OZNACZANIE AZOTU OGOLNEGO I TŁUSZCZU SUROWEGO. Oddział Pszczelnictwa IS WPROWADZENIE

Transkrypt

1 PSZCZELNCZE ZESZYTY NAUKOWE ROK XV GRUDZEŃ 1974 OZNACZANE AZOTU OGOLNEGO TŁUSZCZU SUROWEGO li-l?~,ll:z_ alt:. \"\l OBr--1 [ J Janina Muszyńska Oddział Pszczelnictwa S WPROWADZENE Jednym z kryteriów oceny jakości pszczół jest ich charakterystyka pod względem wielkości świeżej i suchej masy oraz zawartości azotu ogólnego i tłuszczu surowego. Świeża i sucha masa oznaczana jest wagowo, pierwsza bezpośrednio, druga po wysuszeniu pszczół do stałego ciężaru. Azot ogólny oznacza się za pomocą różnych modyfikacji metody Kieldahla. W ostatnich latach analizy pszczół wykonywał między innymi H a y d a k (1961), H e r- b e r t i współautorzy (1970), S t a n d i f e r i współautorzy (1973). Cytowane prace, podobnie jak inne opublikowane wcześniej, nie zawierają opisu metody oznaczania azotu. Również dotychczas nie została opracowana metoda standardowa, dostosowana do analiz azotu w pszczołach. Zawartość tłuszczu surowego oznacza się ekstrahując badany materiał w aparacie Soxhleta za pomocą rozpuszczalników tłuszczowych. Do często stosowanych rozpuszczalników należy między innymi eter naftowy, chloroform, metanol oraz mieszaniny ekstrakcyjne, zawierające chloroform i metanol (K a t e s 1972). Ekstrakcję tłuszczu surowego z pszczół przeprowadzał Woź n i c a (1967) eterem naftowym, a M u s z y ń s k a, K o n o p a c k a mieszaniną chloroform-metanol 2: 1. Autorzy szeregu publikacji z tego zakresu (2 e r e b k i n, S z a g u n 1969, C e r e d n i- k o v, M a r t y n u s z k i n a 1970, 2 e r e b k i n, Jak o v l i e v a 1970) nie podają nazwy używanego sołwerrtu. 175

2 Celem przedstawionych badań było; 1. dostosowanie do oznaczania azotu ogólnego w pszczołach mikrometody Kieldahla, opisanej przez M e j- b a u m - K a tz e 11e n b o g e n i M O C h n a c k a (1966) 2. określenie zależności pomiędzy wynikami ekstrakcji tłuszczu surowego z pszczół a stosowanym rozpuszczalnikiem. Ponadto chodziło o ustalenie optymallnej wielkości próbki, gdy tłuszcz ekstrahowany jest za pomocą mieszaniny chloroform-metanol w stosunku 2 : 1. MATERAŁ METODA Materiał do analiz azotu ogólnego i tłuszczu surowego stanowiły pszczoły robotnice, które po uśpieniu chloroformem pozbawiano przewodów pokarmowych i suszono do stałego ciężaru. Ze względu na analizy tłuszczu suszenie przeprowadzano w temperaturze 70 C pod próżnią 1 atmosfery. Zastosowanie próżni skracało ten proces z około 8 dni do około 1 doby. Po wysuszeniu pszczoły ucierano na proszek. Bezpośrednio przed przygotowaniem naważek materiał ponownie suszono w 70 C przez 1 godzinę. Analizy azotu wykonano w czterech próbach pszczół. Trzy próby wzięto do analiz wiosną, stanowiły one materiał do doświadczenia. Czwarta próba pobrana jesienią stanowiła materiał do doświadczenia. Tłuszcz oznaczano w trzech próbach pszczół. Metoda oznaczania azotu ogólnego. Azot oznaczano metodą opisaną przez M e j b a u m - K a t z e n e 11e n b o g e n i M o c h n a c k ą (1966), do której wprowadzono jedną zmianę: zamiast polecanej mieszaniny katalizującej proces spalania materiału, dodawano perhydrol. Wkraplano go w dwóch porcjach do wystudzonego roztworu, po raz pierwszy gdy roztwór stawał się klarowny, po raz drugi pod koniec spalania. Polecana przez autorkę mieszanina katalizująca nadaje każdej, nawet ślepej próbie odczynnikowej zielonkawe zabarwienie, utrudniające ustalenie końcowego momentu spalania. Naważki, do których dodawano perhydrol stają się po spaleniu bezbarwne, co łatwo ustalić. Po całkowitym odbarwieniu roztworu w kolbie spalenie kontynuowano jeszcze przez godzinę. Próbki analiz azotu przygotowywano w następujący sposób. Do kolb Kieldahla o pojemności 50 ml odważano po 50 mg utartych pszczół i dodawano 4 ml stężonego kwasu siarkowego (ilość kwasu dostosowano do ilości spalanego materiału zgodnie z zaleceniami Kir k a 1950). Spalanie rozpoczynano w kilkanaście godzin po dodaniu kwasu. Po zakończeniu spalania roztwory przenoszono ilościowo do kolb miarowych na 50 ml i dopełniano do tej objętości. Następnie z kolb pobiera n oodpowiednie objętości roztworów (tj. 5, 10, 20, 30 ml), w których oznaczano zawartość azotu. Analizy wykonywano w trzech powtórzeniach a uzyskane wyniki przeliczano na 100 mg suchej masy. 176

