w skali BISAP i wybranymi markerami stanu zapalnego oraz oceniono wartość diagnostyczną sngal. Artykuł numer 4 opublikowany w Folia Medica Cracoviensia porównuje wartość oznaczeń NGAL w moczu i w surowicy u pacjentów z OZT we wczesnej fazie choroby. W szczególności oceniono użyteczność tych oznaczeń w przewidywaniu rozwoju AKI w przebiegu OZT. Oceniono także korelacje między ungal i sngal, a wskaźnikami funkcji nerek (mocznik, kreatynina, albuminuria). Artykuł numer 5 opublikowany w Pancreatology poświęcony jest analizie stężeń wybranych mikrorna, które w dostępnym piśmiennictwie były wiązane z uszkodzeniem trzustki, wątroby 14

15 oraz śródbłonka, u pacjentów we wczesnej fazie OZT. W szczególności oceniano związek surowiczych stężeń mikrorna pochodzenia śródbłonkowego (has-mir-126 i 551b-5p) z ciężkością OZT. Cele badania Celem rozprawy doktorskiej była ocena przydatności oznaczania nowych biomarkerów w przewidywaniu ciężkiego oraz powikłanego przebiegu OZT. Przeprowadzona została analiza związków pomiędzy stężeniami NGAL (w surowicy i w moczu), Ang-2 i wybranych mikrorna oraz ciężkością przebiegu OZT we wczesnej fazie rozwoju choroby. Autor starał się odpowiedzieć na następujące pytania: 1. Czy stężenia Ang-2 i NGAL w surowicy oraz NGAL w moczu wzrastają we wczesnej fazie przebiegu OZT? 2. Jaka jest dynamika zmian analizowanych markerów u chorych z ciężką postacią choroby w porównaniu do innych wczesnych markerów zapalnych? 3. Czy stężenia Ang-2, ungal i sngal pozwalają na wczesne prognozowanie ciężkości OZT i rozwoju powikłań narządowych w przebiegu tej choroby? W szczególności, czy pomiary ungal oraz Ang-2 są użyteczne w rozpoznaniu AKI jako powikłania OZT? 4. Czy oznaczanie mikrorna jest przydatne we wczesnej ocenie ciężkości OZT? Materiał i metody badań Grupa badana W przypadku prac poświęconych pomiarom NGAL w surowicy i moczu oraz Ang-2 w surowicy badaną grupę stanowiło 65 chorych z rozpoznaniem OZT hospitalizowanych i leczonych w Oddziale Chirurgicznym Szpitala Rejonowego w Suchej Beskidzkiej. W publikacji poświęconej mikrorna badanie przeprowadzono w grupie łącznie 88 pacjentów, w 15

16 tym 65 pacjentów leczonych w Oddziale Chirurgicznym Szpitala Rejonowego w Suchej Beskidzkiej oraz 23 chorych hospitalizowanych w Oddziale Klinicznym Chirurgii Ogólnej, Onkologicznej i Gastroenterologicznej Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. OZT rozpoznawano i klasyfikowano w oparciu o zmodyfikowaną w 2012 r. klasyfikację Atlanta (Atlanta Classification revisited) [2]. W świetle tej klasyfikacji, OZT rozpoznawane jest w przypadku wystąpienia co najmniej dwóch z pośród 3 wymienionych kryteriów tj.: 1. typowy obraz kliniczny (ból w nadbrzuszu o ostrym początku, często promieniujący do pleców), 2. przynajmniej 3-krotny wzrost aktywności lipazy lub amylazy 3. charakterystyczne zmiany widoczne w badaniu obrazowym (dynamiczna TK, USG jamy brzusznej, ewentualnie MR). Do grupy badanej zakwalifikowane zostały zarówno kobiety, jak i mężczyźni w wieku powyżej 18 roku życia. Z badania wyłączeni zostali chorzy, którzy w chwili rozpoznania OZT leczeni byli z powodu schorzeń wątroby, nerek oraz chorzy, którzy wycofali zgodę na udział w badaniu. Przeprowadzona została kliniczna ocena ciężkości przebiegu OZT i na jej podstawie chorzy zostali zakwalifikowani do jednej z 3 grup odpowiednio o łagodnym (MAP mild acute pancreatitis), średnio-ciężkim (MSAP moderate acute pancreatitis) oraz ciężkim (SAP severe acute pancreatitis) przebiegu choroby. Jako łagodną charakteryzuje się postać, w której nie dochodzi do rozwoju niewydolności narządowej, ani powikłań miejscowych. Jeżeli rozwinie się przemijająca niewydolność narządowa (trwająca do 48 godzin od początku OZT), powikłania miejscowe (martwica, ostry zbiornik martwiczy, otorbiona martwica trzustki) i/lub dojdzie do zaostrzenia choroby współistniejącej z OZT, pacjenci kwalifikowani byli jako przypadki o MSAP. W sytuacji, gdy pacjent rozwinął przetrwałą niewydolność narządową (trwającą powyżej 48 godzin) i wystąpiło u niego 1 powikłanie miejscowe, kwalifikowany był do grupy o ciężkim przebiegu OZT. 16

17 Materiał badany Materiał badany stanowiły próbki krwi i moczu pacjentów zakwalifikowanych do badania. Materiał pobierano w ciągu pierwszych 12, 48 oraz 72 godzin trwania OZT. Pobranie krwi zostało przeprowadzone przy okazji rutynowych badań służących bieżącej ocenie stanu chorego. Schemat taki zaproponowany został w celu zminimalizowania niedogodności na jakie mógłby zostać narażony pacjent z powodu dodatkowego pobierania krwi. Badania laboratoryjne wykorzystywane do bieżącej oceny stanu pacjenta wykonane były w Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej ZOZ w Suchej Beskidzkiej oraz w Zakładzie Diagnostyki Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. W celu wykonania oznaczeń sngal, Ang-2 oraz mikrorna pobierano dodatkową probówkę krwi na skrzep, po odwirowaniu krwi, surowicę porcjowano i zamrażano w temp. -70 o C do czasu zebrania kompletu próbek. Jednocześnie w ciągu pierwszych 12, 48 oraz 72 godzin trwania OZT pobierano próbkę moczu do oznaczania ungal. Począwszy od drugiej doby od wystąpienia objawów OZT, była to pierwsza poranna porcja moczu. Metody laboratoryjne Pomiary stężeń sngal (Quantikine Human Lipocaline 2/NGAL Immunoassay) oraz Ang-2 (Quantikine ELISA Human Angiopoietin-2 Immunoassay) w surowicy przeprowadzone zostały w Zakładzie Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie. Wymienione parametry oznaczane były przy pomocy techniki ELISA z wykorzystaniem zestawów odczynnikowych firmy R&D Systems (Minneapolis, USA). Pomiary wymienionych markerów przeprowadzone zostały w seriach, po zebraniu pełnych kompletów próbek celem racjonalnego i ekonomicznego wykorzystania zestawów odczynnikowych do oznaczeń techniką ELISA. Pomiary przeprowadzone zostały 17

18 przy użyciu czytnika mikropłytek Automatic Micro ELISA Reader ELX 808 firmy BIO-TEK Instruments, Inc., USA). Pomiar ungal w moczu przeprowadzony został przy użyciu platformy immunochemicznej ARCHITECT (ARCHITECT Analyzer, Abbott Diagnostics, Abbott Park USA) w Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej ZOZ w Suchej Beskidzkiej. Pomiary stężenia ungal wykonywane były w dniu pobrania materiału. Wybrane krążące mirna ekstrahowano przy użyciu mircury RNA Isolation Kit (Exiqon, nr kat ). Ilość i jakość wyizolowanych mirna oceniano stosując Agilent Bioanalyzer 2100 (Small RNA Analysis Chip, Agilent Technologies, Inc.). Odwrotną transkrypcję (RT) wykonano przy użyciu mircurylna Universal RT kit (Exiqon, cat. No ). Reakcję qpcr przeprowadzono używając Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA). Amplifikację cdna wykonano używając KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix (2X) Universal (KAPA BIOSYSTEMS, cat. No. KK4621). Główne wyniki, wnioski i implikacje praktyczne przeprowadzonego badania Artykuł numer 1 opublikowany w Przeglądzie Lekarskim Zamieszczony jako wstęp do niniejszej rozprawy, artykuł ma charakter przeglądu aktualnej wiedzy na temat rozpoznawania i przewidywania ciężkości przebiegu OZT we wczesnej fazie choroby. Przedstawiono w nim definicję OZT i zmodyfikowaną klasyfikację OZT z Atlanty (2012). Zwrócono uwagę na istotne znaczenie wczesnego przewidywania ciężkiej postaci OZT i wczesnego rozpoznania rozwijającej się niewydolności narządowej. Dokonano przeglądu metod obecnie stosowanych rutynowo, jak i opisanych w najnowszym piśmiennictwie, służących do różnicowania ciężkości OZT w ciągu pierwszych godzin. Wśród tych narzędzi diagnostycznych wyróżniono skale prognostyczne, takie jak skala Ransona, APACHE II, Glasgow, CTSI, BISAP, Panc3 i HAPS. Odniesiono się do wczesnego rozpoznawania niewydolności narządowej, w tym do zalecanej wg. zmodyfikowanej klasyfikacji Atlanta skali 18

19 Marshalla. W artykule podkreślono znaczenie technik obrazowych, przede wszystkim tomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym, oraz wzrost znaczenia w rutynowej diagnostyce ultrasonografii endoskopowej (EUS) oraz MRI (magnetic resonance imaging), zwłaszcza wówczas kiedy wykonanie tomografii komputerowej z kontrastem będącej złotym standardem, nie jest zalecane. Kolejnym zagadnieniem, na który zwrócono uwagę są markery laboratoryjne będące potencjalnymi predyktorami ciężkości OZT jak: prokalcytonina (PCT), peptyd aktywujący trypsynę (TAP), elastaza granulocytów obojętnochłonnych (PMNelastaza), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), cytokiny prozapalne: interleukina-6, interleukina-8 oraz najpowszechniej stosowane białko C-reaktywne (CRP). W artykule zaznaczono, jak ważnym kierunkiem jest poszukiwanie nowych biomarkerów wczesnych powikłań OZT, opisując ostre uszkodzenie nerek (AKI) jako jedno z poważniejszych powikłań ciężkiej postaci OZT w szczególności w kontekście ograniczonej wartości dotychczasowych narzędzi diagnostycznych tj. ocena kreatyninemii i diurezy w rozpoznawaniu AKI. Zwrócono uwagę na nowe biomarkery uszkodzenia nerek, jak oznaczane w moczu: ungal, interleukina 6, cząsteczka uszkodzenia nerek (KIM-1), interleukina 18, L-FABP (liver fatty acid binding protein) czy oznaczana w surowicy cystatyna C. Zwłaszcza oznaczanie ungal jest polecane ze względu na nowoczesną technikę pomiarową, łatwą dostępność i możliwość rutynowego wykorzystania w praktyce klinicznej. Uwagę poświęcono także markerom uszkodzenia śródbłonka, takim jak angiopoetyna-2, aktywator plazminogenu typu urokinazowego (upa) oraz jego receptor (upar, CD87). Artykuł numer 2 opublikowany w Mediators of Inflammations W przedstawionym artykule oceniono zmiany stężenia Ang-2 u chorych o różnym stopniu ciężkości OZT, w okresie pierwszych 24 oraz po upływie 48 i 72 godzin od wystąpienia OZT. Poszukiwano zależności pomiędzy stężeniem Ang-2 a rozwojem SAP, niewydolności 19

20 narządowej, w szczególności AKI we wczesnej fazie trwania choroby. Ang-2 należy do klasy angiogenicznych czynników wzrostowych, działających selektywnie na śródbłonek poprzez wiązanie z receptorem Tie-2. Wzrost stężenia Ang-2 działa hamująco na wiązanie Ang-1 do Tie-2 prowadząc tym samym do uszkodzenia śródbłonka naczyń krwionośnych, zwiększonego przesączania oraz adhezji leukocytów. Pod wpływem czynników aktywujących tj. hipoksja, zapalenie, czy uszkodzenie mechaniczne dochodzi do szybkiego uwalniania Ang-2 do krążenia ogólnego. W całej grupie chorych z OZT stężenia Ang-2 były blisko 2-krotnie wyższe w porównaniu z wartościami referencyjnymi. Najwyższe stężenia Ang-2 obserwowano u pacjentów z SAP w ciągu pierwszych 24 godzin od pojawienia się objawów choroby. Wykazano, że Ang-2 jest istotnym predyktorem AKI rozpoznawanej na podstawie kryteriów KDIGO oraz niewydolności nerek ocenianej wg. zmodyfikowanej skali Marshalla. W przedstawionym badaniu wykazano znaczące korelacje pomiędzy stężeniem Ang-2 ocenianym w ciągu pierwszych 72 godzin trwania OZT a markerami zapalnymi i wskaźnikami wydolności narządów: wykazano dodatnie korelacje pomiędzy Ang-2 a CRP, fibrynogenem, D-dimerami, kreatyniną, mocznikiem, ungal i sngal oraz ujemne korelacje pomiędzy Ang-2 a hematokrytem, stężeniem albuminy i wapnia całkowitego. W artykule podkreślono zależność pomiędzy Ang-2 oraz obecnością powikłań nerkowych, zwłaszcza korelację ze stężeniem ungal. Na uwagę zasługuje także wykazana dodatnia korelacja pomiędzy Ang-2, a wielkością wskaźnika uacr (stosunek stężenia albuminy do stężenia kreatyniny w moczu) oceniona w ciągu pierwszych 48 godzin trwania choroby. Przeprowadzone przez autorów pracy badania potwierdziły zależność pomiędzy stężeniem Ang-2 w surowicy chorych, ciężkością przebiegu OZT oraz pogorszeniem funkcji nerek we wczesnym okresie choroby. Wysokie stężenia Ang-2 w korelacji z ungal i uacr u chorych z SAP obserwowane w okresie okna terapeutycznego, tj. pierwszych 48 godzinach trwania OZT, mogą być istotnym predyktorem 20

21 rozwoju ostrego zespołu trzustkowo-nerkowego i ważnym z punktu widzenia podejmowanych decyzji terapeutycznych narzędziem dla klinicysty w ocenie ciężkości przebiegu choroby. Artykuł numer 3 opublikowany w Folia Medica Cracoviensia Artykuł dotyczył wartości diagnostycznej oznaczeń NGAL w surowicy we wczesnej ocenie ciężkości OZT. Dotychczasowe doniesienia wskazują na znaczenie sngal jako markera uogólnionego stanu zapalnego, użytecznego w przebiegu różnych jednostek chorobowych, którego szersze wykorzystanie jest jednak utrudnione ze względu na metodologię oznaczeń (testy ELISA). Dotychczas nie opublikowano polskich badań w tym zakresie. W przedstawionej pracy oceniano stężenia sngal w okresie pierwszych 72 godzin przebiegu OZT. Potwierdzono, że u chorych z SAP stężenie sngal już przy przyjęciu pacjenta do szpitala było wyższe (mediana 329 µg/l) w stosunku do pacjentów z MSAP (226 µg/l) oraz MAP (104 µg/l). Wartość wskaźnika BISAP 3 w ciągu pierwszych 24 godzin trwania OZT i czas pobytu w szpitalu były istotnie skorelowane ze stężeniem sngal. W badaniu przedstawiono także istotne korelacje pomiędzy sngal a wybranymi markerami stanu zapalnego (dodatnie korelacje z całkowitą liczbą leukocytów, CRP, fibrynogenem, ujemna korelacja z albuminą). Należy zwrócić uwagę na silną korelację pomiędzy sngal a CRP. Przy użyciu analizy krzywych ROC (receiver operating characteristics) oceniono wartość diagnostyczną sngal potwierdzając jej użyteczność jako dodatkowego prognostycznego markera OZT, począwszy od drugiej doby po wystąpieniu objawów choroby. W drugiej dobie OZT czułość diagnostyczna sngal w przewidywaniu ciężkiego przebiegu choroby wynosiła 90%, zaś swoistość 72% przy wartości odcięcia 183 µg/l. 21

22 Artykuł numer 4 opublikowany w Folia Medica Cracoviensia Celem badania było porównanie użyteczności diagnostycznej oznaczeń stężenia NGAL w surowicy i w moczu w rozpoznaniu AKI jako wczesnego powikłania OZT. Zaobserwowano, że stężenia NGAL, oznaczane w ciągu pierwszych 72 godzin trwania OZT zarówno w surowicy jak i w moczu, korelują z ciężkością przebiegu OZT oraz rozwojem AKI. Stężenia sngal u chorych z AKI (mediana 276 ng/ml) były istotnie wyższe niż u pacjentów bez tego powikłania (105 ng/ml), jednak stężenia ungal wykazywały większą dysproporcję między tymi grupami (550,6 ng/ml u chorych z AKI w porównaniu z 26,3 ng/ml u chorych bez AKI). Ponadto, w pracy tej wykazano, że istotnie wyższe stężenie sngal i ungal pojawia się u chorych z cięższym stanem klinicznym (z wyższą punktacja w skali BISAP w ciągu pierwszych 24 godzin trwania OZT, niewydolnością narządową ocenianą w skali Marshalla, współistniejącą martwicą trzustki, czy obecnością wysięku opłucnowego). Obserwowano też dodatnie korelacje między sngal i ungal a stężeniem CRP, bezwzględną liczbą neutrofili, a także wskaźnikami funkcji nerek (mocznikiem, kreatyniną i albuminurią). Praktyczną obserwacją kliniczną jest potwierdzenie użyteczności oceny ungal w pojedynczej porcji moczu u chorych z OZT w pierwszej dobie hospitalizacji, celem szybkiego zidentyfikowania rozwijającego się uszkodzenia nerek. U zdecydowanej większości chorych z AKI w badanej grupie, stężenie ungal było wyższe od 100 ng/ml. Można wysnuć wniosek, że szczególnie u tych chorych, począwszy od pierwszej doby od rozpoznania OZT należy wdrożyć intensywne leczenie AKI oraz działania nefroprotekcyjne. Ocena ungal przeprowadzona ponownie po 48 godzinach z dużym prawdopodobieństwem pozwala ocenić efekty leczenia AKI w OZT, a zaobserwowanie istotnego obniżenia się stężenia ungal w pojedynczej porcji moczu pozwala na wyciągniecie wniosku o zmniejszeniu lub braku zagrożenia AKI i skutecznym leczeniu tego powikłania. Można zatem stwierdzić, że w przypadku monitorowania AKI w OZT, oznaczanie ungal może być porównywane i bywa określane mianem troponiny nerkowej. Oznaczanie stężenia 22

23 ungal jest więc prostym, szybkim, w pełni zautomatyzowanym oraz dostępnym w czasie pracy rutynowej laboratorium markerem niosącym konkretne informacje diagnostyczno terapeutyczne. Można tym samym zaliczyć oznaczanie stężenia ungal do grupy markerów o potencjale i możliwościach zastosowania praktycznego do monitorowania funkcji nerek u chorego z OZT. Artykuł numer 5 opublikowany w Pancreatology Wobec złożoności choroby jaką jest OZT i niedoskonałości dotychczasowych metod diagnostycznych, oraz pomimo zaawansowanych technologii laboratoryjnych, nadal należy poszukiwać nowych lepszych potencjalnych biomarkerów. Uszkodzenie śródbłonka jest związane z wczesną fazą uogólnienia procesu chorobowego w przebiegu OZT, co potwierdzają wyżej przedstawione obserwacje dotyczące angiopoetyny-2. W przedstawionym artykule stanowiącym zakończenie niniejszej rozprawy doktorskiej, oceniono stężenia mikrorna pochodzących z trzustki, wątroby oraz ze śródbłonka. MikroRNA są małymi, zbudowanymi z nukleotydów cząstkami RNA, które mają zdolność do wiązania się z mrna dzięki czemu regulują ekspresję genów głównie poprzez ich hamowanie. Stwierdzono obecność mikrorna także poza komórką, m.in. w osoczu oraz surowicy. W badaniu przeprowadzonym przez autorów, ocenie poddano wybrane mikrorna w surowicy, a następnie porównano ich poziom u pacjentów o różnym stopniu ciężkości OZT w stosunku do grupy kontrolnej. W aspekcie opisanej we wcześniejszej pracy pt. Angiopoietin-2 is an early indicator of acute pancreatic-renal syndrome in patients with acute pancreatitis problematyki zwracającej uwagę na uszkodzenia śródbłonka w rozwoju SAP w badaniu podjęto próbę odpowiedzi na pytanie, czy istnieje związek pomiędzy ciężkością przebiegu OZT oraz obecnością śródbłonkowych mikrorna w badanym materiale. Ocenie poddano: hsa-mir-16-5p, hsa-mir- 103a-3p, hsa-mir-122-5p, hsa-mir-126-5p, hsa-mir-148a-3p, hsa-mir-216a-5p, hsa-mir- 23

24 375, hsa-mir-551b-5p. U pacjentów z SAP obserwowano znaczący wzrost poziomu hsa-mir p, hsa-mir-148a-3p, hsa-mir-216a-5p, hsa-mir-551b-5p oraz hsa-mir-375 w stosunku do osób z grupy kontrolnej. Natomiast u pacjentów z MAP obserwowano wzrost: hsa-mir- 216a-5p, hsa-mir-551b-5p oraz hsa-mir-375. Autorzy pracy wykazali, że mikrorna licznie występujące w poszczególnych narządach, jak hsa-mir-122-5p w wątrobie, czy hsa-mir-375 i hsa-mir-148a-3p liczne w trzustce wykazują podwyższone stężenia u pacjentów z OZT, niezależnie od ciężkości choroby. Natomiast mikrorna związane z uszkodzeniem śródbłonka, jak hsa-mir-126-5p oraz hsa-mir-551b-5p, mogą mieć znaczenie dyskryminujące ciężkość choroby (wg analizy ROC dla hsa-mir-126-5p: AUC 0,748; czułość 60,0%; swoistość 87,1%; p<0,001 oraz dla hsa-mir-551b-5p: AUC 0,716; czułość 69,2%; swoistość 72,6%; p<0,001). Aspekty praktyczne pracy Przedstawiona rozprawa doktorska miała na celu ocenę wartości diagnostycznej i rokowniczej angiopoetyny-2 i NGAL jako markerów przebiegu i powikłań OZT we wczesnej fazie rozwoju choroby (pierwsze 72 godziny). Mimo intensywnych badań nad patomechanizmem OZT i prowadzonych od wielu lat poszukiwań optymalnych markerów ciężkości przebiegu choroby, wyniki uzyskane przez autora stanowią oryginalny i unikatowy sposób ujęcia zagadnienia. Badania stężenia Ang-2 i mikrorna w surowicy chorych we wczesnej fazie OZT zostały przeprowadzone po raz pierwszy w populacji polskiej i dostarczyły nowych informacji na temat zakresów oraz dynamiki zmian stężeń tych markerów w przebiegu OZT o różnym stopniu ciężkości. Z kolei obserwacje dotyczące sngal i ungal potwierdzają doniesienia innych autorów. Jednocześnie przeprowadzona ocena użyteczności diagnostycznej tych oznaczeń umożliwia lepsze wykorzystanie ich w praktyce klinicznej. W szczególności dotyczy to ungal, jako rutynowo dostępnego badania laboratoryjnego. 24

