BIODEGRADACJA SZCZECINY W PROCESIE KOMPOSTOWANIA Z UDZIAŁEM SZCZEPIONEK DROBNOUSTROJÓW

Transkrypt

1 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Nauk o Żywności Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Anna Choińska BIODEGRADACJA SZCZECINY W PROCESIE KOMPOSTOWANIA Z UDZIAŁEM SZCZEPIONEK DROBNOUSTROJÓW Biodegradation of pig bristles in the composting process involving microbial inoculum Praca doktorska wykonana pod kierunkiem dr hab. Anny Rodziewicz, prof. nadzw. w Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Wrocław 2013

2 Serdeczne podziękowania kieruję do Pani Promotor dr hab. Anny Rodziewicz, prof. nadzw. za okazaną życzliwość, zaangażowanie i nieocenioną pomoc merytoryczną w trakcie realizacji niniejszej pracy

3 Spis treści 1. Streszczenie Wstęp Charakterystyka białek keratynowych Kompostowanie Szczepionki kompostowe Cel pracy Materiał i metody badań Materiał badawczy Składniki masy kompostowej Mikroorganizmy Metody badawcze Podłoża hodowlane Hodowle mikroorganizmów Szczepionki kompostowe Prowadzenie kompostowania Metody analityczne Omówienie wyników Badanie uzdolnień keratynolitycznych wyjściowych szczepów drobnoustrojów Interakcje między mikroorganizmami wybranymi do składu szczepionek Identyfikacja dwóch wybranych izolatów kompostowych Charakterystyka pozakomórkowych enzymów wydzielanych przez mikroorganizmy wytypowane jako składniki szczepionek Opracowanie utrwalonej formy szczepionki mikroorganizmów Kompostowanie szczeciny w skali laboratoryjnej Kompostowanie szczeciny w skali półtechnicznej Dojrzewanie kompostów na pryzmach Mineralizacja materii organicznej w kompostach Biologiczne testy dojrzałości i fitotoksyczności kompostów Dyskusja wyników Wnioski Spis literatury

4 Badania finansowane w ramach projektu badawczo rozwojowego przez NCBiR NR ,

5 Wykaz skrótów stosowanych w pracy C ALK - frakcja węgla organicznego rozpuszczalna w 0,1 molowym NaOH C BIT frakcja węgla organicznego bitumin C CEL - frakcja węgla celulozowego C k - frakcja węgla organicznego, wydzielona 5% kwasem siarkowym na gorąco C KF węgiel organiczny rdzeniowych kwasów fulwowych C KH węgiel organiczny rdzeniowych kwasów huminowych CMC - karboksymetyloceluloza C org węgiel organiczny C R - frakcja węgla resztkowego C w - frakcja węgla wodnorozpuszczalnego C/N stosunek zawartości węgla organicznego do azotu ogólnego DMSO dimetylosulfotlenek DNS kwas- 3,5 dinitrosalicylowy DTNB - kwas 5,5 dithio-bis-nitorbenzoesowy EDTA - ang. Ethylene Diamine Tetraacetic Acid / kwas etylenodiaminotetraoctowy GI ang. germination index / wskaźnik kiełkowania (germinacji) HR ang. humification ratio / wskaźnik humifikacji KA kompost kontrolny nieinokulowany, zawierający wyłącznie autochtoniczną mikroflorę KP - kompost kontrolny nieinokulowany, zawierający wyłącznie autochtoniczną mikroflorę stymulowaną dodatkiem pożywki MBA ang. Modifed Bennett s Agar, zmodyfikowany agar Bennett s NEM - N-etylowy imid kwasu maleinowego NH 4 /NO 3 - stosunek zawartości azotu amonowego do azotanowego N og azot ogółem P KF - indeks kwasów fulwowych P KH - indeks kwasów huminowych PMSF - fluorek fenylo-metylo sulfonowy RRG - ang. relative root growth / wskaźnik relatywnego wzrostu korzenia RSG ang. relative seed germination / wskaźnik względnego kiełkowania nasion Sog siarka ogółem SZ1 szczepionka wieloorganizmowa: B. cereus B5e/sz, B. licheniformis KT20, S. violaceolatus KP2, T. atroviride KP1 SZ2 szczepionką wieloorganizmowa: B. cereus B5e/sz, B. subtilist16, B. subtilis P22, T. atroviride KP1 TCA - kwas trichlorooctowy TNB - kwas 5-thio-2-nitrobenzoesowy TNBS - 2,4,6- kwas trinitrobenzo-sulfonian TPF - trifenyloformazan TTC - 2,3,5- trifenylotetrazoliowy chlorek

6 Streszczenie 6 1. Streszczenie W pracy badano bioutylizację szczeciny świńskiej w procesie kompostowania przy udziale szczepionek keratynolitycznych mikroorganizmów. Materiał badawczy stanowiło siedemnaście szczepów, w tym bakterie, promieniowce, drożdże i grzyby strzępkowe wyizolowane ze składowiska odpadów keratynowych oraz pochodzące z kolekcji własnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności oraz Katedry Ochrony Roślin. Wstępnie przeprowadzono skrining izolatów pod kątem ich uzdolnień keratynolitycznych. Szczep bakterii Bacillus cereus B5e/sz wyróżniał się największą ilością uwalnianych keratynaz, których aktywność była na poziomie 59 jednostek. Z kolei testy biotyczne interakcji między badanymi szczepami, wykazały, że większość z nich przejawiała neutralne zależności międzygrupowe i międzygatunkowe. Na podstawie uzyskanych rezultatów wytypowano sześć szczepionek jednoorganizmowych oraz opracowano skład dwóch szczepionek czteroorganizmowych SZ1 i SZ2. W skład szczepionki SZ1 wchodziły dwa szczepy bakterii B. cereus B5e/sz i B. licheniformis KT20, jeden szczep promieniowca Streptomyces sp. KP2 oraz jeden szczep grzybów strzępkowych Trichoderma atroviride KP1. Szczepionka SZ2 składała się z trzech szczepów bakterii: B. cereus B5e/sz, Bacillus sp. T16, B. subtilis P22 oraz jednego szczepu grzybów strzępkowych T. atroviride KP1. Szczepy Bacillus sp. T16 i Streptomyces sp. KP2 poddano identyfikacji metodą sekwencjonowania genu kodującego 16S rrna i na podstawie otrzymanych wyników zakwalifikowano je do gatunków odpowiednio B. subtilis T16 i S. violaceolatus KP2. W dalszym etapie przeprowadzono szczegółową charakterystykę pozakomórkowych enzymów keratynolitycznych i proteolitycznych wybranych mikroorganizmów szczepionkowych. Uwalniane przez badane szczepy bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych enzymy proteolityczne w większości stanowiły mieszaninę proteaz serynowych, tiolowych oraz metaloproteaz. W płynach pohodowlanych wykazano także obecność innych enzymów hydrolitycznych takich jak: celulazy, ksylanazy, chitynazy i lipazy. Najwięcej ksylanaz i celulaz uwalniały promieniowce S. violaceolatus KP2, odpowiednio 0,83 i 1,32 jednostek. Równolegle testowano różne metody utrwalania biomasy mikroorganizmów. W przypadku bakterii najbardziej wydajną metodą okazała się być liofilizacja, a w przypadku promieniowców i grzybów strzępkowych suszenie biomasy w temperaturze 30 C wraz z pozostałością podłoża hodowlanego.

7 Streszczenie 7 Opracowane szczepionki jedno- i czteroorganizmowe zostały wykorzystane do kompostowania szczeciny w skali laboratoryjnej i półtechnicznej. Kompostowanie laboratoryjne prowadzono w kolbach Rouxa, gdzie dobierano skład i proporcje składników w masie kompostowej o wadze 170 g. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że najbardziej optymalny stosunek komponentów, w postaci szczeciny, trocin i pyłu węgla brunatnego wynosi odpowiednio 2:1:1. Uzyskane wyniki wykazały znacznie mniejszą efektywność poszczególnych monokultur w porównaniu ze szczepionkami kilkuskładnikowymi. W skali półtechnicznej kompostowano szczecinę natywną lub rozdrobnioną wraz z trocinami i pyłem węglowym o łącznej masie 60 kg w reaktorze mieszadłowym. Wstępne rozdrobnienie surowca przyspieszało proces jego biodegradacji. Po sześciu tygodniach kompostowania rozdrobnionej szczeciny z udziałem szczepionki czteroorganizmowej SZ1 ubytek suchej masy kompostowej wynosił 43,0% i był wyższy o 24,6% w stosunku do kompostu inokulowanego monokulturą B. cereus B5e/sz. W kolejnym etapie badań kompostowany materiał przenoszono na pryzmy, celem dalszego dojrzewania jego frakcji organicznej. Mineralizacja kompostów inokulowanych monokulturą lub szczepionkami czteroorganizmowymi była bardziej zaawansowana w porównaniu z kontrolą. Wartości indeksów dojrzałości kompostów inokulowanych szczepionkami SZ1 i SZ2 wskazywały na właściwy przebieg procesu, ponieważ mieściły się w zakresie następujących standardów dojrzałości: stosunek zawartości węgla organicznego do azotu ogólnego nie większy niż 10,0; stosunek zawartości azotu amonowego do azotanowego mniejszy od jedności; wskaźnik humifikacji większy od jedności a wskaźnik germinacji powyżej 100%. Również testy kiełkowania nasion rzeżuchy wykazały wyższą wartość nawozową i stymulacyjną badanych kompostów, w stosunku do kompostu inokulowanego monokulturą, kompostu kontrolnego, a także standardowego nawozu mineralnego. Wyniki uzyskane w pracy wskazują, że opracowane szczepionki keratynolitycznych drobnoustrojów wyraźne przyspieszały biodegradację szczeciny, a uzyskany produkt w postaci kompostu może znaleźć wykorzystanie w uprawie roślin i w ogrodnictwie.

8 Wstęp 8 2. Wstęp Nieustanny rozwój przemysłu wiąże się bezpośrednio ze wzrostem ilości wytwarzanych odpadów. Przemysł mięsny generuje ich rocznie 18 mln ton, które powinny być odpowiednio utylizowane, celem ochrony środowiska naturalnego przed skażeniem [Sobczak i Błyszczek 2009]. Szczecina jest odpadem szczególnie trudnym do zagospodarowania. Głównym składnikiem budulcowym szczeciny są białka włókienkowe z rodziny keratyn, które nadają jej wytrzymałość mechaniczną oraz odporność na działanie enzymów proteolitycznych pochodzenia zwierzęcego, czynników chemicznych i fizycznych. Z tego względu odpady keratynowe są trudnodegradowalne i uciążliwe dla środowiska [Choińska i wsp. 2012]. Ich spalanie, metanizacja w warunkach beztlenowych, czy składowanie nie są odpowiednimi rozwiązaniami ze względów ekonomicznych lub ekologicznych. Stąd wynika zapotrzebowanie na opracowanie alternatywnej metody recyklingu tej grupy odpadów. Pomimo swojej wysokiej oporności mogą być one efektywnie degradowane przez niektóre gatunki bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych, o uzdolnieniach proteolitycznych i keratynolitycznych [Gupta i Ramnani 2006]. Biologiczny rozkład szczeciny można przyspieszyć poddając ją kompostowaniu. Jest to obecnie preferowana metoda utylizacji odpadów zwierzęcych. Dzięki mikrobiologicznej konwersji zachodzącej w kontrolowanych warunkach można otrzymać czysty, bogaty w próchnicę i stosunkowo stabilny biologicznie produkt, który zawiera łatwo dostępne dla roślin substancje odżywcze, a tym samym może poprawić właściwości gleby [Korniłłowicz- Kowalska i Bohacz 2010]. Klasyczne kompostowanie zachodzi przy udziale autochtonicznej mikroflory, która jest niewystarczająca w przypadku opornych na biodegradację substancji jakimi są odpady keratynowe. Wymagane jest wówczas wspomaganie procesu szczepionką mikroorganizmów o uzdolnieniach keratynolitycznych [Rodziewicz i wsp. 2010]. Ponadto korzystne jest wydłużenie fazy termicznej kompostowania, w której zachodzą najbardziej intensywne przemiany materii organicznej, poprzez wprowadzenie termofilnych mikroorganizmów. W procesie tym ważną rolę odgrywają także mikroorganizmy wytwarzające pozakomórkowe enzymy hydrolityczne, zdolne do rozkładu innych, oprócz białek makrocząsteczek obecnych w środowisku kompostowym. Wzbogacenie mikroflory kompostu wyselekcjonowanymi szczepami drobnoustrojów umożliwia efektywne kompostowanie oraz korzystnie wpływa na przebieg całego procesu [Choińska i wsp. 2012].

9 Wstęp Charakterystyka białek keratynowych Keratyny (gr. kèras = róg) stanowią zróżnicowaną rodzinę białek włókienkowych o zwartej strukturze, stabilizowaną mostkami S-S cystyny. Mechaniczna stabilność keratyn i oporność na degradację uzależniona jest od stopnia upakowania łańcuchów białkowych i ilości mostków disiarczkowych sieciujących te struktury. Keratyny poza tym, że charakteryzują się wysoką odpornością na działanie czynników fizycznych, chemicznych i enzymatycznych, są wybitnie higroskopijne, ale nierozpuszczalne w wodzie. Wysoka zawartość cysteiny (7,8%) odróżnia keratyny od innych białek strukturalnych np. kolagenu czy elastyny. Keratyny charakteryzuje specyficzny skład aminokwasowy, w którym oprócz wysokiej zawartości cystyny, są znaczne ilości: glicyny, proliny, seryny i aminokwasów kwaśnych oraz niskie zawartości, lub brak: lizyny, histydyny, metioniny, tryptofanu [Rodziewicz i wsp. 2005, Korniłłowicz-Kowalska i Bohacz 2011]. Keratyny ze względu na budowę i występowanie są klasyfikowane jako białka heterogeniczne. Łańcuchy polipeptydowe w różnych typach keratyn mają w innych proporcjach konfigurację α-helisy i β-harmonijki. Keratyny piór ptasich mają w przewadze strukturę β, która jest łatwiej degradowana, natomiast w szczecinie i włosach przeważa bardziej stabilna struktura α. Białka te wyekstrahowane z włosów tworzą trzy duże grupy: α, β i γ-keratyny, przy czym trzecia grupa obejmuje niestrukturalne białka, o budowie amorficznej. W zależności od zawartości siarkowych aminokwasów keratyny podzielono na miękkie i twarde. Keratyny miękkie zawierają do 2% Cys, są więc słabo usieciowane i wykazują mniejszą oporność na czynniki chemiczne. Występują w zewnętrznej warstwie naskórka i w rdzeniu włosów [Rys. 1]. Natomiast keratyny twarde w sekwencji aminokwasowej mogą mieć od 10% do 22% Cys oraz w strukturze drugorzędowej przewagę konfiguracji alfa. Obecne są w miękkich i elastycznych wyrostkach skóry kręgowców jak: włosy, wełna oraz skóra (10-14%) a także twardych i sztywnych jak: paznokcie, pazury, rogi, kopyta (22%). Mają one zróżnicowaną strukturę morfologiczną i wykazują wyższą oporność na czynniki chemiczne [Korniłłowicz-Kowalska i Bohacz 2011, Hill i wsp. 2010, Fraser i Parry 2003, Filipello-Marchisio i wsp. 2000].

10 Wstęp 10 [ keratin-hair-treatment.wikispaces.com] Rys. 1. Przekrój poprzeczny włosa (z lewej) oraz zdjęcie mikroskopowe włókna szczeciny (z prawej) przy 400-krotnym powiększeniu całkowitym (badania własne) Białka keratynowe w komórce tzw. cytokeratyny typu I i II tworzą filamenty pośrednie (IF, ang. intermediate filaments), które są elementem cytoszkieletu. Budowa strukturalna cytokeratyn jest modelem wspólnym dla wszystkich IF, zlokalizowanych w różnych tkankach. Cząsteczki białek różnych typów IF mają konserwatywną domenę centralną w postaci helisy α, składającą się z reszt aminokwasowych. W sekwencji aminokwasów α-keratyny wykryto powtarzający się odcinek o długości siedmiu reszt. W domenie centralnej można wyróżnić cztery segmenty o stałej liczbie aminokwasów, przedzielone krótkimi, niehelisowymi łącznikami. Domeny N- i C-terminalne cytokeratyn liczą od 15 do 30 reszt o charakterze zasadowym. Wyodrębnia się wśród nich poddomeny: homologiczne, zmienne oraz końcowe, które odgrywają ważną rolę w montażu filamentów. Zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro pojedyncze łańcuchy kertatyny typu I i II o konformacji lewoskrętnej α-helisy spontanicznie asocjują w prawoskrętne dimery, a te poprzez tetramery, protofilamenty, protofibryle, do filamentów [Rys. 2]. Trzypoziomową strukturę filamentów dodatkowo utrzymują wiązania dwusiarczkowe cystyny [Foisner R. 2001, Rodziewicz i wsp. 2005]. Filamenty pośrednie epitelium stanowią ponad 85% wszystkich białek, które pełnią różne funkcje, polegające między innymi na wzmocnieniu struktury komórki, jej uorganizowaniu oraz nadawaniu kształtu. Pomimo bardzo wysokiej stabilności pierza i szczeciny, struktury keratynowe tych wyrostków nie kumulują się w środowisku, co sugeruje możliwość ich biologicznej degradacji. Jednak w niekontrolowanych warunkach mogą zasiedlać je dermatofity i inne patogeny. Mikroorganizmy saprofityczne: bakterie, promieniowce i grzyby strzępkowe

11 Wstęp 11 również mogą rozwijać się w tym środowisku, jednak proces spontaniczny jest długotrwały oraz może przebiegać w niewłaściwym kierunku [Onifade i wsp. 1998]. [ Rys. 2. Budowa filamentów pośrednich 2.2. Kompostowanie Przebieg procesu Ilość materii organicznej w większości gleb Polski jest niewystarczająca. Potencjalnym źródłem poprawy jej bilansu są m.in. komposty, a wykorzystanie w procesie kompostowania odpadów organicznych, rozwiązuje wiele problemów związanych z ich utylizacją [Ozimek i Kopeć 2012]. W przeciwieństwie do spalania, kompostowanie nie wymaga paliwa ani drogich urządzeń i nie wydzielają się w tym procesie szkodliwe substancje np. tlenki azotu, siarki i dioksyny [Oshima i Moriya 2008]. Proces kompostowania polega na tlenowym rozkładzie materii organicznej z udziałem bakterii, promieniowców, drożdży i grzybów strzępkowych. Zastosowanie kompostowania w celu utylizacji odpadów organicznych niesie z sobą wiele korzyści, do których można zaliczyć: recyrkulację znaczących ilości odpadów ulegających biodegradacji; produkt kompostowania może być wartościowym materiałem m.in. bazą substancji humusowych niezbędnych dla zapewnienia urodzajności gleb (w Polsce ok. 60% gleb ma niedomiar humusu) lub nawozem organicznym wykorzystywanym w uprawie roślin;

12 Wstęp 12 unieszkodliwianie odpadów pod względem sanitarno-epidemiologicznym; szacuje się, że wykorzystanie metod biologicznego przetwarzania może zmniejszyć o 30-50% strumień odpadów kierowanych na składowiska; kompostowanie jest akceptowalne pod względem ekonomicznym (zarówno z punktu widzenia kosztów inwestycyjnych jak i eksploatacyjnych) [Manczarski 2007, Choińska i wsp. 2011] Kompostowanie odpadów organicznych jest procesem, w którym zachodzi mineralizacja i częściowa humifikacja materii organicznej, prowadząca do stabilizacji produktu finalnego, wolnego od fitotoksyn i patogenów. Podczas pierwszej fazy procesu proste źródła węgla organicznego są metabolizowane i mineralizowane przez mikroorganizmy, produkujące CO 2, NH 3, H 2 S, H 2 O, kwasy organiczne i ciepło. Akumulacja ciepła powoduje wzrost temperatury pryzmy kompostowej [Bohacz i Korniłłowicz-Kowalska 2009]. Podczas rozkładu 1 kg odpadów nadających się do kompostowania (w fazie intensywnego kompostowania) wydziela się około 12 MJ ciepła [Scheffold 1993, Jędrczak i Haziak 2005]. Ciepło wydzielane podczas procesu kompostowania prowadzi nie tylko do higienizacji masy kompostowej, ale także do dezaktywacji enzymów wydzielanych przez mikroorganizmy. Może być to proces odwracalny lub mogą być one niszczone ostatecznie, w zależności od wysokości temperatury oraz czasu trwania ekspozycji [Jędrczak i Haziak 2005]. Dezaktywacja cieplna nie jest jednak jedynym czynnikiem unieszkodliwiającym mikroorganizmy chorobotwórcze w kompoście. Istotną rolę odgrywa również konkurencja z innymi mikroorganizmami, antagonistyczne zależności oraz antybiotyki i inhibitory wzrostu produkowane przez niektóre drobnoustroje [Haug 1980]. Czynnik temperaturowy odgrywa jednak kluczową rolę, ze względu na łatwość jego pomiaru i kontroli. Kompostowanie implikuje także redukcję objętości odpadów oraz niszczenie nasion chwastów [Bohacz i Korniłłowicz-Kowalska 2009]. Przebieg procesu kompostowania zdeterminowany jest chemicznym składem odpadów, ich wilgotnością, dostępnością tlenu i biochemiczną aktywnością mikroflory, zamieszkującej kompostowaną masę. Główną rolę w tym procesie odgrywają zewnątrzkomórkowe enzymy wydzielane przez drobnoustroje, w tym: proteazy, dehydrogenazy, fosfatazy, amidohydrolazy i ureazy. Specyficzną grupę stanowią, ściśle kooperujące ze sobą enzymy rozkładające odpady ligninocelulozowe. W wyniku ich działania celuloza, hemiceluloza i lignina przekształcana jest w związki humusowe, co ma znaczący wpływ na dojrzewanie kompostu [Bohacz i Korniłłowicz-Kowalska 2009]. Podczas gdy

13 Wstęp 13 proces ten zachodzi naturalnie w środowisku, wydajność jego przebiegu wymaga kontroli poszczególnych parametrów, żeby uniknąć odorów i uzyskać jakościowy, rolniczy produkt [Bernal i wsp. 2009]. Zanim kompost zostanie wykorzystany w celach rolniczych powinny być określone jego stabilność i dojrzałość. Te dwa terminy nie są synonimami. Stabilizacja określa stopień przekształcenia (utlenienia) substancji organicznych do form bardziej trwałych (tj. stabilnych) i odnosi się do odporności kompostu na dalszą degradację. Natomiast termin "dojrzałość" jest organiczno-chemicznym stanem kompostu, który wskazuje na obecność lub brak fitotoksycznych kwasów organicznych. Do podstawowych cech wartościowego kompostu można zaliczyć [Jędrczak i Haziak 2005]: - ciemny kolor i ziemisty zapach - powinien być materiałem jednorodnym, o jednolitej wielkości cząstek - wilgotność powinna mieścić się w zakresie od % - ph kompostu powinno mieścić się pomiędzy 6,0 i 7,8. - ilość substancji organicznych, wyrażona jako straty przy prażeniu, powinna być > 20 % s.m. - kompost nie powinien zawierać tworzyw sztucznych, metali i materiałów twardych, w tym szczególnie kawałków szkła - musi charakteryzować się niską zawartością metali ciężkich i toksycznych związków organicznych, niskim stężeniem soli rozpuszczalnych (przewodność właściwa mniejsza niż 25 ms/cm), brakiem czynników chorobotwórczych dla ludzi i zwierząt i nie powinien zawierać nasion chwastów Nie można uznać kompostu za stabilny i dojrzały na podstawie określenia jednego parametru. Z uwagi na to, że kompostowanie to tlenowy proces biodegradacji materiałów organicznych, uważa się dostępność tlenu za istotny parametr warunkujący utrzymanie odpowiedniej wilgotności materiału kompostowanego i jego temperatury. Właściwe warunki wilgotnościowe i temperaturowe umożliwiają rozwój mikroorganizmów, częściową degradację substratów masy kompostowanej oraz transformację materii organicznej w związki próchniczne [Ozimek i Kopeć 2012]. Większość kryteriów przyjmowanych przy ocenie dojrzałości kompostu opiera się na badaniu fizycznych i chemicznych parametrów materii organicznej, które odzwierciedlają aktywność metaboliczną mikroorganizmów zasiedlających kompost. Wśród nich można wymienić: temperaturę kompostu i jego zdolność do samonagrzewania, zużycie tlenu, testy fitotoksyczności, pojemność kationowymienną,

14 Wstęp 14 skład materii organicznej, zawartość składników odżywczych oraz stosunek C/N. Oprócz obniżenia temperatury, fizycznymi wskaźnikami dojrzałości kompostów jest także szereg innych czynników tj. jednolitość, ciemny kolor czy glebowy zapach kompostu [Iwegbue i wsp. 2006]. Ponadto aktywność mikrobiologiczna, aktywność oddechowa, potencjał nitryfikacyjny, aktywność enzymów i działalność drobnoustrojów mogą być również wykorzystane do oceny dojrzałości kompostu [Tiquia 2005] [Rys. 3]. Rys. 3. Wskaźniki stabilności i dojrzałości kompostu [Jędrczak i Haziak 2005] Wskaźniki dojrzałości kompostu Wskaźniki fizyczne Kluczowym czynnikiem w procesie kompostowania jest temperatura, która zmienia się w następstwie przemian metabolicznych drobnoustrojów. W związku z przebiegiem jej zmian wyróżnia się cztery podstawowe fazy kompostowania: mezofilną, termofilną, chłodzenia i dojrzewania [Rys. 4]. W pierwszej z nich masa kompostowa osiąga temperaturę C. Mikroorganizmy w pierwszej kolejności wykorzystują łatwo przyswajalne związki organiczne, co wiąże się z intensywnymi przemianami metabolicznymi i uwalnianiem ciepła. Faza termofilna następuje po przekroczeniu temperatury 45 C, podczas której powstaje masa próchnicza. Wysoka temperatura utrzymująca się przez kilka dni zapewnia unieszkodliwienie odpadów pod względem sanitarno-epidemiologicznym. Następuje szybki rozkład białek, lipidów i polisacharydów. W fazie tej dominują termofilne bakterie z rodzaju Bacillus.

15 Wstęp 15 W momencie wyczerpania składników odżywczych, temperatura obniża się do C i rozpoczyna się faza chłodzenia. Rozwijają się mikroorganizmy, które dzięki wytworzeniu form przetrwalnych, przeżyły wysoką temperaturę fazy termofilnej. Ostatnim etapem przemian jest dojrzewanie kompostu. Pozostałe trudnodostępne związki jak np. celuloza, hemiceluloza i ligniny, które biodegradacji ulegają w innych warunkach, rozkładane są za pomocą odpowiednich enzymów, wytwarzanych głównie przez promieniowce i grzyby strzępkowe. Liczebność grzybów wzrasta dopiero, gdy odczyn środowiska jest kwaśny a wilgotność oraz zawartość azotu jest mniejsza. Zwiększa się udział frakcji humusowej w kompoście. Duża liczebność promieniowców może wskazywać na dojrzałość kompostu. Faza kończy się, kiedy warunki w pryzmie są stabilne, czyli temperatura utrzymuje się na stałym poziomie poniżej 25 C, a odczyn środowiska jest bliski obojętnemu. Dojrzały kompost powinien zawierać ok. 60% humusu, który odgrywa bardzo ważną rolę w kształtowaniu właściwości gleb [Błaszczyk 2007, Choińska i wsp. 2011]. Rys. 4. Przebieg zmian temperatury i ph w poszczególnych fazach kompostowania [Jędrczak i Haziak 2005] Na początku, odpady organiczne miesza się ze składnikami wypełniającymi, które zwiększają przepływ tlenu w masie kompostowej. Do typowych wypełniaczy można zaliczyć trociny, korę oraz torf. Do kompostowania bardziej przydatne są odpady o mocnej strukturze, tworzące wolne przestrzenie zapewniające odpowiednie natlenienie, o wystarczającej wilgotności tj. od 50 do 60 % (np. odpady ogrodowe, odpady zielone). Odpady organiczne pozbawione struktury, o dużej zawartości wody (np. selektywnie zbierane bioodpady, trawy, osady ściekowe itp.) bardziej nadają się do procesu fermentacji, gdyż podczas ich

16 Wstęp 16 kompostowania istnieje niebezpieczeństwo kolmatacji i tworzenia się stref beztlenowych w pryzmach [Jędrczak i Haziak 2005]. Temperatura masy kompostowej określa szybkość procesów biologicznych, odgrywa selektywną rolę w sukcesji mikroorganizmów i związana jest z higienizacją szkodliwych drobnoustrojów. Zgodnie z regułami dotyczącymi bezpieczeństwa zdrowia, ze strony produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego, nieprzeznaczonych do spożycia przez ludzi, kompostowania musi być wyposażona w zamknięty reaktor kompostowy zaopatrzony w system monitoringu temperatury [Rainisalo i wsp. 2011]. Kompostowanie jest nieliniowym procesem skorelowanym z czasem, co odzwierciedla przebieg zmian temperatury w masie kompostowej. Dlatego Yu i wsp zaproponowali nieliniowy matematyczny model, jako podstawę statystycznych analiz tego zjawiska. Szeregi czasowe kompostowania wykazują podobieństwo do klasycznej krzywej wzrostu populacji bakterii [Rys. 5A i B]. Ze względu na to podobieństwo matematyczny opis wzrostu mikroorganizmów może stanowić odniesienie dla opracowania funkcji szeregów czasowych temperatury kompostowania. Proponowany model jest więc oparty na założeniu, że temperatura kompostu odpowiada produkcji ciepła, związanej ze wzrostem mikroorganizmów i prowadzonym przez nie rozkładem materii organicznej. Otrzymany model matematyczny może być dopasowany do każdego szeregu zmian temperatur [Rys. 5B]. A) B) Rys. 5. A) Typowa krzywa wzrostu mikroorganizmów; B) Schemat typowego szeregu temperatury kompostowania [Yu i wsp. 2007] Rozdrobnienie kompostowanego surowca sprzyja efektywności kompostowania. Wymiar cząstek, przy optymalnej ich wilgotności, powinien zapewniać objętość wolnych przestrzeni powietrznych w przedziale od 25 do 35 %. Dobre rozdrobnienie skutkuje większą jednorodnością mieszaniny i lepszą izolacją cieplną pryzmy, co pozwala utrzymywać wysoką

17 Wstęp 17 temperaturę w jej wnętrzu. Niemniej zbyt małe cząsteczki redukują objętość wolnych przestrzeni i tym samym dostępność tlenu. Optymalna wilgotność kompostowanej masy powinna wynosić od 50 do 55 %. Wilgotność wyższa niż 65 % ogranicza przepływ tlenu w warstwie odpadów i sprzyja tworzeniu się w jej wnętrzu stref beztlenowych. Jeżeli poziom wilgotności spadnie poniżej % składniki podłoża stają się trudniej dostępne dla mikroorganizmów, ich aktywność spada i proces kompostowania przebiega wolniej. Należy wspomnieć również, że w przypadku mechanicznego napowietrzania i przerzucania, zmniejsza się zawartość wody w kompostowanej masie [Bilitewski i wsp. 1994, Jędrczak i Haziak 2005]. Obracanie jest często wskazywanym czynnikiem wpływającym na przebieg procesu kompostowania. Jest to podstawowy mechanizm zapewniający odpowiednie napowietrzenie i kontrolujący temperaturę kompostowanej masy. Niewystarczająca ilość tlenu (<5% obj.) stwarza warunki rozwoju niekorzystnej mikroflory beztlenowej. Stężenie tlenu w powietrzu zawartym w porach powinno wahać się w granicach od 12 do 14 % (zakres idealny %) [Jędrczak i Haziak 2005]. Wskaźniki chemiczne Aktywności mikroorganizmów w kompoście sprzyja odczyn kompostu w zakresie ph Zwykle nie jest to kluczowy czynnik, ponieważ przeważnie kompostowane materiały mają ph mieszczące się w tym zakresie. Niemniej odczyn środowiska ma wpływ na kontrolę strat azotu, przez amonifikację, która zwiększa się wraz ze wzrostem wartości ph [Bernal i wsp. 2009]. Pojemność kationowymienna (CEC=cation exchange capacity) stanowi kolejny wskaźnik dojrzałości kompostu, wskazujący na jego zdolność do zatrzymywania substancji odżywczych. Określana jest przez ilość humusu obecnego w kompoście. Wraz ze wzrostem stopnia humifikacji zwiększa się stężenie grup alkilowych, aromatycznych, karboksylowych, fenolowych i karbonylowych. Grupy funkcyjne odpowiedzialne za CEC, to grupy fenolowe i karboksylowe. Wkład grup karboksylowych wynosi 55% a fenolowych 35%. Pojemność kationowymienna w materii organicznej rośnie jako funkcja humifikacji, spowodowana formacją obu grup [Iwegbue i wsp. 2006]. Szczególnie istotnym wskaźnikiem dojrzałości kompostu jest stosunek węgla do azotu (C/N), przyjmuje się, że wyjściowy stosunek C/N jest optymalny [Makan i Mountadar 2012]. Wysokie wartości C/N spowalniają przebieg procesu a zbyt niskie powodują straty azotu w postaci amoniaku bądź poprzez procesy ługowania. Niski stosunek

18 Wstęp 18 węgla do azotu może być korygowany przez dodatek odpowiednich substancji wypełniających, zwiększających zawartość węgla [Bernal i wsp. 2009]. Innym przykładem wskaźnika jest zawartość węgla wodnorozpuszczalnego (Cw). Ekstrakty wodne niedojrzałego kompostu zawierają cukry proste, hemicelulozy, substancje fenolowe, aminokwasy, peptydy i inne łatwodegradowalne substancje. W trakcie trwania procesu związki te są stopniowo metabolizowane przez mikroorganizmy. Dlatego parametr ten wskazuje na stopień stabilizacji masy kompostowej [Castaldi i wsp. 2005]. Całkowita zawartość rozpuszczalnego azotu maleje w trakcie kompostowania. Zmniejszający się poziom organicznego azotu obrazuje mineralizację. W czasie fazy termofilnej poziom azotu amonowego jest wysoki, wskazując na wysoki poziom degradacji organicznego azotu przez mikroorganizmy. Wysokie stężenie amoniaku podczas trwania procesu generuje odory. W miarę dojrzewania kompostu poziom amoniaku spada, a stężenie azotanów (V) rośnie [Iwegbue i wsp. 2006]. Kiedy w kompoście zmniejsza się stężenie NH 4, a wzrasta stężenie azotanów NO 3, wówczas kompost osiąga dojrzałość. Wysoka zawartość amoniaku wskazuje na niestabilność materii organicznej [Bernal i wsp. 1998]. Uwalnianie w kompostach związków organicznych zawierających siarkę jest istotne z punktu widzenia wzrostu roślin, gdyż jej niedobór powoduje zmniejszenie plonów, a także obniżenie wartości odżywczej uprawianych roślin [Bao i wsp. 2010]. Humifikacja jest kluczowym czynnikiem odpowiadającym za jakość kompostu z powodu znaczenia substancji humusowych dla ekologii gleby, plenności i korzystnego wpływu na wzrost roślin [Iqbal i wsp. 2012]. Najbardziej wiarygodne są te właściwości kompostu, które bazują na separacji frakcji huminowej i nie-huminowej (NH) (kwasy huminowe HA i kwasy fulwowe FA): HI (humification index = indeks humifikacji), HR (humification ratio = współczynnik humifikacji) i DH% (degree of humification = stopień humifikacji). TEC (total extractable carbon = całkowity ekstrahowalny węgiel), TOC (total organic carbon = całkowity węgiel organiczny) [Iwegbue i wsp. 2006]. Spadek zawartości kwasów fulwowych w czasie, jest związany z ich transformacją do kwasów huminowych [Iqbal i wsp. 2012]. Wiedza na temat biosyntezy i struktury kwasów huminowych nie jest do końca poznana. Jedna z klasycznych teorii głosi, że są formowane na drodze modyfikacji ligniny. Inna teoria, zgodna z powyższą, sugeruje, że kwasy huminowe pochodzą z chinonów, które z kolei są formowane z polifenoli albo produktów dekompozycji ligniny [Koivula i Hänninen 2001].