3 Metoda oznaczania tłuszczu surowego. Ekstrakcję tłuszczu prowadzono w aparacie Soxhleta o pojemności 250 m. Próbki do ekstrakcji tłuszczu przygotowywano następująco. Na odtłuszczone i zważone sączki o średnicy 7 cm odważano określoną ilość materiału. Następnie z sączków formowano pakiety, które umieszczano w aparacie Soxhleta. Jednorazowo w aparacie Soxhleta ekstrahowano nie więcej niż 1,5 g pszczół. Wpływ rozpuszczalnika na ilość wyesktrahowanego tłuszczu surowego oznaczano w naważkach zawierających 100 mg suchej masy. Stosowano następujące rozpuszczalniki: eter naftowy, chloroform-metanol 2 : 1, chloroform, metanol. W doświadczeniu, w którym oceniano wyniki ekstrakcji tłuszczu surowego mieszaniną chloroform-metanol 2 : 1 w naważkach różnej wielkości, pakiety zawierały po 25, 50, 100, 150 i 250 mg suchej masy. Dla statystycznego opracowania uzyskanych wyników została wykonana analiza zmienności (R u s z c z y c 1970). WYNK DYSKU~J A METODA OZNACZANA W PSZCZOŁACH AZOTU OGOLNEGO Mikrometoda Kieldahla należy do czułych. Wg M e j b a u m - K a- t z e e n b o g e n i M o c h n a c k a (1966) badana próbka powinna zawierać od 3 do 6 mg białka, co odpowiada ilości azotu od 0,5 do 1,0 mg. Przeprowadzone badania wykazały, że wymieniona metoda może być zastosowano do oznaczania azotu w pszczołach. Stwierdzono, że 10 mg suchej masy utartych pszczół zawiera (zależnie od ich wieku) od 0,6 do 1,0 mg azotu, a więc optymalną ilość azotu przewidywaną dla metody. Tabela Zawartość azotu wykrywanego w pszczołach w zależności od wielkości naważki Amount of nitrogen detected in weighed portions of various size Wielkość naważki w rng Size ofweighed portions in mg Mg azotu w 100 mg suchej masy Mg of nitrogen in 100 mg of dry matter Doświadczenie Doświadczeniel Experiment Experiment lo 5 8,42 a 8,68 b 8,87 c 10,07 b 10,59 c, 10,55 c Uwaga: Te same lilery obok liczb oznaczają, że liczby należą do jednej klasy wielkości i nie różnią się między sobą istotnie" Note: Means folowed by the same letter are not significantly diłferent Pszczelnicze Zeszyty Naukowe t. XV 177