25 Przedstawione badania przyczyniają się do uzupełnienia danych klinicznych o dodatkowe narzędzie diagnostyczne już na etapie wczesnego kwalifikowania chorych do właściwej pod względem ciężkości przebiegu grupy. W przyszłości może to być pomocne w tworzeniu odpowiedniej strategii leczniczej, podyktowanej znacznie gorszym rokowaniem w grupie pacjentów o ciężkim przebiegu OZT. Otrzymane wyniki skłaniają do dalszych badań na większej grupie pacjentów. 25

26 4. Podsumowanie pracy doktorskiej w języku angielskim Acute pancreatitis (AP) is an acute inflammation of the gland associated with the premature activation of pancreatic proenzymes and tissue damage of various severity, in some cases also damage to distal organs [1-3]. In the majority of cases, AP is not difficult to diagnose, and the morbidity associated with mild acute pancreatitis (MAP) usually never exceeds 2% [4-5]. However, in about 20% of patients AP develops into severe acute pancreatitis (SAP) with local and general complications, and is associated with high mortality rate [6-7]. There is a necessity to find new diagnostic methods useful in prognosis and early recognition of SAP. In 2012, after over 20 years, criteria of recognition and classification of AP have been modified. The revised Atlanta classification 2012 [2] especially stresses the relationship between organ failure and prognosis as well as mortality. A definition of temporary (until 48 hours) and persistent (over 48 hours) organ failure was introduced. A moderately severe acute pancreatitis (MSAP) was also defined [2]. In the course of AP, two phases were distinguished: early, which lasts within the first week, and late which may last next weeks or months [2, 8]. Early diagnosing of SAP, with subsequent hospitalization at the intensive care unit and adequate therapy (i.e. liquid resuscitation, antibiotic prophylaxis in patients with necrosis, fast ERCP in case of biliary obstruction) are for now the only effective methods of treatment [6, 9-11]. AP is a serious disease itself, but mortality increases with complications of SAP, associated among others with increased vascular permeability, acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute renal injury (AKI), coagulation and hemodynamic disorders. Damage to the vascular endothelium and organ failure show severity of AP, and thus biomarkers associated with these lesions are studied in context of prognosis of SAP. Among the best currently known markers of AKI, one can distinguish neutrophil gelatinaseassociated lipocain (NGAL). Early increase of urine NGAL (ungal) serves as a marker of 26

27 AKI, while early measurement of NGAL concentrations in blood serum (sngal) is considered as an early marker of the severity of AP [9, 15-16]. It was denoted that measurements of NGAL may have better prognostic value in comparison to currently used prognostic clinical parameters of SAP, i.e. APACHE II scale (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II) or Ransons scale [9]. NGAL is a protein consisted of 178 aminoacids, with molecular weight 25 kda, secreted to urine by the cells of the thick portion of ascending arm of the loop of Henle and collecting tubules, known in the literature as lipocaine-2 and syderocaline. This protein is also produced by the cells of gastrointestinal tract, respiratory and immune systems, involved in acute and chronic inflammation [15]. It is considered that NGAL takes part in chelatinisation of iron complexes which increase growth of bacteria and in processing of recirculation of iron complexes through endocytosis, thus protecting renal tubules suffering from ischemia [9]. In case of renal damage associated with ischemia, concentration of ungal increases several times during 4-6 hours after nephrotoxic insult, with the peak concentration after 12 hrs. Review of the literature shows that concentration of NGAL in the urine remains an early and sensitive parameter of AKI [9, 17]. Endothelial damage in course of AP is associated with increase in angiopoietin-2 (Ang-2). Serum Ang-2 concentration is concerned to be of prognostic value in detection of organ failure in the course of acute diseases including AP. Authors of not very numerous papers postulate its incorporation into a panel of clinical laboratory tests [12-14]. Angiopoietins (Ang-1 and Ang- 2) are new class of angiopoietic factors which selectively act on endothelial cells increasing or reducing vascular permeability. Ang-2 is localized in Weibel-Palade bodies together with von Willebrandt s factor, P-selectine, CD 63, interleukin-8, endothelin-1 and plasminogen activation factor, and together with them is released from damaged endothelial cells. It can be found in general circulation quite early, about 4.5 hour after exposure to activating factor of 27

28 bacterial origin or growth in concentrations of proinflammatory cytokines, including tumor necrotizing factor alpha (TNF-alpha). Thus, Ang-2 is a potentially useful biomarker of general inflammation and endothelial activation [13]. Recent studies show that biomarkers of endothelial damage include particles of microrna. MicroRNA are small (18-22 nucleotides) non-protein coding, fragments of RNA. They play regulatory role in gene expression, binding with specific sequences of mrna. Particles of microrna may be released from cells and are detected in blood serum or plasma. Circulating particles of microrna are complexed with protein argonaute-2 or are bound with microparticles originated from cells, apoptotic bodies and exosomes. It is postulated that microrna participates in intercellular communication. Concentrations of specific microrna associated with activation or damage of various cells are intensively studied as potential diagnostic biomarkers. MicroRNA associated with endothelial damage are potential markers of severity and organ damage in course of AP. Despite intense studies, prognosis and early diagnosis of SAP is still a challenge. In every day practice, careful observation of a patient and frequent evaluation by attending physician is necessary. Nowadays, it is routinely supported by advanced, wider accessible imaging, application of prognostic scales (Ranson, Glasgow, APACHE II) and measurement of certain laboratory biomarkers, mainly associated with inflammation (CRP, procalcitonin). New laboratory markers, i.e. Ang-2, NGAL, or microrna rise the hope, but the data confirming their prognostic value still remain obscure. At the same time, methodology and quite high expenses limit the routine application of these biomarkers (microrna, Ang-2). Also, there is a lack of data in this certain subject in Polish population. Characteristics of the papers included into PhD thesis Article no 1 published in Przegląd Lekarski is an introduction into the thesis, which guides through the issues related to AP. The article presents definition of AP, and describes in details 28

29 the prognostic scales and laboratory biomarkers useful in early phase of the disease. Basic data from world literature relevant to biomarkers studied in this thesis (NGAL, Ang-2) were also summarized. Article no 2 published in Mediators of Inflammation evaluates the usefulness of angiopoetin-2 (Ang-2) serum concentrations for prognosis of severity of AP and early diagnosis of complications, especially acute kidney injury (AKI following KDIGO) and renal failure recognized on the basis of Marshall score. Correlations were reported between Ang-2 concentrations and laboratory indicators used for monitoring the course of AP, including markers of renal function. Article no 3 published in Folia Medica Cracoviensia deals with diagnostic usefulness of sngal in recognition of SAP in early phase of the disease. The paper shows how sngal concentrations change depending on the severity of the disease, and reports correlations between sngal and BISAP score and certain markers of inflammation. Also, the prognostic value of sngal was estimated. Article no 4 published in Folia Medica Cracoviensia compares the diagnostic utility of urine and serum NGAL concentrations in early phase of AP. Particularly, the usefulness of these measurements in prediction of AKI complicating AP was evaluated. Correlations were reported between ungal, sngal and markers of kidney function (urea, creatinine, albuminuria). Article no 5 published in Pancreatology describes concentrations of selected microrna, that in the literature are associated with pancreatic, hepatic and endothelial damage, in patients in early phase of AP. Especially, associations are reported between serum concentrations of micrornas of endothelial origin (hsa-mir-126-5p and has-mir-551b-5p) and severity of AP. 29

30 Aim of the study The aim of the PhD thesis was the estimation of diagnostic usefulness of new biomarkers in prediction of severe and complicated course of AP. Analysis of correlations between concentrations of NGAL (in serum and urine), Ang-2 and selected micrornas and the severity of AP in early phase of the disease was performed. Author tried to answer the following questions: 1. Do concentrations of Ang-2 and NGAL in serum as well as NGAL in urine increase in the early phase of AP? 2. What is the dynamics of changes in concentrations of the analyzed markers in patients with severe form of AP comparing to other early markers of inflammation? 3. Do concentrations of Ang-2, ungal and sngal allow early prognosis of severity of AP and early diagnosis of organ complications in the course of this disease? Particularly is determination of ungal and Ang-2 useful in recognition of AKI as a complication of AP? 4. Is determination of microrna useful in early evaluation of AP severity? Material and methods Studied group The studies regarding NGAL in serum and urine and Ang-2 in serum included 65 patients diagnosed with AP hospitalized and treated in Surgical Ward of District Hospital in Sucha Beskidzka. In the publication on microrna, the studied group consisted of 88 patients, including 65 treated in Surgical Ward of District Hospital in Sucha Beskidzka, and 23 hospitalized in Surgical Ward of Clinic of General, Oncologic and Gastroenterologic Surgery of University Hospital in Krakow. 30

31 In all patients, AP was diagnosed and classified based on revised Atlanta classification 2012 [2]. Following this classification, AP was diagnosed when at least two criteria were fulfilled out of the three, i.e.: 1. typical clinical picture (acute epigastric pain, commonly radiating to the back), 2. at least 3-fold increase of lipase or amylase activity 3. characteristic changes in imaging (dynamic CT, abdominal USG, eventually MRI). The study group consisted of females and males above 18. Patients treated because of liver or kidney diseases at the moment of diagnosis, and the patients who refused to sign the consent were excluded from the study. Clinical evaluation of severity of AP was performed, and based on it patients were qualified to one of the three groups: MAP, MSAP or SAP. MAP (mild acute pancreatitis) is the form of AP where neither organ failure or local complication occur. Development of temporary organ failure (till 48 hrs from the moment of beginning), local complications (necrosis, acute necrotic collection, walled-off pancreatic necrosis) and/or exacerbation of the disease which coincidences with AP qualified the patients to the group of MSAP (moderately severe acute pancreatitis). In case of development of persistent organ failure (above 48 hours) and local complications, a patient was qualified to SAP (severe acute pancreatitis). Material studied The material consisted of blood and urine samples of patients qualified to the study. Blood and urine was collected within first 12, 48 and 72 hours of AP. The blood samples were collected together with samples for routine lab tests performed for evaluation of patient s condition. Such scheme was proposed to minimize inconveniences to which patient could have been exposed during additional taking of the blood samples. Routine laboratory tests were carried out in Diagnostic Unit of District Hospital in Sucha Beskidzka and Diagnostic Department of 31

32 University Hospital in Krakow. To determine sngal, Ang-2 and microrna additional testtube was taken, without anticoagulants. After clotting, blood was centrifuged, the serum was portioned and frozen in temperature -70 o C until collection of the rest of the samples. At the same time during first 12, 48, ad 72 hours of the course of AP, urine samples were taken in order to determine ungal. Beginning with the 48 hours sample, it was the first morning urine. Laboratory methods Measurements of serum concentrations of sngal (Quantikine Human Lipocaline 2/NGAL Immunoassay) and Ang-2 (Quantikine ELISA Human Angiopoietin-2 Immunoassay) were performed in Diagnostic Department, Chair of Clinical Biochemistry of Jagiellonian University Medical College in Krakow. The markers were estimated by ELISA using sets of reagents manufactured by R&D Systems (Minneapolis, USA). The measurements were performed in series, after collection of full sets of samples for economical use of reagents. Measurements were carried out using microplate reader Automatic Micro ELISA Reader ELX 808 BIO-TEK comp. (Instruments, Inc., USA). Determination of ungal was carried out using ARCHITECT analyzer (Abbott Diagnostics, Abbott Park USA) in Diagnostic Unit of District Hospital in Sucha Beskidzka. Concentrations of ungal were measured on the day of urine collection. Selected circulating micrornas were extracted using mircury RNA Isolation Kit (Exiqon, cat nr ). Quantity and quality of isolated micrornas was estimated using Agilent Bioanalyzer 2100 (Small RNA Analysis Chip, Agilent Technologies, Inc.). Reversed transcription (RT) was performed using mircurylna Universal RT kit (Exiqon, cat. No ). qpcr reaction was performer using Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, 32

33 USA). Amplification of cdna was made using KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix (2X) Universal (KAPA BIOSYSTEMS, cat. No. KK4621). Main results, conclusions and practical implications of the study Article no 1 published in Przegląd Lekarski This article is an introduction into the thesis and a review of current knowledge on diagnosis and prediction of severity of AP in early phase of the disease. Definition of AP and modified classification of AP from Atlanta (2012) was presented. Special attention was paid to the importance of early prediction of severity of AP and early diagnosis of organ failure. Currently used routine methods, and also those described in the current publications, which enable differentiation of severity of AP within first hours were reviewed. Among diagnostic tools, prognostic scales were mentioned, i.e. Ranson scale, APACHE II, Glasgow, CTSI, BISAP, Panc3 and HAPS. The scores used for evaluation of organ failure were mentioned, including modified Marshall score recommended by revised Atlanta classification. Importance of imaging techniques was also emphasized, with special respect toward contrast CT, increase of endoscopic ultrasonography and MRI, particularly at the moment when contrast CT, which is a golden standard, is contraindicated. Next, laboratory markers were discussed that are considered as potential predictors of AP severity, i.e. procalcitonin (PCT), trypsin activating peptide (TAP), PMN-elastase, hepatocyte growth factor (HGF), proinflammatory cytokines: interleukin-6, interleukin-8 and most commonly applied C-reactive protein (CRP). It was emphasized how important is research on new biomarkers of early complications of AP, describing AKI as one of the most common complications, especially with respect to limited value of currently used laboratory tools, i.e. serum creatinine and diuresis, in AKI recognition. New biomarkers of renal failure were described, including ones measured in urine: NGAL, interleukin-6, kidney injury molecule-1 (KIM-1), interleukin-18, liver-type fatty acid binding 33

34 protein (L-FABP) and measured in serum: cystatin C. In particular, determination of ungal is recommended because of modern technique, high availability and possible routine application in clinical practice. Attention was paid to markers of endothelial damage, i.e. angiopoetin-2, urokinase plasminogen activator and its receptor upar, CD 87. Article no 2 published in Mediators of Inflammation In this article, changes in Ang-2 concentrations in patients with various severity of AP during first 48 and 72 hours were evaluated. The relationships between Ang-2 concentrations and SAP progress were studied, especially with respect to organ failure, particularly AKI, in early phase of disease. Ang-2 belongs to proangiogenic factors, selectively acting upon the endothelium through binding with Tie-2 receptor. Increase of Ang-2 concentration inhibits binding of Ang- 1 with Tie-2 leading to endothelial damage, increased permeability and leukocyte adhesion. Under the influence of activating factors i.e. hypoxia, inflammation or mechanical injury, quick release of Ang-2 into general circulation occurs. In the whole group of patients with AP, concentrations of Ang-2 were nearly two folds higher than reference values. The highest concentrations of Ang-2 were observed in patients with SAP during first 24 hours from the initial symptoms of AP. It was showed that Ang-2 is a predictor of AKI diagnosed based on KDIGO criteria as well as renal insufficiency estimated according to Marshall scale. In the study presented, significant correlations were shown between Ang-2 concentrations during the first 72 hours of AP and inflammatory markers and parameters of organ function: we have shown positive correlation between Ang-2 and CRP, fibrinogen, D-dimers, creatinine, urea, ungal and sngal and negative correlation between Ang-2 and hematocrite, albumin and total calcium concentration. Of interest is the relationship between Ang-2 concentration and renal complications, especially correlation with ungal as well as the positive correlation between the Ang-2 and the value of urine albumin to creatinine ratio (uacr), observed during 34

35 first 48 hours of the disease. The studies carried out by the authors confirmed the dependence between serum Ang-2, the severity of AP and the deterioration of renal function in early phase of the disease. High concentrations of Ang-2 observed in patients with SAP during first 48 hours of AP, correlated with ungal and uacr, may be significant predictor of acute pancreato-renal syndrome. This observation seems important from clinical point of view, and may help during decision making in the evaluation of disease severity. Article no 3 published in Folia Medica Cracoviensia Article evaluates the diagnostic usefulness of NGAL measured in blood serum during early phase of AP. Studies performed until now indicate significance of sngal as marker of general inflammation, useful in different diseases. However, methodology of sngal measurements is not easy for routine use because of necessity of ELISA tests. Until now, such studies have not been published in Polish literature. In the article, we presented concentrations of sngal during 72 hours of AP. It was confirmed, that concentration of sngal in patients with SAP immediately after admission was higher (median 329 µg/l) in comparison with patients with MSAP (226 µg/l) and MAP (104 µg/l). The value of BISAP 3 during first 24 hours of AP and time of hospitalization were significantly correlated with concentration of sngal. The study presented significant correlation between sngal and selected markers of inflammation (positive correlation with total amount of leukocytes, CRP, fibrinogen, negative correlation with albumin). Attention should be paid to strong correlation between sngal and CRP. Using receiver operating characteristics (ROC) curves analysis, the diagnostic usefulness of sngal was estimated. Serum NGAL may be an additional prognostic marker of AP from the second day after occurrence of symptoms. In the second day of AP, diagnostic sensitivity of sngal for prediction of SAP was 90%, specificity 72%, at the cut-off value 183 µg/l. 35

36 Article no 4 published in Folia Medica Cracoviensia The aim of the study was to compare the diagnostic usefulness of serum and urine NGAL concentrations to diagnose AKI as an early complication of AP. It has been observed that the concentrations of NGAL, determined during first 72 hours of AP, both in serum and in urine, were associated with the severity of AP and the development of AKI. The concentrations of sngal in patients with AKI (median 276 ng/ml) were significantly higher than in patients without AKI (105 ng/ml), however, the concentrations of ungal showed a greater discrepancy between these groups (median ng/ml in patients with AKI, comparing to 26.3 ng/ml in patients without AKI). Besides, significantly higher concentrations of sngal and ungal were observed in patients with more severe clinical condition (i.e. with higher grades in BISAP sore during first 24 hours of AP, organ failure evaluated in Marshall score, pancreatic necrosis or pneumothorax). Also, sngal and ungal positively correlated with CRP, number of neutrophils in peripheral blood, and markers of kidney function (serum urea, creatinine and albuminuria). The practical aspect of the study was a confirmation of diagnostic usefulness of ungal measured in a single urine sample on the first day of hospitalization, for early prediction of renal failure in AP patients. In most of patients with AKI, concentration of ungal was higher than 100 ng/ml. It may be concluded that especially in these patients, beginning on the first day from recognition of AP, intense treatment of AKI and possible nephroprotective actions should be introduced. Measurement of ungal carried out again after 48 hours allows to evaluate the effects of AKI treatment in AP, and the decrease in ungal concentration allows conclusions with respect to decrease or lack of danger of AKI and effective treatment of this complication. It can be stated, that in monitoring of AKI, ungal may be comparable to and is called renal troponin. Determination of ungal is simple and fast, fully automated and accessible marker, which delivers concrete therapeutic-diagnostic 36

37 information. Thus, ungal is among the markers characterized by practical potential for monitoring of renal function in patients with AP. Article no 5 published in Pancreatology Because of complexity of AP as disease and lack of perfection of diagnostic methods currently used despite advanced laboratory techniques, there is still need to search for potentially better biomarkers. Damage to the endothelial cells is associated with early phase of generalization of the disease process in AP, as suggested by the above observations regarding angiopoetin-2. In the present article that closes the PhD thesis, the concentrations of hepatic, pancreatic and endothelial micrornas were measured in serum. MicroRNAs are small, composed of nucleotides, particles of RNA, which may bind with mrna, thus regulating gene expression mostly through their inhibition. MicroRNAs have been found in serum and plasma. In the study, selected micrornas were measured in serum, and their concentrations were compared between patients with various severity of AP and the control group. In earlier published article Angiopoietin-2 is an early indicator of acute pancreatic-renal syndrome in patients with acute pancreatitis we have considered problematics of damage to the vascular endothelium in course of SAP, while in the present article we took attempt of answering the question: is there a relationship between the severity of AP and the presence of endothelial micrornas in serum? We have evaluated: hsa-mir-16-5p, hsa-mir-103a-3p, hsa-mir-122-5p, hsa-mir-126-5p, hsamir-148a-3p, hsa-mir-216a-5p, hsa-mir-375, hsa-mir-551b-5p. In patients with SAP, we have observed significant increase in serum hsa-mir-126-5p, hsa-mir-148a-3p, hsa-mir-216a- 5p, hsa-mir-551b-5p and hsa-mir-375, in comparison to the control group. In patients with MAP increased serum concentrations of hsa-mir-216a-5p, hsa-mir-551b-5p and hsa-mir-375 were observed. MicroRNAs abundant in particular organs i.e. hsa-mir-122-5p in the liver, or hsa-mir-375 and hsa-mir-148a-3p in pancreas showed increased serum concentrations in 37

38 patients with AP, irrespective of the severity of the disease. However, micrornas associated with endothelial damage, i.e. hsa-mir-126-5p and hsa-mir-551b-5p, may allow the differentiation between MAP and more severe AP (as suggested by the following results of ROC analysis: for hsa-mir-126-5p AUC 0.748; diagnostic sensitivity 60%; specificity 87.1%; p<0.001 and for hsa-mir-551b-5p AUC 0.716; sensitivity 69.2%; specificity 72.6%; p<0.001). Practical aspects of the thesis Presented PhD thesis aimed at evaluating the diagnostic and prognostic usefulness of angiopoetin-2 and NGAL as markers of the severity and complications of AP in the early phase of the disease (first 72 hours). Despite intense studies on the patomechanism of AP and searching for optimal markers of severity of the disease, obtained results are original and unique depiction of the problem. Studies on the concentration of Ang-2 and microrna in the serum of patients in the early phase of AP were carried out for the first time in Polish population and delivered new information on the scope and dynamics of changes of concentrations of these markers in course of AP of various severity. The observations regarding sngal and ungal confirmed the findings of another authors. However, the evaluation of diagnostic usefulness of these markers enables their better use in clinical practice. It is concerned especially to ungal as routine laboratory test. The presented results provide a supplement to clinical data regarding the diagnostic tools that may be used at the early stage of qualification patients with AP to the most appropriate group of disease severity. In the future, it might be helpful in creation of certain treatment strategy, dictated by significantly worse prognoses in patients with SAP. However, obtained results should be confirmed by studies carried out on a larger groups of patients. 38

39 4. Artykuł numer 1 Sporek M., Kolber W., Pędziwiatr M., Kuźniewski M., Walocha J., Kuśnierz-Cabala B.: Przewidywanie ciężkiego przebiegu ostrego zapalenia trzustki - wybrane skale i markery laboratoryjne użyteczne we wczesnej fazie rozwoju choroby. Przegląd Lekarski. 2015; 72 (5):