19 Wstęp 19 Bernal i wsp. [1997] wskazali w swojej pracy następujące wskaźniki dojrzałości kompostu: C/N<12, Cw<1,7%, C w /N org <0,55, NH 4 /NO 3 <0,16, NH 4 -N<0,04% i GI>50%. Dodatkowo wytypowali parametry opisujące mineralizację węgla, jako dodatkowe wskaźniki dojrzałości kompostu: zmineralizowany węgiel (Cm) Cm<30%, szybko mineralizujący węgiel (C R ) < 7,2% i wskaźnik mineralizacji (Cs x Ks) < 0,35% na dobę [Bernal i wsp. 1998]. Kompostowanie prowadzi także do zmian stężenia makro- i mikroelementów w masie kompostowej, co wpływa na dojrzałość kompostu i jego wartość nawozową [Iqbal i wsp. 2012] [Tab. 1]. Tab. 1. Pierwiastkowa analiza dojrzałego kompostu [Iqbal i wsp. 2012] Pierwiastki Metoda tlenowa Metoda mieszana Metoda beztlenowa Na [%] 2,13 1,72 0,91 K [%] 1,51 1,13 1,07 P [%] 0,72 0,55 0,23 Zn [mg/kg] 57,65 34,1 23,7 Mn [mg/kg] 41,7 37,4 19,76 Fe [mg/kg] 639,3 569,2 406,3 Wilgotność [%] 31,9 42,9 78,9 *Wyniki wyrażono jako średnią z 3 powtórzeń Główne mineralne składniki nawozowe N, P i K występują w nawozach organicznych zarówno w postaci związków nieorganicznych jak i w połączeniach organicznych. Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 czerwca 2008 r. [Dz. U. Nr 119 poz.765], nawozy organiczne w postaci stałej powinny zawierać co najmniej 30% substancji organicznej w przeliczeniu na suchą masę. W przypadku deklarowania w nich azotu, fosforu lub potasu albo ich sumy zawartość poszczególnych składników nie może być mniejsza niż wartości podane w tabeli [Choińska i wsp. 2011] [Tab. 2]. Obecność w glebach większości metali ciężkich (tj., B, Zn, Cu i Ni), w małych ilościach, jest niezbędna dla prawidłowego wzrostu roślin. Jednak, w wyższych stężeniach mogą one działać hamująco na ich wzrost.

20 Wstęp 20 Tab. 2. Ocena wartości nawozowej kompostów keratynowych uzyskanych z udziałem szczepionek mikroorganizmów oraz kompostów niezaszczepianych C/N azot og. fosfor potas % (m/m) Nawóz organiczny <10 0,3 0,2 0,2 Niepożądane są również podwyższone ilości innych pierwiastków śladowych w glebach (tj.: As, Cd, Pb i Hg), głównie z powodu ich szkodliwego oddziaływania na organizmy glebowe oraz zwierzęta i ludzi, którzy mogą spożywać zanieczyszczone rośliny lub mieć kontakt z glebą. Metale ciężkie obecne w odpadach pochodzą zwykle ze źródeł antropogenicznych. Zgodnie z rozporządzeniem Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 19 października 2004 r. [Dz.U. Nr 236 poz. 2369], w sprawie wykonania niektórych przepisów ustawy o nawozach i nawożeniu dopuszczalne wartości zanieczyszczeń metalami ciężkimi w nawozach organicznych oraz organiczno-mineralnych (w mg na kg suchej masy nawozu) wynoszą: chrom (100), cynk (1500), kadm (3), miedź (400), nikiel (30), ołów (100), rtęć (2). Ponadto w nawozach nie mogą występować żywe jaja pasożytów jelitowych Ascaris sp., Trichuris sp., Toxocara sp. oraz bakterie z rodzaju Salmonella. W przypadku nawozów organicznych wytworzonych z surowców lub produktów będących ubocznymi produktami zwierzęcymi lub zawierających je w swoim składzie liczba bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, określona na podstawie liczby bakterii tlenowych, powinna wynosić mniej niż 1000 jednostek tworzących kolonie (jtk) na gram nawozu [Jędrczak i Haziak 2005]. Wskaźniki biologiczne Testy roślinne są prawdopodobnie jednymi z najodpowiedniejszych badań, wskazujących na stopień dojrzałości kompostu, ponieważ określają kiedy kompost może być wykorzystany, nie powodując efektu fitotoksycznego. Są one przeprowadzane w formie testów kiełkowania roślin (GI = germination index) i ich wzrostu [Iwegbue i wsp. 2006]. Fitotoksyczność jest jednym z najważniejszych kryteriów oceny przydatności materiałów organicznych do celów rolniczych. Ponadto jest to cenny wskaźnik dekompozycji i stabilizacji materii organicznej oraz efektywności kompostowania. Związany jest on z obecnością różnych związków zawartych w materii organicznej tj. fenole, kwasy organiczne amoniak czy metale ciężkie. Wskaźnik kiełkowania nasion (GI = ang. germination index), który łączy pomiar względnego kiełkowania nasion i względnego wydłużenia nasion np. rzeżuchy (Lepidium sativum L.) jest powszechnie używany zarówno do oceny

21 Wstęp 21 fitotoksyczności jak i dojrzałości kompostu [Alburquerque i wsp. 2006, Bernal i wsp. 1998, Hoekstra i wsp. 2002]. Techniki i systemy kompostowania Proces kompostowania odbywa się z zastosowaniem odpowiednich technik i systemów, które odnoszą się do rodzajów kompostowanych materiałów. Kompostowanie trudno degradowalnych odpadów białkowych tj. pierze i szczecina można prowadzić np. metodą statyczną na pryzmie okresowo przerzucanej lub w specjalnych reaktorach obrotowych [Tab. 3, Rys. 6A i B]. Można wyróżnić trzy podstawowe systemy kompostowania: statyczne, quasi-dynamiczne i dynamiczne. Pierwszy z wymienionych może być prowadzony w pryzmach, komorach lub kontenerach, a także z wykorzystaniem metody mat i technologii Brikollare. Systemy quasi-dynamiczne dotyczą pryzm przerzucanych, a także systemów rzędowych i tunelowych. Natomiast systemy dynamiczne wymagają zastosowania specjalnych bębnów lub wież kompostowniczych [Jędrczak i Haziak 2005]. Dynamiczne reaktory [Rys. 6B] mieszane wymagają większych nakładów finansowych, jednak zapewniają kompostowanej masie lepsze napowietrzenie, a tym samym przyspieszają proces, zwiększając jego efektywność. Napowietrzanie bierne np. w systemie pryzmowym, wymaga mniejszego nakładu pracy, jednak czas trwania procesu zazwyczaj ulega wydłużeniu. Dojrzewanie kompostu, w większości technologii, odbywa się w pryzmach trójkątnych lub trapezowych, z wymuszonym napowietrzaniem lub przerzucanych. Systemy kompostowania można także podzielić na zamknięte, prowadzone w reaktorze i otwarte, prowadzone poza nim [Iqbal i wsp. 2012, Jędrczak i Haziak 2005] [Tab. 4]. Oprócz systemu czy technologii kompostowania, istotne znaczenie odgrywa również skala prowadzenia procesu. W eksperymentach prowadzonych w skali laboratoryjnej (0,4-50L) i pilotażowej ( L) znaczna kontrola warunków procesu nie oddaje jego rzeczywistego przebiegu w skali przemysłowej (>2000L). W kompostach transport ciepła i przepływ cieczy ma kluczowe znaczenie. Istotne jest aby prowadzenie procesu w mniejszej skali dobrze odzwierciedlało jego przebieg w większej skali. W tym celu można zastosować odpowiednie techniki, umożliwiające wiarygodne jej przeniesienie. Nadrzędne znaczenie mają termodynamiczne czynniki, wpływające na generowanie i transfer ciepła, ze względu na ich wpływ na biologiczną aktywność kompostu, wilgotność, transport pary wodnej,

22 Wstęp 22 dostępność tlenu, uwalnianie lotnych związków, wentylację i rozkład temperatury. W literaturze można znaleźć różne projekty i sposoby eksploatacji reaktorów kompostowych. Tab. 3. Format reaktorów kompostowych i ich definicje [Mason i Milke 2005] Format Reaktor z ustaloną temperaturą (Fixed temperature FT) Reaktor samonagrzewający (Self-heating SH) Reaktor z kontrolowaną teperaturą (controlled temperature difference CTD) Reaktor z kontrolowanym strumieniem ciepła (controlled heat flux CHF) Definicja Reaktor, w którym żądana temperatura kompostowania zadawana jest i utrzymywana za pomocą zewnętrznego ogrzewania lub chłodzenia Reaktor ten opiera się wyłącznie na produkcji ciepła mikrobiologicznego, pozwalającego na osiągnięcie i utrzymanie temperatury procesu. Nie jest wyposażony w system kontroli temperatury, posiada jedynie zewnętrzną izolację Reaktor ten opiera się wyłącznie na produkcji ciepła mikrobiologicznego, pozwalającego na osiągnięcie i utrzymanie temperatury procesu. Straty ciepła są kontrolowane przez dostarczanie ciepła do zewnętrznej powierzchni zbiornika, w celu utrzymania wcześniej ustalonej różnicy temperatur kompostowanego materiału i / lub ściany reaktora (ów) Reaktor ten opiera się wyłącznie na produkcji ciepła mikrobiologicznego, pozwalającego na osiągnięcie i utrzymanie temperatury procesu, w którym straty ciepła kontrolowane są przez dostarczanie ciepła do zewnętrznej powierzchni zbiornika, w celu utrzymania wstępnie określonego strumienia ciepła przez ściany reaktora Rys. 6. A) Reaktor statyczny [Rodziewicz i wsp. 2009a]; B) Reaktor dynamiczny [Rodziewicz i wsp. 2009b]

23 Wstęp 23 Tab. 4. Otwarte i zamknięte systemy kompostowania [Jędrczak i Haziak 2005] Systemy niereaktorowe (otwarte) Systemy reaktorowe (zamknięte) bez przemieszczania z przemieszczaniem reaktory o reaktory o przepływie odpadów w złożu odpadów w złożu przepływie poziomym (bębny i pionowym (wieże) zbiorniki) -kompostowanie w -kompostowanie w pryzmach -kompostowanie w -skrzyniowe pryzmach statycznych przerzucanych wieżach z piętrami -kompostowanie -kompostowanie w -kompostowanie w pryzmach -kompostowanie w tunelowe pryzmach z przerzucanych z wieżach bez pięter -kompostowanie napowietrzaniem napowietrzaniem komorowe i kontenerowe -kompostowanie w -kompostowanie technologii Brikollare bębnowe Inne metody utylizacji i zagospodarowania odpadów keratynowych Jest wiele metod termicznych, chemicznych i enzymatycznych, umożliwiających przetwarzanie odpadów keratynowych. W związku z wysoką zawartością białka, odpady pierza do 2000 r. były wykorzystywane do produkcji pasz dla zwierząt. W Polsce popularną metodą przekształcania odpadów keratynowych w pasze była termohydroliza. Mączka z pierza przeważnie była wykorzystywana w paszach przeznaczonych dla drobiu i trzody chlewnej. Charakteryzowała się ona wysoką zawartością azotu białkowego, tłuszczy i substancji mineralnych, niemniej była deficytowa w lizynę, metioninę i histydynę [Korniłłowicz-Kowalska i Bohacz 2011]. Kwasowa lub zasadowa hydroliza stanowi kolejną metodę rozpuszczania keratyny i uwalniania siarkowych aminokwasów do celów dietetycznych dla zwierząt. Fizykochemiczna metoda, polegająca na podgrzewaniu materiału keratynowego z organicznymi rozpuszczalnikami tj. dimetylosulfotlenkiem (DMSO) była także wykorzystywana do produkcji hydrolizatów keratynowych, przeznaczonych do karmienia zwierząt. W procesie przetwarzania pierza i szczeciny, wykorzystywana była także amonoliza. Uzyskany w ten sposób keratyno-mocznikowy granulat, rekomendowano jako suplement w żywieniu przeżuwaczy. Wszystkie te fizyczne i chemiczne metody wymagają dużych nakładów kosztów. Niska dostępność aminokwasów zawartych w keratynie oraz wysokie koszty jej przetwarzania skłaniają do większego zainteresowania metodami mikrobiologicznymi. Vasileva-Tonkowa i wsp. [2009] w swoich badaniach wykazali, że hydrolizaty keratyny piór otrzymane w mieszanej hodowli promieniowców z rodzaju Thermoactinomyces, po 72h były bogate w rozpuszczalne białka i aminokwasy, włączając

24 Wstęp 24 lizynę, treoninę, leucynę, izoleucynę i walinę oraz w mniejszych ilościach prolinę i serynę. Autorzy stwierdzili, że otrzymany hydrolizat może znaleźć zastosowanie do przygotowania nawozów, dodatków do gleby jak i pasz dla zwierząt. Jednak wykorzystywanie mączek paszowych z przetworzonych produktów zwierzęcych, włączając mączkę z piór, zostało zabronione w krajach UE od stycznia 2000 r. Zakaz ma na celu stworzenie skutecznego systemu ochrony ludzkiego zdrowia przed patogenicznymi mikroorganizmami pochodzenia zwierzęcego. Normy zabraniające przetwarzania natywnej keratyny w pasze dla zwierząt skłaniają do poszukiwania innych, alternatywnych metod jej zagospodarowania [Korniłłowicz-Kowalska i Bohacz 2011] Szczepionki kompostowe Mikroorganizmy Szczepionki stosowane do inokulacji kompostów powinny zawierać mikroorganizmy wykazujące uzdolnienia w kierunku degradacji poszczególnych składników zawartych w masie kompostowej. Odpady keratynowe, takie jak szczecina czy pierze, w warunkach naturalnych rozkładane są przez specyficzne proteazy, hydrolizujące keratynę (keratynazy). Enzymy te są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie i uwalniane przez kompendium mikroorganizmów, w tym: bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych, izolowanych głównie z odpadów keratynowych [Gupta i Ramnani 2006]. Bakterie z rodzaju Bacillus są znanymi producentami enzymów proteolitycznych, w tym keratynaz [Kim i wsp. 2001, Suntornsuk i Suntornsuk 2003, Gessesse i wsp. 2003, Park i Son 2009]. Wydzielają pozakomórkowe enzymy, należące do alkalicznych proteaz serynowych oraz cysteinowych, których optymalna temperatura działania mieści się w przedziale C. Wśród nich można wyróżnić gatunek B. cereus, mezofilne, względnie beztlenowe przetrwalnikujące laseczki, szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Występują w żywności, glebie i roślinach, a ich zdolność do wywoływania chorób przenoszonych przez żywność i oportunistycznych infekcji jest zróżnicowana w obrębie poszczególnych szczepów. Interesujący jest fakt, że spektrum potencjalnej toksyczności tego gatunku waha się od probiotyków dla ludzi po toksyczne szczepy, zatruwające żywność [Cadot i wsp. 2010]. Rodziewicz i Łaba [2008] opisują w swojej publikacji uzdolnienia keratynolityczne gatunku B. cereus w warunkach hodowli wstrząsanej i w kompoście. W obu przypadkach, inokulacja spowodowała zwiększenie efektywności rozkładu keratyny.

25 Wstęp 25 Niektóre gatunki bakterii z rodzaju Bacillus zdolne są do tworzenia biofilmów [Rys. 7 A i B]. Przykład może stanowić wytwarzający keratynazy szczep B. subtilis B3, opisany w pracy Rodziewicz i wsp. [2006]. Autorzy pracy stwierdzili, że mikroorganizmy saprofityczne intensywniej degradują keratynę w warunkach tworzenia biofilmu, co czyni keratynolizę bardziej efektywną. Z kolei termotolerancyjne mikroorganizmy keratynolityczne tj. bakterie z gatunku B. licheniformis należą do mezofili, które zdolne są do adaptacji do życia w wyższej temperaturze otoczenia. Potrafią rosnąć i wytwarzać termotolerancyjne produkty. Gatunek ten opisali w swojej pracy Suntornsuk i wsp. [2005]. B. licheniformis hydrolizował keratynę z aktywnością względną na poziomie 3-35%. Bakterie zdolne do pozyskiwania składników odżywczych z keratyny obejmują również keratynolityczne szczepy: Vibrio spp. [Grazziotin i wsp. 2006], Kocuria rosea [Bertsch i Coello 2005], Serratia sp. [Khardenavis i wsp. 2009], Lysobacter, Nesternokia, Microbacterium, Xanthomonas, Stenotrophomonas i Chrysobacterium [Sangali i Brandelli 2000, De Toni i wsp. 2002, Yamamura i wsp. 2002a, Lucas i wsp. 2003]. Przedstawicielami bakterii beztlenowych degradujących keratynę są termofilne, beztlenowe pałeczki z rodziny Thermotogales: Fervidobacterium pennavorans oraz F. islandicum AW-1. Bakterie te produkują termostabilną serynową keratynazę nazwaną ferwidolizyną, o wyjątkowo wysokiej masie cząsteczkowej, wynoszącej 130 kda. Ten zasocjowany ze ścianą komórkową enzym w ciągu 48h całkowicie rozkładał keratynę piór. W przeprowadzonej analizie kompletnej sekwencji genu fls, odpowiedzialnego za syntezę keratynazy, wykazano wysoką jego homologię z rodziną subtilizyn [Rodziewicz i Łabab2006, Nam i wsp. 2002]. Bardzo ważną grupę drobnoustrojów keratynolitycznych stanowią mezofilne i termofilne promieniowce [Rys. 7C]. Produkują one liczne enzymy odgrywające kluczową rolę w rozkładzie keratynowego substratu, ale także antybiotyki oraz różne cenne metabolity [Vasileva-Tonkova i wsp. 2009, Syed i wsp. 2009, Albrecht i wsp. 2010, Mohamedin 1999]. Li i wsp. [2007] opisali w swojej pracy badawczej szczep S. fradiae var. K11, który wykazywał duże uzdolnienia hydrolityczne w stosunku do substratów keratynowych tj. pierze czy włosy ludzkie. Promieniowce z rodzaju Streptomyces, wytwarzają również enzymy proteolityczne np. pronazę, która w formie oczyszczonej dostępna jest komercyjne. Większość keratynolitycznych grzybów strzępkowych należy do grupy grzybów niedoskonałych, włączając następujące rodzaje: Chrysosporium, Aspergillus, Alternaria, Trichurus, Curvularia, Cladosporium, Fusarium, Geomyces, Gleomastis, Monodictys,

26 Wstęp 26 Microsporum, Myrothecium, Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium, Doratomyces. Nie prezentują one jednak dużej wartości komercyjnej, ponieważ większość z nich zaliczana jest do dermatofitów [Gradisar i wsp. 2000, Raju i wsp. 2007, Santos i wsp. 1996, Farag i Hassan 2004, Gupta i Ramnani 2006]. Wśród przedstawicieli grzybów strzępkowych na uwagę zasługują grzyby z rodzaju Trichoderma, które nie są patogenne i wykazują duże uzdolnienia keratynolityczne w tym gatunki T. harzianum i T. atrovride [Ismail i wsp. 2012, Cao i wsp. 2008]. Oprócz mikroorganizmów, enzymy hydrolizujące keratynę uwalniane są także przez przedstawicieli mikrofauny tj. owady. Przykład mogą stanowić larwy mola włosieniczki (Tineola bisselliella), które zdolne są do wykorzystywania keratyny jako jedynego źródła C, N, S i energii [Korniłłowicz-Kowalska i Bohacz 2011]. (A) (B) Rys. 7. Drobnoustroje tworzące biofilm na powierzchni kompostowanej szczeciny: ziarniaki (A) i laseczki (B) oraz obraz mikroskopowy brzegu kolonii promieniowców z rodzaju Streptomyces (C) obserwowany przy 100-krotnym powiększeniu całkowitym (badania własne) (C) Interakcje Wzajemne oddziaływania pomiędzy drobnoustrojami stanowią jedno z podstawowych kryteriów przy komponowaniu składu szczepionki do kompostowania odpadów keratynowych, w której szczególnie niepożądane są interakcje antagonistyczne.

27 Wstęp 27 Szczepionki dwu-szczepowe można znaleźć wyłącznie w laboratorium, gdyż w realnych warunkach mikroorganizmy rzadko oddziałują na siebie w parach. W wielorodzajowych, wielogatunkowych czy wieloszczepowych społecznościach trudno zidentyfikować typ interakcji między populacjami A i B, ponieważ efekt tych interakcji może zależeć od interakcji obu wspomnianych populacji z populacjami C, D i E. W naturalnych społecznościach występuje potencjalnie duża liczba sprzężeń zwrotnych, które są bardzo trudne w badaniach eksperymentalnych. Różnorodność środowiska, poza pozostałymi czynnikami, może sprzyjać ochronie słabszego konkurenta, prowadząc do stabilnej koegzystencji obu konkurentów i ich współwystępowania w jednym czasie i przestrzeni. Przykładem takich oddziaływań są osady morskie, które stanowią niejednolite chemicznie środowisko. W związku z tym warstwa, w której można by oczekiwać dominacji bakterii redukujących siarkę jest w praktyce mozaiką mikrośrodowisk [Mohammadi i wsp. 2011]. Ciekawe wyniki otrzymali Lemunier i wsp. [2005], którzy badali możliwość ponownej inwazji patogenów w dojrzałym kompoście przez gatunki L. monocytogenes, E. coli i Salmonella serovar Enteritidis. Podczas gdy gatunek L. monocytogenes nie został wykryty w kompoście, czas przeżycia szczepu Salmonella serovar Enteritidis był bardzo krótki w próbkach kompostów pobranych w fazie termofilnej, ale dłuższy (3 miesiące) gdy zaszczepiano nimi dojrzały kompost. Za to wszystkie trzy patogeny proliferowały po inokulacji w sterylnym kompoście. Wynik ten ukazuje znaczenie populacji mikroorganizmów kompostowych w przeciwdziałaniu ponownej kolonizacji przez patogeny. Dodatek antagonistycznej mikroflory stanowi środek hamujący rozwój niepożądanych drobnoustrojów. Enzymy Proteazy i keratynazy Keratynazy stały się biotechnologicznie ważne odkąd odkryto, że hydrolizują twarde, silnie usieciowane łańcuchy polipeptydowe keratyny, odporne na powszechnie znane enzymy proteolityczne tj. trypsyna, pepsyna i papaina. Enzymy te są indukcyjne gdyż produkowane są głównie w obecności substratów keratynowych w postaci m.in. włosów, piór, wełny, paznokci i rogów [Wang i wsp. 2003]. Większość badań nad degradacją keratyny wykorzystuje keratynę piór jako modelowy substrat [Ramnani i Gupta 2007]. Wśród keratynaz występują enzymy o dużej i bardzo niskiej specyficzności zdolne do rozkładu

28 Wstęp 28 różnych białkowych substratów takich jak np. albumina, kolagen i elastyna [Onifade i wsp. 1998]. Kim i wsp. [2004] jako pierwsi opisali strukturę krystaliczną keratynazy produkowanej przez termofilny szczep Fervidobacterium pennivorans. Badanie to wykazało, że wspomniana proteaza zbudowana jest z czterech domen: katalitycznej domeny CD, dwóch β- kanapkowych (β-sandwich) domen SDs i domeny PD. Keratynazy są aktywne w szerokim zakresie ph i temperatury. Produkcja keratynaz przez bakterie, promieniowce oraz grzyby odbywa się w przedziale C. Wyjątek stanowią Thermoanaerobacter i Fervidobacterium spp., które uwalniają enzym w temperaturze 70 C [Gupta i Ramnani 2006] i psychrotroficzna produkcja keratynaz prowadzona przez Stenotrophomonas sp. D1 [Yamamura i wsp. 2002a]. Keratynazy produkowane są głównie w warunkach hodowli wgłębnej, wstrząsanej, ale istnieją również doniesienia o hodowli mikroorganizmów keratynolitycznych w warunkach statycznych [Nam i wsp. 2002, Kaul i Sumbali 1999]. Interesujący jest fakt, że kinetyka produkcji keratynazy i jej degradacji nie pokrywa się [Gupta i Ramnani 2006]. Keratynoliza nie może, więc służyć jako wskaźnik produkcji keratynazy. Największa produkcja keratynazy przypada najczęściej w późnej logarytmicznej fazie wzrostu mikroorganizmów [Rodziewicz i Łaba 2006]. Choć istnieją także badania, które wykazały, że keratynaza może być produkowana w wykładniczej i stacjonarnej fazie wzrostu mikroorganizmów, natomiast jej degradacja może trwać od 24 h do kilku dób [Gupta i Ramnani 2006, Kaul i Sumbali 1999, Nam i wsp. 2002]. Keratynazy w dużej mierze zaliczane są do proteaz serynowych i metaloproteaz [Gupta i Ramnani 2006], dlatego PMSF i EDTA wywierają na nie inhibicyjny wpływ [Riffel i wsp. 2003]. Częściową inhibicję większości proteaz serynowych przez EDTA wskazuje na rolę kationów metali, jako czynników stabilizujących enzymy. Aktywność tej grupy enzymów jest stymulowana obecnością jonów metali tj. Ca 2+, Mg 2+ i Mn 2+, a z kolei inhibowana jonami metali ciężkich tj. Cu 2+, Ag +, Hg 2+ [Nam i wsp. 2002, Thys i wsp. 2004]. Keratynazy na ogół są stabilne w obecności organicznych rozpuszczalników i detergentów tj. SDS, DMSO i Triton-X-100 [Riffel i wsp. 2003]. Czynniki redukujące tj. 2-merkaptoetanol, zredukowany glutation, cysteina czy siarczyn sodu, przyczyniając się do redukcji mostków disiarczkowych, zwiększają aktywność keratynolityczną. Enzymy keratynolityczne syntezowane są w większości pozakomórkowo w wyniku indukcyjnego działania białek keratynowych obecnych w środowisku. Rodzaj egzogennego

29 Wstęp 29 induktora może obejmować takie substraty jak natywne pióra, sproszkowane: pierze, wełna, rogi, paznokcie i włosy [Gupta i Ramnani 2006]. W większości przypadków keratyna służy jako induktor, znane są jednak przypadki, w których mączka sojowa spełniała tę funkcję, co oznacza, że keratynazy mogą być konstytutywne [Gradisar i wsp. 2000]. Większość badaczy zalicza keratynazy do enzymów indukcyjnych, istnieją jednak wyjątki, które w swej pracy opisał Manczinger i wsp. [2003]. Warto wspomnieć, że w przypadku większości konstytutywnie wydzielanych keratynaz, charakter tych enzymów bazuje bardziej na ich kazeinolitycznych niż na keratynolitycznych uzdolnieniach [Gupta i Ramnani 2006]. Ponadto cukry proste tj. glukoza hamują syntezę keratynaz poprzez mechanizm katabolicznej represji [Thys i wsp. 2004]. Stwierdzono, że odczyn środowiska w zakresie ph 6-9 wspiera produkcję keratynaz, w przypadku większości mikroorganizmów keratynolitycznych. Zasadowe ph sprzyja degradacji keratyny, ponieważ przekształca cystynę w lantioninę, ułatwiając dostęp właściwym enzymom [Onifade i wsp. 1998]. Oprócz enzymów proteolitycznych w procesie keratynolizy prawdopodobnie uczestniczą również reduktazy disiarczkowe lub inne czynniki redukujące, takie jak siarczek, siarczan (IV), glutation czy cysteina. W pierwszym etapie redukują one siarkę ze zrywanych mostków S-S cystyny do cysteiny i tiocysteiny: Cys-SS-Cys + H2S >>> Cys-SH + Cys-SSH. W dalszym etapie odrywane są grupy aminowe z aminokwasów oraz siarka, która następnie jest wydzielana po uprzednim jej utlenieniu do siarczanu (VI) lub tiosiarczanu. Redukcja mostków dwusiarczkowych cystyny poprzedza proteolizę. Uczestniczą w niej reduktazy disiarczkowe. W wyniku rozkładu keratyny uwalniają się grupy aminowe oraz metabolity siarkowe, wzrasta również stężenie rozpuszczalnego białka. Wyższa alkaliczność przypisana jest reakcjom deaminacji prowadzącym do uwolnienia amoniaku, powodującego wzrost odczynu ph [Gupta i Ramnani 2006, Riffel i wsp. 2003]. Redukcja mostków dwusiarczkowych, a następnie ich ubytek powoduje nagromadzenie siarki -2-2 w postaci nieorganicznej jako SO 3 (siarczan IV), SO 4 (siarczan VI), S 2 O -2 3 (tiosiarczan) oraz w postaci organicznych związków tiolowych [Rodziewicz i wsp. 2006]. Metabolizm siarki nie jest całkowicie jasny, ponadto przebiega odmiennie u organizmów pro- i eukariotycznych [Rodziewicz i wsp. 2006]. Są dwa prawdopodobne mechanizmy keratynolizy. Oba opisują procesy redukcji mostków disiarczkowych przy pomocy czynników chemicznych (sulfitoliza) lub enzymatycznych (aktywność reduktazy disulfidowej). Według Kunerta [1992], keratynolityczne mikroorganizmy wykorzystują cysteinę jako źródło siarki i azotu. Natomiast produktami metabolizmu cystyny przez grzyby

30 Wstęp 30 strzępkowe są nieorganiczne związki siarki i ich pośrednie produkty. Kunert wykazał, że nadmiar siarki jest wydzielany do podłoża w postaci siarczanów i siarczynów. Ten ostatni w środowisku neutralnych i alkalicznym reaguje z cystyną dając cysteinę i S-sulfocysteinę, zgodnie z poniższym równaniem: - - Cys - S - S - Cys + HSO 3 Cys - SH + Cys SSO 3 Według Kunerta reakcja ta zachodzi również w przypadku cystyny związanej z białkiem keratynowym. Wydzielanie siarczynu powoduje dalszą sulfitolizę mostków disiarczkowych. Malviya i wsp. [1992] wykryli, że enzymy keratynolityczne nie były wykrywane w podłożu dopóki połowa dostarczonej keratyny nie została rozłożona, co wskazywało na sulfitolizę. Fizykochemicznych dowodów dostarczają również wyniki badań Kunerta [1992], który sprawdzał wpływ czynników redukujących tj. siarczyn sodu, cysteina, glutation, merkaptoetanol i ditiotreitol na aktywność keratynaz Microsporium gypseum. Uzyskane przezeń wyniki potwierdziły, że degradacja mostków disiarczkowych poprzedzała działanie enzymów proteolitycznych i spowodowała 3-43 krotny wzrost ich aktywności. Zdolność do sulfitolizy różni poszczególne grupy mikroorganizmów i ma to prawdopodobnie związek z ich potencjałem pasożytniczym [Kunert J. 1992, Onifade i wsp. 1998]. Keratynoliza prowadzona przy udziale grzybów strzępkowych obejmuje dodatkowy etap mechanicznego uszkadzania keratynowych substratów, penetrowanych przez wzrastające strzępki grzybni. Mitola i wsp. [2002] opisali w swojej pracy dwie metody inwazji keratynolitycznych grzybów: poprzez powierzchniową erozję i tworzenie kanałów wnikających w strukturę włosa ludzkiego. Te metody kolonizacji stosunkowo łatwo zaobserwować przy pomocy mikroskopu świetlnego i skaningowego. Nie tylko keratynazy degradują keratynę w obecności czynników redukujących ale również inne enzymy proteolityczne tj subtylizyna, chymotrypsyna i papaina. Zjawisko to badali Ramnani i Gupta [2007], wykorzystując mutanta szczepu B. subtilis WB600 z deficytem proteaz, stanowiącym źródło czynników redukujących. Otrzymane wyniki pozwoliły im na stwierdzenie, że różne proteazy serynowe i cysteinowe, zdolne do hydrolizy hydrofobowych produktów w pozycji P1 mogą stanowić suplement wspierający aktywność keratynaz. Większość keratynaz wydzielana jest zewnątrzkomórkowo w kontakcie z keratynowym substratem, niemniej w literaturze można również znaleźć doniesienia dotyczące keratynaz związanych z błoną komórkową [Gupta i Ramnani 2006, Nam i wsp. 2002] i keratynaz wewnątrzkomórkowych [Onifade i wsp. 1998]. Frakcja

31 Wstęp 31 wewnątrzkomórkowa zasilana jest m.in. przed reduktazę disulfidową, siarczyn i tiosiarczan, które synergistycznie wspomagają zewnątrzkomórkowe keratynazy w degradacji keratyn poprzez redukcję mostków disiarczkowych keratyny [Bӧckle i Müller 1997, Yamamura i wsp. 2002b]. Jednak porządek tych procesów i ich natura jest wciąż dyskusyjna. Bӧckle i Müller [1997] badali w swojej pracy redukcję mostków disiarczkowych przez szczep Streptomyces pactum w podłożu z dodatkiem piór kurzych. Otrzymane wyniki skłoniły ich do wyciągnięcia wniosków, że degradacja nierozpuszczlnej keratyny zachodzi poza komórką. Odpowiada za to związany z komórką system redukcyjny lub rozpuszczalny czynnik redukcyjny wydzielany do podłoża. Większość oczyszczonych keratynaz nie może całkowicie rozpuścić natywnej keratyny, dlatego ich dokładny charakter i niezwykłość keratynolizy jest nadal tajemnicą w świecie proteaz [Gupta i Ramnani 2006, Onifade i wsp. 1998, Farag i Hassan, 2004]. Oczyszczona keratynaza, bez dodatku czynników redukujących może zhydrolizować ok. 10% białka keratynowego [Riffel i wsp. 2003, Suh i Lee 2001]. Ponadto badania Evans i wsp. [2000], wykazały, że nie-keratynolityczne subtylizyny mogą również degradować keratynę w obecności bakterii z gatunku B. subtilis, nie wydzielających proteaz, a jedynie wytwarzających potencjał redoks w środowisku. Immobilizowane proteazy znajdują wiele aplikacji do których można zaliczyć m.in. wytwarzanie hydrolizatów białek, ustalanie struktury białek czy ocena ich strawności. Chemiczne metody immobilizacji są pracochłonne i kosztowne, a wykorzystywane enzymy muszą być oczyszczone. Dlatego rozwijają się nowe metody wykorzystujące technologię streptawidyna-biotyna. Immobilizacja keratynazy powoduje zwiększenie stabilności enzymu, co jednak odbywa się kosztem aktywności enzymatycznej, która jest niższa w porównaniu z wolnym enzymem. Badania nad produkcją białka fuzyjnego keratynaza-streptawidyna prowadzili Wang i wsp. [2003]. Przeprowadzili klonowanie Bacillus subtilis plazmidem zawierającym gen fuzyjny kera-stp. Keratynolityczna aktywność immobilizowanego białka zmniejszyła się o 70-80% w stosunku do wolnego enzymu, natomiast wykazywało ono większą stabilność przy wysokich wartościach ph. Osiągnęło 50% aktywności wolnego enzymu w ph=2 i 100% aktywności w ph=12. Podobnie wzrosła także jego stabilność w temperaturze 50 C, gdzie po trzech dobach inkubacji immobilizowana keratynaza zachowała 48% wyjściowej aktywności, a rozpuszczony enzym zaledwie 2%. Podobne wyniki uzyskali Lin i wsp. [1996] dla keratynazy B. licheniformis immobilizowanej na porowatych kulkach szklanych. Immobilizowana keratynaza wykazywała większy poziom