4 Analizy azotu w pszczołach powinny być zatem przeprowadzane w dziesięcio-miligramowych próbkach. Badania wykazały, że (tab. 1) oznaczenia mogą być również wykonywane w próbkach zawierających 5 mg suchej masy. Wyniki analiz uzyskane dla obu wielkości próbek i przeliczone na 100 mg suchej masy nie różnią się istotnie. Nie należy natomiast stosować próbek większych niż 10 mg, ponieważ w tym przypadku stwierdzone różnice (chociaż nie przekraczające 5%) okazały się statystycznie udowodnione. Naważanie 10 miligramowych próbek pszczół jest obarczone dużym błędem ważenia. Należy raczej naważać i spalać większe ilości materiału (50 mg suchej masy), a następnie po spaleniu z przygotowanego roztworu pobierać objętość odpowiadającą 10 mg suchej masy. Ze względów technicznych wydaje się korzystne oznaczanie azotu w 10 ml oraz destylacja amoniaku do 50 ml kolb erlenmajera, które w chwili zakończenia destylacji powinny zawierać około 35 ml roztworu. Tabela 2 Wyniki ekstrakcji tłuszczu surowego z pszczół w zależności od użytego rozpuszczalnika Amount of crude fat extracted from the bees as affected by the used solvent Rozpuszczalnik Solvent Ze 100 mg suchej masy tłuszcz w mg From 100 mg of dry matter crude fat in mg eter naftowy petroleum benzin chloroform-metanol 2: 1 chloroform-methanol 2: 1 chloroform metanol met hano 10,1 13,4 4,1 31,0 OZNACZANE ZAWARTOŚC TŁUSZCZU SUROWEGO W PSZCZOŁACH Wyniki ekstrakcji tłuszczu surowego z pszczół a stosowany rozpuszczalnik. Stwierdzono istotny wpływ rozpuszczalnika na ilość wyekstrahowanego z pszczół tłuszczu surowego (tab. 2). Najmniejsza ilość tłuszczu wynosiła 4,1 mg (chloroform), największa 31 mg (metanol). Eter naftowy (10,1 mg) oraz mieszanina chloroform-metanol (13,4 mg) dały wyniki zbliżone do siebie. Na tej podstawie można sądzić, że uzyskana przez poszczególnych autorów różna zawartość tłuszczu surowego w pszczołach może wynikać ze stosowania przez nich różnych rozpuszczalników, 178

5 o czym nie piszą. Jednakże nawet otrzymanie zgodnych wyników, gdy ekstrakcja przeprowadzana jest za pomocą odmiennych rozpuszczalników, nie oznacza, że skład wyekstrahowanych związków jest taki sam. Szczegółowe porównanie wyników wymagałoby przeprowadzenia identyfikacji wyekstrahowanego tłuszczu. Z tych względów dane cytowane przez poszczególnych autorów a dotyczące zawartości tłuszczu surowego w pszczołach są mniej porównywalne niż wyniki oznaczeń zawartości azotu ogólnego. Wielkość naważki przy oznaczeniach tłuszczu surowego mieszaniną chloroform-metanol 2: 1. Badania wykazały, że ilość tłuszczu surowego wyekstrahowanego z próbek różnej wielkości (od 25 do 250 mg) przeliczona na 100 mg suchej masy zależy od wielkości naważki (ryc. 1). Stwierdzono, że wyniki uzyskane dla naważek 100, 150 i 250 mg nie różnią się pomiędzy sobą istotnie. Zaznaczają się jednak różnice pomiędzy tymi wynikami a wynikami z naważek mniejszych (25 i 50 mg). Wykazano też różnice istotne pomiędzy wynikami, uzyskanymi przy ekstrakcji tłuszczu w naważkach 25 mg i 50 mg. Analizy tłuszczu surowego w pszczołach w sposób opisany powyżej powinny być wykonywane w próbach, zawierających co najmniej 100 mg suchej masy. y ~, ~5, " 4J, J' '1 ~ \ -- '. 30, as 2.0 ts D, ",._ Z5 "" Ryc. 1. lość tłuszczu surowego wyekstrahowanego z pszczół w zależności od wielkości naważki x - wielkość maważki, 'w mg suchej masy y - ilość wyekstrahowanego tłuszczu surowego, w mg na 100 mg suchej masy Effect of the size of wedghed portion Dn the amount of extraoted curde fat. x - si~ of,the weighed portion, D mg of dry matter y - mg of fat extracted from 100 mg of dry matter 12" 179