40 PRACE POGLĄDOWE Mateusz Sporek 1 Witold Kolber 2 Michał Pędziwiatr 3 Marek Kuźniewski 3 Jerzy Walocha 1 Beata Kuśnierz-Cabala 5 Przewidywanie ciężkiego przebiegu ostrego zapalenia trzustki wybrane skale i markery laboratoryjne użyteczne we wczesnej fazie rozwoju choroby Prediction of severe acute pancreatitis selected prognostic scales and laboratory markers useful in the early stage of the disease 1 Katedra Anatomii, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Jerzy Walocha 2 Zespół Zakładów Opieki Zdrowotnej w Wadowicach, Oddział Chirurgii Kierownik: Dr n. med. Zygmunt Łabudziński 3 II Katedra Chirurgii Ogólnej, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Andrzej Budzyński 4 Katedra i Klinika Nefrologii, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Władysław Sułowicz 5 Zakład Diagnostyki, Katedra Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków Dr hab. n. med. Bogdan Solnica, prof. UJ Dodatkowe słowa kluczowe: angiopoetyna-2 NGAL skale prognostyczne Additional key words: angiopoetin-2 NGAL prognostic scales Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Beata Kuśnierz-Cabala Zakład Diagnostyki, Katedra Biochemii Klinicznej Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum ul. Kopernika 15A, Kraków tel./fax: mbkusnie@cyf-kr.edu.pl Wczesne rozpoznanie ciężkiego przebiegu ostrego zapalenia trzustki oraz towarzyszących mu powikłań tj. ostrej niewydolności oddechowej, ostrego uszkodzenia nerek, czy zespołu ciasnoty wewnątrzbrzusznej prowadzących do rozwoju zespołu niewydolności wielonarządowej pozostaje kluczowe dla przeżywalności, wskazując chorych wymagających umieszczenia w oddziale intensywnego nadzoru i wdrożenia adekwatnej terapii. Celem badania była analiza informacji na temat skal oraz potencjalnie użytecznych markerów do prognozowania ciężkiej postaci ostrego zapalenia trzustki w jej wczesnej fazie. Intensywny rozwój medycyny jaki dokonał się na przełomie ostatniej dekady zasadniczo przyczynił się do obniżenia śmiertelności ogólnej z powodu ostrego zapalenia trzustki (OZT), która aktualnie nie przekracza 2% [1-2]. Pomimo tego, OZT jest powszechnie uznawane za chorobę o trudnym do przewidzenia przebiegu, która u ok % chorych z ciężką postacią może wiązać się z występowaniem powikłań miejscowych oraz uogólnionych i wówczas obarczona jest 20-30% śmiertelnością [1-6]. Ze względu na nie w pełni poznaną patofizjologię oraz potencjalnie niepewny przebieg choroby, przez lata poszukiwano skutecznych narzędzi prognostycznych stosując wieloczynnikowe skale łączące parametry kliniczne oraz wyniki badań laboratoryjnych lub wykorzystując czułe markery laboratoryjne [7]. Przykładem mogą być skala Ransona, zmodyfikowana skala Glasgow, czy APACHE II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II) wykorzystywane już w pierwszej klasyfikacji OZT z Atlanty (1992 r.), a które nadal zalecane są w praktyce klinicznej oraz rekomendowane przez American Gastroenterology Association [1,3-4,7-10]. Przez ostatnie 20 lat, rozpoznanie OZT opierano na ocenie obrazu klinicznego, badaniach laboratoryjnych oraz obrazowych, w tym tomografii komputerowej jamy brzusznej z wykorzystaniem dożylnego środka cieniującego, uznanego za złoty standard. Niestety klasyfikacja z Atlanty nie była tak powszechnie stosowana jak tego Early diagnosis of severe acute pancreatitis with its early complications, ie. acute acute respiratory failure, acute kidney injury, or abdominal compartment syndrome, leading to the development of multiple organ failure remains crucial for the survival. It allows for precise selection of high risk patients and enables an early implementation of adequate therapy. The aim of the study was to analyze the current information on potentially useful prognostic scales and markers in the early stage of severe acute pancreatitis. oczekiwano, a z biegiem lat, w wyniku dynamicznego rozwoju nowoczesnej medycyny zaczęła wymagać aktualizacji [6,11]. Prace nad jej modyfikacją rozpoczęto w 2007 r., jednak nowo opracowana klasyfikacja opublikowana została dopiero w 2012 r. [12]. Przede wszystkim zmodyfikowano w niej definicję OZT, które rozpoznajemy, gdy spełnione są dwa spośród trzech kryteriów tj.: ból w nadbrzuszu o ostrym początku, często promieniujący do pleców, co najmniej 3-krotny wzrost aktywności amylazy lub lipazy w surowicy oraz wyniki badań obrazowych pozwalające na uzyskanie obrazów przekrojowych, typowych dla OZT. Podkreślić należy, że jeżeli występują dwa pierwsze objawy i obraz kliniczny jest jednoznaczny, obrazowanie trzustki nie musi być wykonane do celów rozpoznania OZT [13]. Wyróżniono ponadto dwie fazy w przebiegu OZT w zależności od czasu występowania objawów - wczesną trwającą około tygodnia oraz późną mogącą trwać nawet klika miesięcy. Zarówno we wczesnej, jak i późnej fazie może pojawiać się niewydolność narządowa, którą definiuje się w oparciu o zmodyfikowaną skalę Marshalla (Modified Marshall Scoring System) [13-14] (Tab. I). Rozróżniono przemijającą niewydolność narządową trwającą nie dłużej niż 48 godzin oraz przetrwałą niewydolność narządową utrzymującą się powyżej 48 godzin. W odróżnieniu od wcześniejszej klasyfikacji, od 2012 wprowadzono trzy stopnie ciężkości OZT: łagodną postać OZT (mild acute Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 5 263

41 pancreatitis-map) w której nie stwierdza się powikłań miejscowych lub ogólnoustrojowych ani niewydolności narządowej; postać średnio-ciężką (moderate acute pancreatitis) w której stwierdza się powikłania miejscowe/ogólnoustrojowe oraz może wystąpić przemijająca (<48h) niewydolność narządowa oraz postać ciężką (severe acute pancreatitis-sap), która przebiega z przetrwałą (>48h) niewydolnością narządową mogącą wystąpić zarówno we wczesnej, jak i w późnej fazie choroby [11-14]. Podczas prac prowadzonych nad rewizją klasyfikacji z Atlanty, niektóre z zespołów ekspertów proponowały rozszerzenie klasyfikacji i przyjęcie czterech stopni ciężkości w przebiegu OZT. Przykładem może być postulowane przez Petrova [15] wprowadzenie dodatkowego pojęcia - krytycznego OZT, dla skrajnie ciężkiej postaci OZT [15-16]. W przypadku rozwoju niewydolności narządowej w okresie pierwszych 72 godzin od wystąpienia objawów OZT wyróżnia się dodatkowo tzw. wczesne ciężkie ostre zapalenie trzustki (ESAP - early severe acute pancreatitis) [3]. Kolejną nowością w klasyfikacji z 2012 r. jest szczegółowa definicja powikłań w przebiegu OZT tj.: ostry okołotrzustkowy zbiornik płynu, torbiel rzekoma trzustki, ostry zbiornik martwiczy oraz martwica otorbiona [13,17]. O ile leczenie łagodnej postaci OZT nie stwarza trudności terapeutycznych i w większości przypadków ma raczej charakter wspomagający, który polega na zapobieganiu powikłań, leczenie ciężkich postaci może stanowić istotny problem. Ma to związek z brakiem jednoznacznie przyjętych, przejrzystych wytycznych i schematów postępowania, szczególnie w przypadku wystąpienia kilku powikłań jednocześnie. Przyjmuje się, że odpowiednio wczesna diagnoza potencjalnie ciężkiego przebiegu OZT ma kluczowe znaczenie dla rokowania. Istnieje pełna zgodność w poglądach, że chorzy ci powinni zostać niezwłocznie objęci ścisłym nadzorem i poddani intensywnemu leczeniu [3,5,14,18-20]. Prowadzone aktualnie badania dążą do wyznaczenia momentów krytycznych kluczowych dla monitorowania ciężkości OZT. Zaleca się, aby taką ocenę ciężkości rozpocząć już w chwili przyjmowania chorego do szpitala, a następnie powtarzać po upływie 24, 48 oraz 72 godzin i kontynuować w zależności od stanu klinicznego pacjenta. W okresie pierwszych 48 godzin znaczącą wartość dla klinicysty posiadają skale prognostyczne. Ich czułość oraz swoistość dla prognozowania ciężkości przebiegu choroby jest zróżnicowana i mieści się w zakresie od 55-90% [3]. Pierwszą oraz stosowaną do dnia dzisiejszego skalę oceny ciężkości OZT - Ranson a wprowadzono w 1974 r. Do innych zaliczyć należy: skalę APACHE II, Glasgow, wykorzystującą badania obrazowe CTSI (Balthazar computer tomography severity index), skale Pancreatitis Outcome Prediction (POP), BISAP (Bedside index for severity), revisited Japanese Severity Score (JSS), Harmless Acute Pancreatitis Score (HAPS), czy Panc3 [1,3-4,10,19-20]. W bieżącym piśmiennictwie, głównie pochodzącym ze Stanów Zjednoczonych Ameryki najwyżej oceniana jest skala APACHE II, praktycznie nie stosowana w polskich ośrodkach. Wykazano, że po osiągnięciu >10 punktów czułość i swoistość diagnostyczna rozpoznawania późnej śmiertelności w martwiczej postaci OZT wynosi odpowiednio 78% i 80% [21]. System ten posiada również najszerszy zakres ocenianych czynników obejmując wskaźniki laboratoryjne oraz kliniczne, a jego największą wartością jest możliwość stosowania w każdym momencie hospitalizacji pacjenta i w zależności od osiągniętego wyniku niezwłoczne wdrożenie adekwatnego leczenia. Jak pokazuje literatura, wartość rokownicza większości skal prognostycznych rośnie w miarę upływu czasu, podobnie jest również w przypadku skali APACHE II. Badania Khan et al. [22] wykazały, że po upływie 48 godzin może ona osiągać czułość diagnostyczną 93%. Bathazar et al. [23] opracowali w 1990 r. tomograficzny wskaźnik ciężkości OZT (CTSI), mający stanowić standardowy i obiektywny sposób opisywania zmian widocznych w badaniu obrazowym po uwidocznieniu obrazu przy użyciu środka cieniującego. Zauważono, że wartość CSTI>3 najczęściej cechuje ciężki przebieg choroby i przewyższa wg. Gurleyik et al. [24] pod tym względem wartość prognostyczną zarówno APACHE II, jak i pojedynczego pomiaru stężenia CRP. Wskaźnik BISAP jest obliczany w ciągu pierwszych 24 godzin od przyjęcia chorego do szpitala w oparciu o ocenę 5 parametrów: BUN>8,92 mmol/l, stopnia dezorientacji pacjenta lub wystąpienia zaburzeń funkcji psychicznych wg. Glasgow Coma Score <15; obecność SIRS; wiek powyżej 60 lat oraz stwierdzenie wysięku opłucnowego [4,7,25-26]. W prospektywnych badaniach walidowanych udokumentowano, że BISAP 3 wskazuje na klinicznie ciężką postać OZT i pozwala na wczesną identyfikację chorych z wyższym ryzykiem śmiertelności [4]. Dokładność skali BISAP ( 2) dla przewidywania SAP przewyższa ponadto oznaczanie stężenia PCT w surowicy ( 3,29 ng/ml), które oceniane jest jako zbliżone do APACHE II [25-26]. Do najmniej rozbudowanych skal prognostycznych zaliczamy Panc3 score oraz HAPS, opierające się na ocenie zaledwie 3 składowych tj. Hct>44%, BMI>30kg/m 2 i wysięk opłucnowy wykazany w badaniu Rtg klatki piersiowej dla Pan3 score oraz stwierdzenie tkliwości w nadbrzuszu, pomiar HCT i kreatyniny w okresie pierwszych 48 godzin dla skali HAPS [7,19,27]. Tabela I Zmodyfikowana skala Marshalla [13]. Modified Marshall scale. Układ Oddechowy (PaO 2 /FiO 2 ) Nerki (kreatynina w surowicy, µmol/l) Sercowo-naczyniowy (skurczowe ciśnienie tętnicze, mmhg)* Ze względu na wzrost dostępności i coraz szersze zastosowanie w codziennej praktyce klinicznej na znaczeniu zyskują takie techniki obrazowe jak MRI (magnetic resonance imaging) i ultrasonografia endoskopowa (EUS) [28]. Badanie MRI może być szczególnie pomocne w ocenie okołotrzustkowej tkanki tłuszczowej, przewodu trzustkowego, żółciowego i cechuje je wysoka korelacja z obrazem klinicznym choroby [10]. W szczególności dotyczy to grupy chorych, u których wykonanie badania tomografii komputerowej nie jest zalecane w związku z promieniowaniem oraz potencjalnym działaniem nefrotoksycznym stosowanego środka kontrastowego [10]. Lokalną determinantą ciężkości jest pojawienie się zmian martwiczych w trzustce oraz/lub przestrzeni okołotrzustkowej, natomiast za determinantę systemową uznaje się obecność niewydolności narządowej [18]. Najpewniejszym markerem ciężkości we wczesnej fazie rozwoju OZT jest niewydolność narządowa utrzymująca się powyżej 48 godzin [1,18]. Do jej określenia wykorzystywana jest zmodyfikowana skala Marshalla oceniająca trzy najczęściej zajęte układy w przebiegu OZT, tj.: układ oddechowy, sercowo-naczyniowy oraz nerki. Przetrwała niewydolność narządowa definiowana jest, gdy u chorego uzyskuje się 2 punkty dla przynajmniej jednego z wymienionych trzech układów utrzymująca się ponad 48 godzin [Tabela I]. Niewydolność narządowa wiąże się ze zróżnicowanym rokowaniem zależnym od objętego narządu. Najczęściej występującą jest niewydolność oddechowa, której obecność wiąże się ze śmiertelnością poniżej 10%. Jeśli przechodzi w niewydolność wielonarządową, ryzyko zgonu wynosi 35-50% [29]. Dla rokowania pacjenta krytyczny jest więc nie tylko moment powstawania, ale również czas trwania niewydolności. Jeżeli jest ona obecna w chwili rozpoznania OZT lub rozwija się w ciągu pierwszych 24 godzin, śmiertelność znacząco wzrasta. Zaobserwowano, że blisko połowa pacjentów umiera w przebiegu niewydolności wielonarządowej w ciągu pierwszego tygodnia trwania choroby [18]. Występowanie innych powikłań tj. martwicy trzustki nie może być uznawane za marker prognostyczny, mimo że zakażona martwica trzustki często wymaga interwencji chirurgicznej, a na dodatek stanowi częstą przyczynę zgonu w fazie późnej, po upływie pierwszego tygodnia [1,18]. Punktacja > >439 >90 *Bez wspomagania inotropowego <90 odpowiedź na resuscytację płynową <90 brak odpowiedzi na resuscytację płynową <90; ph<7,3 <90; ph<7,2 264 M. Sporek i wsp.

42 Wartość diagnostyczną w prognozowaniu ciężkości przebiegu oraz śmiertelności OZT na nowo odzyskują również pojedyncze oznaczenia parametrów od zawsze rutynowo oznaczanych w każdym laboratorium szpitalnym tj.: stężenie kreatyniny, azot mocznika (BUN), wskaźnik hematokrytu, czy monitorowanie spadku ph krwi, obniżenie stężenia wodorowęglanów i wzrost niedoboru zasad [19,27,30]. Według badania Brown et al. [27] wzrost wartości hematokrytu >44% w chwili rozpoznania może wskazywać na ciężki przebieg OZT. Za potencjalne predyktory ciężkości w okresie pierwszych 24 godzin uznawane są: prokalcytonina (PCT), peptyd TAP (trypsin activation peptide) uwalniany podczas aktywacji trypsynogenu do trypsyny, elastaza granulocytów obojętnochłonnych (PMN-elastaza), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), oraz cytokiny: interleukina 6 (IL-6) i IL-8 [1,19,26,31-32]. Białko C-reaktywne (CRP) będące najpowszechniej stosowanym biochemicznym markerem prognostycznym ciężkości przebiegu OZT największą wartość diagnostyczną w różnicowaniu pomiędzy łagodną i ciężką postacią osiąga stosunkowo późno, bo po upływie godzin od momentu rozwoju OZT [3,9-10,33-35]. Wzrost stężenia CRP powyżej 150 mg/l po upływie 48 godzin z dużym prawdopodobieństwem może wskazywać na rozwijającą się martwicę trzustki [10], SAP [26], natomiast po upływie 72 godzin, czułość diagnostyczna rozpoznania ciężkiej postaci OZT wynosi 85% [3]. Obserwacja ta znalazła swoje zastosowanie w rozszerzonej skali Glasgow [3]. Ostre uszkodzenie nerek (AKI acute kidney injury) należy do poważnych powikłań ciężkiej postaci OZT i pozostaje znaczącym wskaźnikiem śmiertelności w tej grupie chorych (70-80%) [36-37]. Na rozwój AKI w przebiegu SAP wpływ ma wiele czynników, w szczególności hipoksja, uwalnianie przez uszkodzoną trzustkę znacznych ilości amylazy, zaburzenie mikrokrążenia nerek, obniżenie ciśnienia perfuzji w związku z rozwojem zespołu ciasnoty wewnątrzbrzusznej (ACS abdominal compartment syndrome) oraz rozwój hipowolemii. Ważną rolę w patofizjologii rozwoju AKI oraz SAP odgrywają również endotoksyny oraz wolne rodniki tlenowe. Aktualnie do diagnostyki AKI wykorzystywane są kryteria RIFLE (risk, injury, loss, end stage) oraz KDIGO (The Kidney Disease Improving Global Outcomes), natomiast laboratoryjne kryteria opierają się na ocenie dynamiki kreatyninemii oraz spadku wielkości filtracji nerkowej (GFR - glomerular filtration rate) [36]. Wzrost stężenia kreatyniny pojawia się zwykle dopiero po 1-2 dniach od zadziałania czynnika nefrotoksycznego, co może w istotny sposób opóźniać adekwatne leczenie w odwracalnej fazie choroby. Ograniczona wartość kreatyninemii we wczesnej fazie rozwoju AKI w przebiegu OZT zmusza do poszukiwania nowych biomarkerów uszkodzenia nerek, których stężenia mogłyby ulegać znaczącej zmianie we krwi i/lub moczu w przedklinicznym stadium choroby [38]. Potencjalną wartość diagnostyczną posiada oznaczanie w surowicy i w moczu stężenia lipokaliny związanej z żelatynazą neutrofilów (NGAL), stężenia interleukiny 6 (IL-6), cząsteczki uszkodzenia nerek (KIM-1), interleukiny 18 (IL-18) i L-FABP (liver fatty acid binding protein) w moczu oraz cystatyny C w surowicy [29,37]. Na podstawie dostępnego piśmiennictwa należy uznać, że NGAL jest czułym i wczesnym wskaźnikiem ostrego uszkodzenia nerek, a jego zwiększone wydalanie z moczem stwierdza się już po kilku godzinach od zadziałania czynnika nefrotoksycznego [37]. Zauważono, że stężenie NGAL znacząco wzrasta również w surowicy u chorych z OZT i może odgrywać rolę w różnicowaniu pomiędzy łagodną a ciężką postacią choroby [9]. NGAL, znany również jako lipokalina-2 (LCN2) pod względem biochemicznym jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej 25-kDa, uwalnianą ze zaktywowanych neutrofilów w miejscu objętym procesem zapalnym, a u osób zdrowych produkowany jest przez komórki nabłonka jelita cienkiego, żołądka, jelita grubego oraz nerek [9,39]. W warunkach prawidłowych NGAL nie jest produkowany przez przewody trzustkowe oraz komórki pęcherzykowe trzustki, stąd też znaczące wzrosty stężenia w schorzeniach trzustki mogą być istotnym czynnikiem diagnostycznym dla tej grupy pacjentów. Badania Monisha et al. [40] wykazały, że NGAL ulega ekspresji de novo u chorych z gruczolakorakiem i rakiem trzustki oraz w przebiegu OZT, dlatego też wzrost stężenia NGAL w przebiegu OZT może być postrzegany jako bardzo wczesny marker rozwijających się powikłań związanych z uszkodzeniem śródbłonka, nerek, płuca, jelita grubego i wątroby, a jego znamienny wzrost może pojawiać się już po upływie 6 godzin od momentu trwania OZT i wyprzedzać wzrost stężenia kreatyniny. Po upływie 48 godzin wzrost stężenia NGAL w SAP jest również znacząco wyższy w porównaniu do pozostałych chorych [39]. Badania Lipinski et al. [41] wykazały, że oznaczanie stężenia NGAL w moczu przy przyjęciu oraz monitorowanie jego poziomu w kolejnych 24 godzinach stanowi obiecujący nowy diagnostyczny czynnik prognostyczny u chorych z SAP we wczesnej fazie rozwoju schorzenia. NGAL może być również polecany ze względu na nowoczesną technikę pomiarową, łatwą dostępność i możliwość uzyskiwania wyników w trybie rutynowym. Dobrym wskaźnikiem uszkodzenia nerek w przebiegu OZT może być również oznaczanie stężenia interleukiny-18 (IL-18) w moczu, uwalnianej do niego przez nabłonek cewek proksymalnych po zadziałaniu czynnika uszkadzającego, w tym również związanego z niedokrwieniem, pozwalając wykluczyć azotemię przednerkową. Jednym z obiecujących biomarkerów prognostycznych ciężkiego przebiegu OZT jest angiopoetyna-2 (Ang-2) [31]. Ang-2 jest jedną z czterech odkrytych w rodzinie angiopoetyn (Ang-1 Ang-4) odpowiedzialnych za autokrynną regulację stabilności i przepuszczalności naczyń krwionośnych zapewniających zachowanie równowagi w przebiegu procesu zapalnego. W warunkach fizjologicznych Ang-2 produkowana jest przez komórki śródbłonka i magazynowana w obrębie ciałek Weibela i Palade a, a w wyniku aktywacji uwalniania jest łącznie z trombiną, histaminą, serotoniną oraz nadtlenkami prowadząc do rozwoju zapalenia, koagulacji i angiogenezy. Zwiększone uwalnianie Ang-2 w przebiegu SAP w znacznym stopniu przyczynia się do destabilizacji naczyń krwionośnych i zwiększenia ich przepuszczalności [31]. Badania Buddingh et al. [31] wykazały 2-krotnie wyższe stężenia Ang-2 w surowicy chorych z SAP we wczesnej fazie rozwoju choroby, w szczególności u chorych z MOF (multiple organ failure), czy z objawami endotoksemii. Dodatkowo, Whitcomb et al. [42] zaobserowali wzrost stężenia Ang-2 w chwili przyjęcia u chorych, u których doszło do rozwoju przetrwałej niewydolności narządowej w przebiegu SAP [42-43]. Monitorowanie stężenia Ang-2 było to tej pory wykorzystywane głównie u chorych na oddziałach intensywnego nadzoru do prognozowania śmiertelności w przebiegu ciężkiej sepsy oraz ostrego uszkodzenia płuc w przebiegu ARDS (acute respiratory distress dyndrome) [31]. U pacjentów z SIRS może dochodzić do intensywnego uszkodzenia śródbłonka naczyń oraz rozwoju nadkrzepliwości, a po dołączeniu się zaburzeń perfuzji tkanek mogą prowadzić do stopniowego rozwoju niewydolności narządowej [18,44]. Jednym z najwcześniejszych mediatorów fibrynolizy jest aktywator plazminogenu typu urokinazowego (upa), którego aktywacja odbywa się poprzez wiązanie do jego receptora (upar, CD87), ulegającego ekspresji na śródbłonku i odpowiedzialnego za aktywację limfocytów T, granulocytów oraz monocytów zaangażowanych w lokalną proteolizę i fibrynolizę [45]. Badania Wu et al. [45] prowadzone u chorych w oddziale intensywnej terapii potwierdziły istnienie dodatniej korelacji pomiędzy wzrostem stężenia upar oraz ciężkością choroby ocenianą według skali APACHE II. Podsumowanie Dokonując przeglądu parametrów laboratoryjnych wykorzystywanych we wczesnej fazie rozwoju OZT pod kątem ich potencjalnej użyteczności w przewidywaniu postaci o ciężkim i powikłanym przebiegu, nasuwa się sugestia dotycząca konieczności przeprowadzenia ich wstępnej selekcji pod kątem metodyki oznaczeń. Należy w tym miejscu oddzielić liczne badania naukowe mogące poszerzać naszą wiedzę o patomechanizmie OZT i jego powikłaniach, które jednak ze względu na proponowane czasochłonne lub drogie techniki pomiarowe nie zostały zaadoptowane do pracy w trybie rutynowym. Poszukiwaniom potencjalnych markerów rokowniczych użytecznych w codziennej praktyce klinicznej powinien tym samym przyświecać prosty i czysto praktyczny cel, w którym decydować będą zarówno możliwości przeprowadzenia badania oraz czas oczekiwania na wynik. Z drugiej strony dysponując wiedzą na temat potencjalnych korzyści jakie daje ocena ciężkości OZT oparta o analizę wieloczynnikowych skal prognostycznych warto zwrócić uwagę na kilka nowych skal prognostycznych nie wymagających użycia skomplikowanych tabel kalkulacyjnych, jak to ma miejsce w przypadku APACHE II. Prawdopodobnie, największe korzyści dla pacjenta mogłyby przynieść doświadczenia własne związane Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 5 265