32 Wstęp 32 stabilności temperaturowej i zwiększoną tolerancję na alkaliczne środowisko w porównaniu z wolnym enzymem. Keratynazy przeważnie znajdują zastosowanie w procesach biokonwersji odpadów keratynowych do pasz i nawozów. Istnieje również wiele innych, obiecujących możliwości wykorzystania tej grupy enzymów, do których można zaliczyć: depilację skór, wytwarzanie detergentów oraz wytwarzanie biopolimerów z włókien keratynowych. Wykorzystanie keratynaz do zwiększania wchłaniania leków przez niektóre tkanki oraz hydroliza białek prionowych stwarzają nowe, niezwykłe możliwości aplikacyjne tych enzymów w medycynie i kosmetyce. Wiele doniesień naukowych wskazuje keratynę piór jako potencjalne źródło wielu różnorodnych produktów tj. biohydrolizaty, kleje czy folie [Gupta i Ramnani 2006], [Vasileva-Tonkova i wsp. 2009, Ichida i wsp. 2001]. Ponadto hydrolizaty białek keratynowych mogą stanowić źródło cennych aminokwasów tj. cysteina, seryna, czy prolina [Brandelli 2008]. Pomimo, że wiele zastosowań keratynaz nie jest jeszcze rozwiniętych, jednak kilka preparatów keratynolitycznych znalazło drogę do komercjalizacji np. Versazym (Bioresource International s) wykorzystywany do produkcji mączek paszowych [Gupta i Ramnani 2006]. Celulazy i ksylanazy Badania dotyczące enzymów celulolitycznych rozpoczęły się już we wczesnych latach 50-tych, ze względu na tkwiący w nich ogromny potencjał do hydrolizy ligninocelulozy i pozyskiwania na tej drodze glukozy i cukrów rozpuszczalnych. Ligninoceluloza zbudowana jest z dwóch polisacharydów: celulozy i ksylanu oraz ligniny. Celuloza jest najczęściej występującym składnikiem biomasy roślin, występuje prawie wyłącznie w ścianach komórkowych roślin, choć jest też wytwarzana przez niektóre zwierzęta (np. osłonice) czy bakterie. Przeciętnie stanowi ona 35-50% s.m. roślin. Przeważnie celulozowe włókna są osadzone w matrycy innych biopolimerów tj. hemicelulozy czy ligniny, które stanowią odpowiednio 20-35% i 5-10% suchej masy roślin. Krystaliczna natura celulozy, skomponowana z ciasno upakowanych mikrofibryl, zapobiega przenikaniu enzymów, ale także niewielkich cząsteczek tj. cząsteczki wody. Mikrobiologiczny rozkład celulozy i ksylanu odgrywa istotną rolę w obiegu węgla w biosferze ale także stanowi integralny element powszechnie stosowanych procesów takich jak beztlenowa fermentacja i kompostowanie [Bhat 2002]. Celuloliza przebiega z udziałem kilku enzymów np.: celulazy, egzo-β-1,4-glukanazy i β-glukozydazy (celobiazy). Głównym producentem tej grupy enzymów są grzyby

33 Wstęp 33 strzępkowe z rodzaju Trichoderma. Wśród mikroorganizmów zdolnych do rozkładu ligniny można wyróżnić grzyby tzw. białego, brunatnego i szarego rozkładu. Produkują one enzymy ligninolityczne tj. peroksydazy i lakazy, biorące udział w rozkładzie tej wysoce opornej frakcji [Kancelista i Witkowska 2008]. Uzdolnienia celulolityczne rozpowszechnione są w całym królestwie grzybów od prymitywnych Chytridomycetes po bardziej zaawansowane Basidiomycetes, natomiast wśród bakterii można wyróżnić typ Firmicutes i promieniowce typ Actinobacteria. Mikroorganizmy produkują liczne enzymy degradujące materiały roślinne, które określa się mianem enzymatycznych systemów. Ze względu na właściwości strukturalne celulazy podzielono je na trzy grupy: 1) endoglukanazy (1,4-β-D-glukan-4-glukanohydrolazy) (EC ) 2) egzoglukanzy, włączając 1,4-β-D-glukan glukanohydrolazy (znane również jako celodekstrynazy) (EC ) oraz 1,4-β D glukan celobiohydrolazy (celobiohydrolazy) (EC ) 3) β-glukozydazy lub β-glukozydo glukohydrolazy (EC ) Endoglukanazy losowo rozcinają wewnętrzne amorficzne rejony łańcucha β-polisacharydowego celuozy, generując łańcuchy oligosacharydowe o różnych długościach. Egzoglukanazy działają na redukujące i nieredukujące końce łańcucha celulozy, uwalniając cząsteczki glukozy (glukanohydrolazy) albo celobiozy (celobiohydrolazy). Mogą również naruszać mikrokrystaliczną strukturę celulozy. Natomiast glukozydazy hydrolizują celobiozę i rozpuszczalne celodekstryny do cząsteczek glukozy [Bhat 2002]. Ksylanazy (endo-1,4-β-ksylanazy EC ) z kolei zaliczane są do glikozydaz katalizujących hydrolizę ksylanu, głównego komponentu kompleksu hemicelulozy. Enzymy te są wykorzystywane m.in. do wstępnej obróbki paszy dla zwierząt. Gerasimova i Kuisiene [2011] opisali w swojej pracy ksylanazę uwalnianą przez bakterie z rodzaju Geobacillus, charakteryzującą się niską termostabilnością i masą cząsteczkową 45kDa. Cheng i Chang [2011] badali z kolei uzdolnienia celulolityczne szczepów bakterii z rodzaju Pseudomonas. Szczep Pseudomonas sp. CL3 produkował celulolityczne enzymy składające się z endoglukanaz, egzoglukanaz, β-glukozydaz i ksylanaz. Enzymy te mogą znaleźć zastosowanie w produkcji biogazu z odpadów rolniczych. Ponadto wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że celulazy/ksylanazy Pseudomonas sp. CL3 wykazują aktywność w warunkach mezo i termofilnych, co predestynuje je do wykorzystania przy produkcji bioetanolu w procesie jednoczesnego scukrzania i fermentacji [Cheng i Chang 2011]. Enzymy rozkładające ksylan można podzielić ze względu na sposób działania na:

34 Wstęp 34 -odszczepiające ksylooligosacharydy: endo-β-1,4-ksylanazy i egzo-β-1,4-d-ksylozydazy -odszczepiające boczne grupy i łańcuchy heteroksylanu: α-d-glukuronidaza, α-l-arabinofuranozydaza, esteraza octanowa, acetyloksylanoesteraza. Chitynazy Chitynazy (EC 3:2:1:14) są to kluczowe enzymy hydrolityczne odpowiedzialne za hydrolizę chityny. Odgrywają niezwykle ważną rolę w kontroli szkodników i chorób roślin oraz jako czynniki promujące ich wzrost. Wykorzystywane są również przy produkcji żywności i pasz oraz w medycynie, przemyśle i gospodarce odpadami. Wśród chitynaz wyróżnia się endo- i egzochitynazy. Chitynolityczne enzymy wytwarzane są głównie przez mikroorganizmy, a w szczególności egzochitynazy pochodzące z rodzaju Trichoderma ssp. Mogą one ograniczać wzrost patogenów przenoszonych przez glebę poprzez hydrolizę chityny związanej w ścianie komórkowej patogenów. Przykładowo chitynaza grzyba z gatunku Trichoderma harzianum prowadzi do lizy fitopatogenicznego grzyba z gatunku Colletotrichum gloeosporioides [Kumar i wsp. 2012]. Sakai i wsp. [1998] wyizolowali z kompostu organicznych odpadów suplementowanego skorupiakami szczep bakterii Bacillus stearothermophilus CH-4, który produkował termostabilną endochitynazę. Badany szczep uwalniał trzy endochitynazy L, M i S do podłoża hodowlanego. Chitynazy L, S i M wykazywały aktywność względem acetylowanych chitooligosacharydów na poziomie odpowiednio 0,133 μmol/min, 0,158 μmol/min i 0,173 μmol/min [Sakai i wsp. 1998]. Lipazy Enzymy lipolityczne to hydrolazy katalizujące hydrolizę triglicerydów, uwalniające kwasy tłuszczowe i glicerol. Wyróżnia się wśród nich dwie grupy: karboksyesterazy (EC ) i właściwe lipazy (EC ). Otrzymywane są z roślin, zwierząt i mikroorganizmów. Wśród tej ostatniej grupy uwalniane są m.in. przez bakterie z rodzaju Acinetobacter, Lactobacillus i Bacillus, drożdże z rodzaju Mucor, Candida, i Pichia oraz grzyby strzępkowe z rodzaju Aspergillus, Rhizopus i Penicillium [Łebkowska i Załęska- Radziwiłł 2011, Sangeetha i wsp. 2010]. W skład katalitycznej triady centrum aktywnego lipaz wchodzi seryna, histydyna i kwas asparaginowy. Są one zdolne zarówno do rozkładu jak i syntezy wiązań estrowych triacylogliceroli. Lipazy są szeroko wykorzystywane do produkcji detergentów, w przemyśle mleczarskim, skórzanym i farmaceutycznym. Duże zainteresowanie lipazami pochodzenia bakteryjnego wynika z ich stabilności w rozpuszczalnikach organicznych, przy jednoczesnym braku konieczności zastosowania

35 Wstęp 35 kofaktorów i wysokiej enancjoselektywności [Asoodeh i Ghanbari 2013]. W procesie kompostowania odpadów keratynowych pełnią istotną rolę przy odtłuszczaniu substratu, ułatwiając tym samym dostęp enzymom proteolitycznym. Utrwalanie biomasy mikroorganizmów Ze względu na wymaganą stabilność mikroorganizmów oraz konieczność dłuższego przechowywania najczęściej przygotowuje się je w formie utrwalonej w postaci stałej, rzadziej w postaci płynnej. Wśród metod wykorzystywanych do utrwalania komórek wegetatywnych i form przetrwalnych można wymienić przede wszystkim: mrożenie, liofilizację, suszenie rozpyłowe, fluidyzacyjne, fontannowe i mikrofalowe. Obecnie najpowszechniej wykorzystywaną metodą jest mrożenie i liofilizacja. Kultury drobnoustrojów utrwalane tymi metodami, przy zachowaniu odpowiednich parametrów procesu wymrażania i suszenia oraz użyciu odpowiednich czynników osłonowych, odznaczają się wysoką przeżywalnością komórek oraz stabilnością cech biotechnologicznych [Połomska i wsp. 2007]. Stosowane podczas liofilizacji zmniejszone ciśnienie umożliwia sublimację lodu z komórki w temperaturze pokojowej. Dzięki temu wysuszony materiał zachowuje swoją strukturę i porowatość, a po uwodnieniu enzymy odzyskują aktywność katalityczną. Metoda ta wykorzystywana jest do utrwalania białek, enzymów, a także komórek drobnoustrojów [Pasławska 2007]. Suszenie jest jedną z najstarszych metod utrwalania żywności. Polega na usuwaniu wody z suszonych surowców w celu ograniczenia występowania procesów enzymatycznych i spowolnienia przebiegu procesów życiowych drobnoustrojów [Stępień 2008]. Metodą zapewniającą zachowanie właściwości materiałów termolabilnych jest suszenie mikrofalowe. W odróżnieniu od innych metod suszenia, temperatura w środku materiału może być wyższa niż na jego powierzchni. Wilgoć z wnętrza przepływa ku zewnętrznej warstwie dzięki termicznej dyfuzji. Bazując na pozytywnych wynikach suszenia leków i warzyw tą metodą, można sądzić o jej potencjalnym wykorzystaniu do utrwalania szczepionek drobnoustrojów [Pasławska 2007]. Metodą suszenia umożliwiającą zachowanie relatywnie niskiej temperatury materiału suszonego oraz wysokiej przeżywalności drobnoustrojów jest odwadnianie w strumieniu powietrza, na przykład suszenie w złożu fontannowym. Badania nad tą metodą utrwalania drożdży opisała w swej pracy Pasławska [2008]. W przypadku tej grupy drobnoustrojów,

36 Wstęp 36 konieczne było przeprowadzenie płynnej, znacznie uwodnionej biomasy komórek w formę zdolnego do fontannowania ciała stałego w postaci kulek alginianowo-drożdżowych, a więc zastosowanie immobilizacji metodą pułapkowania w żelu oraz ustalenie optymalnej temperatury procesu. Temperatura suszenia na poziomie 40 C okazała się najbardziej korzystną, z punktu widzenia przeżywalności komórek oraz względnie dobrej intensywności odwadniania. Kolejną metodą utrwalania jest suszenie konwekcyjne, którego istotą jest dostarczenie do suszonego materiału ciepła za pośrednictwem czynnika suszącego. Ta powszechnie stosowana na skalę przemysłową metoda jest jednocześnie jedną z najbardziej destrukcyjnych metod utrwalania żywności. Powoduje duże zmiany fizykochemiczne prowadzące do ingerencji w naturę związków chemicznych oraz w strukturę komórkową materiału. Niekorzystny efekt uboczny tego procesu można jednak optymalizować poprzez właściwy dobór parametrów suszenia oraz odpowiednie przygotowanie surowca: mycie, rozdrabnianie, blanszowanie, odwadnianie osmotyczne itp. [Stępień 2008]. Głównymi przyczynami utraty żywotności komórek podczas utrwalania jest zbyt wysoka osmolarność prowadząca do uszkodzenia błony, denaturacja makrocząsteczek i usuwanie wody, która ma wpływ na wiele hydrofilowych cząsteczek w komórkach [Zayed i Roos 2004]. Korzystny wpływ na biomasę w trakcie tych zabiegów mają czynniki osłonowe tj. trehaloza, laktoza, sacharoza, glukoza, miód, hydrokoloidy, mleko w proszku lub unieruchomienie komórek na porowatym nośniku [Pasławska 2007]. Związki te zmniejszają lub zapobiegają niekorzystnym skutkom procesów utrwalania, jednak nie zapobiegają stratom żywotności mikroorganizmów podczas ich przechowywania [Zayed i Roos 2004].

37 Cel pracy Cel pracy Celem badań było: 1. Opracowanie składu szczepionek mikroorganizmów do kompostowania szczeciny 2. Dobór warunków prowadzenia procesu kompostowania 3. Uzyskanie produktu w wysokim stopniu zmineralizowanego o charakterze nawozu organicznego

38 Materiał i metody badań Materiał i metody badań 4.1. Materiał badawczy Przedmiotem badań była szczecina samicy świni (łac. Sus scrofa f. domestica) rasy polska biała zwisłoucha, pochodząca z ubojni trzody chlewnej Składniki masy kompostowej Głównym składnikiem masy kompostowej była szczecina w postaci natywnej lub rozdrobniona w urządzeniu typu T3SOP (model T3S-15) do długości 1-2 cm. W skład masy kompostu wchodziły również dwa komponenty roślinne takie jak trociny z drzew liściastych i iglastych o wymiarach 1-1,5 cm oraz pocięta słoma pszeniczna (sieczka) o wymiarach 2-5 cm, pochodząca z prywatnego gospodarstwa rolnego. Kolejnymi komponentami były pył węgla brunatnego pochodzący z kopalni Sieniawa oraz opcjonalnie suchy nawóz kurzy (kurzeniec). Składniki mieszano w proporcjach zapewniających odpowiedni stosunek węgla do azotu. Jego wartość obliczano jako stosunek sumy zawartości węgla organicznego do sumy zawartości azotu ogółem w suchej masie poszczególnych komponentów [Tab. 5]. Zawartość węgla organicznego (C org ) oznaczano metodą oksydometryczną, a azotu ogółem (N og ) metodą Kiejdahla. Szczegółowe zestawienie składu poszczególnych mieszanek kompostowych ilustruje Tab. 12. Tab. 5. Zawartość węgla organicznego i azotu ogółem w komponentach kompostowych Składniki kompostu C org [g/kg s.m.] N og [g/kg s.m.] Szczecina 203,32 71,7 Sieczka 231,2 1,24 Trociny 427,8 0,08 Pył węglowy 553,45 0,01 Kurzeniec 336,1 18, Mikroorganizmy Materiał badawczy stanowiło jedenaście szczepów bakterii, w tym dwóch promieniowców, dwa szczepy drożdży i cztery szczepy grzybów strzępkowych [Tab. 6].

39 Materiał i metody badań 39 Tab. 6. Badane w pracy mikroorganizmy Mikroorganizmy Rodzaj Gatunek Szczep Źródło izolacji Bakterie Bacillus Optymalna temperatura rozwoju cereus **B5e/sz Odpady, szczecina mezofilny subtilis *P22 Odpady (pierze),, polymyxa **B20,,,, subtilis **B3,,,, subtilis **172,,,, species *T14,, termofilny subtilis *T16,, termotolerancyjny pumilis *T19,, względnie termofilny licheniformis *KT20,,,, Promieniowce Streptomyces variabilis *KP1,, mezofilny violaceolatus *KP2,,,, Drożdże Yarrowia lipolytica **PII6a Ser pleśn. rokpol,, Grzyby strzępkowe Geotrichum candidum **PH1,,,, Trichoderma atroviride *KP1 Odpady (pierze),, asperellum ***B35 -, Penicillum species *K84 Odpady (pierze),, species *GK144,,,, *Izolaty szczepów uzyskane w badaniach własnych; **Szczepy pochodzące z kolekcji własnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu; ***Szczep pochodzący z Kolekcji kultur Katedry Ochrony Roślin Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu 4.2. Metody badawcze Podłoża hodowlane W pracy stosowano podłoża do hodowli bakterii, promieniowców, drożdży oraz grzybów strzępkowych, których warunki hodowli, skład i zastosowanie zestawione są w Tab. 7. Jako płyn do rozcieńczeń stosowano 0,9% roztwór soli fizjologicznej (bakterie i promieniowce) oraz 0,1% roztwór Tween (drożdże i zarodniki grzybów strzępkowych). W hodowlach wstrząsanych szczecina świńska oraz pióra kurze były induktorami keratynaz. W tym celu poddawano je myciu, odtłuszczeniu i rozdrobnieniu do wielkości 2 cm.

40 Promieniowce Bakterie Materiał i metody badań 40 Tab. 7. Podłoża hodowlane oraz warunki hodowli drobnoustrojów Warunki Mikroorg. Podłoża Skład podłoża (g/l) hodowli Temp./czas Wykorzystanie Bulion z -Bulion suchy (8) -Mezofile: -wstrząsana hodowla inokulacyjna glukozą -Glukoza (10) 30 C / 24h -identyfikacja -przechowywanie szczepów; skosy -Termofile: -badanie interakcji: podłoża stałe 55 C / 24h -badanie liczebności bakterii w próbach kompostowych Podłoże -MgSO 4 x 7H 2 O (1) -Mezofile: -hodowle wstrząsane: badanie mineralne z -KH 2 PO 4 (0,1) 30 C / 7 dób uzdolnień keratynolitycznych keratyną i YE -FeSO 4 x7h 2 O (0,01) -CaCl 2 (0,1) -Termofile: - YE (0,5) 55 C / 7 dób - Szczecina/Pierze (10) ph=7,1 Podłoże do -Odtłuszczone mleko w 30 C / 48h - liczebność bakterii proteolitycznych hodowli bakterii proszku (80) w kompostach proteolitycznych* Podłoże MBA -Ekstrakt wołowy (1) 30 C / 3-7 -badanie interakcji: podł. stałe (Modifed Bennett s Agar) -Glukoza/Glicerol (10) -Enzymatyczny hydrolizat kazeiny (2) dób - YE (1); ph=7,3 Podłoże -K 2 HPO 4 (1) 30 C / wstrząsana hodowla inokulac. Cyganowa -MgSO 4 x 7H 2 O (1) dób -identyfikacja -NaCl (1) -przechowyw. szczepów; skosy -(NH 4 ) 2 SO 4 (2) -liczebność promieniowców w -CaCO 3 (bezw.) (10) próbach kompostowych -Skrobia rozp. (10) Podłoże MBA (Modifed Bennett s Agar) j.w. 30 C / 3-21 dób - wstrząsana hodowla inokulac. -badanie interakcji: podł. stałe -identyfikacja -przechowyw. szczepów; skosy

41 Grzyby strzępkowe Drożdże Materiał i metody badań 41 Podłoże -MgSO 4 x 7H 2 O (1) 30 C / 14 -hodowle wstrząsane: badanie mineralne z -KH 2 PO 4 (0,1) dób uzdolnień keratynolitycznych keratyną i YE -FeSO 4 x7h 2 O (0,01) -CaCl 2 (0,1) - YE (0,5) -Szczecina/Pierze (10) ph=7,1 Podłoże YM -Ekstrakt słodowy (3) -Pepton (5) -YE (3) -Glukoza (10); ph=6,5 30 C / 2-3 doby -wstrząsana hodowla inokulac. -badanie interakcji: podł. stałe -przechowyw. szczepów; skosy Podłoże -MgSO 4 x 7H 2 O (0,5) 30 C / 2-3 -hodowle wstrząsane: badanie mineralne z -KH 2 PO 4 (1) doby uzdolnień keratynolitycznych keratyną -FeSO 4 x7h 2 O (0,01) -KCl (0,5) -NaNO 3 (3) -Pierze (10); ph=6,0 Podłoże PDB -PDB (12) 25 C / wstrząsana hodowla inokulac. Oksytetracyklina doby -badanie interakcji: podł. stałe (100mg) dodawana -przechowyw. szczepów; skosy przy bad. - liczebność grzybów w kompostach kompostowych Podłoże -MgSO 4 x 7H 2 O (0,5) 25 C / hodowle wstrząsane: badanie mineralne z -KH 2 PO 4 (1) dób uzdolnień keratynolitycznych keratyną -FeSO 4 x7h 2 O (0,01) -KCl (0,5) -NaNO 3 (3) -Szczecina/Pierze (10) ph=6,0 *Podłoże do hodowli bakterii proteolitycznych sterylizowano w 117 C pod ciśnieniem 0,8 atm przez 15min. Pozostałe podłoża poddawano sterylizacji w 121 C pod ciśnieniem 1 atm przez 30 min. Wszystkie podłoża zestalone w postaci skosów lub płytek zawierały 2% dodatek agaru Hodowle mikroorganizmów Hodowle inokulacyjne Celem uzyskania biomasy mikroorganizmów prowadzono hodowle inokulacyjne. Bakterie wstrząsano przez 4-6 h w podłożu bulion z glukozą w temperaturze 30 C (mezofile) lub 55 C (termofile). Hodowle inokulacyjne promieniowców prowadzono na podłożu stałym

42 Materiał i metody badań 42 MBA w temperaturze 30 C przez siedem dób. Inokulum grzybów strzępkowych stanowiła 7- dobowa hodowla w temperaturze 25 C na podłożu stałym PDA. Hodowle wstrząsane w podłożu mineralnym z dodatkiem induktorów enzymów proteolitycznych lub celulolitycznych Wstępny skrining uzdolnień keratynolitycznych mikroorganizmów szczepionkowych przeprowadzono w hodowli wstrząsanej w podłożu mineralnym z 1% dodatkiem pierza i 0,05% YE, gdzie wyznaczono dla każdego szczepu najwyższą aktywność keratynolityczną w płynie pohodowlanym. Badania objęły dziewięć szczepów bakterii z rodzaju Bacillus: B. subtilis P22, B. cereus B5e/sz, B. sp. T14, Bacillus sp. T16, B. pumilis T19, B. licheniformis KT20, B. polymyxa B20, B. subtilis B3, B. subtilis 172; dwa szczepy promieniowców Streptomyces sp. KP1 i Streptomyces sp. KP2; dwa szczepy drożdży: Yarrowia lipolytica PII6a i Geotrichum candidum PH1 oraz cztery szczepy grzybów strzępkowych: Trichoderma atroviride KP1, T. asperellum B35, Penicillum sp. K84 i P. sp. GK144. Hodowle prowadzono w temperaturze 30 C (mezofile) lub 50 C (termofile) przez 7 do 20 dób (bakterie 7 dób, promieniowce 14 dób, grzyby strzępkowe 20 dób). Hodowle wstrząsane, w których badano aktywności proteaz, keratynaz, celulaz, ksylanaz, chitynaz i lipaz, prowadzono w kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 ml w podłożu mineralnym zawierającym zamiennie: 1% pierza, 1% szczeciny lub 1,5% wysłodek buraczanych, jako źródła węgla. W płynie pohodowlanym badano przyrost biomasy oraz ph. Następnie odwirowywano go, a w uzyskanym supernatancie oznaczano: zawartość białka, stężenie wolnych grup aminowych i sulfhydrylowych aminokwasów i/lub wybrane aktywności enzymatyczne: w hodowlach z dodatkiem szczeciny badano aktywność: proteaz i keratynaz w hodowlach z dodatkiem pierza badano aktywność: proteaz, keratynaz, lipaz w hodowlach z dodatkiem wysłodek buraczanych badano aktywność: celulaz, ksylanaz i chitynaz Optymalizowano również warunki reakcji proteolitycznej i badano wpływ wybranych aktywatorów i inhibitorów na aktywność proteaz. Po zakończeniu każdej hodowli oceniano ubytek suchej masy substratu keratynowego metodą wagową.

43 Grzyby strzępkowe Promieniowce Bakterie Materiał i metody badań 43 Hodowle produkcyjne Szczepionki drobnoustrojów wykorzystywane w procesie kompostowania przygotowywano w formie nieutrwalonej lub utrwalonej biomasy [Tab. 11]. Tab. 11. Podłoża oraz warunki hodowli mikroorganizmów szczepionkowych Mikroorganizmy Podłoże Skład podłoża Warunki hodowli Gęstość inokulum Serwatkowe* -Hydrolizat skrobi -hodowla 9 x 10 8 ziemniacz (30) wstrząsana jtk/ml Serwatkowe - liofilizat -Serwatka (30) -Zarodki pszenne (30) -KH 2 PO 4 (0,1) ph=7,0 -hodowla w bioreaktorze 1 x 10 8 jtk/ml j.w. liofilizat 7 x 10 8 jtk/ml MBA j.w. zmyw 1 x 10 8 Pszenica -Zmielone ziarna pszenicy jtk/ml 1 x 10 8 hodowla na ziarnach pszenicy jtk/ml 1,5 x 10 7 zar/g s.m Skala kompostowania laboratoryjna półtechniczna półtechniczna laboratoryjna półtechniczna laboratoryjna Pszenica szczepionka utrwalona j.w. 1,5 x 10 7 wysuszona hodowla na pszenicy zar/g s.m 3 x 10 6 jtk/g s.m. PDB Tab. 4. zmyw 1 x 10 7 Wysłodki buraczane Wysłodki buraczane szczepionka utrwalona -Zmielone wysłodki buraczane j.w. zar/ml 1 x 10 7 hodowla na wysłodkach wysuszona hodowla na wysłodkach zar./ml 2 x10 9 jtk/g 2 x 10 8 jtk/g s.m. półtechniczna półtechniczna laboratoryjna półtechniczna półtechniczna półtechniczna *Serwatkę sterylizowano w 117 C pod ciśnieniem 0,8 atm przez 15min. Pozostałe podłoża poddawano sterylizacji w 121 C pod ciśnieniem 1 atm przez 30 min. Hodowle poszczególnych mikroorganizmów na odpowiednich podłożach, po zakończeniu procesu stanowiły nieutrwaloną szczepionkę jednoorganizmową, którą inokulowano masę kompostową.

44 Materiał i metody badań Szczepionki kompostowe Interakcje mikroflory szczepionkowej Hodowle badanych mikroorganizmów przeprowadzano zgodnie z opisem przedstawionym w Tab. 7. W badaniach zastosowano metodę słupkową [Strus M. 1998], studzienkową [Klewicka i wsp. 1999] i Test Mańki [Mańka K. 1974]. Wszystkie testy wykonywano w trzech powtórzeniach. Za wynik pozytywny, wskazujący na interakcje antagonistyczne między szczepami, uznawano wystąpienie wyraźnej strefy zahamowania wzrostu jednego z testowanych mikroorganizmów. Wszystkie próby porównywano do kontroli, którą stanowiły osobne hodowle obu szczepów mikroorganizmów. Bakterie bakterie > metoda słupkowa Inokulum bakterii standaryzowano do gęstości 1x10 9 jtk/ml. Hodowle prowadzono w zestalonym podłożu zawierającym bulion i glukozę. Płytki z testami inkubowane były przez 24h w temperaturze 30 C. Bakterie promieniowce > metoda słupkowa Inokulum bakterii stanowiła 24 h stacjonarna hodowla w podłożu BG (10 8 jtk/ml) a inokulum promieniowców zmyw z 7 dobowego skosu (10 7 jtk/ml). Hodowle obu mikroorganizmów prowadzono w zestalonym podłożu MBA. W przypadku szczepów bakteryjnych czas wzrostu hodowli powierzchniowej i wgłębnej wynosił 24 h, a w przypadku promieniowców 8 dób. Płytki przetrzymywano w temperaturze 30 C przez 8 dni. Odczytu dokonywano po 1 i 8 dobach. Bakterie grzyby strzępkowe > metoda słupkowa Wykonano posiewy wgłębne szczepów grzybowych z 7-dobowego skosu na osobnych płytkach z podłożem PDA (1x10 6 kom/ml). Dla pojedynczego szczepu bakterii kontrolę stanowił posiew wgłębny a dla szczepów grzybowych słupki z murawą umieszczone na nieinokulowanym agarze odżywczym. Płytki przetrzymywano przez 12 h w temperaturze 4 C, aby umożliwić dyfuzję antybiotyku ze słupka z murawą grzyba do podłoża. Następnie inkubowano je przez 5 dób w temperaturze 30 C. Promieniowce-promieniowce > metoda studzienkowa Interakcje między szczepami promieniowców Streptomyces sp. KP1 i Streptomyces sp. KP2 badano na podłożu MBA. Płytki przetrzymywano w temperaturze 30 C przez 7 dób. Promieniowce - grzyby strzępkowe > metoda słupkowa Antagonizmy między szczepami promieniowców i grzybów badano na podłożu MBA. Wykonano posiewy wgłębne szczepów grzyba na osobnych płytkach z podłożem PDA. Płytki

45 Materiał i metody badań 45 przetrzymywano przez 12 h w temperaturze 4 C, aby umożliwić dyfuzję antybiotyku ze słupka z murawą grzyba do podłoża. Następnie płytki inkubowano przez 5 dób w temperaturze 30 C. Grzyby strzępkowe-grzyby strzępkowe > test Mańki Interakcje między szczepami grzybów strzępkowych badano w hodowli płytkowej na podłożu PDA prowadzonej w temperaturze 25 C. Identyfikacja wybranych mikroorganizmów Identyfikacji poddano szczep bakterii Bacillus sp. T16 oraz szczep promieniowców Streptomyces sp. KP2. W tym celu przeprowadzono ich analizę makro- i mikroskopową, ocenę optymalnej temperatury wzrostu oraz barwienie metodą Grama. Zbadano także zdolność przetrwalnikowania bakterii Bacillus sp. T16 metodą Schaeffer-Fultona, a konidia promieniowców obserwowano w przyżyciowych preparatach mikroskopowych. Hodowle mikroorganizmów prowadzono na płytkach Petriego w podłożu bulion z glukozą (bakterie) oraz w podłożu MBA (promieniowce) [Tab. 4]. Po wstępnym określeniu przynależności gatunkowej, dalszą identyfikację wykonano na bazie DNA, poprzez sekwencjonowanie genu kodującego 16S rrna. Analiza makroskopowa Badano morfologię kolonii tworzonych przez badany szczep bakterii i szczepy promieniowców. Oceniano wielkość, kształt, brzeg, przejrzystość, barwę i otoczenie oraz profil kolonii. Badania prowadzono w 24 godzinnych hodowlach bakterii i w 7 dobowych hodowlach promieniowców. Analiza mikroskopowa Ocenę mikroskopową wykonywano przy użyciu mikroskopu AXIO Scope. A1 firmy Carl Zeiss przy 400-krotnym powiększeniu całkowitym. Analizowano kształt i wielkość komórek. Badania prowadzono na 24 godzinnych hodowlach bakterii i na 21 dobowych hodowlach promieniowców. Zdolność ruchu Zdolność ruchu badanych szczepów oceniano w preparatach przyżyciowych z 24 h hodowli bakterii i 48 h hodowli promieniowców. Preparaty obserwowano przy 400-krotnym powiększeniu całkowitym, przy użyciu mikroskopu AXIO Scope. A1 firmy Carl Zeiss.