6 WNOSK Do oznaczania azotu ogólnego w pszczołach przydatna okazała się mikrometoda Kieldahla opisana przez M e j b a u m - K a t z e e n b o g e n i M o c h n a c k ą (1966). Analizy należy przeprowadzać w próbkach, zawierających 10 mg suchej masy. Jednakże dla uniknięcia błędu ważenia spalać należy naważki, zawierające 50 mg suchej masy. Przy oznaczeniach zawartości tłuszczu surowego pszczół, gdy ekstrakcja prowadzona jest mieszaniną chlorofrm-metanol w stosunku 2 : 1, badana próbka powinna zawierać nie mniej niż 100 mg suchej masy. Biorąc pod uwagę powyższe stwierdzenia oraz maksymalną efektywność pracy laboratoryjnej, badania pszczół na zawartość w nich azotu ogólnego i tłuszczu surowego należy przeprowadzać po ustaleniu zawartości świeżej i suchej masy. Dla wykonania wszystkich wymienionych analiz wystarczy próba zawierająca 60 pszczół robotnic, jako reprezentacyjna dla populacji wg Muszyńskiej, Konopackiej (1974). LTERATURA C e r e d n i k o v A. V., M a r t y n u s k i n a L. V. (1970) - K voprosu o fotoperiodyzmie. Pcelovodstvo 49(8) : H a y d a k M. H. (1961) - nfluence of storagę on nutritive value pollens for newly ernerged honeybees. Am. Bee. J. 101(1): H e r b e r t E. W., B i c k e y W. E., S h i m a n u k i H. (1970) - The brood rearing capability of caged bees fed dandelion and mixed pollen diets. J. econ. Ent. 63(1) : Kir k P. L. (1950) - Kieldahl method for total nitrogen. Anal. Chem. 22(2) : K a t e s M. (1972) - Techniques of ipidology. Amsterdam. North. Holland Publishing Cornpany, M u s z y ń s k a J., K o n o p a c k a Z. (1974) - Badania nad wielkością reprezentatywnej próby pszczół do analiz fizyko-chemicznych. Pszczelno Zesz. Nauk. 18: R u s z c z y c Z. (1970) - Metodyka doświadczeń zootechnicznych. Warszawa. PWRiL. S t a n d i f e r L. N., H a y d a k M. H., M i s J. P., L e v i n M. D. (1973) - Value of three protein rations in maintaining honeybee colomes in outdoor flight cages. J. apic. Res. 12(3) : S z a g u n Ja. L. (1969) - Cto charakterizujet zimostojkost pćel. Pcelovodstvo 48(12) : Woź n i c a J. (1967) - Badania wpływu stężenia sacharozy w roztworze użytym do jesiennego dokarmiania rodzin pszczelich na ilość zmagazynowanego przez nie pokarmu oraz stan pszczół i przebieg ich zimowli. Annales UMCS sectio E, 22(19) : Z e r e b k i n M. V., S z a g u n Ja. L. (1969) - Ftzjologićeskije ossobiennosti osiennych pćel. Pcelovodstvo 48(1) : Z e r e b k i n M. V., Jak o v e v a. N. (1970) - O rojevych pćelach. Pćelooodst.uo 49(3) :

7 OlPE)l.EJEHliE OE~ErO A30TA li CbPOrO EEJKA B ME)l.OHOCHOJA ląeje R. Mynrmrscxa Pe310Me MUKpOMeTO,!\ Kensnans onacaaasra Ma:li6aYMOM-Kau;eHerrrreH6oreHOM H Moxnauxoa (1966) nphmeheho K 0603Ha'leHHlO ofintero a30ta B rrrenax. Bsino ycranoaneno, 'lto nocne C03lKeHHJ 50 Mr cyxoro Be[(eCTBa, cnenyer npobo,!\hth ananas B npo6ax conepxaurax 5-10 Mr accnenye- Moro MaTepHarra. Tlpa 3KCTpanrpOBaHHlO csrporo lkbpa B 250 M' armapare COKCJeTa,CMeChlOXJOpO<popM-Me- TaHOJ2: 1, aaanaaapyesrsre npofisr rrsen.nojllkhbconepxars He MeHee 100 Mr cyxoro Be[(eCTBa. lpo6a conepzcantaa 60 nxen.noctato'lhajl,!\jjo603ha'rehhj li! oóuiero a30ta li! cupero lkhpa. DETERMNATON OF TOTAL NTROGEN AND CRUDE FAT CONTENT N THE HONEY BEES Janina Muszyńska Summary Micro-Kjeldahl method described by Mejbaum-Katzenellenbogen and Mochnacka (1966) was adjusted for nitrogen analysis in the honeybees. After digestion of 50 mg of dry matter. nitrogen should be analysed in weighed portions of mg. t was demonstrated that sampes for crude fat extraction in 250 ml Soxhlet apparatus using chloroform - methano 2: 1 should contain no less than 100 mg of dry matter. Sixty worker bees are sufficient for both nitrogen and crude fat analyses.