43 Tabela II Dynamika wzrostu wybranych, pojedynczych wskaźników prognostycznych we wczesnej fazie trwania OZT. Selected prognostic factors and laboratory markers in the early stage of acute pancreatitis. Czas od rozpoczęcia OZT Parametr prognostyczny Autor badania 12 godzin 24 godziny godzin powyżej 48 godzin Skala BISAP 3 punktów w chwili przyjęcia wskazuje na SAP Papachristou et al. [4] Wzrost aktywności rozpuszczalnej formy antygenu CD73 w chwili przyjęcia - prognostyczny dla przetrwałej niewydolności narządowej Wyższe stężenia IL-6 u chorych z SAP Wartość LR+ dla pojedynczego oznaczenia IL-6 w chwili przyjęcia na oddział (7,4), a dla HGF (8,3) Maksimow et al. [46] Sathyanarayan et al. [47] Kuśnierz-Cabala et al. [35] Nieminen et al. [48] Wzrost HCt >44% w chwili przyjęcia może wskazywać na SAP Brown et al. [27] Wzrost stężenia NGAL w pierwszym dniu jako obiecujący marker prognostyczny SAP we wczesnej fazie Wzrost stężenia SAA 10,8 mg/l jako marker SAP (czułość diagnostyczna 81,8% i swoistość 37,9%) Wzrost stężenia PCT 0,5 ng/l do przewidywania SAP (czułość diagnostyczna 81% i swoistość 86,2%) Wyższe stężenia HGF u chorych z SAP Lipinski et al. [41] Gurda-Duda A. et al. [49] Gurda-Duda et al. [49] Pezzilli et al. [32] Sporek et al. [50] Wyższe wartości mir-181a-5p u chorych z SAP o etologii związanej z hipertriglicerydemią An et al. [51] ICAM-1 jako wczesny marker diagnostyczny i prognostyczny SAP (24 h od rozpoczęcia bólu) Zhu et al. [2] Wzrost stężenia NGAL przed upływem 48 godzin prognostyczny dla SAP. Chakraborty et al. [9] Stosowanie badania CT pomiędzy h do wykazania ognisk martwiczych Young et al. [37] Tsuji et al. [5] Prognozowanie SAP w oparciu o skale prognostyczne: Glasgow-Imrie 3; Ranson a 3 Schutte et al. [52] Wzrost stężenia CRP 120 mg/l prognostyczny dla rozwoju martwicy trzustki (czułość diagnostyczna %) Wilson et al. [53] Wzrost stężenia CRP 150 mg/l prognostyczny dla SAP Gurleyik et al. [24] Wzrost stężenia CRP 150 mg/l prognostyczny dla rozwoju martwicy Simones et al. [10] Maksymalny wzrost stężenia IL-6 w 3 dobie prognostyczny dla SAP (czułość diagnostyczna %; swoistość 70-86%) Sathyanarayan et al. [10] Khanna et al. [3] Wzrost stężenia rybonukleazy Poli-C swoistej 65,3 U/L (czułość diagnostyczna 72,2%; swoistość 91,6%) oraz CRP 125,7 mg/l (85%; 55,5%) w 3 dobie prognostyczny dla rozwoju martwicy trzustki. Kuśnierz-Cabala et al. [34] CRP białko C-reaktywne; CT badanie tomografii komputerowej; HCT hematokryt; HGF- czynnik wzrostu hepatocytów; ICAM-1 cząsteczka adhezji międzykomórkowej-1; IL-6 interleukina 6; LR+ - dodatni iloraz prawdopodobieństwa; NGAL lipokalina związana z żelatynazą neutrofili; OZT ostre zapalenie trzustki; PCT prokalcytonina; SAA osoczowe białko amyloidowe A; SAP ciężka postać OZT. z łączeniem obu tych podejść. Nic bowiem nie zastąpi dokładnego monitorowania oraz systematycznej oceny klinicznej, które pozwalają na szybką reakcję w przypadku pogarszania się stanu pacjenta. Dynamikę wzrostu wybranych skal prognostycznych oraz pojedynczych markerów we wczesnym okresie trwania OZT przedstawiono w Tabeli II. Piśmiennictwo 1. Pallisera A, Jorba R, Ramia JM, Rodriquez JA, Subirana H. et al: Biological markers of severity in acute pancreatitis. Centr. Eur. J. Med. 2014; Zhu HH, Jiang LL: Serum inter-cellular adhesion molecule 1 is an early marker of diagnosis and prediction of severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 2012; 18: Khanna AK, Meher S, Prakash S, Tiwary SK, Singh U. et al: Comparison of Ranson, Glasgow, MOSS, SIRS, BISAP, APACHE-II, CTSI Scores, IL-6, CRP, and procalcitonin in predicting severity, organ failure, pancreatic necrosis, and mortality in acute pancreatitis. HPB Surgery 2013; doi: Papachristou GI, Muddana V, Yadav D, O Connell M, Sanders MK. et al: Comparison of BISAP, Ranson s, APACHE-II, and CSTI Scores in predicting organ failure, complications, and mortality in acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2010; 105: Tsuji Y, Takahashi N, Tsutomu C: Pancreatic perfusion CT in early stage of severe acute pancreatitis. Int J Inflammation. 2012; doi: /2012/ Vege SS, Gardner TB, Chari ST, Munukuti P, Pearson RK. et al: Low mortality and high morbidity in severe acute pancreatitis without organ failure: a case for revising the Atlanta Classification to include. Moderately severe acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2009; 104: Tuzun A, Baysal B: Pathophysiology, classification and available guidelines of acute pancreatitis. Turk J Gastroenterol. 2014; 25: Bradley EL: A clinically based classification system for acute pancreatitis. Summary of the International Symposium on Acute Pancreatitis, Atlanta, September 11 through 13, Arch Surg. 1993; 128: Chakraborty S, Kaur S, Muddana V, Sharma N, Wittel UA. et al: Elevated serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin is an early predictor of severity and outcome in acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2010; 105: Simoes M, Alves P, Esperto H, Canha C, Meira E. et al: Predicting acute pancreatitis severity: comparison of prognostic scores. Gastroenterol Res. 2011; 4: Bollen TL, van Santvoort HC, Besselink MG, van Leeuwen MS, Horvath KD. et al: The Classification of acute pancreatitis revisited. Br J Surg. 2008; 95: Banks PA, Bollen TL, Dervenis C, Gooszen HG, Johnson CD. et al: Acute Pancreatitis Classification Working Group. Classification of acute pancreatitis 2012: revision of Atlanta Classification and definitions by international consensus. Gut. 2012; 62: Sarr MG: 2012 revision of the Atlanta Classification of acute pancreatitis. Pol Arch Med Wewn. 2013; 123: Tenner S, Baillie J, DeWitt J, Vege SS: American College of Gastroenterology guideline: Management of acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2013; 108: Petrov MS, Windsor JA: Classification of the severity of acute pancreatitis: how many categories make sense? Am J Gastroenterol. 2010; 105: Dellinger EP, Forsmark CE, Layer P, Levy P, Moravi-Poma E. et al: Pancreatitis Across Nations Clinical Research and Education Allisance (PAN- CREA): Determinant-based classification of acute pancreatitis severity: an international multidisciplinary consultation. Ann Surg. 2012; 256: Thoeni RF: The revised Atlanta Classification of Acute Pancreatitis: its importance for the radiologists and its effect on treatment. Radiology 2012; 262: Kylanpaa L, Rakonczay Z, O Reilly D: The clinical course of acute pancreatitis and the inflammatory mediators that drive it. Int J Inflamm. 2012; doi: /2012/ Pezzilli R: How to evaluate the severity of acute pancreatitis: back to the past? JOP. 2012; 13: Yang CY, Chen J, Philips ARJ, Windsor JA, Petrov MS: Predictors of severe and clinical acute 266 M. Sporek i wsp.

44 pancreatitis: A systemic review. Dig Liver Dis. 2014; 46: Suvarna M, Pallipady A, Bhandary N: The clinical prognostic indicators of acute pancreatitis by APA- CHE II scoring. J Clin Diagn Res. 2011; 5: Khan AS, Latif SU, Eloubeidi MA: Controversies in the etiology of acute pancreatitis. JOP. 2010; 11: Balthazar EJ., Robinson DI, Megibow AJ, Ranson JH: Acute pancreatitis: value of CT in establishing prognosis. Radiology 1990; 174: Gurleyik G, Emir S, Kilicoglu G, Arman A, Saglam A: Computed tomography severity index, APACHE II score, and serum CRP concentration for predicting the severity of acute pancreatitis. JOP. 2005; 6: Bezmarevic M, Kostic Z, Jovanovic M, Mickovic S, Mirkovic D. et al: Procalcitonin and BISAP score versus C-reactive protein and APACHE-II score in early assessment of severity and outcome of acute pancreatitis. Vojnosanit Pregl. 2012; 69: Kim BG, Noh MH, Ryu CH, Nam HS, Woo SM. et al: A comparison of the BISAP score and serum procalcitonin for predicting the severity of acute pancreatitis. Korean J Inter Med. 2013; 28: Brown A, Jameson-Stevenson T, Dyson T, Grunkenmeier D: The panc 3 score: a rapid and accurate test for predicting severity on presentation in acute pancreatitis. J Clin Gastroenterol. 2007; 41: Rana SS, Bhasin DK, Sharma V, Sharma R, Chaudhary V, Chhabra P: Can early endoscopic ultrasound predict pancreatic necrosis in acute pancreatitis. Ann Gastroenterol. 2014; 27: Pezzilli R: Immunological aspects of acute respiratory distress syndrome in acute pancreatitis. Immuno- Gastroenterol. 2013; 2: Sharma V, Thingbaijam SD, Sharma R, Chhabra P, Gupta R. et al: Arterial ph, biocarbonate levels and base deficit at presentation as markers of predicting mortality in acute pancreatitis: a singlecentre prospective study. Gastroenterology Report. 2014; doi: Buddigh KL, Koudstaal LG, Svantvoort C, Besselink MG, Timmer R. et al: Early angiopoietin-2 levels after onset predict the advent of severe pancreatitis, multiple organ failure, and infectious complications in patients with acute pancreatitis. J Am Coll Surg. 2014; 218: Pezzilli R, Corsi MM, Barassi A, Iammarino MT, Casadei R. et al: Serum E-cadherin and hepatocyte growth factor in acute pancreatitis: exploring time course, and severity assessment. Immunogastroenterology. 2013; 2: Bota S, Sporea I, Sirli R, Popescu A, Strain M. et al: Predictive factors for severe evolution in acute pancreatitis and a new score for predicting a severe outcome. Ann Gastroenterol. 2013; 26: Kuśnierz-Cabala B, Naskalski JW, Kędra B, Panek J: Comparison of sensitivity and specifisity of serum poly-c avid ribonuclease activity and C-reactive protein concentration in detection of mild and severe acute pancreatitis. Clin Chem Lab Med. 2004; 42: Kuśnierz-Cabala B, Gurda-Duda A, Naskalski JW, Kapusta M, Dumnicka P. et al: Realne korzyści płynące z oznaczania cytokin prozapalnych oraz CRP we wczesnej fazie rozwoju ostrego zapalenia trzustki. Ostry Dyżur 2008; 1: Petejova N, Martinek A: Acute kidney injury following acute pancreatitis: A review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc. Czech Repub. 2013; 157: Young SP, Thompson JP: Severe acute pancreatitis. Crit Care Pain. 2008; 8: Honore PM, Jacobs R, De Waele E, Van Gorp V, Joannes-Boyau O. et al: J Transpl Internal Med. 2014; 2: Helenova K, Spinar J, Parenica J: Diagnostic and prognostic utlility of neutrophil gelatinse-associted lipocalin (NGAL) in patients with cardiovascular diseases-review. Kidney Blood Pressure Res. 2014; 39: Monisha J, Palmavathi G, Bordoloi D, Roy A.K, Kunnumakkara AB: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL): a promising biomarker for cancer diagnosis and a potential target for cancer therapeutics. J Cell Sci Molecul Biol. 2014; 1: Lipinski M, Rydzewska-Rosolowska A, Rydzewski A, Rydzewska G: Urinary neutrophil gelatinaseassociated lipocalin as an early predictor of disease severity and mortality in acute pancreatitis. Pancreas. 2014; doi /mpa. 42. Whitcomb DC, Muddana V, Langmead CJ, Houghton FD, Guenther A. et al: Angiopoetin-2, a regulator of vascular permeability in inflammation, is associated with persistent organ failure in patients with acute pancreatitis from the United States and Germany. Am J Gastroenterol. 2010; 105: Watanabe T, Tsuji T, Kodama Y, Isoda H, Yamamoto H, Chiba T: Relationship between serum angiopoietin-2 level and perfusion CT parameters in severe acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2011; 106: Wereszczynska-Siemiatkowska U, Siemiatkowski A: Mediatory procesu zapalnego i koagulopatii w ostrym zapaleniu trzustki wybrane zagadnienia. Borgis-Postępy Nauk Medycznych 2011; 3: Wu X, Long D, Yu L, Yang J, Zhang Y, Geng F: Urokinase-type plasminogen activator receptor as a predictor of poor outcome in patients with systemic inflammatory response syndrome. World J Emerg Med. 2013; 4: Maksimow M, Kyhala L, Nieminen A, Kylanpaa L, Aalto K. et al: Early prediction of persistent organ failure by soluble CD73 in patients with acute pancreatitis. Critical Care Med. 2014; 42: Sathyanarayan G, Garg PK, Prasad HK, Tandon RK: Elevated level of interleukin-6 predicts organ failure and severe disease in patients with acute pancreatitis. J Gastroenerol Hepatol. 2007; 22: Nieminen A, Maksimow M, Mentula P, Kyhala L, Kylanpaa L. et al: Circulating cytokines in predicting development of severe acute pancreatitis. Critical Care 2014; 18: R Gurda-Duda A, Kuśnierz-Cabala B, Nowak W, Naskalski JW, Kulig J: Assessment of the prognostic value of certain acute-phase proteins and procalcitonin in the prognosis of acute pancreatitis. Pancreas 2008; 37: Sporek M, Kolber W, Kusnierz-Cabala B, Dumnicka P, Gurda-Duda A. et al: Determination of hepatocyte growth factor at early phase of acute pancreatitis. Folia Med Cracov. 2013; 53: An F, Zhan Q, Xia M, Jiang L, Lu G. et al: From moderately severe to severe hypertrigliceridemia induced acute pancreatitis: circulating mirnas play role as potential biomarkers. PLOS ONE. 2014; 9: e Schutte K, Malfertheiner P: Markers for predicting severity and progression of acute pancreatitis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2008; 22: Wilson C, Heads A, Shenkin A, Imrie CW: C-reactive protein, antiproteases and complement factors as objective markers of severity of acute pancreatitis. Br J Surg. 1989; 76: Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 5 267

45 5. Artykuł numer 2 Sporek M., Dumnicka P., Gala-Błądzińska A., Ceranowicz P., Warzecha Z., Dembinski A., Stepien E., Walocha J., Drozdz R., Kuźniewski M., Kusnierz-Cabala B.: Angiopoietin-2 is an early indicator of acute pancreatic-renal syndrome in patients with acute pancreatitis. Mediators of Inflammation. 2016; Doi: /2016/

46 Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation Volume 2016, Article ID , 7 pages Research Article Angiopoietin-2 Is an Early Indicator of Acute Pancreatic-Renal Syndrome in Patients with Acute Pancreatitis Mateusz Sporek, 1,2 Paulina Dumnicka, 3 Agnieszka Gala-Bladzinska, 4 Piotr Ceranowicz, 5 Zygmunt Warzecha, 5 Artur Dembinski, 5 Ewa Stepien, 6 Jerzy Walocha, 2 Ryszard Drozdz, 3 Marek Kuzniewski, 7 and Beata Kusnierz-Cabala 8 1 Surgery Department, The District Hospital, 22 Szpitalna Street, Sucha Beskidzka, Poland 2 Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Jagiellonian University Medical College, 12 Kopernika Street, Krakow, Poland 3 Department of Medical Diagnostics, Faculty of Pharmacy, Jagiellonian University Medical College, 9 Medyczna Street, Krakow, Poland 4 St Queen Jadwiga Clinical District Hospital No. 2, 60 Lwowska Street, Rzeszow, Poland 5 Department of Physiology, Faculty of Medicine, Jagiellonian University Medical College, 16 Grzegorzecka Street, Krakow, Poland 6 Institute of Physics, Department of Medical Physics, Faculty of Physics, Astronomy and Applied Computer Science, JagiellonianUniversity,11LojasiewiczaStreet,30-348Krakow,Poland 7 Department of Nephrology, Faculty of Medicine, Jagiellonian University Medical College, 15c Kopernika Street, Krakow, Poland 8 Department of Diagnostics, Chair of Clinical Biochemistry, Faculty of Medicine, Jagiellonian University Medical College, 15a Kopernika Street, Krakow, Poland Correspondence should be addressed to Piotr Ceranowicz; mpcerano@cyf-kr.edu.pl Received 3 November 2015; Revised 19 January 2016; Accepted 28 January 2016 Academic Editor: Pham My-Chan Dang Copyright 2016 Mateusz Sporek et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Within the first week of the disease, acute kidney injury (AKI) is among the most common causes of mortality in acute pancreatitis (AP). Recently, serum angiopoietin-2 (Ang-2) has been associated with hyperdynamic state of the systemic circulation. The aim of this study was to examine the associations between Ang-2 and the clinical AP severity during the first 72 hours of the disease, and organ disfunction, including AKI. Methods. Study included patients admitted to the surgery ward, diagnosed with AP. AKI was diagnosed according to KDIGO guidelines and renal failure according to modified Marshall scoring system. Ang-2 was determined in serum with ELISA. Results. AP was classified as mild (MAP) in 71% of patients, moderately severe (MSAP) in 22%, and severe (SAP) in 8%. During the first 72 hours of AP, 11 patients developed AKI and 6 developed renal failure. Ang-2 at 24, 48, and 72 hours following the onset of AP symptoms significantly predicted SAP and MSAP, as well as AKI and renal failure. Also, Ang-2 significantly correlated with acute phase proteins as well as with the indicators of renal disfunction. Conclusions.Serum Ang-2 may be a relevant predictor of AP severity, in particular of the development of AP-renal syndrome. 1. Introduction Destabilization of the vascular endothelium as well as escape of fluid from the vascular bed is one of the main factors leading to vasodilatation, decrease in blood pressure, and the development of early complications of acute pancreatitis (AP), which clinically manifest themselves as shock and developing organ failure [1, 2]. The patient s transfer to the intensive care unit, initiation of intensive fluid resuscitation withinthefirst12 24hoursoftheonsetofsevereacute pancreatitis (SAP), close monitoring of organ function, and, in case of acute kidney injury (AKI) in circulatory unstable patients, implementation of continuous blood purification techniques (continuous venovenous hemofiltration or continuous venovenous hemodiafiltration) may have a decisive impact on the survival in this group of patients [1, 3, 4]. Such procedures are particularly justified because, in nearly half of patients classified as SAP, organ failure is diagnosed on admission, whereas the other 50% of patients develop symptoms of organ failure in the first four days of