46 Materiał i metody badań 46 Optymalna temperatura wzrostu Optymalną temperaturę wzrostu szczepu bakterii badano na płytkach z bulionem i glukozą a szczepów promieniowców na płytkach z podłożem MBA. Płytki poddano inkubacji w temperaturach: 4, 14, 25, 30, 37 i 55 C. W przypadku bakterii odczytu dokonywano po 24h (temperatury inkubacji > 30 C) i po 5 dobach (temperatury inkubacji < 14 C) a w przypadku promieniowców odczytu dokonywano po 7 i 14 dobach (temperatury inkubacji > 25 C) oraz po 6 tygodniach (temperatury inkubacji < 14 C). Jako optymalną temperaturę wzrostu wybierano taką, w której obserwowano największy wzrost danego szczepu. Sekwencjonowanie Szczepy Bacillus species T16, Streptomyces sp. KP2 poddano identyfikacji metodą sekwencjonowania genu kodującego 16S rrna. Izolacji DNA dokonano przy użyciu kitów GeneMatrix Tissue and Bacterial DNA Purification kit firmy EURx. Łańcuchową reakcję polimerazacji (PCR) przeprowadzono w termocyklerze firmy Biometra Germany (30 cykli) w następujących warunkach: temperatura początkowej denaturacji 94 C przez 3 min, denenaturacja 94 C przez 1 min, przyłączenia primerów 50 C przez 45 s, wydłużanie 72 C przez 2 min, wykańczanie 72 C przez 5 min. Wykorzystano startery: (27F) AGAGTTTGATCGTGGCTCAG i (1492LR) GGTTACCTTGTTACGACT. Mieszanina reakcyjna zawierała: Master Mix 25 μl, 2 primery po 2 μl każdy, DNA 2 μl, wodę dejonizowaną 19 μl. Produkty PCR zostały rozdzielone elektroforetycznie na 1% żelu agarowym w buforze TAE, przy napięciu 120V przez 15min. Następnie prowadzono elektroforezę, w celu sprawdzenia wyniku reakcji PCR. Stosowano 1% żel agarozowy w buforze TAE z dodatkiem bromku etydyny (5 μl/100 ml żelu). Na dołek nanoszone było 5 μl próby zawierającej 3 μl buforu obciążającego. Standard stanowiło 8 μl markera GeneRuler 1 kb. Sekwencjonowanie przeprowadziła firma Genomed S.A. Uzyskane wyniki, w formacie FASTA wprowadzono do bazy BLAST, gdzie zostały poddane analizie. Utrwalanie mikroorganizmów szczepionkowych W celu przygotowania utrwalonej formy szczepionki bakterii mezofilnych B. cereus B5e/sz wykorzystano następujące metody: liofilizację, suszenie fontannowe i rozpyłowe, ekstruzję oraz suszenie mikrofalowe. Zastosowano następujące środki osłonowe: skrobię, mleko odtłuszczone, laktozę, serwatkę, maltodekstryny, pepton, sacharozę i żelatynę. Stacjonarne hodowle bakterii, wykorzystane do namnożenia biomasy prowadzono w podłożu

47 Materiał i metody badań 47 serwatkowym przez 12 h. Szczepionkę promieniowców S. violaceolatus KP2 i grzybów strzępkowych T. atroviride KP1 przygotowano poprzez suszenie na odpadowych surowcach biologicznych (odpowiednio na rozdrobnionej pszenicy i wysłodkach) w temperaturze 30 C przez okres czterech dób. Posiewy z utrwalonych preparatów wykonywano w trzech powtórzeniach, dla których wyznaczono odchylenie standardowe. Liofilizacja Podczas liofilizacji wykorzystano pięć czynników osłonowych: mleko odtłuszczone, maltodekstryny, laktozę, sacharozę i pepton o stężeniu 5 i 10% każdy. Proces prowadzono w liofilizatorze CHRIST AL.PHA 2-4 o pojemności kondensatora lodu równej 4 kg i wydajności na poziomie 4 kg/24 h. Temperatura zamrażania wynosiła -15 C i była utrzymywana przez 4 h, natomiast cały proces trwał h. Suszenie fontannowe [Pasławska 2008] W suszeniu fontannowym wykorzystano suszarkę Instytutu Inżynierii Rolniczej (Plazmotronika SM-200). Temperatura wlotu komory suszarniczej wynosiła 86 C a temperatura wylotu była na poziomie 60 C. Jako nośnik zastosowano wiórki drzewne w ilości 30 g na 60 ml płynu pohodowlanego. Czas suszenia wynosił 15 min. Suszenie rozpyłowe Suszenie rozpyłowe odbywało się w suszarce 190 Mini Spray Ryder Temperatura wlotu do komory suszarniczej wynosiła 149 C a wylotu była na poziomie 86 C. Płyn pohodowlany przed suszeniem zagęszczono 4-krotnie na wyparce Rotavapor R-151 firmy Büchi, w temperaturze 60 C i ciśnieniu 0,0097Mpa. Szybkość suszenia wynosiła 0,5 L/1 h. Zastosowano następujące protektatny: skrobia, mleko odtłuszczone, laktoza, serwatka, maltodekstryny, pepton, sacharoza i żelatyna w ilości 2%. Ekstruzja [Tomaszewska-Ciosk i wsp. 2012] Utrwalanie metodą ekstruzji prowadzono metodą natryskową i poprzez pułapkowanie wewnątrz ekstrudowanych kulek (metoda wgłębna). W metodzie natryskowej, uprzednio przygotowane kulki skrobiowe opryskiwano dwukrotnie zagęszczonym płynem pohodowlanym, a w metodzie wgłębnej zagęszczony płyn pohodowlany pułapkowano wewnątrz kulek. Oba procesy prowadzono w temperaturze 70 i 170 C. Suszenie mikrofalowe [Pasławska M. 2007] Suszenie mikrofalowe prowadzono w suszarce mikrofalowej Instytutu Inżynierii Rolniczej (typ SM-200). Stosowana moc mikrofal była na poziomie120w. Płyn pohodowlany przed suszeniem zagęszczono 2-krotnie na wyparce Rotavapor R-151 firmy Büchi, w

48 Materiał i metody badań 48 temperaturze 60 C i ciśnieniu 0,0097 Mpa. Do 30 ml zagęszczonego płynu pohodowlanego dodawano 2% maltodektryny w charakterze protektanta. Przygotowanie szczepionek kompostowych Szczepionki stanowiła biomasa wytypowanych szczepów bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych. Szczegółowy skład podłoży i gęstość biomasy inokulum ujęte są w Tab. 11. Przygotowanie szczepionek bakterii Forma nieutrwalona W skali laboratoryjnej szczepionkę stanowiła 4 6 h hodowla wstrząsana w podłożu serwatkowym w temperaturze 30 C (mezofile) i 55 C (termofile) W skali półtechnicznej szczepionkę stanowiła 12 h hodowla w bioreaktorze mieszadłowym* (6L) w podłożu serwatkowym, prowadzona w temperaturze 30 C, przy obrotach mieszadła 500 rpm i napowietrzaniu na poziomie 1 dm 3 /min, zaszczepiana 600 ml wstrząsanej hodowli inokulacyjnej. *Bioreaktor model AK-210 o pojemności całkowitej 10 L, zaopatrzony w mieszadło turbinowe (600 rpm), przepływ powietrza na poziomie 1 v/v/m. Forma utrwalona W skali półtechnicznej utrwaloną formę szczepionki stanowił liofilizat w ilości 6 g/600 ml podłoża serwatkowego ożywiany w temperaturze 30 C (mezofile) i 55 C (termofile) przez 2 3 h. Przygotowanie szczepionek promieniowców Forma nieutrwalona W skali laboratoryjnej i półtechnicznej szczepionkę stanowił zmyw z 7-dobowej hodowli na płytkach MBA. Do kompostów laboratoryjnych wprowadzano 15 ml zmywu, a do półtechnicznych 1 L. Forma utrwalona W skali półtechnicznej szczepionkę stanowiła 14-dobowa hodowla na zmielonych ziarnach pszenicy, utrwalona poprzez suszenie w 30 C, okresowo wstrząsana. Przygotowanie szczepionek grzybów strzępkowych Forma nieutrwalona W skali laboratoryjnej i półtechnicznej szczepionkę stanowił zmyw z 14-dobowej hodowli na płytkach PDA. Do kompostów laboratoryjnych wprowadzano 15 ml zmywu, a do półtechnicznych 1 L.

49 Materiał i metody badań 49 W skali półtechnicznej szczepionkę stanowiła 14-dobowa hodowla solid state w kolbach Roux`a. Podłoże stanowiły zmielone wysłodki buraczane o wilgotności 60% w ilości 100 g/kolbę. Podłoża poddano dwukrotnej sterylizacji. Każdą kolbę zaszczepiono 5mL inokulum (zmyw z płytek PDA). Forma utrwalona W skali półtechnicznej szczepionkę grzyba strzępkowego T. atroviride KP1 stanowiła 14- dobowa hodowla solid state w kolbach Roux`a na zmielonych wysłodkach buraczanych suszona w temperaturze 30 C, okresowo wstrząsana Prowadzenie kompostowania Proces kompostowania szczeciny świńskiej prowadzono w skali laboratoryjnej i półtechnicznej. Masę kompostową stanowiły natywna lub rozdrobniona szczecina, wiórki drzewne, słoma, kurzeniec oraz pył węglowy dodawane w różnym składzie i proporcjach [Tab. 12]. Trociny, jako surowiec roślinny, bilansowały ilość węgla w masie kompostu, a dodatkowo poprawiały strukturę kompostu, dzięki tworzeniu wolnych przestrzeni umożliwiających dostęp tlenu do poszczególnych jego warstw. Pył węglowy sprzyjał utrzymywaniu wilgotności na stałym poziomie 60%, zapewniającym prawidłowy przebieg rozkładu związków organicznych. Przebieg każdego procesu monitorowano poprzez pomiary: temperatury, ph, wilgotności oraz prowadzono dokumentację fotograficzną. W trakcie kompostowania okresowo pobierano próby, w których wykonywano analizy mikrobiologiczne, enzymatyczne, fizyczne, chemiczne oraz testy roślinne. Po zakończeniu procesu dokonywano również oceny makroskopowej kompostu (barwy/struktury) oraz analizowano zmiany dotyczące morfologii i struktury szczeciny z wykorzystaniem mikroskopu elektronowego. Końcowy efekt procesu oceniano na podstawie składu mineralnego otrzymanego kompostu. Kompostowanie prowadzono z zastosowaniem szczepionki monokulturowej i czteroorganizmowej (SZ1 i SZ2). Jako szczepionki kompostowe stosowano: -monokultury: B. cereus B5e/sz, B.subtilis P22, B. subtilis T16, B. lichenifirmis KT20, S. violaceolatus KP2, T. atroviride KP1 -szczepionki wieloorganizmowe: SZ1 B. cereus B5e/sz, B. licheniformis KT20, S. violaceolatus KP2, T. atroviride KP1, SZ2 - B. cereus B5e/sz, B. subtilis T16, B. subtilis P22, T. atroviride KP1

50 Materiał i metody badań 50 Tab. 12. Skład i proporcje masy kompostowej Składniki Proporcje składników Skala Masa Szczecina Sieczka Trociny Pył węgla Kurzeniec C org /N og Warianty badań kompostu brunatnego I a Laboratoryjna 150 g ,1 b Laboratoryjna 150 g ,0 c Laboratoryjna 150 g 2 0,8-0,4 0,8 10,1 Półtechniczna 60 kg ,1 II Laboratoryjna 120 g ,0 III Laboratoryjna 125 g ,4 IV Laboratoryjna 111 g ,9 V Laboratoryjna 160 g ,1 VI Laboratoryjna 168 g ,9 VII Laboratoryjna 168 g ,2 Skala laboratoryjna Komposty laboratoryjne sporządzano w szklanych kolbach Rouxa o pojemności 1dm 3. Wszystkie składniki okresowo mieszano w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu natlenienia, niezbędnego dla rozwoju pożądanej mikroflory. Masa kompostów wynosiła od 111 do 168 g [Tab. 12]. Inokulum stanowiło 10% masy kompostu. Kontrole stanowiły masy kompostowe nieinokulowane oraz sterylne. Kompostowanie prowadzono przez okres od 4 do 6 tygodni. Inokulacja szczepionki jednoorganizmowej odbywała się w pierwszej dobie procesu, a poszczególne szczepy wchodzące w skład szczepionki czteroorganizmowej dodawane były pojedynczo w odstępach trzydobowych [Tab. 13]. Tab. 13. Inokulacja szczepionek wieloorganizmowych w kompoście laboratoryjnym Szczepionka SZ1 Szczepionka SZ2 Szczepy Doby Szczepy Doby B. cereus B5e/sz 1 B. cereus B5e/sz 1 B. licheniformis KT20 4 B. subtilis T16 4 S. violaceolatus KP2 7 B. subtilis P22 7 T. atroviride KP1 10 T. atroviride KP1 10

51 Materiał i metody badań 51 Skala półtechniczna Masa kompostów półtechnicznych wynosiła 60 kg, a w jej skład wchodziła rozdrobniona szczecina, trociny oraz pył węgla brunatnego [Tab. 12]. Inokulum stanowiło 10% masy kompostu i wprowadzane było w różnych odstępach czasowych w zależności od fazy kompostowania [Tab. 14]. Kontrolę stanowiła masa kompostowa nieinokulowana. Kompostowanie prowadzono przez okres od 5 do 10 tygodni w bioreaktorach z mieszadłem poziomym o pojemności 200 dm 3, które znajdowały się na terenie Instytutu Górnictwa Odkrywkowego Poltegor we Wrocławiu [Rys. 8]. Reaktor ten zaopatrzony był w agregat sprężarkowy, przewody zasilające powietrzem, przetwornice częstotliwości, skrzynkę sterowniczą oraz przewody elektryczne i sterownicze. Układ wyposażony był ponadto w wentylację wymuszoną za pośrednictwem kompresora HL 275/50 (30 m 3 na dobę). Szybkość obrotów mieszadła w reaktorze dynamicznym wynosiła 8 obr/min. Inokulacja szczepionki jednoorganizmowej B. cereus B5e/sz odbywała się w pierwszej i czternastej dobie procesu, a poszczególne szczepy wchodzące w skład szczepionki wieloorganizmowej dodawane były pojedynczo w zależności od zmian temperatury masy kompostowej [Tab. 14] Rys. 8. Reaktor mieszadłowy Tab. 14. Kolejność inokulacji kompostów wybranymi szczepami drobnoustrojów wchodzącymi w skład szczepionki jednoorganizmowej oraz szczepionek czteroorganizmowych SZ1 i SZ2 Szczepionka jednoorganizmowa SZ1 Szczepionki czteroorganizmowe Szczep Doby Szczep Doby Szczep Doby B. cereus B5e/sz SZ2 1 B. cereus B5e/sz 1 B. cereus B5e/sz + B. subtilis T16 14 B. licheniformis KT20 7 B. subtilis T16 15 S. violaceolatus KP2 + T. atroviride KP1 20 B. subtilis P22 29 T. atroviride KP1 41 2

52 Materiał i metody badań 52 Badanie przebiegu kompostowania Badania fizyczne Pomiar temperatury W kompostach laboratoryjnych temperatury badano jeden raz na dobę przy pomocy termopary CHY 504 RTD THERMOMETHER. W kompostach półtechnicznych temperatury badano jeden raz na dobę przy pomocy miernika temperaturowego TB-Pt100-03A (zakres pomiarowy: -50 C +180 C; z dokładnością 0,2 C). Pomiar wilgotności Pomiaru wilgotności w kompostach laboratoryjnych i półtechnicznych dokonywano metodą wagową, przy użyciu wagosuszarki firmy RADWAG WPS 110S w temperaturze 105 C. Pomiar ph W kompostach laboratoryjnych odczyn masy kompostowej badano w odstępach tygodniowych. W tym celu 2 g próby kompostu zalewano 20 ml wody wodociągowej, mieszano przez 30 min. Wartość ph odczytywano za pomocą szklanej elektrody ph- metrem CP- 505 firmy Elmetron [Ostrowska 1991]. W kompostach półtechnicznych odczyn masy kompostowej badano codziennie i postępowano analogicznie jak przy kompostach laboratoryjnych. Ubytek suchej masy w hodowlach wstrząsanych i kompostach Po zakończeniu hodowli płynnych pierze i szczecinę odsączano na sączkach jakościowych a następnie suszono. W kolbach Rouxa ubytek suchej masy kompostu mierzono poprzez ważenie hodowli, z których nie pobierano prób, na wadze SARTORIUS AG GOTTINGEN Typ PT1200. Ubytek suchej masy stanowiła różnica między wyjściową masą próby a jej masą końcową, który wyrażono procentowo. W kompostach w skali półtechnicznej monitorowano ubytek suchej masy metodą wagową, przy użyciu wagosuszarki firmy RADWAG WPS 110S w temperaturze 105 C. Ocena makroskopowa Makroskopową ocenę kompostu oraz wyniki badań interakcji mikroorganizmów w hodowli na płytkach dokumentowano za pomocą aparatu cyfrowego firmy OLYMPUS.

53 Materiał i metody badań 53 Ocena mikroskopowa Do obserwacji komórek drobnoustrojów oraz postępów rozkładu szczeciny wykorzystywano mikroskop świetlny firmy Carl Zeiss (powiększenie całkowite 100x i 400x) oraz skaningowy mikroskop elektronowy (powiększenie całkowite 1000x x). Badania mikrobiologiczne Metoda płytkowa Kocha Do badania mikroorganizmów bytujących w środowisku kompostowym wykorzystano metodę płytkową Kocha. Na podstawie wzrostu drobnoustrojów na podłożach stałych oceniano liczebność następujących grup drobnoustrojów: -ogólną liczbę bakterii na podłożu bulion z glukozą, w temperaturze 30 C, po czasie 24 h -bakterii termofilnych na podłożu bulion z glukozą, w temperaturze 55 C, po czasie 24 h -bakteryjnych przetrwalników na podłożu bulion z glukozą, w temperaturze 30 C, po czasie 24 h (przetrwalniki pobudzano do germinacji poprzez szok termiczny: 80 C/10 min) -bakterii proteolitycznych na podłożu agar mleczny, w temperaturze 30 C, po czasie h -promieniowców na podłożu MBA, w temperaturze 30 C, po czasie 72 h -grzybów strzępkowych na podłożu PDA z oksytetracykliną, w temperaturze 25 C, po czasie 7 dób Wykonywano posiewy z trzech wybranych rozcieńczeń i obliczano średnią liczbę jednostek tworzących kolonie w mililitrze roztworu L (jtk/ml) według wzoru: L = [(n 1 f 1 ) + (n 2 f 2 ) + (n 3 f 3 )] / 3 n - średnia liczba kolonii na płytce z danego rozcieńczenia f - faktor rozcieńczenia 3 ilość rozcieńczeń Wszystkie posiewy wykonywano w trzech powtórzeniach, dla których wyznaczono odchylenie standardowe. Komora Thoma W komorze Thoma liczono ilość komórek drożdży i zarodników grzybów strzępkowych w mililitrze roztworu (0,1% Tween) według wzoru: L = a f a średnia liczba zarodników w jednym kwadracie f faktor rozcieńczenia

54 Materiał i metody badań 54 Badanie parametrów chemicznych Oznaczenia mineralno-nawozowe wybranych prób kompostowych oraz poszczególnych komponentów kompostu wykonywane były w Instytucie Nauk o Glebie i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Badanie poszczególnych frakcji węgla, azotu i siarki [Pansu 2006] obejmowały: węgiel organiczny (C org ) metodą oksydymetryczną z użyciem K 2 Cr 2 O 7 zawartość węgla poszczególnych grup związków organicznych oznaczano metodą analizy frakcjonowanej wg Stevensona [1994]: *C w - węgiel wodnorozpuszczalny w wodzie przy stosunku masy próbki do wody równym 1:20 *C K - węgiel rozpuszczalny w kwasie siarkowym (VI) (białka, hemicelulozy, kwasy fulwowe) wydzielony 5% kwasem siarkowym na gorąco (80 C) *C BIT- związki z grupy bitumin ekstrahowane mieszaniną alkohol:benzen (1:2) *C CEL - frakcja węgla celulozowego ekstrahowana 72% kwasem siarkowym (VI) na zimno *C ALK - frakcja węgla organicznego rozpuszczalna w 0,1M NaOH (kompleks lignino humusowy) *C R - węgiel resztkowy oznaczano oksydometrycznie *C KH - kwasy huminowe po zakwaszeniu kwasem siarkowym (VI) do ph = 2 *C KF - kwasy fulwowe po zakwaszeniu kwasem siarkowym (VI) do ph = 2 azot ogólny (N og ) metodą Kiejdahla w aparacie firmy Büchi azot amonowy i azotanowy (N-NH 4 i N-NO 3 ) w ekstraktach wodnych 1:100 spektrofotometrycznie siarkę ogólną (Sog) w aparacie CS-MAT Zawartość makro- i mikroskładników Zawartości całkowite wybranych makroskładnikow (P, K, Mg, Na, Ca) oraz mikroskładników (Ni, Fe, Cr, Pb, Zn, Mn, Cu, Cd) oznaczano metodą ICP po mineralizacji mieszaniną stężonego kwasu solnego i azotowego w stosunku objętościowym 3:1. Natomiast zawartość całkowitą Hg mierzono na analizatorze AMA. Chemiczne wskaźniki dojrzałości kompostu Na podstawie chemicznej analizy poszczególnych składników mineralnych kompostu wyliczono wskaźniki jego dojrzałości: C org /N org stosunek węgla organicznego ogółem do azotu ogółem

55 Materiał i metody badań 55 C w /C org wskaźnik rozpuszczalności węgla N-NH 4 /N-NO 3 wskaźnik utlenienia mineralnych form azotu HR 1 = C KH /C KF wskaźnik humifikacji (humification ratio) P KH = (C KH /C ALK ) udział kwasów huminowych w masie kompostowej P KF = (C KF /C ALK ) udział kwasów fulwowych w masie kompostowej Uzyskane wyniki analiz, zinterpretowano w oparciu o wartości uśrednione z 2 powtórzeń. Testy biologiczne kiełkowania nasion rzeżuchy [Hoekstra i wsp. 2002] Badanie wykonano w ekstraktach czterech wybranych kompostów półtechnicznych inokulowanych monokulturą B. cereus B5e/sz oraz szczepionkami wieloorganizmowymi SZ1 i SZ2, a także kompostu kontrolnego. Próbki przygotowywano poprzez naważenie 10 g s.m. kompostu i zawieszenie jej w 100 ml wody destylowanej. Następnie przetrzymywano ją 15 h w ciemni, po czym wirowano przy 10 tyś. obr./min. Supernatant dodatkowo poddawano filtracji na bibule Whatman 1. Na pytkach Petriego umieszczano 5 warstw bibuły, 20 ziaren rzeżuchy, które zwilżano 5ml przygotowanego ekstraktu. Próby przetrzymywano w szafie klimatycznej w temperaturze 25 C i wilgotności na poziomie 90%. Kontrolę stanowił roztwór standardowego nawozu mineralnego, zawierającego sole w następujących stężeniach (g/dm 3 ): NH 4 NO 3-0,014; (NH 4 ) 2 HPO 4-0,043; KNO 3-0,066; MgO - 0,056. Punkt odniesienia stanowiła próba z nasionami zwilżonymi wodą destylowaną, której wynik przyjęto jako 100%. Wskaźniki kiełkowania nasion rzeżuchy: RSG (relative seed germination/wskaźnik względnego kiełkowania nasion), RRG (relative root growth/wskaźnik relatywnego wzrostu korzenia), GI (germination index/wskaźnik kiełkowania) oznaczono po 72 h hodowli nasion rzeżuchy w optymalnych warunkach. Wszystkie próby wykonywano w trzech powtórzeniach, wynik stanowiła ich średnia wartość wraz z odchyleniem standardowym. Wskaźniki RSG, RRG i GI obliczano ze wzorów: RSG (%) = (L k / L 0 ) 100% L k średnia liczba kiełków w próbie badawczej liczona z 3 powtórzeń L 0 - średnia liczba kiełków w próbie z wodą destylowaną liczona z 3 powtórzeń RRG (%) = (D k / D 0 ) 100% D k średnia długość korzenia kiełków w próbie badawczej liczona z 3 powtórzeń D 0 - średnia długość korzenia kiełków w próbie z wodą destylowaną liczona z 3 powtórzeń GI (%) = (RSG RGG) / 100%

56 Materiał i metody badań Metody analityczne Metody wykorzystane w badaniach płynów hodowlanych Aktywność proteolityczna i keratynolityczna Aktywność proteaz i keratynaz w płynie pohodowlanym oznaczano zmodyfikowaną metodą Ansona [Rodziewicz i Łaba 2008]. Metoda polega na oznaczaniu stężenia tyrozyny i tryptofanu, uwolnionych w trakcie reakcji enzymatycznej, które rozpuszczalne są w kwasie trichlorooctowym (TCA). Substratem reakcji proteolitycznej była kazeina Casein hammersten biochemical (2% roztwór w danym buforze) a keratynoliytycznej keratyna rozpuszczalna (roztwór o stężeniu 1 mg/ml w danym buforze). Parametry reakcji proteolitycznej i keratynolitycznej zestawiono w Tab. 8. Jednostkę aktywności proteolitycznej [JP] i keratynolitycznej [JK] definiowano jako wzrost absorbancji produktów rozpuszczalnych w TCA o 0,01 w przeliczeniu na 1 cm 3 enzymu, w czasie 1 min, w optymalnych warunkach i obliczano ze wzoru: [JP]/[JK] = ((W-K) R / t)) 100 W stężenie tyrozyny w próbie badanej (μg/cm 3 ) K - odczyt z krzywej standardowej dla próby kontrolnej (μg/cm 3 ) R faktor rozcieńczenia płynu pohodowlanego, t czas trwania reakcji [min] Badanie wpływu aktywatorów i inhibitorów na aktywność proteaz i keratynaz Badano wpływ dodatku inhibitorów i aktywatorów na aktywność enzymów proteolitycznych [Tab. 9]. Przebieg reakcji enzymatycznej tj. opisano wyżej, z dodatkiem roztworu aktywatora bądź inhibitora lub obu tych czynników. Procent inhibicji i aktywacji mierzono względem próby kontrolnej: % Inhibicji = 100% - (I / K) 100% % Aktywacji = (A / K) 100% - 100% Aktywację proteaz w obecności inhibitora (Z) liczono ze wzoru: Z = 100% - [(K AI) / (K I)] 100% I aktywność proteolityczna w obecności inhibitora A - aktywność proteolityczna w obecności aktywatora K aktywność proteolityczna w próbie kontrolnej AI aktywność proteolityczna w obecności aktywatora i inhibitora

57 Materiał i metody badań 57 Tab. 8. Warunki reakcji proteolitycznej i keratynolitycznej w płynach pohodowlanych Proteazy Keratynazy Szczep Bufor ph Temp. [ C] Czas reakcji [min] Bufor ph Temp. [ C] Czas reakcji [min] B. cereus B5e/sz Tris/HCl 0,05M, Tris/HCl 0,05M, 45 5 ph 7,4 ph 7,5 B. subtilis P22 Uniwersalny, ph 8, Uniwersalny, ph B. polymyxa B Gly/NaOH 0,05M, 40 5 ph 10,2 B. subtilis B Boranowy 0,1M, ph 7,5 B. subtilis Boranowy 0,1M, ph 7,5 Bacillus sp. T Boranowy 0,1M, ph 7,5 Bacillus sp. T Tris-HCl 0,2M, 40 5 ph 8,0 B. subtilis T16 Uniwersalny, ph 7, Uniwersalny, ph 7, B. licheniformis Tris-HCl 0,2M, Tris-HCl 0,1M, 30 5 KT20 ph 8,7 ph 8,1 S. variabilis KP Tris-HCl 0,1M, 40 5 ph 7,5 S. violaceolatus KP2 Tris-HCl 0,1M, ph 8, Tris-HCl 0,1M, ph 8, Y. lipolytica Uniwersalny, ph 7,5 40 2,5 PII6a G. candidum Boranowy 0,1M, 40 2,5 PH1 ph 7,5 T. atroviride KP1 Tris-HCl 0,2M, Tris-HCl 0,05M, 40 5 ph 8,0 ph 8,0 T. asperellum Tris-HCl 0,2M, Tris-HCl 0,05M, 50 5 B35 ph 7,5 ph 9,0 Penicillum sp Boranowy 0,1M, K84 ph 7,5 Penicillum sp. GK Boranowy 0,1M, ph 7,

58 Materiał i metody badań 58 Tab. 9. Inhibitory i aktywatory zastosowane w reakcji proteolitycznej Inhibitory/Aktywatory Rozpuszczalnik Stężenie w reakcji [mm] EDTA (sól sodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) Inhibitory Bufory: Uniwersalny, Tris-HCl, Glicyna-NaOH NEM (N-etylowy imid kwasu maleinowego) Woda destylowana 2, 5 PMSF (fluorek fenylometylosulfonowy) Izopropanol 2, 5 Aktywatory L-Cysteina Woda destylowana 2, 5 L-Seryna Woda destylowana 1, 5 CaCl 2 Woda destylowana 2, 1 Aktywatory + Inhibitory EDTA (2mM) + Ca (10mM) NEM (5mM) + Cys (5mM) NEM (5mM) + Cys (2mM) PMSF (2mM) + Ser (1mM) PMSF (5mM) + Ser (1mM) 2 Otrzymywanie keratyny rozpuszczalnej Keratynę rozpuszczalną otrzymano zmodyfikowaną metodą Wawrzkiewicz [Wawrzkiewicz i inni 1987]. W tym celu 2 g odtłuszczonych piór gotowano w 100 ml DMSO (dimetylosulfotlenek) w łaźni piaskowej pod chłodnicą zwrotną przez 2-3 h, aż do całkowitego rozpuszczenia piór. Po wystygnięciu keratynę wytrącano acetonem (w stosunku 1:4) i przetrzymywano przez 1 h w temperaturze 4 C. Następnie mieszaninę wirowano przez 20 min przy przyspieszeniu rpm (ang. rotation per minute), a otrzymany osad rozpuszczono w 0,2 M NaOH a następnie zneutralizowano 0,2 M HCl i zawieszono w wybranym buforze o wskazanym ph. Zawartość białka w keratynie ustalano metodą Lowry ego. Do analizy przygotowywano roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Oznaczanie aktywności CMC-az i ksylanaz Metoda polega na kolorymetrycznym oznaczeniu barwnych związków powstających w wyniku utleniania cukrów redukujących (produktów hydrolizy substratu) przy udziale kwasu 3,5 dinitrosalicylowego (DNS). Substrat dla celulaz stanowił 1% roztwór soli sodowej karboksymetylocelulozy (CMC) w 0,5 M buforze octanowym o ph 4,8 a dla

59 Materiał i metody badań 59 ksylanaz 1% roztwór ksylanu brzozowego w 0,05 M buforze octanowym o ph 4,8. Pomiaru absorbancji dokonywano przy długości fali λ= 530nm. Aktywność celulolityczną i ksylanolityczną wyrażono w jednostkach odpowiednio [JCe] i [JKsy], gdzie 1 JCe i 1 JKsy odpowiada stężeniu μm cukrów redukujących uwolnionych na skutek działania enzymów zawartych w 1 ml płynu pohodowlanego w czasie 1 minuty, w temperaturze 50 C, w buforze octanowym o ph 4,8. Oznaczanie aktywności chitynaz [zmodyfikowana metoda Witkowska i wsp. 2009] Metoda polega na utlenieniu cukrów redukujących uwolnionych podczas hydrolizy substratu chitynowego przy udziale kwasu 3,5-dninitrosalicylowego (DNS). Powstałe barwne związki oznacza się kolorymetrycznie przy długości fali λ= 530nm. Substrat reakcji stanowiła 4% zawiesina chityny w 0,05 M buforze octanowym (ph 4,8). Pomiaru absorbancji dokonywano przy długości fali λ= 530nm. Aktywność chitynaz wyrażono w jednostkach [JCh], gdzie 1 JCh to stężenie (wyrażone w μm) uwolnionej N acetyloglukozoaminy w czasie 1 min przez enzymy zawarte w 1 ml płynu pohodowlanego, w temperaturze 40⁰C, w środowisku 0,05 M buforu octanowego o ph 4,8. Oznaczanie aktywności lipaz [Rywińska i wsp. 2005] Metoda polega na oznaczaniu ilości kwasów tłuszczowych, uwolnionych z substratu pod wpływem lipaz i zobojętnionych wodorotlenkiem sodu w obecności fenoloftaleiny. Substrat reakcji enzymatycznej stanowiła 50% emulsja oliwy z oliwek (Melissa extra vergine) otrzymana poprzez zhomogenizowanie 25 ml oliwy z 5 ml 5% roztworu wodnego gumy arabskiej, 10 ml 0,075 M CaCl 2 i 10 ml 1,0 M NaCl. Do reakcji enzymatycznej substrat rozcieńczano 5-krotnie 0,05 M buforem Tris-HCl o ph 8,0. Próby właściwe i kontrolne miareczkowano 0,05 M roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny. Aktywność lipolityczną wyrażono w jednostkach [JL], gdzie 1 JL odpowiada ilości 1 μmol NaOH potrzebnego do zobojętnienia kwasów tłuszczowych powstałych w wyniku działania lipaz zawartych w 1 ml płynu pohodowlanego w ciągu godziny, w temperaturze 37 C, w 0,05 M buforze Tris HCl o ph 8,0. Oznaczenie zawartości białka metodą Lowry ego [Lowry i wsp. 1951] Płyn pohodowlany rozcieńczano 2-5 krotnie 0,9% roztworem NaCl. Absorbancję mierzono przy długości fali λ=750 nm. Stężenie rozpuszczalnego białka odczytywano z krzywej i wyrażano w [µg/ml].

60 Materiał i metody badań 60 Oznaczenie grup aminowych aminokwasów metodą TNBS [Snyder i Sobociński1975] Metoda TNBS wykorzystywana jest do oznaczania ilości grup aminowych w białkach lub peptydach oraz do oznaczania N-końcowych aminokwasów. Reakcja kwasu TNBS (trinitrobenzoesowego) z wolnymi grupami aminowymi aminokwasów daje barwne, żółte kompleksy, które oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 420 nm. Absorbancję mierzono przy długości fali 420 nm wobec próby ślepej na spektrofotometrze Smart Spec Plus (BioRad). Próba ślepa zamiast płynu pohodowlanego zawierała dodatkowe 0,05 ml boraksu. Krzywą standardową wykonano dla roztworu glicyny w zakresie od 0 15 μg/ml. Stężenie wolnych grup aminowych aminokwasów odczytywano z krzywej i uwzględniając rozcieńczenie wyrażano w mg/ml płynu pohodowlanego: [µg/ml] = A / a R A absorbancja odczytana przy długości fali 420 nm R faktor rozcieńczenia płynu pohodowlanego w reakcji (20 razy) a współczynnik kierunkowy krzywej standardowej Oznaczenie wolnych grup sulfhydrylowych metodą Elmana [Riener i wsp. 2002] Metoda polega na reakcji odczynnika Ellmana (DTNB 2- kwas 5,5 dithio-bisnitorbenzoesowy) z anionami tiolowymi (R-S - ) w wyniku, której powstaje kompleks (R-S- TNB - ) i kwas 5-thio-2-nitrobenzoesowy (TNB 2- ). Drugi produkt reakcji (TNB 2- ) wykazuje intensywną absorpcję światła przy 412 nm i jest oznaczany spektrofotometrycznie. Przebieg oznaczenia przedstawiony jest w tabeli 10. Ilość grup sulfhydrylowych wyrażona została w [µg/ml]: molsh = 0,00122L R (A 412s A 412r A 412p ) / (Δε cm) [µg/ml] = molsh 10 6 M A 412s próba właściwa, A 412r kontrola białka, A 412p kontrola odczynnika 0,00122 L objętość mieszaniny reakcyjnej Δε 412 zmiana absorpcji molowej kwasu 5-tio-2-nitrobenzoesowego (TNB) przy 412 nm równa M -1 cm -1 1 cm grubość kuwety pomiarowej R faktor rozcieńczenia płynu pohodowlanego (10 razy) 10 6 przeliczenie jednostek (g/ml na µg/ml) M - masa cząsteczkowa cystyny 121,15 (g/mol)

61 Materiał i metody badań 61 Tab. 10. Oznaczenie stężenia grup sulfhydrylowych aminokwasów Próba Płyn pohodowlany [ml] PBS [ml] Bufor 8,2 [µl] Odczynnik Ellmana [µl] Woda dest. [µl] właściwa 0,1 0, kontrolna białka 0,1 0, kontrolna odczynnika Metody badania aktywności enzymatycznej kompostów Aktywność proteolityczna kompostu [Ladd i Butler 1972] Aktywność proteolityczną oznaczano wobec 1% kazeiny (BDH) zmodyfikowaną metodą Ladd i Butler i wyrażano w μmol uwolnionej tyrozyny w ciągu minuty na 1 g s.m. kompostu. Metoda ta polega na oznaczeniu spektrofotometrycznym produktu hydrolizy substratu kazeinowego (tyrozyny) rozpuszczonego w kwasie trichlorooctowym (TCA). Do 2 g kompostu dodawano 10 ml 1% roztworu kazeiny w 0,1 M buforze Tris/HCl o ph 8,1. Reakcję prowadzono w temperaturze 50 C przez 20 min, po czym zatrzymywano przy użyciu 12,5% roztworu TCA (kwas trichlorooctowy). Próby odwirowywano i dokonywano pomiaru absorbancji przy długości fali λ=280 nm na spektrofotometrze UV-Vis firmy Thermo Scientific (typ: Evolution 300BB) wobec próby kontrolnej. Krzywą standardową wykonano dla roztworu tyrozyny w zakresie 0 5 μg/cm 3. Aktywność proteolityczną wyrażano w jednostkach aktywności [μmol/min/g s. m.] w optymalnych warunkach i obliczano ze wzoru: [μmol/g s.m./min] = ((W-K) / a R 14)) / (x t) W stężenie tyrozyny w próbie badanej (μg/cm 3 ) K - odczyt z krzywej standardowej dla próby kontrolnej (μg/cm 3 ) R faktor rozcieńczenia a współczynnik kierunkowy prostej (a = 0,8489) 14 objętość całkowita [cm 3 ] x sucha masa próby [g] t czas trwania reakcji [min] Oznaczenia wykonywano w trzech powtórzeniach, wynik stanowiła średnia wartość wraz z odchyleniem standardowym.

62 Materiał i metody badań 62 Aktywność dehydrogenaz w kompoście [Casida i wsp. 1964] Aktywność dehydrogenaz oznaczano metodą Casida i wsp. względem chlorku 2,3,5- trifenylo tetrazoliowego (TTC) i wyrażano w μmol powstałego 1,3,5- trifenyloformazanu (TPF) w ciągu 20 h na 1 g s.m. kompostu. Metoda ta polega na redukcji bezbarwnego substratu TTC (2,3,5- trifenylotetrazoliowy chlorek) do barwnego TPF (trifenyloformazan), który jest wypłukiwany metanolem i oznaczany spektrofotometrycznie przy fali λ=485 nm. Do 30 g kompostu dodawano 0,5 ml 3% roztworu TTC, 9,5 ml wody dejonizowanej, 30 mg wysuszonego CaCO 3 i całość poddawano 20 h inkubacji w temperaturze 30 C. Reakcję przerywano dodatkiem 25 ml metanolu i próby ponownie umieszczano na 1 h w termostacie w temperaturze 30 C. Następnie odwirowywano je przy 12 tyś. obr./min, sączono i 5-krotnie rozcieńczano metanolem. Pomiaru absorbancji dokonywano na spektrofotometrze Spekol 11 firmy Carl Zeiss przy długości fali λ=485 nm wobec próby kontrolnej, gdzie TTC zastąpiono 0,5 ml wody destylowanej. Krzywą standardową wykonano dla roztworu TPF w zakresie 0 20 μg/cm 3. Oznaczenia wykonywano w trzech powtórzeniach, wynik stanowiła średnia wartość wraz z odchyleniem standardowym. Aktywność dehydrogenaz wyrażono w μmol wytworzonego formazanu na gram suchej masy próby kompostu w czasie 20h, którą obliczano według wzoru: [μmol TPF g -1 s. m. 20h -1 ] = [(W - K) V R] / g s. m. M a - W stężenie TPF w próbie badanej (μg/cm 3 ) - K odczyt z krzywej standardowej dla próby kontrolnej bez TTC (μg/cm 3 ) - V - objętość mieszaniny reakcyjnej (35 ml) - R faktor rozcieńczenia próby przed pomiarem - M - masa molowa TPF 300,4 g/mol - a współczynnik kierunkowy prostej (a = 0,0468)

63 Materiał i metody badań 63 SCHEMAT BADAŃ

64 Omówienie wyników Omówienie wyników 5.1. Badanie uzdolnień keratynolitycznych wyjściowych szczepów drobnoustrojów Keratynazy jako enzymy proteolityczne specyficzne wobec białek keratynowych, umożliwiają mikroorganizmom wykorzystanie tego trudnodegradowalnego białka jako źródła węgla i azotu. Przeprowadzono hodowle wstrząsane dziewięciu wybranych szczepów bakterii, dwóch szczepów promieniowców, dwóch szczepów drożdży i czterech szczepów grzybów strzępkowych na podłożu syntetycznym z 1% dodatkiem pierza kurzego, jako źródła węgla i azotu. Zastosowanie metody przesiewowej (ang. screening) pozwoliło na wytypowanie mikroorganizmów najbardziej uzdolnionych keratynolitycznie. Były nimi bakterie, których płyny pohodowlane wykazały najwyższą aktywność keratynolityczną w zakresie 22,0-59,0 JK [Rys. 9]. Do dalszych badań zakwalifikowano więc cztery szczepy bakterii z rodzaju Bacillus: B. cereus B5e/sz, B. subtilis P22, Bacillus sp. T16, B. licheniformis KT20. Znacznie niższą aktywnością pozakomórkowych keratynaz charakteryzowały się oba szczepy promieniowców Streptomyces sp. KP1 i Streptomyces sp. KP2. W płynie pohodowlanym tych szczepów aktywność keratynaz była na poziomie 6,0 JK [Rys. 9]. Rys. 9. Aktywność keratynolityczna w płynie pohodowlanym badanych szczepów bakterii, promieniowców, drożdży i grzybów strzępkowych (wartości najwyższe) Do dalszych badań włączono je ze względu na liczne doniesienia literaturowe, dokumentujące skuteczność promieniowców z rodzaju Streptomyces w degradacji keratyny. Możliwość ich wykorzystania jako komponentów szczepionki zweryfikowano w toku

65 Omówienie wyników 65 dalszych badań. Natomiast spośród sześciu szczepów grzybów, w tym dwóch szczepów drożdży i czterech szczepów grzybów strzępkowych, najwyższą zdolność do syntezy keratynaz wykazały drożdże Y. lipolytica PII6a (54 JK). Pozostałe szczepy syntezowały mniej enzymów keratynolitycznych na poziomie 10,0 16,0 JK. Do dalszych badań zakwalifikowano więc gatunki, których aktywność mieściła się w granicach 10,0-54,0 JK: Y. lipolytica PII6a, G. candidum PH1, T. atroviride KP1, T. asperellum B35 [Rys. 9] Interakcje między mikroorganizmami wybranymi do składu szczepionek Rodzaj wzajemnych oddziaływań pomiędzy drobnoustrojami stanowi jedno z podstawowych kryteriów komponowania składu szczepionki, w której szczególnie niepożądane są interakcje antagonistyczne. W testach biotycznych na podłożach stałych oceniano interakcje pomiędzy dwoma różnymi szczepami w obrębie bakterii z rodzaju Bacillus, w obrębie promieniowców z rodzaju Streptomyces, w obrębie grzybów strzępkowych z rodzaju Trichoderma, drożdży Yarrowia i Geotrichum oraz pomiędzy tymi grupami. Nie badano interakcji bakterii termofilnych z pozostałymi mikrooorganizmami, ze względu na różnice warunków ich hodowli. Przedstawicielami bakterii były szczepy B. cereus B5e/sz i B. subtilis P22, promieniowców szczepy Streptomyces sp. KP1 i Streptomyces sp. KP2, grzybów strzępkowych szczepy Trichoderma atroviride KP1 oraz T. asperellum B35, drożdży Yarrowia lipolytica PII6a i Geotrichum candidum PH1 [Tab. 15]. Większość badanych drobnoustrojów przejawiała neutralne zależności międzygrupowe i międzygatunkowe [Tab. 15, Rys. 10C]. Wśród bakterii antagonistyczne oddziaływania wykazywał m.in. szczep B. subtilis P22, hamując wzrost szczepu B. cereus B5e/sz, Streptomyces sp. KP1 i Y. lipolytica PII6a [Rys. 10A]. Bakterie z gatunku B. subtilis mają wysokie zdolności do wytwarzania antybiotyków peptydowych np. subtilizyn, umożliwiających im konkurencję z innymi drobnoustrojami o daną niszę ekologiczną. Najbardziej wrażliwą na oddziaływanie innych drobnoustrojów grupą okazały się drożdże. Wzrost obu szczepów był hamowany zarówno przez grzyby strzępkowe z rodzaju Trichoderma jak i bakterie z rodzaju Bacillus [Rys. 10B].

66 Omówienie wyników 66 Tab. 15. Interakcje mikroorganizmów wytypowanych jako szczepionki A. Antagonistyczna aktywność szczepu B. subtilis P22 - słupek w stosunku do promieniowca Streptomyces sp. KP1 - posiew wgłębny B. Hamowanie wzrostu drożdży Y. lipolytica PII6a (po lewej) przez szczep grzyba T. asperellum B35 (po prawej) C. Interakcje neutralne dwóch szczepów grzybów T. asperellum B35 (po prawej) i T. atroviride KP1 (po lewej) Rys. 10 (A, B i C). Przykłady różnych typów interakcji międzygatunkowych i międzygrupowych

67 Omówienie wyników 67 Z tego względu, pomimo ich stosunkowo dużych uzdolnień keratynolitycznych, zostały one wykluczone ze składu szczepionki. Spośród dwóch szczepów promieniowców do dalszych badań zakwalifikowano tylko szczep Streptomyces sp. KP2, który wykazywał mniej antagonistycznych oddziaływań z pozostałymi mikroorganizmami, w porównaniu ze szczepem Streptomyces sp. KP1, nie licząc niewielkich oddziaływań antagonistycznych względem B. subtilis P22. Uzyskane wyniki pozwoliły na ustalenie składu mikroorganizmów w szczepionkach wieloorganizmowych, a także kolejności ich inokulacji. Najbardziej kontrowersyjnym był szczep bakterii B. subtilis P22, który z jednej strony wykazywał wysokie uzdolnienia proteolityczne, a z drugiej antagonistyczne wobec: B. cereus B5e/sz, Streptomyces i Y. lipolytica. Pomimo tego został on wybrany do dalszych badań, z zastrzeżeniem zachowania ostrożności, a także z racji dużego potencjału zasiedlania środowiska, co jest istotne w warunkach kompostowych. Ostatecznie do składu szczepionki wytypowano siedem szczepów, w tym cztery szczepy bakterii z rodzaju Bacillus: B. subtilis P22, Bacillus sp. T16, B. licheniformis KT20 i B. cereus B5e/sz, jeden szczep promieniowca Streptomyces sp. KP2 oraz dwa szczepy grzybów strzępkowych z rodzaju Trichoderma: T. atroviride KP1 i T. asperellum B Identyfikacja dwóch wybranych izolatów kompostowych Dwa nieoznaczone do gatunku szczepy Bacillus sp. T16 i Streptomyces sp. KP2 poddano identyfikacji poprzez: analizę makro- i mikroskopową, badanie morfologii kolonii oraz wzrostu, a także cech fizjologicznych. Celem potwierdzenia przynależności gatunkowej izolowano DNA, a następnie sekwencjonowano gen kodujący 16S rrna. Badane bakterie z rodzaju Bacillus na podłożu bulion z glukozą tworzyły kremowe kolonie o wypukłym profilu [Tab. 16]. Komórki bakteryjne, obserwowane w preparacie mikroskopowym, były ruchliwe i miały kształt laseczek o długości. 0,8-6,0 μm i szerokości 0,2-0,4 μm [Tab. 17, Rys. 11]. Szczep ten wykazywał wzrost zarówno w temperaturze 30 C jak i 55 C, co może oznaczać, że zalicza się do mikroorganizmów termotolerancyjnych. Barwienie metodą Grama i Schaeffer-Fultona wykazało, że szczep Bacillus sp. T16 można zaliczyć do bakterii gram dodatnich, wytwarzających przetrwalniki [Tab. 17]. Kolonie promieniowców Streptomyces sp. KP2 miały okrągły kształt z postrzępionymi brzegami i wydzielały do podłoża charakterystyczny, fioletowy barwnik [Tab. 16, Rys. 12]. Komórki badanego szczepu były skręcone w kształcie sprężyny, o długości 4-10 μm

68 Omówienie wyników 68 i szerokości 0,2-0,38 μm oraz wytwarzały owalne konidia o wielkości 0,3-0,5 μm [Rys. 13]. Testy fizjologiczne wykazały, że badany gatunek jest mezofilny oraz gram dodatni. Tab. 16. Morfologia kolonii badanych szczepów Szczep Bacillus sp. T16 Streptomyces sp. KP2 Wielkość [mm] Kształt Brzeg Przejrzystość 1-3 okrągły gładki nieprzejrzyste 1-5 okrągły strzępiasty nieprzejrzyste Profil Barwa kolonii Barwa otoczenia wypukły kremowa - ze wnętrze fioletowa wzniesionym białe, środkiem brzegi szare Tab. 17. Cechy fizjologiczne badanych szczepów Oznaczenie szczepu Optymalna temperatura wzrostu Ruchliwość Barwienie Grama Tworzenie przetrwalników / konidiów [ C] T16 30 i 55 ruchliwe G+ + KP G+ + W dalszym etapie pracy z biomasy badanych szczepów izolowano DNA, który powielano na odpowiednich starterach metodą PCR. Po rozdziale elektroforetycznym sekwencjonowano fragmenty o długości odpowiednio 1340 i 1264 pz. W efekcie sekwencjonowania genu kodującego 16S rrna uzyskano wyniki, w formacie FASTA, które wprowadzono do bazy BLAST, gdzie zostały poddane analizie. Na ich podstawie szczep Bacillus sp. T16 zakwalifikowano do gatunku Bacillus subtilis, a Streptomyces sp. KP2 do gatunku Streptomyces violaceolatus [Tab. 18, Rys. 14 i 15]. Sekwencje badanych szczepów były zgodne w 99% ze szczepami referencyjnymi wskazanych dwóch gatunków mikroorganizmów.

69 Omówienie wyników 69 Rys. 11. Obraz mikroskopowy komórek bakterii Bacillus sp. T16 obserwowany przy 400- krotnym powiększeniu całkowitym Rys. 12. Obraz mikroskopowy brzegu kolonii promieniowców Streptomyces sp. KP2 obserwowany przy 100-krotnym powiększeniu całkowitym Rys. 13. Obraz mikroskopowy komórek promieniowców Streptomyces sp. KP2 obserwowany przy 400-krotnym powiększeniu całkowitym

70 Omówienie wyników 70 Tab. 18. Przynależność gatunkowa badanych szczepów drobnoustrojów względem szczepów referencyjnych Oznaczenie Szczep referencyjny Podobieństwo sekwencji 16S Oznaczony szczepu (BLAST) rrna gatunek T16 KP2 B. subtilis subsp. subtilis DSM 10 S. violaceolatus DSM % B. subtilis T16 100% S. violaceolatus KP2 Rys. 14. Dendrogram zestawiający szczep bakterii Bacillus sp. T16 z innymi przedstawicielami rodzaju Bacillus w oparciu o analizę sekwencji 16S rrna

71 Omówienie wyników 71 Rys. 15. Dendrogram zestawiający badany szczepy promieniowca Streptomyces sp. KP2 z innymi przedstawicielami rodzaju Streptomyces w oparciu o analizę sekwencji 16S rrna

72 Omówienie wyników Charakterystyka pozakomórkowych enzymów wydzielanych przez mikroorganizmy wytypowane jako składniki szczepionek Uzdolnienia enzymatyczne mikroorganizmów szczepionkowych są podstawą przebiegu i kierunku zmian materii organicznej zachodzących w procesie kompostowania. Rozkład szczeciny uwarunkowany jest obecnością i zarazem wysoką aktywnością enzymów proteolitycznych, w tym specyficznych keratynaz. Przejawem ich aktywności jest nagromadzenie w środowisku hodowlanym peptydów i aminokwasów, a także białka rozpuszczalnego. Szczegółowa charakterystyka proteaz pozwala na ustalenie optymalnych warunków, w których uzyskują najwyższą aktywność, a także określenie czynników, które ją regulują. Rozkład substratów roślinnych w kompoście istotny jest ze względu na zawarte w nich polisacharydy, które pod wpływem ksylanaz, celulaz i innych glukanaz ulegają hydrolizie do cukrów prostych, a te z kolei indukują dalszy wzrost mikroflory. Prowadzono hodowle wstrząsane pojedynczych szczepów mikroorganizmów wytypowanych do szczepionki kompostowej w podłożu syntetycznym z dodatkiem różnych odpadów keratynowych (pierza, szczeciny) i celulozowych (wysłodki buraczane). W płynach pohodowlanych monitorowano ich wzrost, biosyntezę enzymów oraz biodegradację białek keratynowych szczeciny lub pierza. Enzymy proteolityczne zawarte w supernatancie płynu pohodowlanego wstępnie charakteryzowano. Dodatkowo po zakończeniu każdej hodowli oceniano również ubytek suchej masy pierza. Hodowle szczepów bakterii z gatunku Bacillus subtilis: P22 i T16 Bacillus subtilis P22 Szczep B. subtilis P22 wykazywał wysoką zdolność do wzrostu w podłożu z keratyną pierza, jako jedynym źródłem węgla. Faza logarytmiczna wzrostu wystąpiła już w pierwszej dobie [Rys. 16]. Od czwartej doby odczyn środowiska był w zakresie alkalicznym (ph 8,0-9,0), co sprzyjało aktywności alkalicznych keratynaz. W trzeciej dobie nastąpiło chwilowe obniżenie odczynu środowiska do ph bliskiego obojętnemu, co mogło sprzyjać aktywności metaloproteaz. Biosynteza enzymów proteolitycznych i keratynolitycznych wystąpiła na początku stacjonarnej fazy wzrostu. Najwyższa aktywność proteolityczna przypadła na czwartą dobę (8,9 JP), natomiast keratynolityczna dwukrotnie w trzeciej i siódmej dobie, osiągając wartości odpowiednio 17,5 i 24,8 JK [Rys. 17]. Symptomem zachodzącej keratynolizy było sukcesywne zwiększanie ilości produktów tego procesu, stężenia wolnych grup aminowych aminokwasów, które osiągały poziom 1,42 mg/ml, grup

73 Omówienie wyników 73 tiolowych cysteiny pochodzących ze zredukowanych mostków dwusiarczkowych cystyny, a także rozpuszczalnego białka do poziomu 3,15 mg/ml. Uwalniane w wyniku keratynolizy aminokwasy i peptydy mogły blokować proces hydrolizy i syntezy enzymów na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Rys. 16. Wzrost komórek i zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu B. subtilis P22 na podłożu z dodatkiem pierza w temperaturze 30 C Rys. 17. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. subtilis P22 na podłożu z dodatkiem pierza w temperaturze 30 C W kolejnej hodowli szczepu B. subtilis P22 w składzie podłoża pierze zastąpiono dodatkiem odtłuszczonej i pociętej szczeciny [Tab. 19]. Czynnikiem wyraźnie odróżniającym wyniki uzyskane w obu hodowlach była aktywność keratynolityczna. W przypadku zastosowania szczeciny jako źródła keratyny indukcja keratynaz była niemal czterokrotnie niższa w porównaniu z pierzem. Substrat ten ze względu na swoją budowę jest mniej dostępny hydrolizie enzymatycznej. Niemniej w hodowli ze szczeciną odnotowano bardzo wysoką aktywność proteolityczną, na poziomie 89,0 JP.

74 Omówienie wyników 74 Tab. 19. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. subtilis P22 w podłożu ze szczeciną Czas hodowli [doby] OD [550nm] ph Białko [mg/ml] NH 2 [mg/ml] SH [ug/ml] Proteazy [JP] Keratynazy [JK] 1 2,50 8,50 0,50 0,10 0,00 39,50 6,50 2 2,53 8,80 0,47 0,15 0,00 31,50 1,50 3 3,00 8,85 0,15 0,19 4,15 7,00 6,00 4 3,16 8,90 1,62 0,16 1,10 0,00 4,70 5 2,48 8,90 0,75 1,19 6,88 89,00 6,80 6 2,68 8,90 0,67 1,32 4,00 58,60 2,00 7 2,81 8,90 0,80 0,70 7,84 78,00 4,40 Charakteryzując pozakomórkowe enzymy B. subtilis P22, wykazano w płynie pohodowlanym mieszaninę 4-6 frakcji proteaz, różniących się optymalnym odczynem środowiska [Rys. 18]. W zakresie ph 7,0-10,0 najwyższe aktywności proteolityczne uzyskano w ph 7,0; 7,3; 8,0 i 10,0. Proteazy, wykazujące najwyższą aktywność w obojętnym odczynie środowiska (ph 7,0 i 7,3) w ponad 70% były inhibowane EDTA, NEM i PMSF oraz w % aktywowane jonami wapniowymi i cysteiną [Tab. 20]. Wskazuje to na polikatalityczny charakter enzymów (P) obejmujący metaloproteazy (M), proteazy tiolowe (T) i serynowe (S). Z kolei enzymy proteolityczne, wykazujące najwyższą aktywność w ph 8,0 i 10,0 również miały charakter polikatalityczny (P), stanowiły prawdopodobnie mieszaninę proteaz T, S i M, z przewagą proteaz tiolowych. Ponadto w ph 10,0 proteazy serynowe ulegały aktywacji seryną (aktywacja 49%). W następnej kolejności zbadano odwracalność inhibicji z udziałem wybranych aktywatorów. W przypadku większości grup proteaz dodatek związków stabilizujących centrum aktywne enzymu znosił inhibicję, co sugeruje ich odwracalny charakter [Tab. 21]. W największym stopniu efekt ten dotyczył proteaz sulfhydrylowych aktywowanych cysteiną, gdzie aktywność w odczynie alkalicznym była wielokrotnie wyższa w porównaniu z kontrolą bez dodatku wspomnianych czynników. W badanym płynie pohodowlanym we wszystkich analizowanych wartościach ph wyraźnie dominowały proteazy tiolowe, natomiast w ph obojętnym zaznaczył się udział metaloproteaz oraz w ph alkalicznym proteaz tiolowo-serynowych. Na podstawie uzyskanych wyników, w kolejnych etapach badań aktywność proteaz i keratynaz badano w ph 8,0.

75 Omówienie wyników 75 Rys. 18. Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów proteolitycznych szczepu B. subtilis P22 Tab. 20. Wpływ inhibitorów (% hamowania) i aktywatorów (% aktywacji) na wybrane grupy enzymów proteolitycznych ph INHIBICJA AKTYWACJA EDTA [2mM] NEM [5mM] PMSF [2mM] CaCl 2 [10mM] L-Cys [5mM] L-Ser [1mM] Inhibicja / Aktywacja [%] , Tab. 21. Odwracalność inhibicji enzymów proteolitycznych zawartych w płynie pohodowlanym bakterii B. subtilis P22 *Aktywacja proteaz w obecności inhibitora ph Rodzaj próby Z*[%] 7 EDTA(2mM) +Ca(10mM) 288,0 NEM(5mM) +Cys(5mM) 170,4 7,3 EDTA(2mM) +Ca(10mM) 761,1 NEM(5mM) +Cys(5mM) 2217,4 8 EDTA(2mM) +Ca(10mM) 78,1 NEM(5mM) +Cys (5mM) 427,6 PMSF (2mM) +Ser(1mM) 83,7 10 EDTA(2mM) +Ca(10mM) 43,8 NEM(5mM) +Cys (5mM) 841,5 PMSF (2Mm) + Ser(1mM) 433,3

76 Omówienie wyników 76 Proteazy uwalniane przez szczep B. subtilis P22 wykazywały największą aktywność w temperaturze 60 C, a keratynazy 55 C [Tab. 22]. Najintensywniejszy rozkład keratyny w warunkach kompostowych powinien zatem przypadać w fazie termofilnej procesu. Enzymy keratynolityczne badanego szczepu najwyższą aktywność osiągały w ph 10,0, co wskazuje na to, że prawdopodobnie najliczniej reprezentowane były przez alkaliczne proteazy serynowe subtylizyny [Rys. 19]. Tab. 22. Wpływ temperatury reakcji enzymatycznej na aktywność proteaz i keratynaz szczepu B. subtilis P22, wyrażonych w procentach najwyższej aktywności obu enzymów Temperatura [ C] Proteazy [%] Keratynazy [%] 30 15,38 0, ,37 13, ,90 0, ,70 0, ,02 0, ,02 100, ,00 36, ,19 - Rys. 19. Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów keratynolitycznych szczepu B. subtilis P22 Szczep B. subtilis P22 w hodowli z pierzem produkował również enzymy lipolityczne, których aktywność w trzeciej dobie hodowli wyniosła 50 JL [Rys. 20]. Enzymatyczne lub chemiczne odtłuszczenie szczeciny prawdopodobnie ułatwia dostęp keratynazom do substratu, jednak w kompoście taką funkcję mogą pełnić pozakomórkowe lipazy. Materiał kompostowy, oprócz szczeciny czy pierza, zawiera również trudnodegradowalne polimery roślinne tj. celulozę, ksylany czy ligninę. W hodowli szczepu B. subtilis P22 na podłożu z wysłodkami wykazano niewielkie aktywności enzymów

77 Omówienie wyników 77 celulolitycznych i ksylanolitycznych, których aktywność nie przekroczyła wartości, odpowiednio 0, 08 JCe i 0,22 JKsy [Rys. 21]. Rys. 20. Aktywność lipaz [AL] w płynie pohodowlanym szczepu B. subtilis P22 Rys. 21. Aktywność ksylanaz [AKsy] i celulaz [ACel] w płynie pohodowlanym szczepu B. subtilis P22 Bacillus subtilis T16 Szczep B. subtilis T16 do czwartej doby hodowli w temperaturze 55 C wykazywał intensywny wzrost komórek i alkalizację środowiska, która ustabilizowała się na stałym poziomie osiągając wartość ph 8,5 [Rys. 22]. Przebieg keratynolizy z udziałem tego szczepu ilustruje rys. 23. Zwiększenie aktywności proteaz obserwowano w trzeciej i szóstej dobie hodowli, gdzie osiągały aktywność 30-42,5 JP. Podobnie kształtowała się aktywność keratynaz, która w pierwszej połowie i pod koniec hodowli była najwyższa (13,6 JK). Zwiększone uwalnianie obu grup enzymów w trzeciej dobie hodowli, mogło spowodować wzrost stężenia rozpuszczalnego białka do poziomu 0,9 mg/ml, grup aminowych do 0,3

78 Omówienie wyników 78 mg/ml i sulfhydrylowych aminokwasów do wartości 4,7 μg/ml. Ogólnie uzdolnienia proteolityczne tego szczepu były niższe niż omówionego wcześniej szczepu B. subtilis P22. Rys. 22. Wzrost komórek i zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu B. subtilis T16 na podłożu z dodatkiem pierza w temperaturze 55 C Rys. 23. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. subtilis T16 na podłożu z pierzem w temperaturze 55 C Następnie porównano przebieg hodowli szczepu B. subtilis T16 w podłożu syntetycznym z dodatkiem szczeciny w temperaturze 30 i 55 C. W temperaturze optymalnej dla mikroorganizmów termofilnych, wzrost badanego szczepu obniżył się o cztery/pięć jednostek OD w porównaniu ze wzrostem w temperaturze 30 C [Rys. 24]. Wynik ten wskazuje na to, że szczep B. subtilis T16 jest mikroorganizmem jedynie termotolerancyjnym. Odczyn środowiska w hodowli prowadzonej w temperaturze 55 C był bardziej alkaliczny (ph 8,5-9,25) z ph wyższym o jedną jednostkę w porównaniu do hodowli prowadzonej

79 Omówienie wyników 79 w temperaturze 30 C (ph 7,5-8,5) [Rys. 24]. Obserwowano również różnice w przebiegu keratynolizy prowadzonej w obu temperaturach [Tab. 23 i 24]. Rys. 24. Wzrost komórek i zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu B. subtilis T16 w temperaturze 30 i 55 C na podłożu z dodatkiem szczeciny Tab. 23. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. subtilis T16 ze szczeciną w temperaturze 30 C Czas hodowli [doby] Białko [mg/ml] NH 2 [mg/ml] SH [ug/ml] Proteazy [JP] Keratynazy [JK] 1 44,00 0,02 23,97 9,00 1, ,00 0,02 41,10 3,50 2, ,00 0,02 33,39 27,50 3, ,00 0,03 34,25 28,75 4, ,00 0,02 62,50 32,25 1, ,00 0,03 46,23 25,75 1,00 Tab. 24. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. subtilis T16 ze szczeciną w temperaturze 55 C Czas hodowli [doby] Białko [mg/ml] NH 2 [mg/ml] SH [ug/ml] Proteazy [JP] Keratynazy [JK] 1 92,00 0,04 0,00 4,00 0, ,00 0,07 20,55 5,25 2, ,00 0,08 26,54 6,50 2, ,00 0,07 77,91 7,75 1, ,00 0,15 41,95 3,00 7, ,00 0,02 48,80 2,50 7,75 W hodowli prowadzonej w temp. 30 C aktywność proteaz była zbliżona do aktywności odnotowanej dla hodowli z pierzem prowadzonej w 55 C i wynosiła 32 JP [Tab.

80 Omówienie wyników 80 23]. Zdecydowane różnice dotyczyły aktywności keratynolitycznej, która była znacznie niższa w hodowli indukowanej szczeciną w obu temperaturach w porównaniu z hodowlą z dodatkiem pierza w temperaturze 55 C. Natomiast nie było istotnej różnicy w aktywności keratynaz uwalnianych w obu badanych temperaturach, gdzie ich wartość nie przekroczyła 8,0 JK. Pozostałe badane wielkości wskazują na to, że proces keratynolizy najintensywniej zachodził do czwartej/piątej doby w temperaturach 30 i 55 C, po czym nastąpił spadek wartości analizowanych parametrów. W temperaturze 55 C enzymy wytwarzane przez szczep B. subtilis T16 uwalniały znacznie więcej grup aminowych aminokwasów (0,15 mg/ml) w porównaniu z hodowlą prowadzoną w temperaturze 30 C (0,03 mg/ml). Stężenie białka rozpuszczalnego i aminokwasów siarkowych w obu hodowlach zmieniało się analogicznie, osiągając zbliżone wartości odpowiednio mg/ml i 62,5-77,9 μg/ml. Hodowle szczepu bakterii Bacillus licheniformis KT20 W hodowli szczepu B. licheniformis KT20 w podłożu z dodatkiem pierza, od pierwszej do czwartej doby jej trwania obserwowano przyrost biomasy i stopniową alkalizację środowiska, osiągające wartość odpowiednio OD=3,5 i ph 8,9 [Rys. 25]. Wysoki odczyn środowiska nie sprzyjał aktywności proteaz tiolowych uwalnianych przez omawiane komórki bakterii. W siódmej dobie nastąpiło nieznaczne obniżenie odczynu środowiska do poziomu ph 8,5. Utrzymujące się alkaliczne ph wskazywało na postępujący proces keratynolizy. Jej przebieg zilustrowano na rys. 26. W czasie siedmiu dób hodowli stopniowo wzrastało stężenie rozpuszczalnego białka do wartości 2,9 mg/ml i aminokwasów do wartości 1,5 mg/ml. Natomiast zawartość aminokwasów siarkowych w płynie pohodowlanym wzrastała do piątej doby kiedy osiągnęła poziom 11,5 μg/ml, po czym nastąpił jej spadek. Począwszy od trzeciej doby aktywność proteaz i keratynaz podwyższała się. Proteazy osiągnęły najwyższą aktywność w szóstej dobie 10,0 JP, a keratynazy o jedną dobę wcześniej uzyskały dwukrotnie wyższą aktywność 23,0 JK. W tym samym czasie wykazano najwyższe stężenie grup sulfhydrylowych aminokwasów, reprezentowanych przez cysteinę. Jej zwiększone stężenie mogło obniżać potencjał oksydo-redukcyjny, a ten z kolei mógł podwyższać aktywność tiolowej keratynazy.

81 Omówienie wyników 81 Rys. 25. Wzrost komórek i zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu B. licheniformis KT20 na podłożu z dodatkiem pierza w temperaturze 55 C Rys. 26. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. licheniformis KT20 na podłożu z dodatkiem pierza w temperaturze 55 C Wzrost biomasy szczepu B. licheniformis KT20 w podłożu ze szczeciną miał podobny przebieg jak w obecności pierza, natomiast odczyn środowiska stopniowo zmniejszał się, jednak był w zakresie alkalicznym ph 8,9 do 8,2 [Tab. 25]. Keratynoliza szczeciny świńskiej zachodziła mniej intensywnie w porównaniu do pierza. Szczecina w mniejszym stopniu indukowała enzymy proteolityczne i keratynolityczne, których średnia aktywność wynosiła odpowiednio 1,81 JP i 7,63 JK. Konsekwencją tego było także niższe stężenie białka rozpuszczalnego (1,65 mg/ml). Zawartość grup aminowych aminokwasów w hodowli była stała (0,2-0,3 mg/ml), natomiast najwyższe stężenie grup sulfhydrylowych aminokwasów odnotowano w trzeciej dobie, kiedy wynosiło ono 7,8 μg/ml [Tab. 25].