47 2 Mediators of Inflammation hospitalization [5, 6]. Moreover, more than a half of deaths in SAP patients occur within the first week of the disease [7]. AKI and acute respiratory distress syndrome are the most common causes of mortality (70 80%) in this group of patients [4, 8]. Currently, for the diagnostics of AKI, the risk, injury, failure, loss, and end stage (RIFLE) and the Kidney Disease ImprovingGlobalOutcomes(KDIGO)criteriaareused.Both criteriaarebasedontheincreaseinserumcreatinineandthe decrease in diuresis [4, 9]. In the treatment of AKI, it is critical to quickly determine the cause of kidney injury (prerenal, intrinsic, or postrenal). Unfortunately, an increase in serum creatinine concentration usually occurs about 1-2 days after kidney injury, which often delays the possibility of taking actioninthereversiblephaseofthedisease.thelimitedvalue of serum creatinine in the early phase of AKI as well as a burdensome necessity to monitor diuresis requiring (invasive) urinary catheterization urges us to search for new biomarkers of kidney injury. Early indicators include urine concentrations of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (ungal), kidney injury molecule-1 (KIM-1), and interleukin-18 (IL-18) [9]. One of the promising prognostic biomarkers of acute pancreatitis is angiopoietin-2 (Ang-2) [10]. Studies by Whitcomb et al. [11] showed that Ang-2 concentration is considerably increased already at the time of the diagnosis of AP and is significantly higher in patients with developing persistent organ failure [11]. Watanabe et al. [12] demonstrated a correlation between Ang-2 concentrations and perfusion parameters using computed tomography [12]. Increased Ang- 2 concentrations in blood are associated with hyperdynamic state of the systemic circulation, and Ang-2 monitoring may be helpful in the evaluation of the response to systemic treatment, that is, fluid resuscitation, or antithrombotic therapy [12]. Ang-2 belongs to a new class of angiogenic growth factors that exerts a selective effect on the endothelium by binding with Tie-2 receptor. It was demonstrated that Ang- 2 has an inhibitory effect on angiopoietin-1 binding to Tie-2, which leads to destabilization of the vascular endothelium, increased fluid leakage, and leukocyte adhesion [2, 12, 13]. Under physiologic conditions, Ang-2 is stored within Weibel- Palade bodies, along with P-selectin, von Willebrand factor, CD63, interleukin-8, and endothelin-1 [14]. Factors such as hypoxia, inflammation, or mechanical injury may cause the rapid release of Ang-2 into the systemic circulation [13, 14]. Ang-2 was proposed to be a link between angiogenic and inflammatory pathway [14]. Serum concentrations of Ang-2 seem to reflect the extent of endothelial activation [2] and may be useful in early clinical assessment of patients with acute conditions, including AP. The aim of this preliminary study was to assess Ang- 2 serum concentrations in patients with AP of various severityintheearlyphaseofthedisease,thatis,during the first 72 hours of the disease, as well as to examine the associations between Ang-2 and the clinical measures of the severity of AP, in particular organ dysfunction, including AKI. 2. Materials and Methods The prospective observational study included 65 consecutive adult patients (men and women) admitted with AP, hospitalized, and treated in the Department of Surgery, District Hospital in Sucha Beskidzka, Poland, between January and December AP was diagnosed according to the 2012 revision of the Atlanta classification, that is, when at least two of the three following features were present: abdominal pain consistent with AP (acute onset and persistent and severe and epigastric pain); serum lipase or amylase activity at least three times greater than the upper reference limit; and the characteristic findings of AP on contrast-enhanced computer tomography or magnetic resonance imaging or transabdominal ultrasonography [15]. Only adult patients who signed the informed consent for the study were included. Patients with symptoms of AP lasting longer than 24 hours were excluded. Also, the exclusion criteria were chronic pancreatitis, neoplasms, and chronic liver diseases such as cirrhosis or viral hepatitis. On the basis of the clinical evaluation of the severity of AP, thepatientswereassignedtooneofthe3groups:withmild acute pancreatitis (MAP), moderately severe acute pancreatitis (MSAP), or severe acute pancreatitis (SAP). The MAP group included patients who did not show any organ failure or local complications. Patients with organ failure lasting less than 48 hours (transient organ failure), local complications (necrosis, acute necrotic collection, and walled-off pancreatic necrosis), and/or exacerbation of comorbidity were assigned to MSAP. Patients with persistent organ failure (lasting more than 48 hours) and 1 local complications were assigned to SAP [15]. AKI was diagnosed according to KDIGO guideline [16], that is, when serum creatinine increased 26.5 μmol/l within 48 hours or 1.5 times which is known or presumed to occur within 7 days, or urine volume <0.5 ml/kg/h for 6 hours. Organ failure was diagnosed according to the modified Marshall scoring system (MMSS), as cited in 2012 revision of the Atlanta classification [15]; in particular, renal failure was diagnosed in patients with serum creatinine 170 μmol/l. In order to determine serum Ang-2 concentrations in healthy persons, a control group was recruited which included 21 healthy volunteers (men and women) at the age similar to that of the study group, without any pancreatic, liver, or renal diseases. The study protocol was approved by the Bioethics Committee of the Jagiellonian University (Approval number KBET/247/B/2013) Laboratory Tests. Blood and urine for laboratory tests werecollectedat24,48,and72hoursfromtheonsetof symptoms of AP. The routine laboratory tests and the measurements of ungal, urine albumin, and urine creatinine were performed at the day of collection, while serum samples for serum NGAL (sngal) and Ang-2 measurements were frozen in aliquots and stored in 70 C. The routine tests included complete blood count, urinalysis, serum amylase, total calcium, albumin, urea, creatinine, glucose, C-reactive protein, plasma fibrinogen, and D-dimer. All the routine

48 Mediators of Inflammation 3 Table 1: Clinical characteristics of patients included in the study. Variable Patients with acute pancreatitis, n=65 Male sex, n (%) 34 (52) Age, years 62 ± 16 Etiology: Gallstones, n (%) 33 (51) Alcohol, n (%) 18 (28) Hypertriglyceridemia, n (%) 5(8) After ERCP, n (%) 1(2) Others, n (%) 8(12) Duration of pain until admission, hours 12 (6 24) Duration of hospital stay, days 6(5 12) Severity: Mild acute pancreatitis, n (%) 46 (71) Moderately severe acute pancreatitis, n (%) 14 (22) Severe acute pancreatitis, n (%) 5(8) BISAP score: =2 in the first 24 hours, n (%) 12 (18) 3 in the first 24 hours, n (%) 6(9) Comorbidities, n (%) 50 (80) SIRS, n (%) 8(12) Pancreatic or peripancreatic necrosis, n (%) 3(5) Peripancreatic fluid collections, n (%) 5(8) Transient organ failure, n (%) 6(9) Persistent organ failure, n (%) 5(8) Pleural effusion, n (%) 13 (20) Acute kidney injury (KDIGO), n (%) 11 (17) Renal failure (MMSS), n (%) 6(9) Antibiotic prophylaxis, n (%) 31 (48) Parenteral nutrition, n (%) 3(5) Surgery, n (%) 3(5) Early mortality/late mortality, n (%) 0/3 (5) Data are presented as median (lower upper quartile). n (%): number of patients in each category (percentage of the studied group of 65 patients); BISAP: bedside index for severity in acute pancreatitis; SIRS: systemic inflammatory response syndrome; ERCP: endoscopic retrograde cholangiopancreatography; MMSS: modified Marshall scoring system; KDIGO: Kidney Disease Improving Global Outcomes. laboratory tests and the measurements of ungal, urine albumin, and urine creatinine were performed in the Department of Laboratory Diagnostics, District Hospital in Sucha Beskidzka, Poland. Complete blood counts were analyzed in K 2 EDTA-anticoagulated blood with the Sysmex XE 2100 (Sysmex Corp., Japan) automated hematology analyzer. Urine NGAL concentrations were determined with the ARCHI- TECT Analyzer (Abbott Park, USA) using chemiluminescent microparticle immunoassay. Ang-2 and sngal measurements were performed in the Department of Diagnostics, Chair of Biochemistry, Jagiellonian University Medical College in Cracow, Poland. Serum NGAL concentrations were measured with the Human Lipocalin-2/NGAL ELISA kits (BioVendor, Brno, Czech Republic). Serum Ang-2 were measured with the Quantikine ELISA Human Angiopoietin- 2 Immunoassay kits (R&D Systems, Minneapolis, USA) Statistical Analysis. Data are shown as number of patients (percentage of the group) for categories and median (25th 75th percentile) or mean ± standard deviation for qualitative variables, depending on distribution (as assessed using the Shapiro-Wilk test). As the distributions of Ang-2 concentrations significantly differed from normal, the nonparametric tests were used. In detail, the differences between the groups were studied using the Kruskal-Wallis ANOVA or Mann- Whitney test, and the Spearman coefficient was used to assess correlations. In order to study associations between Ang-2 andthemeasuresofapseverity,simpleandmultiplelogistic regression were used, and the resulting odds ratios (ORs) were reported with 95% confidence intervals (95% CIs). Results were considered statistically significant at p < The Statistica 10.0 (StatSoft, Tulsa, USA) software package was used for computations. 3. Results In 71% of the study patients, AP was classified as mild, 22% had MSAP, and 8% had SAP (Table 1). In most patients, comorbidities were observed, most commonly hypertension (22 patients, 34%), ischemic heart disease (18 patients, 28%), anddiabetes(10patients,15%);sevenpatients(11%)were diagnosed with lung diseases and 3 (5%) with kidney diseases (chronic kidney disease stages G3 in 2 patients and G4 in 4 patients). During the first 72 hours of AP, 11 patients developed AKI according to the KDIGO criteria, including stage 1 in 10 patients and stage 2 in one patient. According to the modified Marshall scoring system, renal failure was diagnosed in 6 patients. The detailed clinical characteristics of the patients are presented in Table 1. The median serum concentrations of Ang-2 were about 2 times higher in the whole group of AP patients than in healthy controls (Table 2). However, the median Ang- 2 concentrations in MSAP and especially in SAP patients were several times higher; the highest Ang-2 concentrations in those groups were observed in serum samples taken 24 hoursaftertheonsetofsymptomsofap(figure1).the median concentrations of urea, creatinine, and ungal in thewholegroupofpatientswerewithinthereferenceranges (Table 2); however, 21 patients had an estimated glomerular filtration rate (egfr, based on MDRD equation) of less than 60 ml/min/1.73 m 2 at 24 hours. The concentrations of urea andcreatininewerethehighestat24hoursanddeclinedwith treatment (Table 2). Ang-2 concentrations in the first 72 hours of AP significantlypredictedmoreseveredisease(table3).inparticular, Ang-2 was a significant predictor of AKI (diagnosed based on the KDIGO criteria) and renal failure (diagnosed according to the modified Marshall scoring system) both in simple analysis (Table 3) and after adjustment for age, sex, and comorbidities, with ORs for AKI of 1.13 ( ); 1.40 ( ); and 1.66 ( ) and ORs for renal failure of 1.14 ( ); 1.38 ( ); and 1.84 ( ) per 1 ng/ml

49 4 Mediators of Inflammation Table 2: Laboratory data in the whole group of patients with acute pancreatitis (n =65). Variable 24 hours 48 hours 72 hours Reference values Ang-2 [ng/ml] 3.18 ( ) 3.33 ( ) 3.12 ( ) 1.73 ± 0.38 (range: ) CRP [mg/l] ( ) ( ) ( ) <5.0 WBC [ 10 3 /μl] ( ) 9.80 ( ) 8.43 ( ) HCT [%] 42.8 ( ) 39.8 ( ) 39.5 ( ) F: /M: PLT [ 10 3 /μl] 234 ( ) 197 ( ) 206 ( ) Amylase [U/L] 1069 ( ) 162 ( ) 92 (62 152) Glucose [mmol/l] 7.81 ( ) 5.39 ( ) 5.28 ( ) Urea [mmol/l] 6.07 ( ) 4.36 ( ) 4.39 ( ) Creatinine [μmol/l] 76.0 ( ) 70.9 ( ) 70.5 ( ) Fibrinogen [g/l] 2.80 ( ) 3.87 ( ) 4.49 ( ) D-dimer [μg/l] 1683 ( ) 2076 ( ) 2039 ( ) <500 sngal [μg/l] ( ) ( ) ( ) F: /M: ungal [μg/l] 28.5 ( ) 38.3 ( ) 41.7 ( ) <131.7 uacr [mg/g] 43.3 ( ) 35.8 ( ) 22.2 ( ) <30 Data are presented as median (lower upper quartile); reference values established in 21 healthy controls; Ang-2: angiopoietin-2; CRP: C-reactive protein; WBC: white blood cells; HCT: hematocrit; PLT: platelets; NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocalin in (s) serum and (u) urine; uacr: urine albumin/creatinine ratio h 48 h 72 h p = p < p < Angiopoietin-2 (ng/ml) Angiopoietin-2 (ng/ml) Angiopoietin-2 (ng/ml) MAP MSAP SAP 0 MAP MSAP SAP 0 MAP MSAP SAP Figure 1: Serum angiopoietin-2 concentrations at 24, 48, and 72 hours after the onset of symptoms in patients with mild (MAP), moderately severe (MSAP), and severe acute pancreatitis (SAP). Data are shown as median, 25th 75th percentile (boxes), and nonoutlier range (whiskers); the points represent raw data. increase in Ang-2 concentration at 24, 48, and 72 hours, respectively. The concentrations of Ang-2 in patients with a creatinine 170 μmol/l (i.e., renal failure according to the modified Marshal scoring system) are shown in Figure 2. During the first 72 hours of AP, serum Ang-2 concentrations were significantly correlated with several laboratory markersusedinroutinemonitoringofappatients,that is, hematocrit, CRP, fibrinogen, or D-dimer (Table 4). Also, Ang-2 negatively correlated with albumin and calcium concentrations at 48 and 72 hours (Table 4). Interestingly, Ang- 2 concentrations were positively correlated with markers related to kidney function, that is, urea, sngal, and ungal, during the first 48 hours, as well as creatinine and urine albumin/creatinine ratio (uacr) during the entire study (Table 4). 4. Discussion Acute pancreatitis is a relatively common disease that in most patients is mild or self-limiting; however, about 20% of patients develop SAP associated with life-threatening complications and a mortality of 20 30% [3, 9]. In older patients (over 60 years of age), being obese (with a body mass index greater than 30) or with chronic comorbidities such as cardiovascular diseases or chronic kidney disease, the mortality can reach 50 80% [4].

50 Mediators of Inflammation 5 Table 3: Angiopoietin-2 serum concentrations as a predictor of the severity of acute pancreatitis results of simple logistic regression. Dependent variable OR (95% CI), per 1 ng/ml increase in Ang-2 concentration 24 h 48 h 72 h SAP 1.11 ( ) 1.22 ( ) 1.31 ( ) SAP or MSAP 1.29 ( ) 1.58 ( ) 1.70 ( ) BISAP in the first 24 hours ( ) 1.37 ( ) 1.68 ( ) SIRS 1.25 ( ) 1.49 ( ) 1.48 ( ) AKI (KDIGO) 1.12 ( ) 1.37 ( ) 1.49 ( ) Renal failure (MMSS) 1.10 ( ) 1.28 ( ) 1.44 ( ) Pleural effusion NS 1.25 ( ) 1.33 ( ) Death NS 1.27 ( ) 1.42 ( ) Forabbreviations,seeTable1;AKI:acutekidneyinjury h 48 h 72 h p < p < p < Angiopoietin-2 (ng/ml) Angiopoietin-2 (ng/ml) Angiopoietin-2 (ng/ml) No RF RF 0 No RF RF 0 No RF RF Figure 2: Serum angiopoietin-2 concentrations at 24, 48, and 72 hours after the onset of symptoms in AP patients without renal failure (no RF) and with renal failure (RF) diagnosed according to the modified Marshall scoring system. Data are shown as median, 25th 75th percentile (boxes), and nonoutlier range (whiskers); the points represent raw data. In the present study, serum Ang-2 concentrations significantlypredictedtheseverityofapintheearlyphase of the disease. Also, the correlations were found between Ang-2 and the laboratory markers of organ failure and inflammation. In particular, Ang-2 significantly correlated with the markers of kidney function and predicted both AKI diagnosed according to KDIGO definition and renal failure diagnosed according to modified Marshall scoring system. The most reliable indicator of the severity of AP is organ failure persisting more than 48 hours [17]. The 2012 revision of Atlanta classification recommends the assessment of organ failure in AP with the use of the modified Marshall scoring system [15]. Although the pathogenesis of AKI in SAP is not fully elucidated, AKI significantly contributes to mortality in AP. Especially susceptible are elderly patients withreducedglomerularfiltrationandpatientswithhistory of renal disease [16, 18]. In the revised Atlanta classification, a patient s age over 60 years and the presence of comorbidities are recognized factors that significantly worsen the prognosis and are associated with more severe AP; this should be taken into account in the preliminary assessment of patients [15]. The results of the present study are in concordance with the observations of Buddingh et al. [10] and Whitcomb et al. [11] who reported the association between high serum Ang- 2 concentrations and SAP. Also, increased Ang-2 has been recently associated with AKI [19]. Ang-2 is found in endothelial cells at the sites of vascular remodeling, and its autocrine effect weakens the interaction between endothelial cells and the surrounding cells, especially pericytes [20]. Vascular endothelial growth factor (VEGF) participates in the regulation of Ang-2 synthesis [21]. In the initial phase of inflammation and in the absence of VEGF, Ang-2 causes vascular regression by inducing apoptosis of endothelial cells. In the systemic inflammatory process, activated neutrophils and monocytes release a range of enzymes such as phospholipase, elastase, or lipocalin-2,

51 6 Mediators of Inflammation Table 4: Simple correlations between angiopoietin-2 and selected variables during the first 72 hours of acute pancreatitis. Variable 24 h 48 h 72 h R p R p R p Age Urea < Creatinine NS CRP 0.48 < Albumin 0.23 NS 0.45 < <0.001 Calcium 0.10 NS 0.44 < <0.001 HCT Fibrinogen <0.001 D-dimer < sngal 0.53 < < <0.001 ungal 0.59 < < <0.001 uacr NS Ang-2: angiopoietin-2; HCT: hematocrit; NGAL: neutrophil gelatinaseassociated lipocalin in (s) serum and (u) urine; CRP: C-reactive protein; uacr: urine albumin/creatinine ratio. which intensifies degradation of phospholipids and may lead to pancreatic and peripancreatic necrosis, as well as intensified infiltration of other organs by inflammatory cells [4]. In the present study, the concentrations of Ang-2 in the systemic circulation were higher in patients than in controls andcorrelatedwithinflammatorymarkers,thatis,crp, fibrinogen, and NGAL concentrations in serum. The renal endothelium is identified as a rich source of Ang-2. Its release from the kidneys may increase due to kidney injury, for example, in the course of AP [2, 14, 22, 23]. The correlations between Ang-2 and urea, creatinine, ungal, and albuminuria support the association of Ang-2 with kidney injury. Urine NGAL is a promising biomarker of AKI [24]. As a low molecular weight lipocalin, NGAL is easily filtered by healthy glomeruli and then almost completely absorbed in proximal tubules. The main fraction of ungal in AKI is synthesized in the distal tubules of the glomeruli in response to a damaging factor. In turn, increased sngal concentrations are observed as a consequence of either decreased glomerular filtration or increased synthesis by activated neutrophils during inflammation. In AP, various factors may lead to AKI, such as the effect of pancreatic amylase on the renal microcirculation, hypoxemia, or a toxic effect of excessively produced pancreatic phospholipase A 2 on the proximal tubules. However, the primary cause of the development and progression of AKI in AP is associated with hypovolemia associated with a decrease in filtration pressure in the kidneys [4]. Hypovolemia is a result of a systemic inflammatory state initiated by AP, associated with vasodilation, escape of fluid into the third space, and increase in intra-abdominal pressure. In patients with SAP, intraabdominal hypertension is observed, which significantly contributes to the reduced perfusion of organs, including thekidneys[25].dehydrationandhypovolemiaarealso intensified by vomiting or fever, often accompanying AP. These factors cause a decrease in renal perfusion and, as a consequence, damage to the renal tubules and the increase in ungal concentrations. In chronic kidney disease, albuminuria is a recognized indicator of renal function, assessed along with egfr; uacr is recommended as a simple measure of albuminuria [18]. In AKI, albuminuria may be associated with an injury to the endothelium of glomerular vessels, being a part of a filtration barrier. The other mechanism responsible for albuminuria inakiisaninjurytotheproximaltubuleandreduced albumin reabsorption from primary urine. Recently, albuminuria observed during the first 72 hours of ICU stay has been associated with worse outcomes in patients with sepsisassociated AKI [26]. On the other hand, the meta-analyses performed by CKD prognosis consortium, published in 2015, have recognized albuminuria (uacr) as a risk factor for AKI[27,28].Inthepresentstudy,uACRshowedapositive correlation with serum Ang-2 concentrations during the first 48 hours following the onset of AP. Tsai et al. [14] and Chang et al. [29] reported the association between increased Ang-2 and albuminuria in patients with chronic kidney disease. 5. Conclusions Early diagnosis and quick and accurate determination of thecausearecriticalfortheeffectivetreatmentofaki.the present study shows a correlation between increased serum Ang-2 concentrations in patients with AP and deteriorated renal function in the early phase of the disease. High Ang-2 concentrations correlated with ungal and uacr in patients with AP in the therapeutic window, that is, within the first 48 hours following the onset of AP. Thus, serum Ang- 2 may be a relevant predictor of the development of acute pancreatic-renal syndrome and a useful tool for a clinician in the evaluation of disease severity. Conflict of Interests The authors declare that they have no conflict of interests. Acknowledgments The work was partly financed by Jagiellonian University Medical College, Grants nos. K/ZDS/ and K/DSC/ References [1] P. Mentula and A. Leppäniemi, Position paper: timely interventions in severe acute pancreatitis are crucial for survival, World Journal of Emergency Surgery,vol.9,article15,2014. [2]H.S.El-Banawy,E.W.Gaber,D.A.Maharem,andK.A. Matrawy, Angiopoietin-2, endothelial dysfunction and renal involvement in patients with systemic lupus erythematosus, Journal of Nephrology,vol.25,no.4,pp ,2012. [3] S. Tenner, J. Baillie, and S. S. Vege, American College of Gastroenterology guideline: management of acute pancreatitis, The American Journal of Gastroenterology, vol.108,pp , [4] N. Petejova and A. Martinek, Acute kidney injury following acute pancreatitis: a review, Biomedical Papers, vol. 157, no. 2, pp , 2013.