82 Omówienie wyników 82 Tab. 25. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. licheniformis KT20 w podłożu ze szczeciną w temperaturze 55 C Czas hodowli [doby] OD [550nm] ph Białko [mg/ml] NH 2 [mg/ml] SH [ug/ml] Proteazy [JP] Keratynazy [JK] 1 1,75 8,70 0,55 0,18 0,00 1,20 5,00 2 2,98 8,91 1,00 0,24 3,15 3,20 2,10 3 2,20 8,50 0,54 0,16 7,80 0,90 5,00 4 2,45 8,50 0,57 0,17 3,20 1,30 7,50 5 3,11 8,47 0,84 0,22 0,00 0,94 20,00 6 3,15 8,39 0,18 0,23 3,87 3,20 6,80 7 3,47 8,18 1,65 0,28 5,40 1,94 7,00 Enzymy proteolityczne szczepu B. licheniformis KT20 wydzielane do środowiska w trakcie hodowli tego szczepu stanowiły mieszaninę trzech alkalicznych proteaz [Rys. 27]. Badana grupa enzymów najwyższe aktywności wykazywała przy różnych wartościach ph: 8,1; 8,7; 9,5. Przetestowano wpływ inhibitorów i aktywatorów na przebieg reakcji enzymatycznej. W ph 8,1 dominowały proteazy serynowe w 96% inhibowane PMSF i metaloproteazy w 44% inhibowane EDTA, co do których można przypuszczać, że zaliczają się odpowiednio do proteaz serynowych i metaloproteaz [Tab. 26]. Nieznaczny udział w tej mieszaninie miały także proteazy podobne w działaniu do tiolowych. Dodatek jonów Ca 2+ wyraźnie aktywował przeważającą grupę metaloprotez (84%). W ph 8,7 i 9,5 największą aktywność wykazywały enzymy proteolityczne, które można zaliczyć do grupy proteaz tiolowych (w 100% inhibowanych NEM) i serynowych (w 63-94% inhibowanych PMSF). Dominujące proteazy tiolowe, indukowała obecność cysteiny w mieszaninie reakcyjnej, która obniża potencjał oksydo-redukcyjny. W większości grup proteaz dodatek związków stabilizujących centrum aktywne enzymu znosił inhibicję. Jedynie w przypadku proteaz tiolowych, z optymalnym ph = 8,1, przy których zastosowano 5 mm stężenie NEM, dodatek 2 mm cysteiny nie aktywował zahamowanej reakcji. W przypadku proteaz tiolowych zniesienie inhibicji przez NEM nastąpiło przy ph = 9,5, przy stężeniu cysteiny równym 5 mm [Tab. 27]. Gdy stosunek inhibitora do aktywatora wynosił 1:1, inhibicja była odwracalna. W ph 8,1 dodatek 10 mm jonów Ca 2+ usunął inhibicję EDTA. Dalsze badania aktywności proteolitycznej prowadzono w ph 8,7 a keratynolitycznej w ph 8,1.

83 Omówienie wyników 83 Rys. 27. Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów proteolitycznych szczepu B. licheniformis KT20 Tab. 26. Wpływ inhibitorów (% hamowania) i aktywatorów (% aktywacji) na wybrane grupy enzymów proteolitycznych ph INHIBICJA AKTYWACJA EDTA [2mM] NEM [5mM] PMSF [2mM] CaCl 2 [10mM] L-Cys [5mM] L-Ser [1mM] Inhibicja / Aktywacja [%] 8, , , Tab. 27. Odwracalność inhibicji enzymów proteolitycznych zawartych w płynie pohodowlanym bakterii B. licheniformis KT20 *Aktywacja proteaz w obecności inhibitora ph Rodzaj próby Z*[%] 8,1 EDTA(2mM) +Ca(10mM) 292,9 NEM(5mM) +Cys(5mM) 130,8 NEM(5mM) +Cys(2mM) 0 PMSF(5mM) +Ser(1mM) 35,2 8,7 NEM(5mM) +Cys(5mM) 236,8 NEM(5mM) +Cys(2mM) 68,3 PMSF(5mM) +Ser(1mM) 70,2 9,5 NEM(5mM) +Cys(5mM) 569,5 Najwyższą aktywność proteaz odnotowano w temperaturze 70 C, a keratynaz w 30 C, zatem alkaliczne proteazy syntezowane przez szczep B. licheniformis KT20 w warunkach

84 Omówienie wyników 84 kompostowych najefektywniej powinny hydrolizować białko w fazie termofilnej, a keratynazy w fazie mezofilnej. W zakresie temperatur od 65 C do 85 C aktywność enzymów proteolitycznych mieściła się w przedziale od 70 do 100% wartości maksymalnej [Tab. 28]. Keratynazy wydzielane przez badany szczep najwyższą aktywność osiągały w ph 8,1 co wskazuje na ich przynależność do alkalicznych proteaz [Rys. 28]. Tab. 28. Wpływ temperatury reakcji enzymatycznej na aktywność proteaz i keratynaz szczepu B. licheniformis KT20, wyrażonych w procentach najwyższej aktywności obu enzymów Temperatura [ C] Proteazy [%] Keratynazy [%] 30 5,17 100, ,45 50, ,17 63, ,24 45, ,07 0, ,76 27, ,48 44, , , , , , , ,00 - Rys. 28. Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów keratynolitycznych szczepu B. licheniformis KT20 W środowisku hodowli w obecności pierza, lipazy uwalniane były dopiero od trzeciej doby jej trwania. Najwyższą aktywność osiągnęły w szóstej i siódmej dobie (50 JL) [Rys. 29]. Aktywności ksylanaz i celulaz w hodowli były znikome, a jej wartości nie przekraczały odpowiednio 0,03 JKsy i 0,06 JCe [Rys. 30].

85 Omówienie wyników 85 Rys. 29. Aktywność lipaz [AL] w hodowli szczepu B. licheniformis KT20 Rys. 30. Aktywność ksylanaz [AKsy] i celulaz [ACel] w hodowli szczepu B. licheniformis KT20 Hodowle szczepu bakterii Bacillus cereus B5e/sz W hodowli szczepu B. cereus B5e/sz w podłożu z keratyną pierza, przyrostowi biomasy podczas pierwszych trzech dób towarzyszyła alkalizacja podłoża do ph 8,0 [Rys. 31]. Przebieg keratynolizy zilustrowany na rys. potwierdzał wysokie uzdolnienia proteolityczne i keratynolityczne tego szczepu bakterii. Najwyższa aktywność proteaz przypadła na czwartą dobę osiągając wartość 84 JP po czym znacznie obniżyła się. Inaczej kształtowała się aktywność keratynolityczna, która stopniowo wzrastała w czasie trwania hodowli, osiągając najwyższą wartość 58,0 JK w szóstej i siódmej dobie. Stężenie rozpuszczalnego białka początkowo zwiększało się, po czym od trzeciej doby utrzymywało

86 Omówienie wyników 86 się na zbliżonym poziomie 0,70-0,87 mg/ml. W czasie trwania hodowli sukcesywnie zwiększało się stężenie aminokwasów (0,17 mg/ml), w tym cysteiny (1,54 mg/ml). Rys. 31. Wzrost komórek i zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu B. cereus B5e/sz na podłożu z dodatkiem pierza Rys. 32. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu B. cereus B5e/sz na podłożu z dodatkiem pierza Szczegółowe wyniki badań szczepu B. cereus B5e/sz, przebieg jego hodowli na różnych substratach keratynowych oraz charakterystyka wytwarzanych przez niego enzymów proteolitycznych i keratynolitycznych została przedstawiona w badaniach wcześniejszych [Łaba 2007]. W badaniach własnych oceniano zdolność szczepu B. cereus B5e/sz do wytwarzania enzymów lipolitycznych (hodowla z dodatkiem pierza) oraz ksylanaz i celulaz (hodowla na wysłodkach). Szczep ten w pierwszej dobie hodowli wydzielił lipazy o aktywności 14,95 JL, jednak obserwowano sukcesywny spadek aktywności tej grupy enzymów wraz z upływem

87 Omówienie wyników 87 czasu hodowli [Rys. 33]. Aktywność ksylanaz, przez cały okres jej trwania utrzymywała się na poziomie 0,13-0,17 JKsy, natomiast obecności enzymów celulolitycznych nie wykazano w płynie pohodowlanym [Rys. 34]. Podczas prowadzenia siedmiodobowej hodowli szczepu B. cereus B5e/sz w podłożu mineralnym ze szczeciną wykazano makroskopowe i mikroskopowe zmiany w strukturze szczeciny, która została wyraźnie naruszona [Rys. 35A i B]. Badane bakterie zasiedlały włókna szczeciny, poprzez wydzielanie egzopolimerycznej macierzy z wytworzeniem biofilmu na jej powierzchni [Rys. 35C]. Rys. 33. Aktywność lipaz [AL] w hodowli szczepu B. cereus B5e/sz Rys. 34. Aktywność ksylanaz [AKsy] i celulaz [ACel] w hodowli szczepu B. cereus B5e/sz

88 Omówienie wyników 88 (A) (B) (C) Rys. 35. Włókno szczeciny przed (A) oraz po zakończeniu (B i C) 7-dobowej hodowli wstrząsanej w podłożu mineralnym z udziałem bakterii B. cereus B5e/sz przy powiększeniu 1000-krotnym (A i B) oraz 6000-krotnym (C)

89 Omówienie wyników 89 Hodowle promieniowców Streptomyces violaceolatus KP2 W hodowli szczepu S. violaceolatus KP2 w podłożu z dodatkiem pierza jako źródła keratyny, a zarazem węgla i azotu największy przyrost biomasy obserwowano między siódmą, a dziesiątą dobą hodowli, która trwała dłużej niż hodowla bakterii. Odczyn środowiska stopniowo wzrastał wraz z upływem czasu, osiągając w czternastej dobie wartość ph 6,9. W przeciwieństwie do wcześniej omawianych szczepów bakterii, szczep promieniowca S. violaceolatus KP2 nie powodował alkalizacji podłoża hodowlanego, zatem ph optymalne dla aktywności proteaz i keratynaz (ph 8,0) nie zostało osiągnięte [Rys. 36]. W czasie czternastu dób hodowli wzrastało stężenie rozpuszczalnego białka do wartości 1,2 mg/ml. Najwyższe stężenie aminokwasów odnotowano w czternastej dobie, kiedy wynosiło ono 0,15 mg/ml, z czego udział aminokwasów siarkowych stanowił 2%. W siódmej dobie nastąpiło zwiększenie aktywności enzymów proteolitycznych do poziomu 14,9 JP, po czym miał miejsce jej spadek. Aktywność keratynaz wzrastała stopniowo począwszy od trzeciej doby hodowli osiągając maksymalną wartość 8,5 JK w dziesiątej dobie [Rys. 37]. Podczas hodowli szczepu S. violaceolatus KP2 w podłożu z dodatkiem szczeciny obserwowano sukcesywny wzrost biomasy, natomiast odczyn środowiska był alkaliczny i utrzymywał się na stałym poziomie ph 8,6-8,7 przez cały czas trwania hodowli [Tab. 29]. W wyniku zachodzącej hydrolizy z udziałem drobnoustrojów wzrastało stężenie białka rozpuszczalnego, jednak jego stężenie było trzykrotnie niższe w porównaniu z hodowlą z dodatkiem pierza i wynosiło 0,38 mg/ml. Mimo tego ilości uwalnianych aminokwasów były zbliżone w obu hodowlach i wynosiły średnio 0,04-0,05 mg/ml. W hodowli z dodatkiem szczeciny wzrastało stężenie aminokwasów siarkowych do wartości 6,42 μg/ml. Szczecina okazała się lepszym induktorem proteaz i keratynaz, w porównaniu do hodowli z pierzem, ponieważ w hodowli z jej dodatkiem wymienione enzymy wykazywały dwu-trzy krotnie wyższą aktywność, odpowiednio 42,0 JP i 19,5 JK. Płyn pohodowlany uzyskany z hodowli szczepu promieniowca S. violaceolatus KP2 zawierał mieszaninę alkalicznych proteaz, które uzyskiwały najwyższe aktywności wynoszące 15,0 i 6,0 JP w ph 8,0 i 11,0 [Rys. 38]. W ph 8,0 enzymy proteolityczne w 100% inhibowane były przez EDTA i w 52% aktywowane jonami wapnia, co może wskazywać na ich przynależność do metaloproteaz [Tab. 30]. Jednoczesne wprowadzenie inhibitora w postaci EDTA lub NEM oraz aktywatora np. Ca 2+, skutkowało zachowaniem aktywności w ph 11,0 na niezmienionym poziomie.

90 Omówienie wyników 90 Rys. 36. Wzrost komórek i zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu S. violaceolatus KP2 na podłożu z dodatkiem pierza Rys. 37. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu S. violaceolatus KP2 z dodatkiem pierza na podłożu Tab. 29. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu S. violaceolatus KP2 ze szczeciną Czas hodowli [doby] OD [550nm] ph Białko [mg/ml] NH 2 [mg/ml] SH [ug/ml] Proteazy [JP] Keratynazy [JK] 3 0,03 8,57 0,04 0,02 2,09 12,50 2,00 5 0,18 8,59 0,10 0,04 3,03 11,00 5,50 7 0,35 8,75 0,12 0,04 1,72 42,00 5, ,66 8,76 0,32 0,04 1,99 0,00 9, ,45 8,76 0,34 0,06 1,88 13,50 15, ,75 8,70 0,38 0,05 6,42 14,00 19,50 W przypadku ph 8,0 zniesienie inhibicji z udziałem EDTA było możliwe przy stężeniu jonów wapnia równoważnym stężeniu inhibitora (2mM) [Tab. 31]. W dalszych etapach badań aktywność enzymów proteolitycznych i keratynolitycznych obecnych w omawianych płynach hodowlanych, badano w ph 8,0. Optymalna temperatura działania badanych proteaz

91 Omówienie wyników 91 zawartych w płynach pohodowlanych wynosiła 55 C, a jej obniżenie o 5 C spowodowało zmniejszenie ich aktywności o 67% [Tab. 32]. Rys. 38. Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów proteolitycznych szczepu S. violaceolatus KP2 Tab. 30. Wpływ inhibitorów (% hamowania) i aktywatorów (% aktywacji) na wybrane grupy enzymów proteolitycznych ph INHIBICJA AKTYWACJA EDTA [2mM] PMSF [5mM] CaCl 2 [2mM] Inhibicja / Aktywacja [%] 8, , Tab. 31. Odwracalność inhibicji enzymów proteolitycznych zawartych w płynie pohodowlanym promieniowców S. violaceolatus KP2 *Aktywacja proteaz w obecności inhibitora ph Rodzaj próby Z* [%] 8,0 EDTA(2mM) 202,0 +Ca(2mM) Tab. 32. Wpływ temperatury reakcji enzymatycznej na aktywność proteaz szczepu S. violaceolatus KP2, wyrażonych w procentach najwyższej ich aktywności Temperatura [ C] Proteazy [%] Szczep promieniowca S. violaceolatus KP2, w hodowli na pożywce z wysłodkami buraczanymi wydzielał do środowiska ksylanazy na poziomie 0,83 JKsy i celulazy na

92 Omówienie wyników 92 poziomie 1,32 JCe [Rys. 39]. Były to wartości kilkukrotnie wyższe w porównaniu do przedstawionych szczepów bakteryjnych. Badany promieniowiec w inny sposób niż bakterie zasiedlał włókna szczeciny, poprzez penetrację ich powierzchni z udziałem nitkowatych form komórek [Rys. 40]. Szczep ten wykazywał uzdolnienia hydrolityczne w stosunku do opornego substratu keratynowego jakim jest szczecina świńska. Wytwarzał on także większe ilości ksylanaz i celulaz w porównaniu do badanych szczepów bakteryjnych. Oba wyniki wskazują na celowość wykorzystania szczepu S. violaceolatus KP2 do inokulacji kompostów z keratyną szczeciny oraz trocinami, zawierającymi w swoim składzie głównie celulozę i hemicelulozę. Rys. 39. Aktywność ksylanaz [AKsy] i celulaz [ACel] w hodowli szczepu S. violaceolatus KP2 Rys. 40. Włókno szczeciny po 7- dobowej hodowli wstrząsanej w podłożu mineralnym z udziałem szczepu promieniowca S. violaceolatus KP2, obserwowane przy powiększeniu 3000-krotnym (z lewej) i 6000-krotnym (z prawej)

93 Omówienie wyników 93 Hodowle grzybów strzępkowych Trichoderma atroviride KP1 W hodowli szczepu T. atroviride KP1 na podłożu z dodatkiem pierza podobnie jak w innych hodowlach, widoczna była alkalizacja środowiska do wartość ph 8,5, która utrzymywała się na tym poziomie od trzeciej doby aż do zakończenia hodowli [Rys. 41]. W szóstej dobie hodowli wykazano obecność enzymów proteolitycznych o niskiej aktywności wynoszącej 3,77 JP, natomiast w 17 dobie enzymów keratynolitycznych, których aktywność była kilkakrotnie wyższa, równa 16,0 JK [Rys. 42]. Jednak w odniesieniu do bakterii z rodzaju Bacillus aktywności te były znacznie mniejsze. Stężenie białka rozpuszczalnego (3 mg/ml) i grup aminowych aminokwasów (0,5-0,7 mg/ml) w płynie pohodowlanym, przez cały czas trwania hodowli utrzymywało się na stałym poziomie. W odróżnieniu od nich aminokwasy siarkowe w ilościach 4,2-4,8 μg/ml uwalniane były do 10 doby, po czym ponowny wzrost ich ilości nastąpił w 17 dobie, równocześnie ze wzrostem aktywności enzymów keratynolitycznych [Rys. 42]. Pozakomórkowe proteazy zawarte w płynie pohodowlanym szczepu T. atroviride KP1 miały optymalną aktywność wynoszącą 2,5-3,5 JP w ph: 7,0; 7,8 oraz 9,5 [Rys. 43]. Ich charakterystyka wykazała także typ polikatalityczny (P). Enzymy aktywne w ph 7,0 całkowicie inhibował PMSF i częściowo NEM oraz były niewrażliwe na EDTA, chociaż ulegały niewielkiej aktywacji jonami wapnia (18%) [Tab. 33]. Enzymy wykazujące najwyższą aktywność w odczynie alkalicznym (ph 8,0 i 9,5) w wyższym stopniu reagowały na obecność EDTA niż na PMSF. Uzyskane wyniki sugerują dużą różnorodność proteinaz w środowisku hodowlanym, zatem bez uprzedniej izolacji i oczyszczania niemożliwa jest ich bliższa charakterystyka. Z powodu znacznego udziału enzymów o aktywności w słabo alkalicznym środowisku, ich dalsze badania były prowadzone w ph 8,0. W tym odczynie badano wpływ temperatury na aktywność. Badane proteazy w ph 8,0 wykazywały najwyższą aktywność w temperaturze 50 C, przy czym jej zmniejszenie lub zwiększenie o 5 C powodowało obniżenie aktywności odpowiednio o 14 i 22% [Tab. 34]. Keratynazy w ph 8,0 utrzymywały wysoką aktywność w przedziale temperatur od 30 do 50 C, osiągając maksimum w temperaturze 40 C. Ksylanazy i chitynazy uwalniane w hodowli na podłożu z dodatkiem wysłodek buraczanych, osiągały aktywność odpowiednio 0,44 JKsy i 0,22 JCh, która utrzymywała się przez cały okres jej trwania [Rys. 44]. Uzyskane wartości były kilkukrotnie wyższe w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla badanych szczepów bakteryjnych. Pozakomórkowe celulazy produkowane przez T. atroviride KP1 największą aktywność

94 Omówienie wyników 94 wynoszącą 0,23 JCe wykazały w trzeciej dobie hodowli, od której zmniejszała się ona aż do wartości śladowych po koniec procesu. Rys. 41. Zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu T. atroviride KP1 na podłożu z dodatkiem pierza Rys. 42. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu T. atroviride KP1 na podłożu z dodatkiem pierza Rys. 43. Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów proteolitycznych szczepu T. atroviride KP1

95 Omówienie wyników 95 Tab. 33. Wpływ inhibitorów (% hamowania) i aktywatorów (% aktywacji) na wybrane grupy enzymów proteolitycznych szczepu T. atroviride KP1 ph INHIBICJA AKTYWACJA EDTA [2mM] NEM [2mM] PMSF [5mM] CaCl 2 [5mM] L-Cys [5mM] Inhibicja / Aktywacja [%] , Tab. 34. Wpływ temperatury reakcji enzymatycznej na aktywność proteaz i keratynaz szczepu T. atroviride KP1, wyrażonych w procentach najwyższej aktywności obu enzymów Temperatura [ C] Proteazy [%] Keratynazy [%] ,8 40 Rys. 44. Aktywność ksylanaz [AKsy], celulaz [ACel] i chitynaz [ACh] w hodowli szczepu T. atroviride KP1 Hodowle grzybów strzępkowych Trichoderma asperellum B35 Ogólnie hodowla z udziałem szczepu T. asperellum B35 przebiegała podobnie jak wyżej omawianego szczepu z tego samego rodzaju. Jednak alkalizacja środowiska zachodziła wolniej i była niższa,w granicach ph 6,8 do 8,0 [Rys. 45]. Enzymy proteolityczne także wykazywały znikomą aktywność, która była najwyższa w 17 dobie - 1,8 JP [Rys. 46]. Z kolei keratynazy dominowały w pierwszych trzynastu dobach procesu, pod koniec którego ich aktywność wyniosła 6,0 JK. Szczep T. asperellum B35 w porównaniu do szczepu T. atroviride KP1 uwalniał zbliżone ilości obu grup enzymów. Natomiast pozostałe

96 Omówienie wyników 96 oznaczenia ilości rozpuszczalnego białka oraz aminowych i sulfhydrylowych grup aminokwasów wskazywały na mniej efektywny przebieg keratynolizy w hodowli T. asperellum B35. Stężenie rozpuszczalnego białka i grup NH 2 aminokwasów nie przekroczyło 0,4 mg/ml. Uwalniane grupy SH były w ilościach śladowych i osiągnęły w 10 dobie stężenie 2 μg/ml [Rys. 46]. Rys. 45. Zmiany odczynu środowiska w hodowli szczepu T. asperellum B35 na podłożu z dodatkiem pierza Rys. 46. Przebieg keratynolizy w hodowli szczepu T. asperellum B35 na podłożu z dodatkiem pierza Enzymy proteolityczne wykazały duże podobieństwo do pochodzących ze szczepu T. atroviride KP1. Najwyższą aktywność miały w ph: 7,5 i 9,0 [Rys. 47]. Niemożliwe było bliższe określenie enzymów o aktywności w ph 7,5 natomiast frakcję o charakterze alkalicznym można zaliczyć do grupy proteaz serynowych [Tab. 35]. Dalsze oznaczenia aktywności proteolitycznej prowadzono w ph 7,5 a keratynolitycznej w ph 9,0.

97 Omówienie wyników 97 W kolejnym etapie badań wyznaczono optymalną temperaturę aktywności proteaz i keratynaz, która wynosiła odpowiednio 55 i 50 C [Tab. 36]. Keratynazy zachowały wysoką jej wartość (73-100%) w przedziale temperatur od 40 do 50 C. Rys. 47. Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów proteolitycznych szczepu T. asperellum B35 Tab. 35. Wpływ inhibitorów (% hamowania) i aktywatorów (% aktywacji) na wybrane grupy enzymów proteolitycznych szczepu T. asperellum B35 INHIBICJA AKTYWACJA ph EDTA [2mM] NEM [2mM] PMSF [5mM] CaCl 2 [5mM] L-Cys [5mM] Inhibicja / Aktywacja [%] 7, Tab. 36. Wpływ temperatury reakcji enzymatycznej na aktywność proteaz i keratynaz szczepu T. asperellum B35, wyrażonych w procentach najwyższej aktywności obu enzymów Temperatura [ C] Proteazy [%] Keratynazy [%] W hodowli szczepu T. asperellum B35 na wysłodkach aktywności ksylanaz, celulaz i chitynaz nie zmieniały się znacząco w miarę upływu czasu trwania procesu [Rys. 48]. Średnia aktywność ksylanaz wynosiła 0,51 JKsy i była porównywalna z aktywnością ksylanaz uzyskaną w hodowli szczepu T. atroviride KP1. Natomiast aktywności celulaz i chitynaz były w odniesieniu do porównywanego szczepu kilkukrotnie niższe i przyjmowały wartości odpowiednio 0,05 JCe i 0,11 JCh.

98 Omówienie wyników 98 Ze względu na mniejsze uzdolnienia keratynolityczne i celulolityczne szczepu T. asperllum B35, do celów szczepionkowych wykorzystywano szczep T. atroviride KP1. Rys. 48. Aktywność ksylanaz [AKsy], celulaz [ACel] i chitynaz [ACh] w hodowli szczepu T. asperellum B35 Ubytek suchej masy pierza w hodowlach wybranych mikroorganizmów Zestawienie ubytku pierza po zakończeniu hodowli siedmiu wybranych szczepów drobnoustrojów obrazuje ostateczny efekt działania keratynolitycznych proteaz w degradacji odpadów keratynowych [Rys. 49]. Enzymy szczepu B. subtilis P22 degradowały 75% ich masy, B. licheniformis KT20 60%, T. atroviride KP1 52%. W dalszej kolejności były bakterie B. cereus B5e/sz (45%), grzyby strzępkowe T. asperellum B35 (32%) oraz bakterie B. subtilis T16 (21%). W najmniejszym stopniu zdegradowały pierze enzymy wydzielane przez promieniowce z rodzaju Streptomyces, tylko 5%. Można przypuszczać, że nie wszystkie szczepy miały optymalne warunki do rozwoju, poza tym w kompoście mogą być inne relacje. Rys. 49. Porównanie ubytku keratyny piór w hodowlach wybranych szczepów bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych

99 Omówienie wyników Opracowanie utrwalonej formy szczepionki mikroorganizmów Istotnym elementem opracowania szczepionek do kompostowania odpadów organicznych jest przygotowanie ich utrwalonych form, które mogą być wykorzystane komercyjnie jako preparaty handlowe. Utrwalaniu poddano biomasę bakterii mezofilnych B. cereus B5e/sz i promieniowców S. violaceolatus KP2. W tym celu wykorzystano następujące metody: liofilizację, suszenie fontannowe i rozpyłowe, ekstruzję, suszenie mikrofalowe oraz suszenie na odpadowych surowcach biologicznych w temperaturze 30 C. Z wyjątkiem suszenia na surowcach odpadowych, w pozostałych przypadkach zastosowano różne środki osłonowe: skrobię, mleko odtłuszczone, laktozę, serwatkę, maltodekstryny, pepton, sacharozę i żelatynę. Skrining metod utrwalania dwóch pozostałych mikroorganizmów wchodzących w skład szczepionki czteroorganizmowej: B. licheniformis KT20 oraz T. atroviride KP1 zostały opisane w innej pracy [Sobolczyk 2011]. Badania te wykazały, że najbardziej efektywną metodą utrwalania bakterii termofilnych była liofilizacja z dodatkiem serwatki, jako krioprotektanta, a w przypadku grzybów strzępkowych liofilizacja z udziałem dwóch środków osłonowych w postaci maltodekstryn i PVP oraz metoda suszenia konidiów immobilizowanych na wysłodkach, w temperaturze 30 C. Bakterie B. cereus B5e/sz poddano liofilizacji przy użyciu pięciu czynników osłonowych: mleka odtłuszczonego, maltodekstryn, laktozy, sacharozy i peptonu o stężeniu 5 i 10% każdy. Najskuteczniejszym krioprotektantem była laktoza w obu stężeniach i sacharoza w stężeniu 10% [Rys. 50]. Liczebność wegetatywnych form bakterii w trakcie trwania procesu zmalała o jeden rząd logarytmiczny, a liczebność form przetrwanych wzrosła o 1-2 rzędy logarytmiczne. Prawdopodobnie niekorzystne, stresowe warunki środowiskowe, występujące w trakcie liofilizacji stymulowały komórki bakteryjne do tworzenia przetrwalników w ciągu dwudziestogodzinnego procesu. Brak czynnika osłonowego w czasie trwania procesu skutkował obniżeniem liczebności komórek wegetatywnych aż o trzy rzędy logarytmiczne. Wynik ten potwierdza konieczność stosowania odpowiednich czynników osłonowych podczas liofilizacji. Przeżywalność form wegetatywnych bakterii B. cereus B5e/sz w procesie suszenia rozpyłowego w temperaturze 86 C była bardzo niska. Wyjściowa liczebność drobnoustrojów, na poziomie 7,8 x 10 8 jtk/ml, po procesie zmalała aż o pięć-sześciu rzędów logarytmicznych, niezależnie od zastosowanego czynnika osłonowego [Rys. 51]. Badane protektatny (skrobia, mleko odtłuszczone, laktoza, serwatka, maltodekstryny, pepton, sacharoza i żelatyna) nie

100 Omówienie wyników 100 chroniły komórek bakterii przed niszczycielskim wpływem wysokiej temperatury. W efekcie nastąpił wzrost liczebności form przetrwanych po zakończeniu procesu. Rys. 50. Utrwalanie biomasy B. cereus B5e/sz poprzez liofilizację z udziałem wybranych czynników osłonowych w stężeniach 5 i 10% Rys. 51. Utrwalanie biomasy B. cereus B5e/sz poprzez suszenie rozpyłowe w temperaturze 86 C z udziałem wybranych czynników osłonowych w stężeniach 1 i 2% Utrwalanie metodą ekstruzji prowadzono metodą natryskową i poprzez pułapkowanie. Oba procesy odbywały się w temperaturze 70 i 170 C. Po ekstruzji, wyjściowa liczebność komórek wegetatywnych zmniejszyła się o dwa-trzy rzędy logarytmiczne, a form przetrwalnych o trzy do pięciu rzędów logarytmicznych [Rys. 52]. Uwagę zwraca znaczny spadek ilości przetrwalników podczas ekstruzji metodą pułapkowania w temperaturze 170 C. Warunki te okazały się niekorzystne dla form przetrwanych. Fakt ujawnienia stosunkowo licznych form wegetatywnych bakterii po obróbce cieplnej w tak wysokiej temperaturze jak 170 C, może wynikać z zakażenia ekstrudowanego materiału po zakończonym procesie.

101 Omówienie wyników 101 Ekstruzja bowiem, z przyczyn technicznych, nie może być prowadzona w warunkach sterylnych. Rys. 52. Utrwalanie biomasy B. cereus B5e/sz poprzez ekstruzję metodą natryskową i poprzez pułapkowanie w dwóch temperaturach Suszenie fontannowe było również mało efektywnym sposobem utrwalania komórek badanego szczepu [Rys. 53A]. Liczebność komórek wegetatywnych obniżyła się z poziomu 3,46 x 10 9 jtk/ml do poziomu 1,25 x 10 6 jtk/ml, a form przetrwalnych wzrosła zaledwie o jeden rząd logarytmiczny. Wynik ten był stosunkowo niski w porównaniu z suszeniem mikrofalowym z odtłuszczonym mlekiem, gdzie przeżywalność komórek wegetatywnych wyniosła 10% [Rys. 53B]. A Rys. 53. Utrwalanie biomasy B. cereus B5e/sz: (A) metodą suszenia fontannowego w temperaturze 60 C z zastosowaniem serwatki jako czynnika osłonowego oraz (B) metodą suszenia mikrofalowego z zastosowaniem mleka odtłuszczonego jako czynnika osłonowego B

102 Omówienie wyników 102 Spośród sześciu użytych metod utrwalania biomasy bakterii B. cereus B5e/sz najbardziej wydajne okazały się liofilizacja i ekstruzja, gdzie z 1g uzyskano 2-5 x 10 9 jtk/g [Tab. 37]. Mimo iż wyniki badań obu technik utrwalania są zbliżone, jednak trudność w zachowaniu sterylnych warunków podczas ekstruzji, stanowi argument przeciwko stosowaniu tej metody w większej skali. W dalszych badaniach wykorzystano liofilizat B. cereus B5e/sz, utrwalany przy udziale 10% laktozy, jako czynnika osłonowego. Zgodnie z wynikami wcześniejszych badań [Sobolczyk 2011] szczep promieniowca z rodzaju Streptomyces najwięcej zarodników tworzył podczas hodowli w temperaturze 30 C na rozdrobnionych ziarnach pszenicy. Promieniowce morfologicznie przypominają grzyby strzępkowe, a więc ze względu na to podobieństwo w procesie ich utrwalania wykorzystano metodę optymalną dla grzybów strzępkowych, a mianowicie suszenie w temp. 30 C na wybranym podłożu stałym. W hodowli typu solid state wykorzystano, wcześniej wspomniane, rozdrobnione ziarna pszenicy. Po czternastu dobach hodowli uzyskano 1,45 x 10 7 zar/g s.m. W czasie, trwającego cztery doby, procesu suszenia liczebność promieniowców zmniejszyła się aż o trzy rzędy logarytmiczne i wynosiła 9,71 x 10 3 zar/g s.m. Wynik ten jest niezadowalający i wskazuje na konieczność dopracowania tej metody utrwalania promieniowców. Tab. 37. Przeżywalność biomasy B. cereus B5e/sz po zastosowaniu wybranych metod utrwalania Metoda Czynnik osłonowy Przeżywalność Liofilizacja Suszenie fontannowe Suszenie rozpyłowe Ekstruzja Suszenie mikrofalowe Laktoza 10% Serwatka 3% Skrobia 1% Serwatka 3% Odtłuszczone mleko 10% jtk/g 5,40E+09 2,50E+06 7,75E+05 2,60E+09 2,44E+05

103 Omówienie wyników Kompostowanie szczeciny w skali laboratoryjnej Badano przebieg kompostowania szczeciny z dodatkiem miału węglowego oraz jednego/dwóch z następujących komponentów: trocin, słomy i granulowanych odchodów kurzych (kurzeńca). Proces prowadzono przy udziale szczepionki B. cereus B5e/sz. Na podstawie otrzymanych wyników badań dobrano optymalny skład oraz proporcje komponentów mieszaniny kompostowej. Następnie kompostowano wybraną mieszankę przy udziale szczepionek jedno- i czteroorganizmowych. Dobór składu oraz proporcji składników mieszaniny kompostowej Odpowiedni skład i proporcja składników poddawanych kompostowaniu są czynnikami warunkującymi właściwy przebieg procesu. Mają one wpływ przede wszystkim na ilość frakcji organicznej oraz na optymalny stosunek węgla do azotu (C/N), który powinien mieścić się w zakresie Kompozycja mieszanin kompostowych wpływa także na odczyn ich masy, zdolność do utrzymywania odpowiedniej wilgotności i natlenienia. Powstawanie stref beztlenowych często jest wynikiem zbytniego rozdrobnienia składników w kompoście i powoduje niekorzystny beztlenowy rozkład materii organicznej, nierzadko z udziałem chorobotwórczych mikroorganizmów. Właściwie skomponowana mieszanina kompostowa zapewnia rozwój odpowiedniej mikroflory tlenowej, która bierze udział w biodegradacji kompostowanego materiału. Porównano przebieg kompostowania szczeciny w mieszaninie z miałem węglowym oraz jednym/dwoma z następujących komponentów: wiórek, słomy i kurzeńca w stosunkach wagowych ujętych w tab. 38 (kompost I). W przebiegu kompostowania badanych mieszanek kompostowych nie zaobserwowano fazy termofilnej, gdyż maksymalna temperatura nie przekroczyła 32 C [Rys. 54, 55 i 56]. Temperatura kompostów inokulowanych szczepionką była wyższa od kontrolnych średnio o 1-2 C. W tych warunkach wzrost drobnoustrojów termofilnych oraz procesy degradacji szczeciny były ograniczone. Przebieg temperatury w kompoście inokulowanym monokulturą B. cereus B5e/sz nieznacznie różnił się w stosunku do kontroli. Ponadto temperatury masy kompostowej w czasie trwania procesu były zaledwie o kilka stopni wyższe od temperatury otoczenia. Nie zaobserwowano faz charakterystycznych dla kompostowania, a w szczególności fazy intensywnego rozkładu materii organicznej. Prawdopodobnie zbyt mała była masa kompostowanego materiału ( g), co uniemożliwiało prawidłowy przebieg procesu.