52 Mediators of Inflammation 7 [5] A. Buter, C. W. Imrie, C. R. Carter, S. Evans, and C. J. McKay, Dynamic nature of early organ dysfunction determines outcome in acute pancreatitis, British Journal of Surgery,vol.89, no. 3, pp , [6] P. Mentula, M.-L. Kylänpää-Bäck, E. Kemppainen et al., Decreased HLA (human leucocyte antigen)-dr expression on peripheral blood monocytes predicts the development of organ failure in patients with acute pancreatitis, Clinical Science,vol. 105, no. 4, pp , [7]D.J.Mole,B.Olabi,V.Robinson,O.J.Garden,andR.W. Parks, Incidence of individual organ dysfunction in fatal acute pancreatitis: analysis of 1024 death records, HPB,vol.11,no.2, pp , [8]J.Zhou,Y.Li,Y.Tangetal., Effectofacutekidneyinjury on mortality and hospital stay in patient with severe acute pancreatitis, Nephrology,vol.20,no.7,pp ,2015. [9] M. Sporek, W. Kolber, M. Pedziwiatr, M. Kuzniewski, J. Walocha, and B. Kusnierz-Cabala, Prediction of severe acute pancreatitis selected prognostic scales and laboratory markers useful in the early stage of the disease, Przegląd Lekarski,vol.72, pp , [10] K. T. Buddingh, L. G. Koudstaal, H. C. Van Santvoort et al., Early angiopoietin-2 levels after onset predict the advent of severe pancreatitis, multiple organ failure, and infectious complications in patients with acute pancreatitis, Journal of the American College of Surgeons,vol.218,no.1,pp.26 32,2014. [11] D. C. Whitcomb, V. Muddana, C. J. Langmead et al., Angiopoietin-2, a regulator of vascular permeability in inflammation, is associated with persistent organ failure in patients with acute pancreatitis from the United States and Germany, The American Journal of Gastroenterology, vol.105,no.10,pp , [12] T. Watanabe, Y. Tsuji, Y. Kodama, H. Isoda, H. Yamamoto, and T. Chiba, Relationship between serum angiopoietin-2 level and perfusion CT parameters in severe acute pancreatitis, American Journal of Gastroenterology,vol.106,no.10,pp , [13] G. Thurston and C. Daly, The complex role of angiopoietin-2 in the angiopoietin Tie signaling pathway, Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine,vol.2,no.9,ArticleIDa006650,2012. [14] Y.-C. Tsai, Y.-W. Chiu, J.-C. Tsai et al., Association of angiopoietin-2 with renal outcome in chronic kidney disease, PLoS ONE,vol.9,no.10,ArticleIDe108862,2014. [15]P.A.Banks,T.L.Bollen,C.Dervenis,H.G.Gooszen,C.D. Johnson, and M. G. Sarr, Classification of acute pancreatitis 2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus, Gut, vol. 62, no. 1, pp , [16] J. A. Kellum, N. Lameire, P. Aspelin et al., Diagnosis, evaluation, and management of acute kidney injury: a KDIGO summary (Part 1), Critical Care, vol. 17, article 204, [17] M. S. Petrov, S. Shanbhag, M. Chakraborty, A. R. J. Phillips, and J. A. Windsor, Organ failure and infection of pancreatic necrosis as determinants of mortality in patients with acute pancreatitis, Gastroenterology,vol.139,no.3,pp ,2010. [18] KDIGO 2012 clinical practice guideline for the evaluation and management of chronic kidney disease, Kidney International, vol.3,no.1,pp.1 150,2013. [19] P. Kümpers, C. Hafer, S. David et al., Angiopoietin-2 in patients requiring renal replacement therapy in the ICU: relation to acute kidney injury, multiple organ dysfunction syndrome and outcome, Intensive Care Medicine, vol. 36, no. 3, pp , [20] U. Fiedler, T. Krissl, S. Koidl et al., Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 share the same binding domains in the Tie- 2 receptor involving the first Ig-like loop and the epidermal growth factor-like repeats, The Journal of Biological Chemistry, vol. 278, no. 3, pp , [21] M. Yamakawa, L. X. Liu, T. Date et al., Hypoxia-inducible factor-1 mediates activation of cultured vascular endothelial cells by inducing multiple angiogenic factors, Circulation Research,vol.93,no.7,pp ,2003. [22] J. Szederjesi, E. Almasy, A. Lazar, A. Hutanu, and A. Georgescu, The role of angiopoietine-2 in the diagnosis and prognosis of sepsis, The Journal of Critical Care Medicine, vol.1,pp.18 23, [23] M. M. Luz Fiusa, C. Costa-Lima, G. R. de Souza et al., A high angiopoietin-2/angiopoietin-1 ratio is associated with a high risk of septic shock in patients with febrile neutropenia, Critical Care,vol.17,no.4,articleR169,2013. [24]K.Soto,A.L.Papoila,S.Coelhoetal., PlasmaNGALfor the diagnosis of AKI in patients admitted from the emergency department setting, Clinical Journal of the American Society of Nephrology,vol.8,no.12,pp ,2013. [25] J. G. Zhao, Q. Liao, Y. P. Zhao, and Y. Hu, Mortality indicators and risk factors for intraabdominal hypertension in severe acute pancreatitis, International Surgery, vol.99,no.3,pp , [26] J. A. Neyra, X. Li, L. Yessayan, B. Adams-Huet, J. Yee, and R. D. Toto, Dipstick albuminuria and acute kidney injury recovery in critically ill septic patients, Nephrology,2015. [27] M.E.Grams,Y.Sang,S.H.Ballewetal., Ameta-analysisofthe association of estimated GFR, albuminuria, age, race, and sex with acute kidney injury, AmericanJournalofKidneyDiseases, vol.66,no.4,pp ,2015. [28] M. T. James, M. E. Grams, M. Woodward et al., A meta-analysis of the association of estimated GFR, albuminuria, diabetes mellitus, and hypertension with acute kidney injury, American Journal of Kidney Diseases,vol.66,no.4,pp ,2015. [29] F.-C. Chang, T.-S. Lai, C.-K. Chiang et al., Angiopoietin-2 is associated with albuminuria and microalbuminuria in chronic kidney disease, PLoS ONE,vol.8,no.3,ArticleIDe54668,2013.

53 MEDIATORS of INFLAMMATION The Scientific World Journal Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Gastroenterology Research and Practice Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Journal of Hindawi Publishing Corporation Diabetes Research Volume 2014 Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 International Journal of Journal of Endocrinology Immunology Research Hindawi Publishing Corporation Disease Markers Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Volume 2014 Submit your manuscripts at BioMed Research International PPAR Research Hindawi Publishing Corporation Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Volume 2014 Journal of Obesity Journal of Ophthalmology Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Stem Cells International Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Journal of Oncology Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Parkinson s Disease Computational and Mathematical Methods in Medicine Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 AIDS Behavioural Neurology Hindawi Publishing Corporation Research and Treatment Volume 2014 Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Hindawi Publishing Corporation Volume 2014 Oxidative Medicine and Cellular Longevity Hindawi Publishing Corporation Volume 2014

54 6. Artykuł numer 3 Sporek M., Dumnicka P., Gala-Bladzinska A., Mazur-Laskowska M., Walocha J., Ceranowicz P., Warzecha Z., Dembinski A., Kuzniewski M., Olszanecki R., Kusnierz-Cabala B.: Determination of serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin at the early stage of acute pancreatitis. Folia Medica Cracoviensia Table of Contents Title Page..55 Abstract.57 Introduction...58 Materials and Methods..59 Results...61 Discussion.63 References.65 Tables...70 Figures

55 Determination of serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin at the early stage of acute pancreatitis. Mateusz Sporek 1,2, Paulina Dumnicka 3, Agnieszka Gala-Bladzinska 4, Malgorzata Mazur- Laskowska 5, Jerzy Walocha 1, Piotr Ceranowicz 6, Zygmunt Warzecha 6, Artur Dembinski 6, Marek Kuzniewski 7, Rafal Olszanecki 8, Beata Kusnierz-Cabala 9 1 -Department of Anatomy, Jagiellonian University Medical College, Kopernika 12 St., Krakow, Poland (Head: Prof. Jerzy Walocha; MD, PhD) and 2 -Surgery Department of the District Hospital in Sucha Beskidzka , Szpitalna 22 St., Poland (Head: Tadeusz Bernacki; MD, PhD) 3 - Department of Medical Diagnostics, Faculty of Pharmacy, Jagiellonian University Medical College, Medyczna 9 St., Krakow, Poland Head: Ryszard Drozdz; PhD, Ass. Prof. 4 -St` Queen Jadwiga Clinical District Hospital No 2 in Rzeszow , Lwowska 60 St., Poland Head: Janusz Solorz, MSc 5 Diagnostic Department University Hospital in Krakow , Kopernika 15B St., Poland Head: Barbara Maziarz, PhD 6 Department of Physiology, Jagiellonian University Medical College, Grzegórzecka 16 St., Krakow, Poland Head: Prof. Tomasz Brzozowski, PhD 7 Department of Nephrology, Jagiellonian University Medical College, Kopernika 15C St., Krakow, Poland Head: Prof. Władysław Sułowicz; MD, PhD 55

56 8 Laboratory of Molecular Pharmacology and Nanopharmacology, Chair of Pharmacology, 16 Grzegorzecka St., Krakow, Poland Head: Prof. Ryszard Korbut 9 Department of Diagnostics, Chair of Clinical Biochemistry Jagiellonian University Medical College, Kopernika 15A St., Krakow, Poland Head: Bogdan Solnica, MD, PhD, Ass. Prof. Corresponding author: Beata Kuśnierz-Cabala, PhD, DSc Department of Diagnostics, Chair of Clinical Biochemistry Jagiellonian University Medical College 15A Kopernika Street, Krakow; Poland Tel./fax.: mbkusnie@cyf-kr.edu.pl Key words: acute pancreatitis, neutrophil gelatinase-associated lipocalin, prognostic markers 56

57 Abstract Aim: The aim of the study was to assess the diagnostic value of serum concentrations of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (sngal) for the determination of the severity of acute pancreatitis (AP) at the early stage of the disease. Materials and Methods: The study group consisted of 65 patients (34 men and 31 women), aged 62.2±16.0, admitted to the Surgery Department of the District Hospital in Sucha Beskidzka, Poland, with the diagnosis of AP according to the revised Atlanta classification (2012). sngal was measured with ELISA at 24, 48 and 72 hours following the onset of AP symptoms. The correlations were analyzed between sngal and clinical, as well as laboratory parameters, used for the assessment of AP severity. Results: Severe AP was associated with higher sngal at 24, 48 and 72 hours, while moderately severe AP was associated with higher sngal at 48 and 72 hours as compared to mild disease. The BISAP score 3 during the first 24 hours of hospital stay, and the duration of hospital stay were significantly correlated with sngal. Also, sngal positively correlated with white blood cells, C-reactive protein and fibrinogen and negatively with albumin throughout the study. The diagnostic accuracy of sngal for the differentiation between mild AP and more severe disease was 75%, 77% and 85% at 24, 48 and 72 hours, respectively. Conclusions: Serum NGAL concentrations are associated with inflammatory markers, BISAP score and the severity of AP. sngal may serve as an additional prognostic biomarker in the early assessment of AP severity. 57

58 Introduction Nearly 80% of all cases of acute pancreatitis (AP) are mild (MAP mild acute pancreatitis). MAP requires only supportive care, and it generally resolves without any complications. However, 20% of patients develop the severe acute pancreatitis (SAP), which is a lifethreatening disease with a mortality rate of 20-30% [1-4]. The mortality rate is significantly higher in older patients and in patients with BMI 30 [2]. At early phase of the disease, the mortality is associated with prolonged (lasting longer than 48 hours) organ failure (mainly respiratory, circulatory or renal failure) [2,5-7]. In patients with acute kidney disease (AKI) in the course of AP the mortality rate reaches 70-80% [8-10]. An early classification of the severity of AP and initiation of adequate treatment is decisive for the prognosis as well as for the patient survival [11-12]. The therapeutic window in AP is usually reported to last between the 48 and 72 hours following the onset of symptoms [5]. On the other hand, despite numerous studies and significant progress in diagnostic techniques, the early determination of AP severity remains difficult. Together with clinical assessment, the multi-parameter prognostic scales such as Ranson s score, Glasgow, Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II (APACHE II), or bedside index for severity in AP (BISAP) are used for this reason [1,12]. Simultaneously, the diagnostic value of single laboratory markers are studied in this context. Procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP) levels are among the most recognized biomarkers [3,10,12-13]. Even though a significant increase in CRP concentrations is observed in SAP rather than in MAP patients, its peak concentrations are observed relatively late, between the 48 th and 72 nd hour after the disease onset [3,12]. During the first 24 hours of AP, the secretion of proteolytic enzymes from activated neutrophils, i.e. polymorphonuclear granulocyte elastase (PMN-elastase), or gelatinases is observed [3,12,14]. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), also known as lipocalin-2, is a 25kDa glycoprotein, initially found in activated human neutrophils in a form covalently bound to 58

59 neutrophil gelatinase. Physiologically, NGAL is expressed in low levels in kidneys, trachea, lungs, stomach, pancreas and colon; its expression is significantly increased under inflammatory conditions and following damage to the endothelial cells [14-18]. NGAL is freely filtered by the renal glomeruli, and almost completely absorbed by the proximal tubules [19-20]. Serum NGAL concentrations depend to some extend on age, sex, and liver condition, and correlate with markers of inflammation [18,21-24]. The aim of the study was to assess the diagnostic value of serum concentrations of NGAL (sngal) for the determination of the severity of AP at early stage, i.e. the first 72 hours after the onset of symptoms of the disease. Also, the correlations were analyzed between sngal and clinical, as well as laboratory parameters used for the assessment of AP severity, including the inflammatory markers. Materials and methods The study group The prospective study included 65 adult patients admitted with the diagnosis of AP, undergoing treatment in the Surgery Department of the District Hospital in Sucha Beskidzka between January and December AP was diagnosed according to the revised Atlanta classification (2012)[6]. Patients who were admitted later than 24 hours after the onset of symptoms of AP and those who refused to sign the informed consent for the study were excluded. Depending on the severity of AP, patients were assigned to one of 3 groups [6]. The first group mild acute pancreatitis (MAP) included patients in whom no organ dysfunction or local complications were observed during the hospital stay. The second group consisted of patients with moderately severe acute pancreatitis (MSAP), with transient organ failure 59

60 (lasting for less than 48 hours), local complications (i.e. acute peripancreatic fluid, pancreatic pseudocyst, acute necrotic collection, walled-off necrosis), and/or exacerbation of comorbidities. Patients persistent organ failure (lasting longer than 48 hours) and 1 local complications were assigned to the third group severe acute pancreatitis (SAP). The study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki. The study protocol was approved by the Bioethics Committee of the Jagiellonian University in Cracow (Poland) (approval no. KBET/247/B/2013). Laboratory tests Blood samples for the laboratory tests were collected at 24, 48 and 72 hours from the onset of AP symptoms. The routine laboratory tests, including the complete blood count (WBC), amylase activity, serum concentrations of urea, creatinine, calcium, C-reactive protein (CRP), albumin, and plasma concentrations of fibrinogen were performed the same day in the Medical Diagnostic Laboratory in Sucha Beskidzka, Poland. The sera for sngal determination were frozen within 1 hour of blood collection and stored at -70 C no longer than 6 months. The sngal concentrations were measured using the Human Lipocalin- 2/NGAL ELISA kit (BioVendor, Brno, Czech Republic) and the Automatic Micro ELISA Reader ELX 808 (BIO-TEK Instruments Inc., Winooski, VT, USA) at the Department of Diagnostics, Chair of Clinical Biochemistry, Jagiellonian University Medical College in Cracow, Poland. Statistical analysis Data are reported as number of patients and percentage of the group for categories, and the mean ± standard deviation (SD) or median (lower-upper quartile) for quantitative variables, depending on the distribution (the Shapiro-Wilk test was used to assess normality). 60

61 Differences between groups were tested with ANOVA or Kruskal-Wallis ANOVA. Spearman rank coefficient was calculated to assess correlations. The receiver operating characteristic (ROC) curves were used to assess the diagnostic value of sngal, the areas under the ROC curves (AUC) are reported with 95% confidence intervals (95% CI). All the tests were two-tailed and the results were considered significant at p-value of less than The Statistica 10.0 package (Statsoft Inc., Tulsa, USA) was used for computations. Results Relationship between sngal and the severity of AP The clinical characteristics of patients with MAP, MSAP and SAP together with the results of laboratory tests performed at 24 hours after the onset of AP symptoms are presented in Table 1. The differences between groups regarding age, sex, or prevalence of comorbidities were not statistically significant. AP aetiology was mostly gallstones (33 patients, 51%), alcohol (18 patients, 28%) and hypertriglyceridemia (5 patients, 8%). There were no significant differences in aetiology between MAP, MSAP and SAP patients. The most prevalent comorbidities included: hypertension (22 patients, 34%), ischemic heart disease (18 patients, 28%) and diabetes (10 patients, 15%); 7 patients (11%) were diagnosed with lung diseases and 3 (5%) with kidney diseases. The BISAP score during the first 24 hours of hospital stay, and the duration of hospital stay were significantly associated with AP severity (Table 1). There were 3 deaths among SAP patients after days of hospital stay (i.e. all are classified as late mortality). Also, SAP patients had higher concentrations of urea, creatinine, CRP, D-dimer and sngal, and lower concentrations of albumin at admission (Table 1, Figure 1). The concentrations of sngal on days 2 and 3 after admission were higher in SAP and MSAP patients as compared to MAP (Figure 1, Table 1). The highest median sngal 61

62 concentrations were detected on day 2 in all groups (Figure 1), although the time-related differences were statistically significant only among MAP patients (p=0.038). The concentrations of sngal were significantly correlated with the duration of hospital stay and the BISAP score throughout the study (Table 2). Relationships between sngal and selected markers of inflammation Significant positive correlations were found between sngal and the markers of inflammation, i.e. WBC, CRP and fibrinogen. The correlations with CRP were particularly strong. Also, sngal negatively correlated with albumin. All the relationships were observed throughout the study (Table 2). Diagnostic value of sngal in AP When applying the upper reference limits provided by the manufacturer of the test (276 µg/l for women and µg/l for men), 15 (23%), 23 (35%) and 21 (32%) patients had increased sngal at admission, on days 2 and 3 of hospital stay, respectively. However, there were no sex-related differences in sngal concentrations among studied patients (p-values from 0.2 at admission to 0.7 on day 2). In ROC curves analysis, sngal assessed at admission enabled the differentiation between MAP and more severe forms of AP (MSAP or SAP), although the value of AUC at admission was lower than on day 2 and 3 of hospital stay (Figure 2). The best cut-off values were close to the upper reference limit provided by the manufacturer for men, and significantly lower than the upper reference limit for women. At admission, using the manufacturer s upper reference limits to diagnose between MAP and MSAP or SAP yielded lower sensitivity but higher specificity comparing to ROC-based cut- 62

63 off value. However, on subsequent days, ROC-based values that did not differ between men and women yielded better diagnostic value. Discussion According to the revised Atlanta classification, two phases may be distinguished in the course of AP: an early phase up to the first week, and a late phase thereafter [6,12]. The severity of AP is stratified into mild, moderately severe, and severe [3]. Nearly 50% of deaths due to SAP take place in the early phase, in a consequence of multiple organ dysfunction syndrome (MODS) [3,5]. In the present study, serum NGAL concentrations measured early in the course of AP was associated with the disease severity. Already at 24 hours following the onset of symptoms of AP, sngal was significantly higher in SAP than in MAP, and enabled the differentiation between MAP and more severe disease. Also, sngal at 24 hours was positively correlated with BISAP score and the duration of hospital stay. There is an emerging literature showing the associations between serum, plasma urine and NGAL concentrations and prognosis of SAP [3,11,25-26]. Increased concentrations of NGAL in serum and in urine have been reported in the course of various infectious and non-infectious diseases [14,17,24,27-28]. The increased expression of NGAL has been shown in acute and chronic inflammatory states, e.g. in acute renal failure, chronic kidney disease, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, and acute pancreatitis [9,14-15,17,24,28-29]. The observed overexpression of NGAL indicates activation of neutrophils, and may be considered a symptom of the development of acute systemic inflammation in response to the presence of harmful stimuli, and a symptom of the development of complications [3,11,17-18,28]. In the present study, a number of correlations between sngal and acute phase proteins, i.e. CRP, albumin and fibrinogen, were observed. In AP, premature activation of pancreatic enzymes, microcirculatory disorders, local 63

64 gathering of inflammatory cells, i.e. macrophages and neutrophils, as well as the excessive inflammatory response with production of cytokines and inflammatory mediators initiate a series of processes which, within a short period of time, may lead to the development of irreversible changes and death, even in patients for whom the prognosis was initially good. The rapid, dynamic changes in the course of AP make it difficult to create a unified regimen for the assessment and treatment of AP patients [9]. At present, the most widely used routine diagnostic procedure for the prediction of the severity of AP is, next to imaging examinations and the multifactor prognostic scoring systems, measurement of serum CRP and PCT [8,12-13]. However, neutrophils and proteolytic enzymes secreted after the activation of neutrophils (neutrophil elastase, gelatinase), play the key role in the inflammatory cascade in the course of AP [3,12]. Our earlier studies [30] point towards the diagnostic value of PMN elastase in the early-phase of AP. PMN elastase was significantly increased in AP patients starting from the first day of hospital stay, being one of the early markers of the developing inflammatory state. In turn, Helanova et al. [21] show the diagnostic value of NGAL for the evaluation of the intensity of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS), and for the early prognosis organ dysfunction, mainly acute respiratory distress syndrome, and acute kidney injury [12,20]. Although the present study shows some usefulness of sngal in the early prediction of AP severity, the diagnostic value of sngal is too low to support the its use as a single predictor. Also, its diagnostic accuracy at 24 hours of AP is lower than at 48 and 72 hours. After 72 hours, the diagnostic sensitivity (84%) and specificity (78%) for the cut-off value 182 µg/l are similar to other markers of inflammation, e.g. CRP [12]. Also, our data support the need for establishing the appropriate cut-off or decision values, as the use of manufacturer-provided values resulted in lower diagnostic utility. 64

65 The low number of patients included and the one-center design are obvious limitations of our study. At present, the determination of NGAL in serum is connected with methodological limitations, that limit its use as a routine laboratory test. However, also in the light of other reports [25-26], our data indicate the usefulness of sngal as an additional marker for the stratification of the severity of AP. Conclusions The measurement of sngal during the early phase of AP enables the differentiation between mild and more severe forms of the disease with acceptable diagnostic accuracy. Also, sngal concentrations in AP patients are correlated with inflammatory markers, BISAP score, and the duration of hospital treatment. The present study indicates that sngal may serve as an additional prognostic biomarker in the early assessment of AP severity. References: 1. Pavlidis P., Crichton S., Smith J.L. et al.: Improved outcome of severe acute pancreatitis. Crit Care Res Pract. 2013; doi: org/ /2013/ Kumar R., Pahwa N., Jain N.: Acute kidney injury in severe acute pancreatitis: an experience from tertiary care center. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2015; 26: doi: / Meher S., Mishra T.S., Sasmal P.K. et al.: Role of biomarkers in diagnosis and prognostic evaluation of acute pancreatitis. J Biomarkers. 2015; DOI: /2015/ Muddana V., Whitcomb D.C., Khalid A., Slivka A., Papachristou G.I.: Elevated serum creatinine as a marker of pancreatic necrosis in acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2009:104: Doi: /ajg

66 5. Kylanpaa L., Rakonczay Z., O Reilly D.: The clinical course of acute pancreatitis and the inflammatory mediators that driver it. Int J Inflamm. 2012; doi: /2012/ Banks P.A., Bollen T.L., Devernis C. et al.: Classification of acute pancreatitis 2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 2013; 62: doi: /gutjnl Lankisch P.G., Weber-Dany B., Maisonneuve P., Lowenfels A.B.: High serum creatinine in acute pancreatitis: a marker for pancreatic necrosis? Am J Gastroenterol. 2010; 105: doi: /ajg Lin H.-Y., Lai J.-I., Lai Y.-C., Lin P.-C., Chang S.-C., Tang G.-J.: Acute renal failure in severe pancreatitis: a population-based study. Upsala J Med Sci. 2011; 116: doi: / Petejova N., Martinek A.: Acute kidney injury following acute pancreatitis: a review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2013; 157: doi: /bp Huang H.-L., Nie X., Cai B. et al.: Procalcitonin levels predict acute kidney injury and prognosis in acute pancreatitis: a prospective study. Plos One 2013; 8: e doi: /journal.pone Lipinski M., Rydzewska-Rosołowska A., Rydzewski A., Rydzewska G.: Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin as an early predictor of disease severity and mortality in acute pancreatitis. Pancreas. 2015; 44: doi: /MPA Staubli S.M., Oertli D., Nebiker C.A.: Laboratory markers predicting severity of acute pancreatitis. Crit Rev Clin Lab Sci. 2015; 52: doi: / Lee K.J., Kim H.M., Choi J.S., Kim Y.J., Kim Y.S., Cho J.H.: Comparison of predictive systems in severe acute pancreatitis according to the revised Atlanta Classification. Pancreas. 2015; doi: 1097/MPA

67 14. Gumus A., Ozkaya S., Ozyurt S. et al.: A novel biomarker in the diagnosis of parapneumonic effusion: neutrophil gelatinase-associated lipocalin. Multidisciplinary Respiratory Med. 2014; 9: 49. doi: / Merrikhi A., Gheissan A., Mousazadeh H.: Urine and serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin cut-off point for the prediction of acute kidney injury. Adv Med. Res. 2014; 3: 66. PMID: Mussap M., Degrandi R., Fravega M., Fanos V.: Acute kidney injury in critically ill infants: the role of urine neutrophil gelatinase- associated lipocalin (NGAL). J Maternal-Fetal Neonatal Med. 2010; 3: doi: / Otto G.P., Hurtado-Oliveros J., Chung H.-Y. et al.: Plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin is primarily related to inflammation during sepsis: a translational approach. PLOS One. 2015; doi: /journal.pone.o Fodor R., Grigorescu B., Veres M. et al.: Plasma neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL) early biomarker for acute kidney injury in critically ill patients. J Crit Care Med. 2015; 1: doi: /jccm Devarajan P.: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin: a promising biomarker for human acute kidney injury. Biomark Med. 2010; 4: doi: /bmm Simsek A., Tugcu V., Tasci A.I.: New biomarkers for the quick detection of acute kidney injury. Nephrology. 2013; doi: /2013/ Helanova K., Spinar J., Parenica J.: Diagnostic and prognostic utility of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in patients with cardiovascular diseases-review. Kidney Blood Press Res. 2014; 39: doi: / Gala-Bladzinska A., Zylka A., Rybak K., Dumnicka P., Kuzniewski M., Kusnierz-Cabala B.: Usefulness of measuring urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and 67

68 calculating NGAL to creatinine ratio as early predictors of kidney dysfunction in patients with diabetes type 2. Diagn Lab. 2015; 51: Hasse M., Devarajan P., Hasse-Fielitz A. et al.: The outcome of neutrophil gelatinaseassociated lipocalin-positive subclinical acute kidney injury. J Am Coll Cardiol. 2011; 57: doi: /j.jacc Paragas N., Qiu A., Hollmen M, Nickolas T.L. et al.: NGAL-siderocalin in kidney disease. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823: doi: /j.bbamcr Chakraborty S., Kaur S., Muddana V. et al.: Elevated serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin is an early predictor of severity and outcome in acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2010; 105: doi: /ajg Kaur S., Chakraborty S., Baine M.J. et al.: Potentials of plasma NGAL and MIC-1 as biomarker(s) in the diagnosis of lethal pancreatic cancer. PLoS One. 2013; 8: e doi: /journal.pone Oikonomou K.A., Kapsoritakis A.N., Theodoridou C., Karangelis D., Germenis A.E., Stefanidis I.: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in inflammatory bowel disease: association with pathophysiology of inflammation, established markers, and diseases activity. J Gastroenterol. 2012; 47: doi: /s Soto K., Papoila A.L., Coelho S. et al.: Plasma NGAL for the diagnosis of AKI in patients admitted from the emergency department setting. CJASN. 2013; 8: doi: /CJN Reddy S.S, Kumar P.K, Valli M.B. et al.: Urine neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL) in septic versus non-septic acute kidney injury. Inter Arch Integrated Med. 2015; 2: Kusnierz-Cabala B., Gurda-Duda A, Dumnicka P. et al.: Plasma pentraxin 3 concentrations in patients with acute pancreatitis. Clin Lab. 2013; 59: PMID:

69 Conflict of interest: No declared. Acknowledgments: The work was partly financed from Jagiellonian University Medical College grants no. K/ZDS/ and K/DSC/

70 Table 1. Clinical characteristics of AP patients and laboratory data at admission according to severity of the disease MAP (n=46) MSAP (n=14) SAP (n=5) p* Age, years 59±19 64±16 70±19 NS Males, n (%) 25 (54) 6 (42) 3 (60) NS Duration of pain until admission, hours Duration of hospital stay, days BISAP score 3 in first 24 h, n (%) 12 (6-24) 12 (6-36) 24 (24-48) NS 6 (5-7) 12 (10-17) 27 (13-31) <0.001 a,b 0 2 (14) 4 (80) <0.001 c Comorbidities, n (%) 33 (72) 12 (86) 5 (100) NS Mortality, n (%) (60) - WBC, x10 3 /µl 11.1 ( ) 12.4 ( ) 10.4 ( ) NS HCT, % 42.5± ± ±7.1 NS PLT, x10 3 /µl 237 ( ) 230 ( ) 128 ( ) NS Amylase, U/L 1085 ( ) 1038 ( ) 1013 ( ) NS Glucose, mmol/l 7.7 ( ) 9.1 ( ) 13.3 ( ) NS Urea, mmol/l 5.5 ( ) 6.7 ( ) 13.4 ( ) a Creatinine, µmol/l 72.7 ( ) 90.7 ( ) ( ) a Calcium, mmol/l 2.33± ± ±0.34 NS CRP, mg/l 5.9 ( ) 24.4 ( ) ( ) a Albumin, g/l 40.6± ± ± a Fibrinogen, g/l 2.62 ( ) 3.19 ( ) 4.46 ( ) NS 70

71 sngal, µg/l 104 (68-139) 226 ( ) 329 ( ) a * p-value for overall difference between the 3 groups; superscript numbers denote significant differences in post-hoc tests: a between MAP and SAP; b between MAP and MSAP; c in all between-groups comparisons Table 2. Simple correlations between sngal and the selected variables at 24, 48 and 72 hours after onset of AP symptoms. Variable 24 hours 48 hours 72 hours R p R p R p Duration of hospital stay < <0.001 BISAP score < <0.001 WBC 0.46 < < <0.001 CRP 0.66 < < <0.001 Fibrinogen 0.51 < < Albumin < < <

72 Table 3. The diagnostic value of sngal for the differentiation between MAP and more severe AP (MSAP or SAP) at the cut-off values chosen based on ROC curves analysis and the upper reference limits (URL) provided by the manufacturer of the test (i.e. 276 µg/l for women and µg/l for men). Time point* Cut-off value Sens., % Spec., % PPV, % NPV, % Acc.,% 24 hours 48 hours 72 hours ROC: 165 µg/l URL ROC: 183 µg/l URL ROC: 182 µg/l URL Sens. sensitivity; Spec. specificity; PPV predictive value of positive result; NPV predictive value of negative result; Acc. accuracy * Time after the onset of AP symptoms. 72

73 Figure 1. The concentrations of sngal in patients with mild (MAP), moderately severe (MSAP) and severe acute pancreatitis (SAP) at 24 (a), 48 (b) and 72 hours (c) after the onset of AP symptoms; p-values are shown for significant differences in post-hoc tests. 73

74 Figure 2. ROC curves presenting the diagnostic value of sngal concentrations in differentiating between MAP and more severe forms of AP (MSAP or SAP) at 24 (a), 48 (b) and 72 hours (c) after the onset of AP symptoms. The selected cut-off values are highlighted. The area under curve (AUC) values are reported with 95% confidence intervals. 74

75 7. Artykuł numer 4 Sporek M., Gala-Błądzińska A., Dumnicka P., Mazur-Laskowska M., Kielczewski S., Walocha J., Ceranowicz P., Kuźniewski M., Mituś J., Kuśnierz-Cabala B.: Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function in the early course of acute pancreatitis. Folia Medica Cracoviensia. 2016; (56) 1:

76 FOLIA MEDICA CRACOVIENSIA Vol. LVI, 1, 2016: PL ISSN Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function in the early course of acute pancreatitis Mateusz Sporek 1,2, Agnieszka Gala-Błądzińska 3, Paulina Dumnicka 4, Małgorzata Mazur-Laskowska 5, Stanislas Kielczewski 1, Jerzy Walocha 1, Piotr Ceranowicz 6, Marek Kuźniewski 7, Jerzy Mituś 1, Beata Kuśnierz-Cabala 8 1 Department of Anatomy, Jagiellonian University Medical College ul. Kopernika 12, Kraków, Poland 2 Surgery Department of the District Hospital in Sucha Beskidzka ul. Szpitalna 22, Sucha Beskidzka, Poland 3 St Queen Jadwiga Clinical District Hospital No 2 in Rzeszów ul. Lwowska 60, Rzeszów, Poland 4 Department of Medical Diagnostics, Faculty of Pharmacy, Jagiellonian University Medical College ul. Medyczna 9, Kraków, Poland 5 Diagnostic Department University Hospital in Krakow ul. Kopernika 15B, Kraków, Poland 6 Department of Physiology, Jagiellonian University Medical College ul. Grzegórzecka 16, Kraków, Poland 7 Department of Nephrology, Jagiellonian University Medical College ul. Kopernika 15C, Kraków, Poland 8 Department of Diagnostics, Chair of Clinical Biochemistry Jagiellonian University Medical College ul. Kopernika 15A, Kraków, Poland Corresponding author: Mateusz Sporek, MD; Department of Anatomy, Jagiellonian University Medical College ul. Kopernika 12, Kraków; Poland; Phone/fax: ; msporek1983@gmail.com Abstract: I n t r o d u c t i o n: Acute Kidney Injury (AKI) is a serious early complications in patients with acute pancreatitis (AP) that significantly increases mortality rates compared to patients without AKI. The early diagnosis of AKI during its treatable phases and implementation of appropriate treatment protocols can improve outcomes for this group of patients. A promising biomarker for AKI is neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). A i m: This study evaluated the diagnostic value of NGAL concentrations in serum and in urine for patients developing AKI as an early complication of AP compared to AP patients without AKI. Material and methods: The study group composed of 65 patients (34 men and 31 women) with a mean age of 62.2 ± 16 years with AP and hospitalized in the Surgery Department of the Direct Hospital in Sucha Beskidzka, Poland

77 14 Mateusz Sporek, Agnieszka Gala-Błądzińska, et al. between January and December Serum NGAL (sngal) levels were measured with the BioVendor ELISA kit, and urine NGAL (ungal) with the Abbott ARCHITECT Analyzer. R e s u l t s: In the early phase of AP, 11 patients (17%) developed AKI, including 10 patients with stage 1 and one with stage 2. AKI was associated with more severe AP, higher BISAP scores, the need for more intensive treatment, longer hospital stays and higher mortality. Both serum and urine NGAL concentrations were significantly higher in patients with AKI throughout the study and significantly predicted AKI in simple and multiple logistic regression adjusted for age, sex and comorbidities. Serum and urine NGAL concentrations were significantly correlated with levels of serum urea, creatinine, urine albumin, and the maximum change in serum creatinine. Serum and urine NGAL levels also correlated positively with direct neutrophil counts and CRP concentrations throughout the study. C o n c l u s i o n s: The measurement of NGAL levels, particularly in urine, is simple, easy to interpret, routinely available, and clinically useful in the assessment of dynamic changes in kidney function for patients with AP. Key words: urine NGAL, severe of acute pancreatitis, acute kidney injury. Introduction Acute pancreatitis (AP) in the most of patients have mild course of the disease (MAP-mild acute pancreatitis). Laboratory tests and imaging studies performed in the early stages of the disease may not give any warning signs of eventual organ failure. But, timely recognition of the severity of AP and monitoring of organ function is the only way to survive this condition [1 4]. It should be noted that more than half of patients with severe acute pancreatitis (SAP) die within the first week of the illness, and that the most common causes of death (70 80%) are acute renal injury (AKI) and acute lung injury (ALI) due to acute respiratory distress syndrome (ARDS) [2, 5 9]. The established criteria for measuring AKI, the 2004 RIFLE classification and 2012 KDIGO guidelines, are both based on estimated increase in creatinine and decrease in urine output over time [8, 10]. These biomarker measurements for AKI were proposed for use internationally due to their general availability in clinical settings across the world. Unfortunately, serum creatinine level has limited value as an indicator of renal impairment as it varies with factors such as muscle mass, age, sex, and diet of the patient [5, 11]. More importantly, the increase in serum creatinine usually occurs hours after kidney damage [10]. As such, monitoring serum creatinine does not meet the diagnostic needs of clinicians treating patients with SAP whose condition may change from hour to hour. Similarly, the hourly measurement of urine output commonly used in most surgery departments is also not an ideal benchmark for estimating renal function. Limitations include general variability, invasiveness and laboriousness of acquiring measurements and difficulty of interpreting the results. Instead, clinicians need a fast and simple diagnostic tool that provides reliable assessment of a patient s risk for AKI. There is a pressing need for new markers of kidney damage that allow for quick diagnosis and appropriate treatment. One such promising marker is neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). This

78 Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function protein s increased concentration in blood serum and urine is observed as early as 4 6 hours after kidney ischemia or exposure to nephrotoxic agents in both the preclinical and reversible phases of AKI [8, 10, 12]. NGAL, also known as gelatinase siderocalin or lipocalin 2, is a secretory protein in the lipocalin family present in the granules of neutrophils and macrophages [11]. NGAL was first described as a marker for acute kidney injury in 2003 when it was found in patients having undergone cardiac surgery [13]. Under normal physiological conditions, NGAL is freely filtered by the kidney glomerulus and is mostly resorbed at the proximal convoluted tubule. It begins to be secreted in response to kidney ischemia as soon as 2 hours after the injury and may be considered as a sort of renal troponin. The concentration of NGAL in blood serum is considered to be a morphological indicator of damage to the renal tubules (as opposed to serum creatinine, which is only a marker of kidney activity) [11, 13]. Increased concentration of NGAL in urine indicates damage to the proximal convoluted tubule of the nephron and lack of resorption. However, the majority of urine NGAL is synthesized in the distal part of the nephron in response to ischemia or exposure to nephrotoxic agents [10]. A clinically negligible expression of NGAL has also been shown in numerous other human tissues but only significantly increasing serum NGAL levels in response to inflammatory agents. The increase in concentration of urine NGAL during AKI is significantly larger than the increase in the serum NGAL. The aim of the study was to compare the concentrations of NGAL in serum and urine for AP patients with AKI and AP patients without AKI at 24, 48 and 72 hours after the onset of acute pancreatitis. Materials and methods This prospective observational study included 65 adult patients with a diagnosis of AP, treated in the Department of Surgery, District Hospital in Sucha Beskidzka, Poland between January and December AP was diagnosed based on the revised Atlanta Classification 2012 [14]. The patients with symptoms of AP lasting longer than 24 hours and those who have not signed an informed consent form were excluded from the study. The severity of AP was stratified according to the revised Atlanta Classification into mild (MAP), moderately severe (MSAP) or severe AP (SAP), based on the presence of transient or persistent organ failure, exacerbation of comorbidities and/or local complications. AKI was diagnosed according to KDIGO guideline, i.e. when serum creatinine increased 26.5 µmol/l within 48 hours, or 1.5-times within 7 days or urine volume was <0.5 ml/kg/h for 6 hours [15]. All laboratory tests conducted for the routine assessment of patients were performed in the Department of Laboratory Diagnostics Health Care Centre in Sucha Beskidzka on the date of the order. Measured parameters included amylase activity, concentration of total calcium, serum albumin, urine urea nitrogen, serum creatinine, C-reactive protein (CRP) and complete blood counts. Complete

79 16 Mateusz Sporek, Agnieszka Gala-Błądzińska, et al. blood counts were performed on whole blood in K 2 EDTA using an automated hematology counter type 5-diff Sysmex XE 2100 (Sysmex Corp., Japan). Urine NGAL (ungal) concentration was measured in individual urine samples with an ARCHITECT Analyzer Abbott Diagnostics (Abbott Park, USA) using chemiluminescent microparticle immunoassays (CMIA). Concentration of NGAL in blood serum (sngal) was measured using Human Lipocalin-2/NGAL ELISA kits from BioVendor (Brno. Czech Republic) on the Automatic Micro ELISA Reader ELX 808 (BIO-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). The study design was approved by the Bioethics Committee of the Jagiellonian University (Decision No. KBET/247/B/2013). Statistical analysis Categorical data were reported as numbers of patients (percentage of the appropriate group) and compared with the chi-squared test. Median (lower-upper quartile) or mean ± standard deviation were reported for continuous variables. The variables distributions were checked for normality using the Shapiro Wilk s test. The differences between groups were tested with the t-test or Mann Whitney s test. Simple correlations between NGAL and the selected variables were assessed with the Spearman s rank coefficient as both sngal and ungal were characterized by non-normal distributions. Odds ratios (OR) of 95% with confidence intervals (CI) of 95% were reported in case of the simple and multiple logistic regression; multiple models were adjusted for a-priori chosen confounders. The results were considered significant at p <0.05. The Statistica 12.5 software package (StatSoft, Tulsa, USA) was used for computations. Results AP was classified as mild in 46 (71%), moderately-severe in 14 (22%), and severe in 5 (8%). At the early phase of AP, 11 patients (17%) developed AKI according to the KDIGO criteria. AKI stage 1 was diagnosed in 10 patients and stage 2 in one patient. The clinical and laboratory characteristics of patients with and without AKI are reported in Table 1. The diagnosis of AKI was associated with more severe AP, higher BISAP scores, the necessity for more intensive treatment and longer hospital stay, as well as with higher mortality (although there were only 3 deaths, all in late phase of the disease) (Table 1). Patients with and without AKI did not differ in overall prevalence of comorbidities, however, chronic kidney disease and diabetes were significantly associated with AKI (Table 1). The comorbidities were observed in nearly 80% of patients, most commonly hypertension (22 patients, 34%), ischemic heart disease (18 patients, 28%), and diabetes (10 patients, 15%); 7 patients (11%) were diagnosed with lung diseases and 3 (5%) with kidney diseases (chronic kidney disease stage G3 in 2 patients and G4 in 4 patients).

80 Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function Table 1. Clinical characteristics of patients with acute pancreatitis (N = 65) and the results of laboratory tests at 24 hours. Variable Patients without AKI (N = 54) Patients with AKI (N = 11) Male sex, N (%) 27 (50) 7 (63) NS Age, years 59 ± ± 17 NS Duration of pain until admission, hours 12 (6 24) 16 (8 24) NS Duration of hospital stay, days 6 (5 8) 14 (10 27) <0.001 Mild acute pancreatitis, N (%) 45 (83) 1 (9) Moderately severe acute pancreatitis, N (%) 8 (19) 6 (55) Severe acute pancreatitis, N (%) 1 (2) 4 (36) BISAP score 3 in the first 24 hours, N (%) 0 6 (55) <0.001 Co-morbidities, N (%) 40 (74) 10 (91) NS Renal disease diagnosed before AP, N (%) 1 (2) 2 (18) Diabetes, N (%) 6 (11) 4 (36) SIRS, N (%) 2 (4) 6 (55) <0.001 Pancreatic or peripancreatic necrosis, N (%) 1 (2) 2 (18) Peripancreatic fluid collections, N (%) 5 (9) 0 NS Transient organ failure, N (%)* 2 (4) 4 (36) <0.001 Persistent organ failure, N (%)* 1 (2) 4 (36) <0.001 Pleural effusion, N (%) 7 (13) 6 (55) Antibiotic prophylaxis, N (%) 21 (40) 10 (91) Parenteral nutrition, N (%) 0 3 (27) Surgery, N (%) 1 (2) 2 (18) Early mortality / late mortality, N (%) 0 / 1 (2) 0 / 2 (18) / Leukocytes, x10 3 /µl 11.2 ( ) 13.6 ( ) NS Neutrophils, x10 3 /µl 9.1 ( ) 10.7 ( ) NS Hematocrit, % 43.1 ± ± 6.3 NS Platelets, x10 3 /µl 240 ( ) 130 ( ) Amylase, U/l 1217 ( ) 733 ( ) NS Glucose, mmol/l 7.8 ( ) 9.6 ( ) NS Serum albumin, g/l 40.6 ( ) 37.6 ( ) CRP, mg/l 12.2 ( ) ( ) <0.001 Calcium, mmol/l 2.35 ( ) 2.18 ( ) NS p <0.001

81 18 Mateusz Sporek, Agnieszka Gala-Błądzińska, et al. Variable Patients without AKI (N = 54) Patients with AKI (N = 11) Urea, mmol/l 5.9 ( ) 11.7 ( ) Creatinine, µmol/l 73 (63 92) 157 ( ) <0.001 Urine albumin, mg/dl 340 ( ) 2300 ( ) sngal, ng/ml 105 (68 137) 276 ( ) <0.001 ungal, ng/ml 26.3 ( ) ( ) <0.001 N number of patients; BISAP bedside index for severity in acute pancreatitis; SIRS systemic inflammatory response syndrome; NGAL neutrophil gelatinase-associated lipocalin; s serum; u urine; CRP C-reactive protein * according to modified Marshall scoring system. p Fig. 1. NGAL concentrations in serum (sngal) and urine (ungal) of patients with and without AKI at 24, 48 and 72 hours after onset of symptoms of AP. Data are shown as median, percentile (boxes) and non-outlier range (whiskers), points represent the outliers.