104 Omówienie wyników 104 Tab. 38. Skład mieszanin kompostowych badanych w skali laboratoryjnej Kompost Szczecina Trociny Słoma Pył węglowy Kurzeniec [g] [g] [g] [g] C org /N og I a ,1 b ,0 c 2-0,8 0,4 0,8 10,13 II ,0 III ,4 IV ,9 V ,1 VI ,9 VII ,2 Rys. 54. Temperatura kompostu w procesie kompostowania masy o składzie: szczecina, pył węglowy oraz trociny (kompost I a) inokulowanej szczepionką B. cereus B5e/sz Rys. 55. Temperatura kompostu w procesie kompostowania masy o składzie: szczecina, miał węglowy, słoma (kompost I b) inokulowanej szczepionką B. cereus B5e/sz

105 Omówienie wyników 105 Rys. 56. Temperatura kompostu w procesie kompostowania masy o składzie: szczecina, miał węglowy, słoma z dodatkiem kurzeńca (kompost I c), inokulowanej szczepionką B. cereus B5e/sz Analizując aktywność enzymatyczną wybranych mieszanek wykazano, że w kompostach inokulowanych szczepionką bakterii B. cereus B5e/sz w większości przypadków uwalnianie proteaz i dehydrogenaz było bardziej intensywne w porównaniu do próby kontrolnej [KA] [Rys. 57 i 58]. W kompostowanej masie z dodatkiem trocin i słomy mikroorganizmy uwalniały największe ilości enzymów proteolitycznych i oksydoredukcyjnych, odpowiednio 6-7 JP i 2-3 JD. Proteazy osiągały aktywność wyższą o 0,2-2,4 JP w stosunku do kompostu zawierającego wyłącznie autochtoniczną mikroflorę [KA]. Ta różnica stanowi zysk inokulacji szczepionką bakteryjną. Rys. 57. Aktywność proteolityczna wybranych mieszanek kompostowych zawierających szczecinę i pył węglowy oraz dodatkowo: trociny, słomę lub słomę z kurzeńcem, inokulowanych szczepionką B. cereus B5e/sz (kompost badawczy) oraz odpowiadające im kontrole (kompost kontrolny) (najwyższe wartości)

106 Omówienie wyników 106 Rys. 58. Aktywność dehydrogenaz wybranych mieszanek kompostowych zawierających szczecinę i pył węglowy oraz dodatkowo: trociny, słomę lub słomę z kurzeńcem, inokulowanych szczepionką B. cereus B5e/sz (kompost badawczy) oraz odpowiadające im kontrole (kompost kontrolny) (najwyższe wartości) W trzech inokulowanych mieszankach kompostowych ubytek suchej masy był wyższy w stosunku do kontroli o 8 do 17% [Rys. 59]. Najlepsze wyniki uzyskano w kompoście o składzie: szczecina, trociny, miał węglowy (2:1:1) oraz kompostu o składzie: szczecina, słoma, miał węglowy (2:1:1). Przebieg procesu w obu przypadkach był porównywalny, dlatego można stwierdzić, że zarówno trociny jak i słoma mogą być z powodzeniem wykorzystane jako składniki kompostu. Oba komponenty zawierają duże ilości węgla i niewielką ilość azotu, co korzystnie wpływa na bilans obu tych pierwiastków w kompoście. W dalszych badaniach wykorzystywano mieszankę kompostową, która zawierała, w swoim składzie szczecinę, trociny oraz pył węgla brunatnego. Rys. 59. Ubytek suchej masy wybranych mieszanek kompostowych, pomniejszony o wartość ubytku suchej masy w kompoście kontrolnym [KA]

107 Omówienie wyników 107 W kolejnym etapie badań przeprowadzono kompostowanie natywnej szczeciny, trocin oraz pyłu węglowego w różnych stosunkach wagowych (2:1:1, 4:1:1, 8:1:1, 18:1:1). Kontrolnie przetestowano także kompozycje dwuskładnikowe szczeciny z trocinami (13:1, 15:1) oraz szczeciny [Tab. 38]. Trociny, jako odpad roślinny z jednej strony podwyższały zawartość węgla organicznego, a z drugiej utrzymywały strukturę kompostu dzięki tworzeniu wolnych przestrzeni umożliwiających dostęp tlenu do poszczególnych jego warstw. Dodatek chłonącego wodę miału węglowego sprzyjał utrzymywaniu wilgotności na stałym poziomie 60%, zapewniającym prawidłowy przebieg rozkładu związków organicznych. Kompostowanie prowadzono przy udziale szczepionki jednoorganizmowej B. cereus B5e/sz. Jako kryteria efektywności kompostowania przyjęto: aktywności enzymatyczne kompostów, stosunek C/N oraz ubytek ich masy. Największe ilości proteaz o aktywności 4-5 JP uwalniała mikroflora kompostów o proporcjach składników 2:1:1, 4:1:1 i 13:1, a największe ilości dehydrogenaz o aktywności 1,25 JD uwalniała mikroflora kompostu o proporcji składników 2:1:1 [Tab. 39]. Świadczy to o najintensywniejszej hydrolizie białek i najwyższej aktywności metabolicznej mikroflory w masach kompostowych o wskazanych proporcjach składu. Różnica ubytku suchej masy wybranych mieszanin kompostów badawczych i kontrolnych przedstawiona na rys. 60. pozwoliła ocenić efektywność zastosowanej szczepionki B. cereus B5e/sz. Tab. 39. Aktywności proteaz i dehydrogenaz kompostów o różnych proporcjach składników inokulowanych szczepionką B. cereus B5e/sz (najwyższe wartości) Komposty Proporcje składników sz:t:p* Proteazy [JP] Dehydrogenazy [JD] Badawcze I 2:1:1 4,02 1,25 II 4:1:1 4,23 0,66 III 8:1:1 3,5 0,5 IV 18:1:1 3,35 0,63 Kontrolne V 13:1 trociny 4,95 0,8 VI 15:1 trociny 3,32 0,61 VII 15:1 węgiel 1,91 0,95 *sz-szczecina; t-trociny; p-pył węglowy We wszystkich kompostach badawczych odnotowano większy ubytek suchej masy w porównaniu do kompostów zawierających wyłącznie autochtoniczną mikroflorę. W kompostach o proporcjach składników 2:1:1, 4:1:1 i 13:1 dodatek szczepionki przyspieszył rozkład materii organicznej, który był wyższy w stosunku do kontroli o 7%. Natomiast całkowity ubytek suchej substancji w wymienionych wyżej kompostach zawierał się

108 Omówienie wyników 108 w granicach 40-47%. Wyniki badań pokazały również, że im mniejszy był stosunek C/N w kompoście, tym aktywności enzymatyczne były niższe. Efekt ten mógł wynikać z faktu, że nadmierna ilość szczeciny (głównego źródła azotu) w stosunku do masy trocin (w których skład wchodzi głównie węgiel) powoduje powstawanie w kompoście stref beztlenowych, ograniczających wzrost mikroflory kompostowej. Rys. 60. Ubytek suchej masy wybranych mieszanek kompostów badawczych (inokulowanych) pomniejszony o ubytek suchej masy w odpowiadających im kompostach kontrolnych (nieinokulowanych) Stosunek węgla do azotu w wyjściowej mieszaninie powinien mieścić się w zakresie C/N = Optymalnym składem masy charakteryzował się więc kompost, w którym C/N wynosił 21,1 [Tab. 38]. Taką wartość uzyskano w kompoście zawierającym 50% szczeciny, 25% trocin i 25% miału węglowego. W kompoście II, w którego składzie było 75% szczeciny i 25% pozostałych składników wspomniany wskaźnik był dwukrotnie niższy. Można przypuszczać, że wyższa procentowa zawartość składników roślinnych i pyłu węglowego, oprócz bilansowania ilości węgla organicznego, zapewnia zachowanie lepszej wilgotności i struktury kompostu. Uwzględniając uzyskane wyniki ustalono, że optymalną proporcją szczeciny do pozostałych składników było 50%. Podsumowując dotychczasowe badania, można stwierdzić, że dla wydajnego kompostowania, optymalna proporcja szczeciny do pozostałych komponentów powinna wynosić jeden do jednego. Zarówno trociny jak i słoma mogą być stosowane zamiennie jako składniki roślinne kompostu.

109 Omówienie wyników 109 Kompostowanie przy udziale wybranych szczepionek jednoorganizmowych Przebieg kompostowania z udziałem wybranych monokultur drobnoustrojów oraz porównawczo autochtonicznej mikroflory analizowano w kompostach o proporcjach szczeciny, trocin i pyłu węglowego, odpowiednio 2:1:1. W badaniach wykorzystano sześć szczepionek, w tym cztery szczepy bakterii z rodzaju Bacillus: B. cereus B5e/sz (mezofil), B. subtilis P22 (mezofil), B. subtilis T16 (termotolerancyjny) i B. licheniformis KT20 (termofil), jeden szczep promieniowca S. violaceolatus KP2 oraz jeden szczep grzybów strzępkowych T. atroviride KP1. Kontrolę stanowiła niezaszczepiana masa kompostowa zawierająca autochtoniczną mikroflorę [KA]. Przebieg procesu oceniano na podstawie zmian odczynu środowiska, aktywności enzymatycznej proteaz i dehydrogenaz oraz ubytku suchej masy kompostowej. Zmiany odczynu środowiska w czasie kompostowania przy udziale szczepionek bakterii, a także autochtonicznej mikroflory wskazywały na stopniową alkalizację podłoża do ph 8,5-9,1, która trwała do 3-4 tygodnia [Rys. 61]. Następnie ph kompostów nieznacznie obniżyło się, osiągając wartość ph 8,2. Najwyższy wzrost odczynu środowiska kompostowego spowodowały bakterie z rodzaju Bacillus w tym szczególnie szczepy B. subtilis T16 (ph 9,1) i B. subtilis P22 (ph 9,0). Alkalizacja podłoża była m.in. skutkiem postępującego rozkładu białek. W przypadku, gdy odczyn kompostowanego środowiska przekroczył ph 9,0 wystąpił niekorzystny efekt uwalniania amoniaku, co powodowało zmniejszenie puli dostępnego dla mikroorganizmów azotu. Z drugiej strony wysoki odczyn środowiska ułatwia hydrolizę enzymatyczną trudno degradowalnej keratyny. W przypadku grzybów strzępkowych T. atroviride KP1 alkalizacja podłoża kompostowego przebiegała analogicznie jak w przypadku szczepów bakteryjnych [Rys. 61]. W pierwszej połowie 6-tygodniowego kompostowania obserwowano najwyższe aktywności proteaz zarówno w inokulowanych kompostach jak i w próbie kontrolnej [KA] [Rys. 62]. Wyjątek stanowiła mieszanina kompostowa inokulowana szczepionką B. subtilis P22, w której aktywność proteolityczna osiągnęła najwyższą wartość 3,4 JP dopiero w piątym tygodniu trwania procesu. Między 2 a 4 tygodniem kompostowania, termotolerancyjne i termofilne szczepy z rodzaju Bacillus uwalniały proteazy na poziomie 6,7 JP (B. subtilis T16 i B. licheniformis KT20). Aktywność metaboliczna mikroflory kompostowej, wyrażana w jednostkach aktywności oksydoredukcyjnej, miała zróżnicowany przebieg w poszczególnych kompostach [Rys. 63].

110 Omówienie wyników 110 Rys. 61. Odczyn środowiska w nieinokulowanej kontroli [KA] i w kompostach inokulowanych wybranymi szczepami bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych Największą aktywność dehydrogenaz wykazano w kompoście inokulowanym szczepionką B. subtilis T16 (1,25 JD). Uwagę zwracają stosunkowo wysokie aktywności proteaz (5,93 JP) i dehydrogenaz (1,25 JD) w kompoście kontrolnym, porównywanym do prób inokulowanych wybranymi mikroorganizmami. Szczepienie kompostów monokulturami nie przyczyniło się do znaczącego zwiększenia aktywności badanych enzymów. Najwyższe aktywności proteaz i dehydrogenaz uwalnianych przez badany szczep grzybów strzępkowych odnotowano w 2 i 3 tygodniu procesu, gdzie wyniosły one 6,6 JP i 1,0 JD [Rys. 62 i 63]. Uzyskane wyniki były porównywalne z aktywnościami enzymatycznymi oznaczonymi w kompostach inokulowanych szczepami bakteryjnymi. Rys. 62. Aktywność proteolityczna w nieinokulowanej kontroli [KA] i w kompostach inokulowanych wybranymi szczepami bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych

111 Omówienie wyników 111 Rys. 63. Aktywność dehydrogenaz w nieinokulowanej kontroli [KA] i w kompostach inokulowanych wybranymi szczepami bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych Wynikiem rozstrzygającym o efektywności kompostowania był ubytek suchej masy kompostu po zakończonym procesie [Rys. 64]. Po sześciu tygodniach kompostowania zastosowanie szczepionki B. subtilis T16 oraz B. cereus B5e/sz przyczyniło się do zmniejszenia masy materii organicznej o połowę. Uzyskany wynik był o 10% wyższy w stosunku do kontroli zawierającej wyłącznie autochtoniczną mikroflorę. Pozostałe szczepionki bakteryjne i szczepionka grzybowa nie przyczyniły się do zwiększenia ubytku suchej masy kompostu w odniesieniu do nieinokulowanej kontroli. Rys. 64. Ubytek suchej masy kompostów inokulowanych wybranymi szczepami bakterii i grzybów strzępkowych oraz nieinokulowanej kontroli [KA] Podsumowując można uznać, że przebieg kompostowania z udziałem szczepionek monokultur drobnoustrojów nie różnił się znacząco od kompostu kontrolnego. Wyjątek stanowiły komposty inokulowane szczepionką B. subtilis T16 oraz B. cereus B5e/sz, których

112 Omówienie wyników 112 aplikacja spowodowała zwiększenie ubytku materii organicznej. Ogólnie kompostowana masa była zbyt niska żeby mogły wystąpić prawidłowe fazy kompostowania. Wykazane aktywności enzymatyczne proteaz i dehydrogenaz w kompostach, wskazują, że wybrane szczepy, mają potencjał biodegradacyjny, który może być wykorzystany do utylizacji odpadów keratynowych. Kompostowanie przy udziale szczepionek czteroorganizmowych Na podstawie otrzymanych wyników badań skomponowano skład dwóch szczepionek czteroorganizmowych SZ1 i SZ2: szczepionka SZ1 obejmowała dwa szczepy bakterii z rodzaju Bacillus, jeden szczep promieniowca z rodzaju Streptomyces i jeden szczepy grzybów z rodzaju Trichoderma: B. cereus B5e/sz, B. licheniformis KT20, S. violaceolatus KP2, T. atroviride KP1 szczepionka SZ2 obejmowała trzy szczepy bakterii z rodzaju Bacillus i jeden szczep grzybów z rodzaju Trichoderma: B. cereus B5e/sz, B. subtilis T16, B. subtilis P22, T. atroviride KP1 Na wybór wymienionych wyżej szczepów wpłynęły głównie ich uzdolnienia enzymatyczne, a także zachodzące między nimi interakcje. W przypadku antagonizmów w obrębie jednej szczepionki, aplikacja poszczególnych monokultur była odpowiednio rozłożona w czasie. Wśród mikroflory szczepionkowej znalazły się mezofilne i termotolerancyjne/termofilne bakterie oraz promieniowiec o uzdolnieniach proteolitycznych, a także grzyby strzępkowe, które oprócz proteaz znane są z biosyntezy pozakomórkowych glukanaz degradujących polimery roślinne. Czteroorganizmowymi szczepionkami SZ1 i SZ2 inokulowano masę kompostową składającą się ze szczeciny, trocin i pyłu węglowego o proporcji wagowej 2:1:1. Porównano proces kompostowania tej masy z udziałem obu szczepionek. W trakcie kompostowania ciepłota środowiska osiągała wartość C i była o 4-6 C wyższa w porównaniu do kompostu inokulowanego monokulturą B. cereus B5e/sz [Rys. 65 i 66]. W kompoście inokulowanym szczepionką SZ1 widoczna była faza termofilna oraz wyraźne różnice między próbą badawczą, a kontrolną [Rys. 65]. Na wykresie ilustrującym zmiany wartości temperatury, w kompoście inokulowanym szczepionką SZ2 faza termofilna była krótsza oraz brak było wyraźnego przejścia do fazy mezofilnej [Rys. 66].

113 Omówienie wyników 113 Rys. 65. Temperatura masy kompostowej o składzie: szczecina, miał węglowy i trociny inokulowanej szczepionką czteroorganizmową SZ1 Rys. 66. Temperatura masy kompostowej o składzie: szczecina, miał węglowy i trociny inokulowanej szczepionką czteroorganizmową SZ2 Zmiany aktywności enzymatycznych kompostów, które różniły się składem inokulowanych szczepionek czteroorganizmowych ilustrują rysunki 67 i 68. W obu kompostach w pierwszej połowie kompostowania aktywność proteolityczna miała zbliżoną wartość do kontroli, a w trzecim i czwartym tygodniu w kompoście inokulowanym szczepionką SZ2 zaznaczył się znaczny wzrost aktywności proteaz (7,3 JP) [Rys. 67]. W porównaniu z wartościami uzyskanymi w kompostach zaszczepianych monokulturami, w kompostach inokulowanych szczepionkami wieloorganizmowymi uwalniane ilości enzymów proteolitycznych były zbliżone. Od drugiego tygodnia procesu aktywność dehydrogenaz w kompostach inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi była wyższa nawet o 2 jednostki

114 Omówienie wyników 114 w stosunku do próby kontrolnej i wynosiła w kompoście inokulowanym szczepionką SZ1 2 jednostki, a w kompoście inokulowanym szczepionką SZ2 1,5 jednostki [Rys. 68]. Wynik ten wskazuje na zwiększoną aktywność metaboliczną mikroorganizmów w tym okresie, związaną z postępującym rozkładem materii organicznej. Przy zastosowaniu szczepionek jednoorganizmowych, uzyskiwano dwukrotnie niższą aktywność dehydrogenaz. Rys. 67. Aktywność proteolityczna kompostów inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 Rys. 68. Aktywność dehydrogenaz w kompostach inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 Ubytek suchej masy kompostu inokulowanego szczepionką SZ1 wyniósł 47% i był aż o 21% wyższy w stosunku do kontroli [KA] [Rys. 69]. W tym kompoście uzyskano największy poziom degradacji odpadu keratynowego. Dla porównania, inokulacja monokultury B. subtilis T16 przyczyniła się do rozkładu zaledwie 10% suchej masy kompostowej. Uzyskane wyniki sugerują, że bardziej efektywna była szczepionka

115 Omówienie wyników 115 o różnorodnym składzie zawierająca zarówno bakterie mezo- i termofilne/termotolerancyjne, szczep promieniowca oraz jeden szczep grzybów strzępkowych. Adaptacja monokultury, wprowadzonej do kompostu z licznie reprezentowaną mikroflorą autochtoniczną jest znacznie utrudniona. Skojarzone szczepionki kilku szczepów drobnoustrojów mają znacznie większą szansę na opanowanie nowego środowiska i przezwyciężenie skutków antagonistycznych oddziaływań ze strony mikroorganizmów naturalnie w nim bytujących. Rys. 69. Ubytek suchej masy kompostowej inokulowanej szczepionkami SZ1 i SZ2, pomniejszona o wartość ubytku suchej masy w kompoście niezaszczepianym [KA] A B C D Rys. 70. Makroskopowa ocena biodegradacji szczeciny w kompoście na początku wyjściowa mieszanka (A) i po zakończeniu procesu kompostowania w kompoście kontrolnym (B), w kompoście inokulowanym szczepionką B. cereus B5e/sz (C) oraz w kompoście inokulowanym szczepionką wieloorganizmową SZ1 (D) Inokulacja szczepionek czteroorganizmowych, w porównaniu z zastosowaniem autochtonicznej mikroflory czy aplikacji pojedynczych szczepów, zwiększyła efektywność rozkładu materii organicznej, co potwierdziły również wizualne zmiany w masie

116 Omówienie wyników 116 kompostowej widoczne na zdjęciach [Rys. 70]. Przebieg kompostowania z udziałem obu szczepionek wieloorganizmowych był zbliżony, jednak większy ubytek suchej masy spowodowała inokulacja szczepionki SZ Kompostowanie szczeciny w skali półtechnicznej W kolejnym etapie badań została powiększona skala kompostowania szczeciny z laboratoryjnej do półtechnicznej, w której masa całkowita zwiększyła się 353 razy - ze 170g do 60 kg przy zachowanym stosunku ilościowym odpadów keratynowych do pozostałych komponentów, który wynosił 1:1. Dodatkowo główny surowiec kompostowy, czyli szczecinę poddano również rozdrobnieniu. Proces prowadzono w reaktorze mieszadłowym metodą dynamiczną. Badano przebieg kompostowania niezaszczepianej oraz inokulowanej mieszanki kompostowej. Szczepionki wprowadzane były do kompostu w postaci płynu pohodowlanego. Zawarte w nim składniki odżywcze mogły stymulować wzrost mikroflory kompostowej. Dlatego też do badań wprowadzono drugą kontrolę, do której dodano tylko pożywkę bez mikroorganizmów [KP]. W dalszym etapie została użyta szczepionka jednoorganizmowa oraz czteroorganizmowa w formie nieutrwalonej i utrwalonej. Komposty kontrolne Analizując temperaturę w obu kompostach kontrolnych (KA i KP) wykazano, że w kontroli z dodatkiem pożywki były one średnio o 7 C niższe w porównaniu z kontrolą KA i osiągały wartość 54 C [Rys. 71]. Uwagę zwraca fakt, że w skali półtechnicznej, w obu kontrolnych mieszankach kompostowych wystąpiła faza termofilna, gdzie temperatura przekroczyła wartość 45 C i utrzymywała się przez okres 9-13 dób. W tym czasie w kompoście zachodziły intensywne przemiany materii organicznej i najprawdopodobniej miała miejsce higienizacja kompostu. Zwiększenie skali kompostowania z laboratoryjnej na półtechniczną korzystnie wpłynęło na przebieg procesu. W zwiększonej masie mikroorganizmy przyczyniały się do egzotermicznego rozkładu substancji organicznej, a w konsekwencji uwalniania większej ilości ciepła.

117 Omówienie wyników 117 Rys. 71. Temperatury masy kompostów kontrolnych z dodatkiem pożywki [KP] i bez dodatku pożywki [KA] W obu kompostach, autochtoniczna mikroflora wytwarzała enzymy proteolityczne i dehydrogenazy w porównywalnej ilości 0,5-2,5 jednostki [Rys. 72 i 73]. Początkowo w kompoście kontrolnym z pożywką aktywność proteaz była o jedną jednostkę wyższa w porównaniu z kontrolą KA ale w 84 dobie proporcje te odwróciły się i w kompoście KA odnotowano aktywność proteaz na poziomie 1,8 JP. Ze względu na efektywność procesu kompostowania, najistotniejszymi grupami mikroorganizmów, zasiedlającymi to środowisko były bakterie proteolityczne i termofilne a także promieniowce. Ich sukcesja w obu badanych kompostach miała porównywalny przebieg [Rys. 74 i 75]. W kompoście kontrolnym KA liczebność mikroflory proteolitycznej początkowo zwiększyła się do poziomu 3,75x10 9 jtk/g s.m., a następnie po 10 dobie gwałtownie się obniżyła [Rys. 74]. Natomiast liczba termofilnych bakterii utrzymywała się na stałym poziomie i wynosiła 1x10 8 1x10 9 jtk/g s.m. W przypadku kompostu kontrolnego KP liczba bakterii proteolitycznych przez 35 dób była stosunkowo wysoka (1x10 8 jtk/g s.m.) [Rys. 75]. Populacja termofilnej mikroflory w kompoście KP, podobnie jak w kompoście KA utrzymywała się na stałym poziomie i wynosiła 1x10 6 1x10 7 jtk/g s.m. Niewielkie różnice między kompostami KP i KA zaobserwowano również porównując ubytek suchej masy kompostowej po zakończonym procesie, który w obu przypadkach wynosił ok % [Rys. 76].

118 Omówienie wyników 118 Rys. 72. Aktywność proteolityczna kompostów kontrolnych z dodatkiem i bez dodatku pożywki Rys. 73. Aktywność dehydrogenaz kompostów kontrolnych z dodatkiem i bez dodatku pożywki Rys. 74. Mikroflora kompostu kontrolnego [KA]

119 Omówienie wyników 119 Rys. 75. Mikroflora kompostu kontrolnego [KP] Rys. 76. Ubytek suchej masy kompostowej wzbogaconej w pożywkę i bez jej dodatku Podsumowując dotychczasowe wyniki można zauważyć, że wprowadzenie pożywki do masy kompostowej nie było wystarczającym zabiegiem wpływającym na przebieg procesu kompostowania przy udziale autochtonicznej mikroflory. Stymulacja jej rozwoju poprzez dostarczenie łatwo przyswajalnych składników nie przyspieszała rozkładu szczeciny przez mikroflorę bytującą w masie kompostowej. Kompostowanie przy udziale szczepionki jednoorganizmowej Surowce poddane kompostowaniu często wymagają dodatkowego rozdrobnienia, jeżeli wielkość pojedynczych składników przekracza 40 mm. Szczecina, której długość mieści w granicach od 5 do 8 cm została rozdrobniona do wielkości 1 cm. Zabieg ten umożliwił bardziej równomierne ułożenie odpadu keratynowego w masie kompostowej. Kompostowaniu poddano szczecinę rozdrobnioną lub nierozdrobnioną, którą inokulowano szczepionką bakterii B. cereus B5e/sz w postaci płynu pohodowlanego. Rozdrobnienie

120 Omówienie wyników 120 surowca może wpływać na kształtowanie się struktury kompostu, a tym samym na jego parametry fizyczne tj. dyfuzję tlenu oraz utrzymywanie odpowiedniej wilgotności. Nierozdrobniona szczecina zwiększała objętość kompostowanej masy, a tym samym dostępność tlenu do poszczególnych jego warstw. Rozdrobnienie keratynowego odpadu ułatwiało z kolei dostępność mikrobiologiczną i rozkład trudnodegradowalnego białka. W masie kompostowej z natywną szczeciną, inokulowaną szczepionką B. cereus B5e/sz faza termofilna była bardzo krótka, a od 8 doby temperatura utrzymywała się na poziomie 30 C [Rys. 77]. W kompoście kontrolnym temperatura 40 C utrzymywała się dłużej, bo do szóstej doby. Ponadto kompostowany materiał inokulowany szczepionką, w trakcie obracania reaktora, zbijał się w twarde kule o średnicy Φ=5-9 cm, widoczne na zdjęciu [Rys. 78]. Spowodowało to tworzenie się stref beztlenowych w kompostowanej masie i zaburzenie przebiegu całego procesu. W kompoście z rozdrobnioną szczeciną efekt ten nie wystąpił. Kompostowana masa miała jednolitą strukturę, a jej temperatura w trakcie trwania procesu od 5 do 7 doby osiągała wysokość 68 C [Rys. 79]. Faza termofilna utrzymywała się przez 11 dób, co sprzyjało higienizacji kompostu. Temperatura kompostów półtechnicznych była wyższa średnio o 20 C w porównaniu z kompostami laboratoryjnymi, w których masa mieszanek kompostowych okazała się zbyt mała, przez co nie odwzorowywała prawidłowego przebiegu procesu. Rys. 77. Temperatura masy kompostowej na bazie nierozdrobnionej szczeciny inokulowanej szczepionką B. cereus B5e/sz

121 Omówienie wyników 121 Rys. 78. Kuliste skupiska tworzące się w trakcie kompostowania nierozdrobnionej szczeciny w bioreaktorze mieszadłowym Rys. 79. Temperatura masy kompostowej z rozdrobnioną szczeciną inokulowaną szczepionką B. cereus B5e/sz Dalszą konsekwencją była aktywność proteaz i dehydrogenaz masy kompostowej, a szczególnie drugiej wspomnianej grupy enzymów [Rys. 80]. Podczas kompostowania więcej dehydrogenaz uwalniały mikroorganizmy w kompoście z rozdrobnioną szczeciną (0,94 JD). Wstępna obróbka substratu keratynowego sprzyjała zwiększeniu ich aktywności metabolicznej. Rys. 80. Aktywność proteaz (z lewej) i dehydrogenaz (z prawej) kompostów z rozdrobnioną i nierozdrobnioną szczeciną inokulowaną szczepionką B. cereus B5e/sz

122 Omówienie wyników 122 W obu kompostowanych masach odmiennie przedstawiała się też liczebność poszczególnych grup drobnoustrojów [Rys. 81 i 82]. W trakcie trwania procesu, w kompoście z natywnej szczeciny liczebność bakterii termofilnych i proteolitycznych utrzymywała się na stałym poziomie 1x10 6-1x10 8 jtk/g s.m. [Rys. 81]. Mogło to być konsekwencją nieodpowiednich warunków do rozwoju mikroflory. Populacja promieniowców, początkowo niewielka, dopiero pod koniec kompostowania liczyła 4x10 5 jtk/g s.m. Przypuszczalnie mikroorganizmy te także nie miały odpowiednich warunków do rozwoju. Liczebność proteolitycznych bakterii w kompoście z rozdrobnioną szczeciną, utrzymywała się na poziomie 1x10 6-1x10 8 jtk/g s.m. z tendencją rosnącą [Rys. 82]. Natomiast populacja termofilnej mikroflory po 8 dobie gwałtownie się zmniejszała. W kompoście tym utrzymywała się stosunkowo wysoka liczebność grzybów strzępkowych (1x10 6-1x10 8 jtk/g s.m.), która także miała tendencję wzrostową. Liczebność form przetrwalnych bakterii w trakcie trwania procesu z rozdrobnioną i natywną szczeciną zmieniała się nieznacznie, utrzymując się na poziomie 1x10 5-1x10 6 jtk/g s.m. Zwiększenie liczby przetrwalników bakterii mezofilnych było istotne ze względu na przetrwanie przez tę grupę drobnoustrojów niekorzystnych warunków temperaturowych panujących w fazie termofilnej. Rys. 81. Mikroflora kompostu z nierozdrobnionej szczeciny inokulowanej szczepionką B. cereus B5e/sz

123 Omówienie wyników 123 Rys. 82. Mikroflora kompostu z rozdrobnioną szczeciną inokulowaną szczepionką B. cereus B5e/sz O bardziej efektywnym przebiegu kompostowania rozdrobnionej szczeciny w porównaniu do kompostu z natywnym substratem rozstrzyga ostatecznie ubytek suchej masy kompostowej. W pierwszym wspomnianym kompoście wynosił on 18,4% i był o 9% wyższy w stosunku do kompostu z nierozdrobnioną szczeciną [Rys. 83]. Rys. 83. Ubytek suchej masy kompostowej z rozdrobnioną i nierozdrobnioną szczeciną, inokulowaną szczepionką B. cereus B5e/sz Na podstawie otrzymanych wyników badań można stwierdzić, że kompostowanie rozdrobnionej szczeciny jest bardziej efektywne w porównaniu z kompostowaniem natywnego substratu keratynowego. W skali półtechnicznej kompostowanie szczeciny natywnej, w bioreaktorze mieszadłowym jest niemożliwe, gdyż proces przebiegał nieprawidłowo.