82 Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function At 24 hours after the onset of AP, the patients who do not developed AKI were characterized by higher platelets, decreased in serum albumin, and increased in CRP, urea, creatinine as well as higher urine albumin concentrations (Table 1). Serum and urine NGAL concentrations were significantly higher in AKI patients throughout the study (Table 1, Fig. 1). In logistic regression analysis, both serum and urine NGAL concentrations significantly predicted AKI (Table 2). The association between sngal and ungal with AKI was independent of age, sex and comorbidities. The odds ratios for AKI estimated for sngal and ungal were of similar magnitude. Table 2. Serum and urine NGAL concentrations as predictors of acute kidney injury in patients with acute pancreatitis. Time* Independent variable Simple OR (95%CI) Adjusted** OR (95%CI) 24 hours 48 hours 72 hours sngal, per 10 ng/ml 1.20 ( ) 1.09 ( ) ungal, per 10 ng/ml 1.20 ( ) 1.11 ( ) sngal, per 10 ng/ml 1.08 ( ) 1.07 ( ) ungal, per 10 ng/ml 1.08 ( ) 1.08 ( ) sngal, per 10 ng/ml 1.09 ( ) 1.19 ( ) ungal, per 10 ng/ml 1.10 ( ) 1.20 ( ) ** Time between the onset of AP symptoms and blood/urine collection for NGAL determination. ** The models were adjusted for age, sex and comorbidities. Table 3. Simple correlations between serum and urine NGAL concentrations and the selected variables during the first 72 hours of acute pancreatitis. Variable Urea R = 0.34 p = Creatinine R = 0.40 p <0.001 Creatinine max. change* 24 h 48 h 72 h sngal ungal sngal ungal sngal ungal R = 0.43 p <0.001 Urine albumin R = 0.31 p = CRP R = 0.66 p <0.001 Neutrophils R = 0.49 p <0.001 R = 0.21 R = 0.25 p = 0.1 NS p = R = 0.16 R = 0.33 p = 0.2 NS p = R = 0.45 p <0.001 R = 0.51 p <0.001 R = 0.58 p <0.001 R = 0.31 p = R = 0.39 p = R = 0.52 p <0.001 R = 0.70 p <0.001 R = 0.71 p <0.001 R = 0.34 p = R = 0.32 p = R = 0.38 p = R = 0.58 p <0.001 R = 0.41 p <0.001 R = 0.42 p <0.001 R = 0.34 p = R = 0.35 p = R = 0.22 R = 0.11 p = 0.08 NS p = 0.4 NS R = 0.46 p <0.001 R = 0.39 p = R = 0.11 p = 0.4 NS R = 0.21 p = 0.1 NS R = 0.60 p <0.001 R = 0.67 p <0.001 R = 0.53 p <0.001 R = 0.57 p <0.001 NGAL neutrophil gelatinase-associated lipocalin; s serum; u urine; CRP C-reactive protein * Maximum change in serum creatinine concentrations during the first 72 hours after the onset of symptoms of AP

83 20 Mateusz Sporek, Agnieszka Gala-Błądzińska, et al. Moreover, both serum and urine NGAL concentrations were significantly correlated with other laboratory markers of kidney function, i.e. serum urea, serum creatinine and urine albumin (Table 3). Of note, the correlations between NGAL and creatinine concentrations were relatively weak or even non-significant in some time-points, however, there were significant correlations between both serum and urine NGAL and maximum change in serum creatinine, throughout the study (Table 3). Also, both serum and urine NGAL were positively correlated with the direct neutrophil counts as well as with CRP concentrations (Table 3). Discussion The clinical diagnosis of acute pancreatitis requires at least two of the three diagnostic criteria: abdominal pain typical to AP, at least a threefold increase of lipase or amylase in serum and CT imaging consistent with AP [16]. However, these criteria indicate neither the severity nor prognosis of the disease. For these, the clinician needs to conduct an experienced analysis of a multitude of additional studies. This requires careful clinical observation and continuous monitoring of many parameters such as heart and respiratory rates, arterial blood gases, body temperature, pulse oximetry, serum creatinine, blood urea nitrogen, level of consciousness on the Glasgow Coma Scale, the presence of pleural effusion and the presence and extent of pancreatic necrosis as measured by Balthazar scoring [3, 17 18]. It should be emphasized that in the case of a patient with AP lasting more than 48 hours, organ failure is the major predictor of morbidity and mortality regardless of the assessment method of the severity of AP (Ranson Scale, APACHE II, BISAP score) [3, 9, 19 21]. The assessment of multiple organ dysfunction (Marshall score) is essential for the formulation of a personalized patient treatment plan including indications for intravenous fluid administration, enteral and parenteral nutrition, pain management, decompressive nasogastric tube, antibiotics, percutaneous drainage, endoscopic treatment or laparotomy [8, 14, 16, 22]. The Marshall score assumes a loss of kidney function when serum creatinine is between 168 and 318 mmol/l ( mg/dL), while levels below 124 mmol/l (1.4mg/dL) indicate normal kidney function [23]. This classification is not consistent with the definition of AKI currently used by nephrologist. Notably, KDIGO guidelines are based on the change of serum creatinine concentration over time as well as hourly urine output [15]. These guidelines specify treatment protocols for patients depending on the severity of AKI and can be useful in speeding up decision making in time-sensitive cases [15]. In the present study, the severity of AKI as defined by KDIGO correlated with a longer hospital stay, severity of AP, severity of disease as assessed with the BISAP score upon admission, the advent of systemic inflammatory response syndrome (SIRS), persistent organ failure and the presence of pleural effusion. Patients with diagnosed AKI had more frequent need for antibiotic administration and surgical intervention. These results are

84 Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function confirmed by the observations of other authors, for whom the presence of AKI indicated a poor prognosis for AP patients [24 25]. But, since evaluating AKI based on serum creatinine and urine output can be inadequate, the clinician is in need of a simple biomarker for the assessment of patients with AP with special consideration of renal function. The ideal biomarker, to be useful clinically, should be easy to measure and interpret, dynamically responsive to the patient s condition and reliable in informing therapeutic decisions. Based on previous studies, NGAL concentrations in the serum and urine are excellent candidates as clinically useful biomarkers in the evaluation of patients with AP. Patients with AKI had significantly higher concentrations of sngal and ungal compared to those that did not develop this complication. Additionally, this study s results demonstrate that significantly higher levels of NGAL in serum and urine also correlate with a more severe clinical state (e.g. higher BISAP scores in the first 24 hours, greater organ dysfunction assessed via Marshall score, accompanying pancreatic necrosis or presence of pleural effusion) and higher parameters of inflammation (CRP and direct neutrophil count) [Table 1]. Lipinski et al. [2] observed that urine NGAL levels in AP patients, particularly when collected in the first 24 hours, is a reliable predictor of more severe disease and mortality. In the cited work ungal levels above 68.9 ng/ml were predictive of SAP [2]. Our clinical observations support this interpretation of un- GAL levels to rapidly identify AP patients at risk for AKI, when the samples are taken during the first day of hospitalization. The vast majority of patients our study group that developed AKI had concentration ungal was higher than 100 ng/ml. It can be concluded that these patients would benefit from immediate and aggressive prevention of AKI. This should primarily include intensive rehydration precisely regulated by the daily urine output, blood pressure and blood volume based on daily measurements of body weight. It should also include the elimination of potentially nephrotoxic drugs and avoiding the use of imaging studies with potentially nephrotoxic contrast agents, at least until the decrease in the concentration of ungal. These patients also require careful dosage of drugs metabolized by the kidney, depending on their degree of function. Measuring ungal again after 48 hours allows for the evaluation of the effects of treatment of AKI in AP patients. A significant decrease in concentration of ungal infers a reduction or avoidance of AKI and should be considered as an effective treatment of this complication. As such, in the case of avoiding AKI in AP, ungal can be thought of as a renal troponin similarly predictive as its cardiac counterpart. Other studies have also shown that ungal levels change dynamically over time (in as little as four hours), after the activation of a nephrotoxic contrast agent. The measurement of urine NGAL levels is simple, fast, responsive to change, easily added to routine laboratory protocols and provides the clinician with diagnostically and therapeutically relevant information. This marker has significant potential for practical application in monitoring the kidney function of patients with AP. Neyra et al. [26] found that in patients with AKI in intensive care units, albuminuria greater than 30 mg/dl on the dipstick test

85 22 Mateusz Sporek, Agnieszka Gala-Błądzińska, et al. correlates with a potentially worse prognosis in their AKI recovery compared to similar patients with lower albuminuria. Those results correspond well with our study s significant correlations of high ungal and sngal levels with high albuminuria urine samples (all above 150 mg/dl). This correspondence indicates that the levels of these biomarkers in patients 24 and 48 hours after the onset of abdominal pain have predictive value for AKI. Monitoring serum NGAL during the subsequent days of AP allows the clinician to expect either improvement or systemic inflammation and the development of SIRS (Systemic Inflammatory Response Systems). Lipinski et al. [2] observed that the initial phase of SAP is marked by the release of NGAL from ischemic cells and organs (particularly the kidney), which is typical of the pathophysiology of acute systemic diseases. In our study, measurement of sngal at 24, 48 and 72 hours after admission yielded comparably increasing concentrations. This increase should be treated like other acute phase proteins, such as increasing CRP or declining serum albumin, that signal a systemic inflammatory process developing as part of AP. Although the authors observed a statistically significant correlation between the increase of sngal in AP patients with AKI compared to AP patients without AKI ( ng/ml vs ng/ml), it is the levels of ungal that showed the more remarkable correlations for these two groups of patients ( ng/ml vs ng/ml) [Table 1]. This conclusion is supported by the study authored by Soto et al. [27] based on prospective observation of 616 ICU patients, confirming the usefulness of sngal levels in the monitoring of renal function in patients with AKI [27]. Measurements of NGAL in the urine and serum, however, have its limitations. Because it is a protein associated with neutrophil gelatinase, the increase in NGAL levels can be a consequence of the presence of an infection in the body which may not necessarily be associated with AP (eg. bacterial pneumonia or pyelonephritis) [28]. There is also evidence that sngal levels increase in patients with pancreatic cancer, and although it is not a very specific marker for this disease, this protein may be present in the early stages of tumor development [29]. It is also reported that concentration of sngal may increase in cancers of other organs including the ovaries, lungs and stomach [30 32]. Increases in ungal are in turn observed in patients with chronic renal failure even in the very early stages [33], and in patients with leukocyturia, which may limit the predictive quality of the biomarker in the assessment of renal failure in patients with AP. These limitations require further study to validate. Conclusions Acute pancreatitis is a complex disease that if accompanied by organ failure can cause serious complications and death. Measuring NGAL levels, particularly in urine, in patients with AP is simple, easy to interpret, routinely available and above all clinically useful in the diagnosis and evaluation of dynamic changes in renal function. NGAL levels in

86 Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function these patients is correlated with other parameters of inflammation and is most useful as an additional test in the assessment of ongoing systemic inflammation. These results need further research on larger groups of patients to be fully validated. Acknowledgements The study was partially financed by Jagiellonian University Medical College grants No K/DSC/ and No K/ZDS/ No declared. Conflict of interest References 11. Pavlidis P., Crichton S., Lemmich-Smith J., Morrison D., Atkinson S., Wyncoll D., et al.: Improved outcome of severe acute pancreatitis in the intensive care unit. Crit Care Res Practice. 2013; doi: /2013/ Lipinski M., Rydzewska-Rosolowska A., Rydzewski A., Rydzewska G.: Urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin as an early predictor of disease severity and mortality in acute pancreatitis. Pancreas. 2015; 44: , doi: 1097/MPA Vege S.S., Whitcomb D.C., Grover S.: Predicting the severity of acute pancreatitis. UpToDay. Dec Chu L.P., Zhou J.J., Yu Y.F., Huang Y., Dong W.X.: Clinical effects of pulse high-volume hemofiltration on severe acute pancreatitis complicated with multiple organ dysfunction syndrome. Ther Apher Dial. 2013; 17: 78 83, doi: /j x. 15. Huang H.L., Nie X., Cai B., Tang J.T., He Y., Miao Q., et al.: Procalcitonin levels predict acute kidney injury and prognosis in acute pancreatitis: a prospective study. Plos One. 2013; 8: e82250, doi: / journal.pone Kumar R., Pahwa N., Jain N.: Acute kidney injury in severe acute pancreatitis: an experience from a tertiary care center. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2015; 26: 56 60, doi: / Meher S., Mishra T.S., Sasmal P.K., Rath S., Sharma R., Rout B., Sahu M.K..: Role of biomarkers in diagnosis and prognostic evaluation of acute pancreatitis. J Biomarkers. 2015; doi: /2015/ Petejova N., Martinek A.: Acute kidney injury following acute pancreatitis: A review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc. 2013; 157: , doi: /bp Khanna A.K., Meher S., Prakash A., Tiwary S.K., Singh U., Srivastava A., Dixit V.K.: Comparison of Ranson, Glasgow, MOSS, SIRS, BISAP, APACHE II, CTSI Scores, IL-6, CRP, and procalcitonin in predicting severity, organ failure, pancreatic necrosis and mortality in acute pancreatitis. HPB Surgery. 2013; doi: /2013/ Simsek A., Tugru V., Tasci A.I.: New biomarkers for quick detection of acute kidney injury. ISRN Nephrology. 2013; doi: /2013/ Bianca G., Raluca F., Veres M., Orlandea M., Badea J., Hlavathy K., Cioc A.: Plasma neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL) early biomarker for acute kidney injury in critically ill patients. J Crit Care Med. 2015; 1: , doi: /jccm Hjortrup P.B., Haase N., Wetterslev M., Perner A.: Clinical review: Predictive value of neutrophil gelatinase-associated lipocalin for acute kidney injury in intensive care patients. Critical Care 2013; 17: 211, doi: /cc11855.

87 24 Mateusz Sporek, Agnieszka Gala-Błądzińska, et al. 13. Martensson J., Bellomo R.: The rise and fall of NGAL in Acute Kidney Injury. Blood Purif. 2014; 37: , doi: / Banks P.A., Bollen T.L., Devernis C., Gooszen H.G., Johnson C.D., Sarr M.G., et al.: Classification of acute pancreatitis 2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 2013; 62: , doi: /gutjnl Kellum J.A., Lameire N., for the KDIGO AKI Guideline Work Group. Diagnosis, evaluation, and management of acute kidney injury: a KDIGO summary (Part 1). Crit Care. 2013; 17: 204, doi: / cc Tenner S., Baillie J., Vege S.S.: American College of Gastroenterology guideline: management of acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2013; 108: , doi: /ajg Wu B., Johannes R.S., Sun X., Conwell D.L., Banks P.A.: Early changes in blood urea nitrogen predict mortality in acute pancreatitis. Gastroenterology. 2009; 137: , doi: /j.gastro Pezzilli R.: How to evaluate the severity of acute pancreatitis: back to the past? JOP. 2012; 13: , PMID: Simoes M., Alves P., Esperto H., Canha C., Meira E., Ferreira E., et al.: Predicting acute pancreatitis severity: comparison of prognosis scores. Gastroenterol Res. 2011; 4: , doi: /gr364w. 20. Papachristou G.I., Muddana V., Yadav D., O Connell M., Sanders M.K., Slivka A., Whitcomb D.: Comparison of BISAP, Ranson s, APACHE II, and CSTI Scores in predicting organ failure, complications, and mortality in acute pancreatitis. Am J Gastroeneterol. 2009; 105: , doi: /ajg Yang C.J., Chen J.C., Phillips A.R.J., Windsor J.A., Petrov M.S.: Predictors of severe and critical acute pancreatitis: a systematic review. Dig Liver Dis. 2014; 46: , doi: 1016/j.dld Rupniewska-Ładyko A., Zielońska-Borkowska U.: Leczenie ciężkiej postaci ostrego zapalenia trzustki. Borgis. 2014; 8: Sarr M.G.: 2012 Revision of the Atlanta Classification of acute pancreatitis. Pol Arch Med Wewn. 2013; 123: , PMID: Tran D.D., Oe P.L., de Fijter C.W., van der Meulen J., Cuesta M.A.: Acute renal failure in patients with acute pancreatitis: prevalence, risk factors, and outcome. Nephrol Dial Transplant. 1993; 8: , PMID: Takase K., Takeyama Y., Nishikawa J., Ueda T., Hori Y., Yamamoto M., Kuroda Y.: Apoptotic cell death of renal tubules in experimental severe acute pancreatitis. Surgery. 1999; 125: , /S (99) Neyra J.A., Li X., Yessayan L., Adams-Huet B., Yee J., Toto R.D.: Acute Kidney Injury in Critical Illness Study Group. Dipstick albuminuria and acute kidney injury recovery in critically ill septic patients. Nephrology (Carlton). 2015, doi: /nep Soto K., Papoila A.L., Coelho S., Bennett M., Rodrigues M.Q., Fidalgo P., et al.: Plasma NGAL for the diagnosis of AKI in patients admitted from the emergency department setting. Clin J Am Soc Nephrol. 2013; 8: , doi: /CJN Wang Y., Lam K.S., Kraegen E.W., Sweeney G., Zhang J., Tso A.W., et al.: Lipocalin-2 is an inflammatory marker closely associated with obesity, insulin resistance, and hyperglycemia in humans. Clin Chem. 2007; 53: 34 41, doi: /clinchem Kaur S., Chakraborty S., Baine M.J., Mallya K., Smith L.M., Sasson A., et al.: Potentials of plasma NGAL and MIC-1 as biomarker(s) in the diagnosis of lethal pancreatic cancer. PLOS One. 2013; 8: e55171, doi: /journal.pone Cho H., Kim J.H.: Lipocalin-2 expressions correlate significantly with tumor differentiation in epithelial ovarian cancer. J Histochem Cytochem. 2009; 57: , doi: /jhc Bauer M., Eickhoff J.C., Gould M.N., Mundhenke C., Maass N., Friedl A.: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) is a predictor of poor prognosis in human primary breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2008; 108: , doi: /s

88 Urine NGAL is useful in the clinical evaluation of renal function Monisha J., Padmavathi G., Bordoloi D., Roy N.K., Kunnumakkara A.B.: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL): a promising biomarker for cancer diagnosis and a potential target for cancer therapeutics. J Cell Science Mol Biol. 2014; 1: Gala-Błądzińska A., Żyłka A., Rybak K., Dumnicka P., Kuźniewski M., Kuśnierz-Cabala B.: The use of a gelatinase-associated lipocalin neutrophils (NGAL) and calculation of an NGAL index to creatinine in urine as a predictor of early renal failure in patients with type 2 diabetes). Diag Lab. 2015; 51: 1 8.

89 8. Artykuł numer 5 Kuśnierz-Cabala B., Nowak E., Sporek M., Kowalik A., Kuźniewski M., Enguita F.J., Stępień E.: Serum levels of unique mir-551-5p and endothelial-specific mir-126a-5p allow discrimination of patients in the early phase of acute pancreatitis. Pancreatology. 2015; 15:

90 Pancreatology xxx (2015) 1e8 Contents lists available at ScienceDirect Pancreatology journal homepage: Original article Serum levels of unique mir-551-5p and endothelial-specific mir-126a-5p allow discrimination of patients in the early phase of acute pancreatitis Beata Kusnierz-Cabala a, Ewelina Nowak b, Mateusz Sporek c, d, Artur Kowalik b, Marek Kuzniewski e, Francisco J. Enguita f a, g, *,EwaStępien a Department of Clinical Biochemistry, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland b Department of Molecular Diagnostics, Holycross Cancer Center, Kielce, Poland c Department of Anatomy, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland d Surgery Department of the District Hospital in Sucha Beskidzka, Poland e Department of Nephrology, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland f Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal g Department of Medical Physics, M. Smoluchowski Institute of Physics, Jagiellonian University, Krakow, Poland article info abstract Article history: Available online xxx Keywords: Biomarkers microrna Acute pancreatitis Endothelial dysfunction Patient stratification Predictors Objectives: Vascular dysfunction is a severe complication which can cause organ ischemia and damage during acute pancreatitis (AP). Laboratory assessment of AP is based on several routine parameters and does not reflect endothelial dysfunction or organ injury. Recently, small noneprotein-coding RNAs (mirnas) have been introduced to laboratory diagnostics as new biomarkers or predictive parameters. Candidate mirnas (hsa-mir-16-5p, -103a-3p, p, p, -148a-5p, -216a-5p, -375, and -551b-5b) were selected to check their possible clinical application in stratification of patients with different AP severity. Methods: In this observational study, 62 patients with mild (MAP) and 26 with moderate and severe (SAP) acute pancreatitis were included. The control group consisted of 10 age and sex matched subjects. Circulating mirnas were analyzed in serum using a quantitative real-time PCR method (q-rt-pcr) by means of 3'-locked-nucleic-acid primers. Results: In SAP patients, a significant increase in most of the selected mirnas (mir-126-5p, -148a-3p, -216a-5p and -551b-5p, and mir-375) was observed when compared to control subjects. In MAP patients, three mirnas were significantly elevated: endothelial-specific mir-216a-5p, -551b-5p, as well as mir-375 that is highly abundant in pancreas. ROC analysis revealed that mir-126-p and mir-551b-5p can predict AP severity (AUC 0.748, sensitivity 60.0%, specificity 87.1%, p < 0.001) and (AUC 0.716; sensitivity 69.2%, specificity 72.6%, p < 0.001). mir-375 was not relevant (AUC 0.458; sensitivity 55.%, specificity 44.4%). Conclusions: A pancreatic mirna signature can be useful for assessment of pancreatic injury in the acute phase of AP. Endothelial dysfunction during AP is reflected by levels of specific circulating mirnas and may help in patient stratification. Copyright 2015, IAP and EPC. Published by Elsevier India, a division of Reed Elsevier India Pvt. Ltd. All rights reserved. Introduction The diagnosis of acute pancreatitis (AP) based on the revised Atlanta classification (2013) relies on typical signs and symptoms, an appropriate increase of pancreatic enzymes, and characteristic * Corresponding author. Department of Medical Physics, M. Smoluchowski Institute of Physics, Faculty of Physics, Astronomy and Applied Computer Science, Jagiellonian University, 11 Łojasiewicza St., Room D1.28, Krakow, Poland. Tel.: þ ; fax: þ address: e.stepien@uj.edu.pl (E. Stępien). findings on abdominal imaging (contrast-enhanced computed tomography, transabdominal ultrasonography, or magnetic resonance), and is clearly defined by the guidelines [1,2]. However, in some specific cases, including patients with infected necrosis (IN), these criteria should be considered carefully [3]. In contrast to diagnosing the disease, early differentiation between severe (SAP) and mild (MAP) form of AP remains challenging even for an experienced physician. Moreover, both forms of disease may be observed in patients with different etiology including heavy alcohol consumption or biliary etiology [4] /Copyright 2015, IAP and EPC. Published by Elsevier India, a division of Reed Elsevier India Pvt. Ltd. All rights reserved. Please cite this article in press as: Kusnierz-Cabala B, et al., Serum levels of unique mir-551-5p and endothelial-specific mir-126a-5p allow discrimination of patients in the early phase of acute pancreatitis, Pancreatology (2015),