124 Omówienie wyników 124 Kompostowanie przy udziale szczepionek wieloorganizmowych W następnym etapie badań przeprowadzono kompostowanie z udziałem szczepionek wieloorganizmowych SZ1 i SZ2. Proces prowadzono metodą dynamiczną z zastosowaniem rozdrobnionej szczeciny. Szczepionki, w postaci płynu pohodowlanego, wprowadzano sukcesywnie do masy kompostowej. Kolejność inokulacji odzwierciedlała naturalną sukcesję poszczególnych grup drobnoustrojów w kompoście. Warunkowały ją interakcje mikroorganizmów w obrębie danej szczepionki oraz temperatura kompostu, której monitoring stanowił narzędzie kontroli procesu kompostowania [Tab. 40]. W kompostach inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 temperatura masy była wyższa o C w porównaniu do kontroli [KA] [Rys. 84 i 85]. Faza termofilna w kompoście badawczym SZ1 trwała 11 dób, a temperatura kompostu osiągnęła wartość 68 C [Rys. 84]. Inokulacja termofilną szczepionką B. licheniformis KT20 miała miejsce w 7 dobie procesu, gdy temperatura kompostu obniżyła się o C zarówno w próbie badawczej jak i nieinokulowanej kontroli. Tab. 40. Kolejność inokulacji kompostów wybranymi szczepami bakterii, promieniowców i grzybów strzępkowych, wchodzących w skład szczepionek wieloorganizmowych SZ1 i SZ2 w zależności od fazy kompostowania Fazy kompostowania Szczepionka SZ1 Szczepionka SZ2 Szczep Szczep Mezofilna B. cereus B5e/sz B. cereus B5e/sz + B. subtilis T16 Termofilna B. licheniformis KT20 B. subtilis T16 Schładzania i dojrzewania S. violaceolatus KP2 + T. atroviride KP1 B. subtilis P22 T. atroviride KP1 Zabieg ten przyczynił się do przedłużenia fazy intensywnych przemian w kompoście badawczym, gdyż jego temperatura ponownie wzrosła do 62 C. W kontroli podwyższona temperatura (powyżej 45 C) utrzymywała się zaledwie przez trzy doby. Po zakończonej fazie termofilnej, temperatura masy kompostu badawczego i kontrolnego zmniejszyła się do 30 C, stwarzając warunki do rozwoju mezofilnej mikroflory. W 20 dobie procesu inokulowano zatem kompost szczepionką promieniowców S. violaceolatus KP2 i grzybów strzępkowych T. atroviride KP1. W czwartym tygodniu kompostowania temperatura masy kompostu badawczego i kontrolnego ponownie wzrosła, osiągając wartość C, po czym nastąpiła faza schładzania. Przebieg kompostowania szczeciny inokulowanej szczepionką

125 Omówienie wyników 125 czteroorganizmową SZ2 przedstawiał się bardziej korzystnie. Faza termofilna, zapoczątkowana inokulacją dwoma szczepami bakterii z rodzaju Bacillus trwała 14 dób, podtrzymana była dodatkową inokulacją termotolerancyjnym szczepem B. subtilis T16 [Rys. 85]. W porównywanym kompoście kontrolnym, proces ten trwał o 4 doby krócej. W fazie schładzania, gdy temperatura obniżyła się do 30 C, masę kompostową inokulowano mezofilnym szczepem bakterii B. subtilis P22, a następnie po 12 dobach dodano szczepionkę grzybów z rodzaju Trichoderma. W 40-stej dobie procesu kompost osiągnął fazę dojrzewania, w której temperatura masy obniżyła się do C. Porównując przebieg kompostowania z udziałem obu wieloorganizmowych szczepionek, warto zwrócić uwagę na fakt, że różni się on również temperaturą otoczenia. W przypadku kompostu inokulowanego szczepionką SZ2, średnia temperatura otoczenia wynosiła 33 C i była o 10 C wyższa w porównaniu do temperatury otoczenia monitorowanej w pomieszczeniu, w którym prowadzono proces z udziałem szczepionki SZ1. Prawdopodobnie różnica wynikała z faktu, iż pierwsze wspomniane kompostowanie odbywało się w okresie letnim, a drugie w okresie jesiennym. Mimo iż, oba reaktory znajdowały się w zamkniętym pomieszczeniu, jednak brak stałej klimatyzacji, mógł mieć wpływ na różnice w przebiegu kompostowania. Jak można zaobserwować na rysunkach 1 i 2, temperatura zagrzewających się kompostów miała niewielki wpływ na temperaturę otoczenia. Rys. 84. Temperatury masy kompostu badawczego inokulowanego szczepionką SZ1 oraz kompostu kontrolnego [KA]

126 Omówienie wyników 126 Rys. 85. Temperatury masy kompostu badawczego inokulowanego szczepionką SZ2 oraz kompostu kontrolnego [KA] Odczyn środowiska kompostów inokulowanych szczepionkami wieloorganizmowymi oraz kompostu kontrolnego przez cały czas trwania procesu utrzymywał się na poziomie alkalicznym, osiągając wartość ph 8,7-8,8 [Rys. 86]. Warunki te sprzyjały hydrolizie enzymatycznej odpadów keratynowych. Wysoki odczyn środowiska wskazywał na niedojrzałość kompostu i konieczność kontynuowania procesu kompostowania na pryźmie. Rys. 86. Odczyn środowiska masy kompostowej inokulowanej szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 oraz kompostu kontrolnego KA Badane komposty różniły się między sobą aktywnościami enzymatycznymi. W masie kompostowej inokulowanej szczepionką SZ2 średnia aktywność proteaz była 3-krotnie wyższa w porównaniu z kompostem badawczym inokulowanym szczepionką SZ1 i kontrolą KA [Rys. 87]. W 1 i 20 dobie procesu odnotowano znaczne ilości tej grupy enzymów (3 i 2,7

127 Omówienie wyników 127 JP). Z kolei średnia aktywność dehydrogenaz w kompoście badawczym SZ1 była dwukrotnie wyższa w odniesieniu do pozostałych kompostów i najwyższą wartość osiągnęła w 20 dobie procesu, po inokulacji szczepionkami S. violaceolatus KP2 i T. atroviride KP1 (7,1 JD) [Rys. 88]. Rys. 87. Aktywność proteolityczna kompostów inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 oraz niezaszczepianej kontroli KA Rys. 88. Aktywność dehydrogenaz w kompostach inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 oraz niezaszczepianej kontroli KA Mikroflora kompostowa w inokulowanych kompostach oraz w kontroli zmieniała się sukcesywnie w czasie trwania procesu. Między 5, a 20 dobą kompostowania z udziałem szczepionki SZ2 populacja termofilnych bakterii zwiększyła się do poziomu jtk/g s.m., po czym zmniejszyła się o dwa rzędy logarytmiczne [Rys. 90]. W przypadku masy kompostowej z dodatkiem szczepionki SZ1, wzrost liczebności bakterii termofilnych nastąpił dopiero po zakończeniu fazy termofilnej [Rys. 89]. Natomiast w nieinokulowanej kontroli populacja wspomnianej grupy mikroorganizmów utrzymywała się na stałym, niskim

128 Omówienie wyników 128 poziomie 10 5 jtk/g s.m. [Rys. 91]. W kompoście badawczym SZ2 liczba bakterii proteolitycznych w pierwszej połowie procesu wynosiła jtk/g s.m. i była o 1-2 rzędy logarytmiczne wyższa w stosunku do kompostu badawczego SZ1 i nieinokulowanej kontroli KA, w których sukcesja tej grupy mikroorganizmów miała analogiczny przebieg. Kompost inokulowany szczepionką SZ2 wyróżniał się także liczną populacją promieniowców i grzybów strzępkowych ( jtk/g s.m.), rozkładających polimery roślinne. W pozostałych kompostach (SZ1 i KA) liczebność tych drobnoustrojów przez 3 tygodnie utrzymywała się na niskim poziomie, dopiero po 20 dobie wzrosła i osiągnęła wartość 10 6 jtk/g s.m. w przypadku promieniowców i 10 3 jtk/g s.m. w przypadku grzybów strzępkowych. Ostatecznym wskaźnikiem skuteczności obu szczepionek był ubytek suchej masy kompostowej, który w kompoście badawczym SZ2 wynosił 36%, a w kompoście badawczym SZ1 23,6% [Rys. 92]. W ostatnim, wspomnianym przypadku był on niezadowalający ponieważ był wyższy od kontroli zaledwie o 2%. Po sześciu tygodniach kompostowania z udziałem szczepionek czteroorganizmowych uzyskano glebopodobny produkt kompostowy [Rys. 93]. Rys. 89. Mikroflora kompostu inokulowanego czteroorganizmową szczepionką SZ1 Rys. 90. Mikroflora kompostu inokulowanego czteroorganizmową szczepionką SZ2

129 Omówienie wyników 129 Rys. 91. Mikroflora kompostu kontrolnego KA Rys. 92. Ubytek suchej masy kompostowej inokulowanej szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 oraz nieinokulowanej kontroli KA A B Rys. 93. Zmiany wizualne kompostu w skali półtechnicznej po 6 tygodniach procesu: A kompost kontrolny, B - kompost inokulowany szczepionką wieloorganizmową SZ1

130 Omówienie wyników 130 Wykorzystanie szczepionek drobnoustrojów do celów kompostowych na skalę przemysłową wiąże się z koniecznością przygotowania ich utrwalonych preparatów. Jedynie w tej formie komercyjne zastosowanie byłoby korzystne za względów praktycznych (ułatwiony proces technologiczny) i ekonomicznych. Przeprowadzono kompostowanie z udziałem szczepów wchodzących w skład szczepionki SZ1 w postaci utrwalonego preparatu i porównano jego przebieg z analogicznym procesem zachodzącym z udziałem nieutrwalonych szczepionek mikroorganizmów. Szczepy bakteryjne poddano liofilizacji, natomiast hodowlę solid-state grzybów strzępkowych na substratach odpadowych wysuszono w temperaturze 30 C. W badaniach wykorzystano siedmiodobową hodowlę w podłożu stałym szczepu S. violaceolatus KP2 na podłożu MBA. Tak przygotowane szczepionki posłużyły do inokulacji masy kompostowej. Kolejność inokulacji była jednakowa jak w przypadku zastosowania szczepionki nieutrwalonej [Tab. 40]. W kompoście inokulowanym czteroorganizmową utrwaloną szczepionką SZ1 wystąpiła 8 dobowa faza termofilna [Rys. 94]. Przy aplikacji nieutrwalonego odpowiednika szczepionki etap intensywnych przemian był o 3 doby dłuższy, jednak w kompoście tym obserwowano znaczne wahania temperatury. Podobnie jak w przypadku wcześniej omawianych kompostów badawczych SZ1 i SZ2, odczyn środowiska w kompoście inokulowanym utrwaloną szczepionką był alkaliczny [Rys. 95]. Do 29 doby utrzymywał się na poziomie ph 8,6 po czym obserwowano jego obniżenie do ph 8,0. Wykazano także różnice w aktywności proteolitycznej kompostu zaszczepianego utrwaloną szczepionką, gdzie była ona trzykrotnie wyższa w porównaniu do kompostu inokulowanego szczepionką nieutrwaloną [Rys. 96]. Natomiast średnia aktywność metaboliczna w kompoście inokulowanym utrwaloną szczepionką była dwukrotnie niższa w porównaniu do kompostu inokulowanego szczepionką nieutrwaloną i wynosiła 1 JD [Rys. 96]. Efekt ten mógł wynikać z trudniejszej adaptacji mikroflory szczepionkowej poddanej utrwalaniu do środowiska masy kompostowej. Skład mikroflory kompostu inokulowanego utrwaloną szczepionką przedstawiał się mniej korzystnie w porównaniu do kompostu inokulowanego szczepionką nieutrwaloną. Początkowa, wysoka liczebność promieniowców i grzybów strzępkowych (10 6 jtk/ g s.m.) pod koniec procesu uległa redukcji aż o 5 rzędów logarytmicznych [Rys. 97]. Zastosowana forma szczepionek obu grup mikroorganizmów nie przyczyniła się do wzrostu ich liczebności w kompoście. Wprowadzone drobnoustroje nie zaadaptowały się do nowego środowiska. Populacja mikroflory termofilnej i proteolitycznej utrzymywała się na poziomie jtk/ g

131 Omówienie wyników 131 s.m. Porównywalny wynik uzyskano w kompoście inokulowanym nieutrwaloną szczepionką. Wzrost liczebności bakterii termofilnych obserwowany był na początku fazy termofilnej i wiązał się ze zwiększeniem temperatury masy kompostowej. Ubytek suchej masy po zakończeniu 41-dobowego procesu z udziałem utrwalonej szczepionki SZ1 był dwukrotnie wyższy w porównaniu z ubytkiem odnotowanym w kompoście inokulowanym szczepionką nieutrwaloną i wynosił aż 43%. Drobnoustroje, wprowadzone do kompostu w postaci utrwalonego preparatu, dłużej adaptowały się do nowego środowiska, jednak przyczyniły się do większego ubytku suchej masy materii organicznej w porównaniu z kompostem inokulowanym szczepionką nieutrwaloną, dlatego w dalszych badaniach wykorzystywano kompost inokulowany utrwaloną szczepionką SZ1 oraz kompost inokulowany nieutrwaloną szczepionką SZ2. Rys. 94. Temperatura masy kompostu badawczego z udziałem utrwalonej szczepionki SZ1 Rys. 95. Odczyn środowiska masy kompostowej inokulowanej utrwaloną szczepionką SZ1

132 Omówienie wyników 132 Rys. 96. Aktywność proteaz i dehydrogenaz w kompoście inokulowanym utrwaloną szczepionką SZ1 Rys. 97. Mikroflora kompostu kontrolnego inokulowanego utrwaloną szczepionką SZ Dojrzewanie kompostów na pryzmach Dotychczasowe wyniki badań kompostów inokulowanych szczepionką jednoorganizmową lub jedną z dwóch szczepionek czteroorganizmowych oraz kontrolnych wskazywały, że po zakończeniu aktywnej fazy kompostowania, uzyskany produkt jeszcze nie był w pełni dojrzałym kompostem. Dlatego też kompostowany materiał przenoszono na pryzmy, gdzie powinny zachodzić dalsze etapy wcześniej rozpoczętej mineralizacji i humifikacji substancji organicznych. Pozostałe, dotychczas nierozłożone, makrocząsteczki jak np. ligninoceluloza, celuloza czy ksylany głównie rozkładane są przez promieniowce i grzyby strzępkowe, których liczebność znacznie wzrasta w końcowej fazie kompostowania, gdyż panujące wówczas warunki sprzyjają ich rozwojowi. Badano zmiany, które zaszły w wybranych kompostach po 4 miesiącach pryzmowania.

133 Omówienie wyników 133 W warunkach dojrzewania na pryźmie aktywność enzymatyczna wszystkich badanych kompostów zmniejszyła się kilku lub kilkunastokrotnie w porównaniu z wynikami otrzymanymi w fazie aktywnej procesu. Największa redukcja ilości uwalnianych proteaz i dehydrogenaz była obserwowana w kompoście badawczym inokulowanym szczepionką SZ1, gdzie aktywność wspomnianych grup enzymów wynosiła odpowiednio 0,061 JP i 0,01 JD [Rys. 98]. Wynik ten związany był ze spadkiem aktywności mikroflory w fazie dojrzewania kompostu. W tym okresie rozkład materii organicznej zachodził mniej intensywnie. Faza dojrzewania kończy się wtedy, kiedy warunki panujące w pryźmie stabilizują się, czyli temperatura utrzymuje się na stałym poziomie poniżej 25 C, a odczyn środowiska jest bliski obojętnemu. Taki wynik uzyskano dla wszystkich badanych kompostów. Odczyn środowiska masy kompostowej, który w czasie trwania fazy aktywnej procesu był wyraźnie alkaliczny, na pryźmie zbliżył się do odczynu obojętnego [Rys. 99]. Stopniowe jego obniżanie świadczyło o stabilizacji kompostu. Rys. 98. Aktywność proteaz i dehydrogenaz w wybranych kompostach badawczych i kontroli KA po 4 miesiącach pryzmowania Duża liczebność promieniowców w środowisku może oznaczać, że kompost jest już dojrzały. Wzrost liczebności tej grupy mikroorganizmów odnotowano w kompoście inokulowanym szczepionką SZ1 i nieinokulowanej kontroli KA, gdzie wynosiła ona jtk/g s.m. [Rys. 100]. Natomiast populacja grzybów strzępkowych w badanych kompostach, z wyjątkiem kompostu inokulowanego monokulturą, utrzymywała się na stosunkowo niskim poziomie nie przekraczając 10 6 jtk/g s.m. Liczebność tej grupy mikroorganizmów w kompoście wzrasta dopiero wtedy, gdy odczyn środowiska jest kwaśny, zmniejsza się

134 Omówienie wyników 134 wilgotność i zawartość azotu, tymczasem odczyn pryzmowanego kompostu był w dalszym ciągu neutralny. Rys. 99. Odczyn środowiska masy kompostowej inokulowanej wybranymi szczepionkami i kompostu kontrolnego KA po 4 miesiącach pryzmowania Rys Mikroflora wybranych kompostów badawczych i kontroli KA po 4 miesiącach pryzmowania Efektywność obu wieloorganizmowych szczepionek była porównywalna, z niewielką przewagą kompostu badawczego inokulowanego szczepionką SZ2. Różnice te mogły wynikać z odmiennych warunków temperaturowych panujących podczas prowadzenia obu procesów. Podczas procesu pryzmowania badane komposty osiągnęły większą dojrzałość.

135 Omówienie wyników Mineralizacja materii organicznej w kompostach W trakcie procesu kompostowania zachodzi transformacja związków organicznych w składniki mineralne, które mogą być wykorzystane do nawożenia gleby, co jest podstawą recyklingu. W kolejnym etapie badań określano kierunki tych przemian w kompostach inokulowanych szczepionką jednoorganizmową i szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 oraz SZ2, a także w kontroli KA. W badanych kompostach obserwowano zmniejszanie się zawartości węgla organicznego wraz z upływem czasu kompostowania. Najbardziej intensywna transformacja węgla organicznego (C org ) zachodziła w kompoście inokulowanym szczepionką B. cereus B5e/sz i SZ1, gdzie zawartość C org po pryzmowaniu zmniejszyła się o g kg -1 [Tab. 41]. Głównym źródłem azotu w masie kompostowej były białka keratynowe szczeciny, które ulegały biodegradacji, a azot grup aminowych aminokwasów uwalniany był poprzez deaminację. Częściowo był tracony przez uwalnianie do środowiska, jednak jego zasadnicza część podlegała nitryfikacji, a także denitryfikacji. Pierwiastek ten odgrywa istotną rolę przy określaniu wartości nawozowej kompostu. Ogólna zawartość azotu (N og ) i poszczególnych jego form w badanych kompostach wzrastały wraz z czasem trwania procesu [Tab. 41]. Przeniesienie kompostowanej masy z bioreaktorów na pryzmy spowolniło tempo przyrostu azotu ogólnego. Najwyższą zawartość formy N og 34,74 g kg -1, zanotowano w kompoście badawczym, inokulowanym monokulturą po pięciu miesiącach dojrzewania na pryźmie. Wybrane komposty różniły się zawartością wodnorozpuszczalnych, mineralnych form azotu N-NH 4 i N-NO 3. Inokulacja szczepionkami spowodowała większy przyrost stężenia N-NO 3 w porównaniu z kompostem kontrolnym KA. Najwyższe wartości tego parametru wykazano w kompostach badawczych poddanych pryzmowaniu, a szczególnie w kompoście zawierającym szczepionkę B. cereus B5e/sz (1,98 g kg -1 ). Szczepionka SZ1 tylko w niewielkim stopniu stymulowała przemiany azotu w masie kompostowanej. Drobnoustroje wprowadzone w szczepionce jednoorganizmowej B. cereus B5e/sz i wieloorganizowych SZ1 i SZ2 zwiększały tempo keratynolizy w kompoście, co przejawiało się dominacją N amonowego nad azotanowym (V). Nagromadzenie NH 4 mogło zmniejszać ogólne tempo przemian, a szczególnie nitryfikację, co wymaga dalszych badań.

136 Omówienie wyników 136 Tab. 41. Zawartość węgla, azotu i siarki w wybranych kompostach Czerwone strzałki wskazują na prawidłowy kierunek zmian stężenia poszczególnych składników w dojrzewającym kompoście Postępująca mineralizacja i ubytek materii organicznej prowadziły do zwiększenia całkowitej zawartości siarki w kompoście. Największe ilości siarki ogółem 15,8 g kg -1 obserwowano w pryzmowanym kompoście badawczym SZ2 [Tab. 41]. W czasie trwania procesu zawartość tego pierwiastka wzrosła dwukrotnie w odniesieniu do materiału wyjściowego. Kompost badawczy SZ1 zawierał niskie stężenie siarki ogółem, nie przekraczające 3,5 g kg -1. Wynik ten był niezadowalający i świadczył o niepełnej mineralizacji kompostu lub stratach tego pierwiastka. W trakcie kompostowania większość związków organicznych podlegała procesom biotransformacji, co jest rezultatem aktywności autochtonicznej mikroflory zasiedlającej to środowisko oraz wprowadzonych mikroorganizmów. We wszystkich badanych kompostach, w miarę upływu czasu, malała koncentracja bitumin. Największy ubytek tych składników odnotowano w pryzmowanym kompoście badawczym SZ2, gdzie po 197 dobach procesu uzyskano stężenie C BIT 7,97 g kg -1 [Tab. 42]. W aktywnej fazie kompostowania zaznaczył się wzrost zawartości frakcji węgla C w i C K, a podczas dojrzewania na pryźmie obserwowano zmniejszenie stężenia obu frakcji. Najintensywniejsze zmiany stwierdzono w kompoście inokulowanym szczepionką czteroorganizmową SZ2, gdzie do 41 dnia eksperymentu, zawartości frakcji C w i C K (odpowiednio 7,69 i 10,02 g kg -1 ), były najwyższe oraz kilkukrotnie większe od wartości początkowych. Wzrost ten można tłumaczyć wzmożonymi procesami rozkładu związków tj. białka, hemicelulozy, kwasy fulwowe. Mikroflora rodzima

137 Omówienie wyników 137 kompostów oraz wprowadzone szczepionki mikroorganizmów wykazywały odpowiednie uzdolnienia enzymatyczne. Tab. 42. Zawartość różnych frakcji węgla w kompostach *C BIT frakcja węgla organicznego bitumin, C w - węgiel wodnorozpuszczalny, C K - węgiel rozpuszczalny w kwasie (białka, hemicelulozy, kwasy fulwowe), C CEL - frakcja węgla celulozowego, C ALK - frakcja węgla organicznego rozpuszczalna w 0,1 molowym NaOH, C R - frakcja węgla resztkowego, C KF - kwasy fulwowe, C KH - kwasy huminowe Analizując przebieg zmian zawartości frakcji węgla celulozowego (C CEL ) w badanych kompostach można zaobserwować, że bardzo wolno podlegały one procesom biotransformacji. Po zakończeniu procesu, wyjściowa zawartość C CEL w większości kompostów zmniejszyła się zaledwie o 10-14%. Wyjątek stanowił kompost inokulowany szczepionką SZ1, gdzie po 41 dobach kompostowania zawartość frakcji węgla celulozowego wynosiła 70,56 g kg -1, a po dojrzewaniu na pryźmie uległa dalszej redukcji do poziomu 2,17 g kg -1. Zmniejszona ilość tej frakcji w kompoście inokulowanym monokulturą oraz szczepionką wieloorganizmową SZ2, może wskazywać na konieczność wprowadzania do kompostowanej masy dodatkowych szczepionek mikroorganizmów zdolnych do rozkładu polisacharydów. Prawdopodobnie mikroorganizmy wchodzące w skład szczepionki SZ1 bardziej stymulowały dekompozycję celulozowych odpadów roślinnych [Tab. 42]. Frakcje węgla organicznego rozpuszczalne w NaOH (C ALK ) stanowią właściwe, substancje próchniczne obejmujące grupę kwasów fulowych i huminowych. Najniższe

138 Omówienie wyników 138 zawartości C ALK w analizowanych kompostach, stwierdzono w materiale wyjściowym natomiast po zakończeniu procesu ich ilość we wszystkich badanych kompostach zwiększyła się umiarkowanie. Najwyższe zawartości omawianej frakcji stwierdzono w kompoście badawczym SZ1 po 197 dobach (108,34 g kg -1 ) [Tab. 42]. Zawartość niehydrolizującej frakcji węgla resztkowego (C R ) stopniowo zmniejszała się w czasie trwania procesu. Dynamika tych zmian była najbardziej intensywna w czasie pierwszych 6 tygodni trwania procesu. Największą redukcję związków reprezentowanych przez C R stwierdzono w kompoście badawczym B. cereus B5e/sz i SZ2, gdzie uzyskano wynik, odpowiednio 110,10 i 112,53 g kg -1. Można to wyjaśnić zwiększeniem aktywności biologicznej kompostów spowodowanej inokulacją mikroorganizmów zdolnych do efektywnej biotransformacji różnych grup substancji organicznych. Można zauważyć że w czasie pryzmowania wybranych kompostów doszło do zwolnienia tempa przemian materii organicznej w wyniku zaburzenia parametrów kompostowania, a w szczególności temperatury i warunków tlenowych, które na pryzmach nie były kontrolowane, tak jak w bioreaktorze. Wyrazem tego mogą być, miedzy innymi, stosunkowo wysokie zawartości frakcji bitumicznych po zakończeniu procesu. Jednocześnie spadki ilości węgla C ALK, C w oraz C K w omawianych kombinacjach, mogą świadczyć o zaburzeniach procesów humifikacji, którym najczęściej towarzyszą straty węgla w wyniku nadmiernej mineralizacji lub wymywania prostych związków organicznych z pryzmy. Jedynie w przypadku kompostów inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi SZ1 i SZ2 po 156 dobach pryzmowania obserwowano znaczny spadek bitumin oraz wzrost C ALK w porównaniu do materiału przenoszonego na pryzmę. Zawarte we frakcji węgla całkowitego C ALK kwasy humusowe badano jako oddzielne frakcje kwasów fulwowych (C KF ) i huminowych (C KH ). W badanych kompostach ilość frakcji C KH wzrastała w czasie trwania aktywnej fazy kompostowania W czasie dojrzewania na pryźmie tendencja ta uległa zmianie w przypadku kompostu inokulowanego monokulturą i szczepionką wieloorganizmową SZ2, gdzie odnotowano zmniejszenie zawartości tego składnika. Przeciwnie, w kompoście inokulowanym szczepionką SZ1 ilość frakcji C KH podczas pryzmowania wzrosła dwukrotnie, osiągając wartość 61,38 g kg -1. W materiale kompostowanym przy udziale wszystkich wybranych szczepionek wystąpił niekorzystny efekt wzmożonej syntezy niskocząsteczkowych, ruchliwych związków organicznych, reprezentowanych przez C KF, w czasie ich dojrzewania na pryźmie. Mogło mieć to związek z zaburzeniem procesów humifikacji w tych kompostach. Mimo to w obu pryzmowanych

139 Omówienie wyników 139 kompostach inokulowanych szczepionkami czteroorganizmowymi zachowana została dominacja kwasów huminowych nad fulwowymi, których stosunek ilościowy wynosił C KH / C KF 1,2-1,3 co było oczekiwanym rezultatem tych badań. Postępujący proces mineralizacji zachodzący w kompoście powodował zwiększanie zawartości makroelementów w środowisku. W badanych kompostach, wraz z upływem czasu eksperymentu, obserwowano zwiększenie zawartości omawianych składników o 30 do 200% w stosunku do wyjściowej mieszanki [Tab. 43]. Wyjątek stanowił kompost badawczy SZ1, w którym stężenie sodu i potasu obniżyło się po 41 dobach kompostowania. W kompoście kontrolnym KA zmiany zawartości poszczególnych makroskładników zachodziły wolniej niż w kompoście badawczym B. cereus B5e/sz, po tym samym czasie. Podczas pryzmowania proces uwalniania omawianych pierwiastków uległ wyraźnemu spowolnieniu w kompostach badawczych szczepionych B. cereus B5e/sz i SZ2, natomiast przyspieszony był w kompoście badawczym SZ1 Spowolnienie tempa akumulacji makroskładników w materiale pryzmowanym, może świadczyć o zaburzeniu optymalnych warunków kompostowania. Najwyższe stężenia P +5, Ca 2+, Mg 2+ uzyskano w pryzmowanym kompoście SZ1 odpowiednio: 4,10 g kg -1, 12,25 g kg -1 i 2,80 g kg -1, a Na + i K + odpowiednio: 3,03 g kg -1 i 5,89 g kg -1 w pryzmowanym kompoście SZ2. Tab. 43. Zawartość makroelementów w wybranych kompostach Czerwone strzałki wskazują na prawidłowy kierunek zmian stężenia poszczególnych składników w dojrzewającym kompoście Mineralizacja i ubytek masy organicznej, oprócz korzystnych przemian, powodują także niepożądany efekt w postaci nadmiernej akumulacji mikroskładników, a w szczególności

140 Omówienie wyników 140 metali ciężkich. W dużej koncentracji niekorzystnie wpływają one na mikroflorę kompostową i jednocześnie pogarszają jakość wytworzonego kompostu. Skład mikroelementów badano w kompoście badawczym B. cereus B5e/sz i SZ2 oraz w kontroli KA. W kompostach z odpadów keratynowych, inokulowanych wybranymi szczepionkami, określono zawartości całkowite następujących mikroskładników: Ni, Fe, Cu, Zn, Mn, Cr, Cd, Pb i Hg [Tab. 44]. Ponieważ ilości rtęci i kadmu w badanych kompostach były znikome, na granicy detekcji, wyniki pomiaru ich zawartości uznano za nieistotne przy ocenie przydatności kompostu. Zawartość wszystkich badanych mikroskładników zwiększała się wraz z upływem czasu kompostowania. W przypadku chromu, niklu i ołowiu, wskazanych w Rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 czerwca 2008 r. nie przekroczyła ona dopuszczalnej zawartości zanieczyszczeń w nawozach. W kompoście inokulowanym szczepionką wieloorganizmową SZ2 intensywność koncentracji metali ciężkich była znacznie wyższa w porównaniu do kompostu inokulowanego monokulturą i w przypadku żelaza, chromu i miedzi wynosiła odpowiednio: 6,7 g kg -1, 10,2 mg kg -1, 4,5 mg kg -1. Podczas dojrzewania na pryźmie, w kompoście inokulowanym szczepionką wieloorganizmową SZ2, zawartości pozostałych mikroskładników wzrosły kilkukrotnie w porównaniu z materiałem wyjściowym. Na podstawie dotychczasowych wyników badań poszczególnych składników mineralnych, dokonano końcowej oceny kompostów określając chemiczne indeksy ich dojrzałości [Tab. 45]. Wskaźnik humifikacji HR to najpowszechniej stosowany parametr charakteryzujący kierunek przemian substancji organicznych w kompostach. Przyjmuje się, iż kompost jest dojrzały, gdy HR > 1,0. Wartość tą osiągnęły wszystkie badane komposty, oprócz kompostu inokulowanego monokulturą, w którym obniżył się on na etapie dojrzewania na pryźmie do wartości HR 0,85, co sugeruje zaburzenie procesu humifikacji. Podobną tendencję miał indeks który określa procentowy udział kwasów huminowych w masie kompostowej. Wartości P KH > 50 świadczą o pożądanej dominacji kwasów huminowych nad fulwowymi. Taki indeks miały wszystkie komposty oprócz wyżej wspomnianego [Tab. 45]. Wskaźnik P KF określa procentowy udział kwasów fulwowych w masie kompostowej, zatem oczekiwana wartość powinna być niższa niż P KH. Tendencja ta została zachowana, pomijając ponownie ten sam kompost oraz kompost inokulowany szczepionką SZ2.

141 Omówienie wyników 141 Tab. 44. Zawartość mikroelementów w wybranych mieszankach kompostowych *Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 czerwca 2008 r. w sprawie wykonania niektórych przepisów ustawy o nawozach i nawożeniu (Dz.U ) Podstawowym czynnikiem warunkującym prawidłowy przebieg procesu kompostowania jest odpowiedni stosunek węgla do azotu w materiale wyjściowym, który powinien mieścić się w zakresie C/N W dojrzałym kompoście wskaźnik ten powinien być niższy C/N<12. Wszystkie badane komposty spełniały to kryterium, ponieważ indeks C/N mieścił się w granicach 8,18 10,22 [Tab. 45]. Faktorem określającym intensywność biotransformacji substancji organicznej w czasie kompostowania, jest również udział procentowy węgla wodnorozpuszczalnego w całkowitej zawartości węgla organicznego. Wskaźnik ten wraz z postępującymi procesami dojrzewania, powinien wykazywać tendencję spadkową i ustabilizować się na poziomie poniżej 1%. Tymczasem w badanych kompostach wartości te były trochę wyższe w przedziale C w /C org 0,87 2,37 przy czym najniższy w kompoście inokulowanym monokulturą. Ten wynik wskazuje na niezakończony jeszcze proces degradacji hemicelulozy czy białek keratynowych lub na nadmiar kwasów fulwowych. Z punktu widzenia nawozowej wartości kompostu istotnym indeksem dojrzałości, jest stosunek azotu N-NH 4 /N-NO 3, który obrazuje stopień utlenienia azotu mineralnego. Gdy stosunek N-NH 4 /N-NO 3 jest równy jedności, przyjmuje się, że nastąpił początek stabilizacji procesów związanych z transformacją azotu. W materiale wyjściowym stosunek NH 4 /-NO 3 wynosił 31,50, a kompostach badawczych 1,03 2,97. Najbardziej zaawansowane utlenianie

142 Omówienie wyników 142 azotu zachodziło w kompoście inokulowanym szczepionką SZ2 [Tab. 45]. monokulturą B. cereus B5e/sz oraz Tab. 45. Chemiczne indeksy dojrzałości kompostów HR-wskaźnik humifikacji; P KH -indeks kwasów huminowych; P KF -indeks kwasów fulwowych; C org -węgiel organiczny; N og -azot ogólny; C w -węgiel wodnorozpuszczalny Czerwone strzałki wskazują na prawidłowy kierunek zmian stężenia poszczególnych składników w dojrzewającym kompoście szczeciny udziałem wybranych szczepionek Podsumowując dotychczasowe wyniki badań, można stwierdzić, że przemiany związków mineralnych zachodzące w kompoście kontrolnym były mniej intensywne w porównaniu do kompostu inokulowanego monokulturą oraz szczepionkami czteroorganizmowymi. Analiza uzyskanych danych pozwala uznać, że opracowane szczepionki mikroorganizmów miały stymulujący wpływ na rozkład materii organicznej i procesy transformacji poszczególnych związków. Przeniesienie kompostowanej masy z bioreaktorów na pryzmy wyraźnie spowalniało tempo przemian materii organicznej, co wynikało prawdopodobnie z pogorszenia warunków tlenowych i temperaturowych. Procesy humifikacji w badanych kompostach zachodzące podczas pryzmowania wymagają dalszych badań. Większość badanych parametrów wskazywała na to, że w kompostach inokulowanych szczepionkami wieloorganizmowymi postęp mineralizacji był większy w porównaniu do

143 Omówienie wyników 143 kompostu inokulowanego monokulturą. Jednakże kompost badawczy SZ1 osiągał pożądane wartości poszczególnych wskaźników dopiero po procesie dojrzewania na pryźmie. Indeksy dojrzałości kompostów: C/N, HR, N-NH 4 /N-NO 3, P KH, P KF wskazują, że komposty badawcze SZ1 i SZ2 osiągnęły dojrzałość, jedynie wskaźnik Cw/Corg nieznacznie odbiegał od wartości oczekiwanej, więc pryzmowanie należało jeszcze kontynuować Biologiczne testy dojrzałości i fitotoksyczności kompostów Testowano kiełkowanie nasion rzeżuchy w celu oceny dojrzałości wybranych kompostów i możliwości ich zastosowania w recepturze nawozu mineralno-organicznego. Wskaźnik GI (germination index), jest czułym parametrem określającym fitotoksyczność mieszanek kompostowych. W swoim składzie mogą one zawierać metale ciężkie i/lub niskocząsteczkowe związki organiczne (np. kwasy organiczne), które niekorzystnie wpływają na kiełkowanie nasion i hamują rozwój korzeni roślin. Najwięcej nasion rzeżuchy wykiełkowało po zastosowaniu standardowego nawozu mineralnego oraz pod wpływem ekstraktów z kompostu kontrolnego KA i badawczego, inokulowanego szczepionką SZ1 [Rys. 101]. W ostatnim, wspomnianym materiale kompostowym wskaźnik względnego kiełkowania nasion wynosił RSG 105,9%. W pozostałych próbach parametr ten osiągnął niższe wartości w odniesieniu do próby z wodą destylowaną. We wszystkich inokulowanych kompostach wskaźnik RRG przyjmował wyższe wartości w porównaniu z kontrolą KA i nawozowym standardem. Korzenie rzeżuchy w przypadku kompostu badawczego SZ2 były aż o 20% dłuższe w porównaniu z próbą zwilżaną wodą destylowaną. We wszystkich badanych ekstraktach wskaźnik GI przekroczył wartość 80%, co wskazuje na to, że osiągnęły one dojrzałość i były wolne od fitotoksyn. Na tle innych prób wyraźnie wyróżniały się komposty inokulowane szczepionkami wieloorganizmowymi SZ1 i SZ2, dla których wskaźnik GI>100%. Przeprowadzone badania wykazały, że inokulacja szczepionkami czteroorganizmowymi korzystnie wpłynęła na właściwości otrzymanych kompostów, których ekstrakty stymulowały kiełkowanie nasion, a także wzrost korzeni rzeżuchy. Ich wartość nawozowa była wyższa w porównaniu ze standardowym nawozem mineralnym, kompostem kontrolnym KA oraz kompostem badawczym inokulowanym monokulturą B5e/sz.

144 Omówienie wyników 144 Rys Wskaźniki kiełkowania nasion oraz wzrostu korzenia rzeżuchy w ekstraktach wybranych kompostów Standard - nawóz mineralny RSG - relative seed germination/ wskaźnik względnego kiełkowania nasion RRG - relative root growth/ wskaźnik relatywnego wzrostu korzenia GI- germination index/ wskaźnik kiełkowania