Rola bia³ek rodziny BCL-2 w kontroli apoptozy w pêcherzykach jajnikowych

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE Rola bia³ek rodziny BCL-2 w kontroli apoptozy w pêcherzykach jajnikowych Jolanta Opiela, Lucyna K¹tska-Ksi¹ kiewicz Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t, Instytut Zootechniki, Balice k. Krakowa Bcl-2 proteins in ovarian apoptosis Summary Members of the Bcl-2 family are considered principal players in the cascade of events that activate or inhibit apoptosis. Recent evidence strongly supports fundamental role of Bcl-2 and related proteins in regulating ovarian cell death. This article will provide an overview of the current knowledge regarding Bcl-2 proteins in programmed cell death in development of the ovary and the postnatal ovarian cycles. Key words: mammals, ovary, apoptosis, Bcl-2, Bax. 1. Wprowadzenie Adres do korespondencji Jolanta Opiela, Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t, Instytut Zootechniki, ul. Krakowska 1, Balice k. Krakowa. 1 (72) Apoptozê okreœla siê jako fizjologiczn¹ œmieræ komórki co oznacza, e jest ona genetycznie zaprogramowanym procesem, podczas którego komórka bierze aktywny udzia³ we w³asnym unicestwieniu. Pierwsz¹ wzmiankê na temat apoptozy datuje siê na rok 1885, kiedy to Flemming zbada³ zmiany morfologiczne w komórkach wzgórka jajonoœnego w zdrowych i degeneruj¹cych pêcherzykach jajnikowych królika (1,2). Jajnik jest znakomitym materia³em do badania apoptozy, zarówno w okresie pre- jak i postnatalnym. Gonada samicy cechuje siê bowiem najwy szym odsetkiem komórek podlegaj¹cych apoptozie jak i najd³u szym czasem trwania tego procesu. Stwierdzono, e w jajniku p³odu ludzkiego do po³owy ci¹ y powstaje oko³o 7 milionów komórek

2 Rola bia³ek rodziny BCL-2 w kontroli apoptozy w pêcherzykach jajnikowych p³ciowych, ale tylko ok. miliona pozostaje w momencie narodzin lub krótko po urodzeniu (1). Liczba oocytów ulega dalszej redukcji w trakcie wzrostu i rozwoju, a w czasie menopauzy w jajniku stwierdza siê ju tylko kilkaset oocytów, g³ównie atretycznych (3). Przyjmuj¹c, e w okresie reprodukcyjnym mo e owulowaæ oko³o 400 oocytów, oznacza to, e ponad 99,9% komórek p³ciowych ulega degeneracji. Podobne straty komórek p³ciowych w okresie pre- i postnatalnym wystêpuj¹ u samic innych ssaków, jak np. mysz, szczur czy krowa (4-6). Próbuj¹c wyjaœniæ tê ogromn¹ degeneracjê, obejmuj¹c¹ oko³o dwóch trzecich puli pierwotnych komórek p³ciowych, która nastêpuje jeszcze podczas ycia p³odowego lub wkrótce po urodzeniu, Tilly (2) zaproponowa³ trzy hipotetyczne mechanizmy reguluj¹ce. Pierwszy z nich, œmieræ przez zaniedbanie (ang. death by neglect) jest nastêpstwem zbyt niskiej aktywnoœci czynników wzrostu, które s¹ znane jako zwi¹zki przeciwdzia³aj¹ce wyst¹pieniu apoptozy. Drugi mechanizm, œmieræ przez uszkodzenie (ang. death by defect), wywo³any jest b³êdami podczas rekombinacji mejotycznej, a trzeci, nazwany œmieræ przez poœwiêcenie w³asne (ang. death by self-sacrifice), jest dowodem altruizmu komórek. Pierwotne komórki p³ciowe poœwiêcaj¹ siê na rzecz s¹siaduj¹cej komórki w celu zwiêkszenia jej szans na prze ycie, np. poprzez lepsze od ywianie. Komórki, którym uda³o siê unikn¹æ œmierci na drodze apoptozy w yciu p³odowym, po urodzeniu dziesi¹tkowane s¹ wskutek procesu zwanego atrezj¹. Atrezja mo e wyst¹piæ w ka dym stadium rozwoju pêcherzyka. BodŸcem inicjuj¹cym atrezjê pêcherzyków: pierwotnego, pierwszego rzêdu oraz ma³ego przedantralnego jest apoptoza oocytu. Natomiast w pêcherzykach wiêkszych, od stadium póÿnoprzedantralnego do owulacyjnego atrezja nastêpuje w efekcie apoptozy komórek wzgórka jajonoœnego (7,8). Oprócz fizjologicznie zaprogramowanej œmierci komórki proces apoptozy mo e byæ równie indukowany czynnikami œrodowiskowymi lub terapi¹, np. antynowotworow¹. Stwierdzono, e policykliczne wêglowodory aromatyczne (PAH, ang. polycyclic aromatic hydrocarbons), które powstaj¹ w procesie spalania, tak e w dymie tytoniowym, aktywuj¹ apoptozê w oocytach (9,10). W wewn¹trzkomórkowej maszynerii, która u krêgowców decyduje o yciu lub œmierci komórki, wspó³dzia³aj¹ oraz oddzia³ywaj¹ na wewn¹trzkomórkowe organelle bia³ka ró nych rodzin. Wœród nich najwa niejsz¹ rolê pe³ni¹ bia³ka rodziny Bcl Aktywnoœæ bia³ek rodziny Bcl-2 w apoptozie Niew¹tpliwym prze³omem w badaniach nad poznaniem funkcji bia³ka Bcl-2 oraz pokrewnych bia³ek tej rodziny, które uczestnicz¹ w kontroli apoptozy, by³o sklonowanie w 1985 r. genu bcl-2 (11). Dotychczasowa znajomoœæ omawianych procesów powsta³a w oparciu na wynikach uzyskanych in vitro, przy u yciu izolowanych linii komórkowych. Fundamentalne znaczenie ma jednak okreœlenie roli bia³ek Bcl-2 w rozwoju organizmu i utrzymaniu jego homeostazy w warunkach in vivo. BIOTECHNOLOGIA 1 (72)

3 Jolanta Opiela, Lucyna K¹tska-Ksi¹ kiewicz Bia³ka rodziny Bcl-2 s¹ ewolucyjnie konserwatywne, mog¹ wykazywaæ aktywnoœæ pro- lub antyapoptotyczn¹. Wszystkie bia³ka tej rodziny charakteryzuj¹ siê obecnoœci¹ co najmniej jednej z czterech domen homologii (BH, ang. Bcl-2 homology domains). Domena BH3 bia³ek proapoptotycznych odpowiedzialna jest za w³aœciwoœci tych bia³ek promuj¹ce œmieræ (12,13). Interakcja domeny BH3 z hydrofobow¹ szczelin¹ utworzon¹ przez domeny BH1, BH2, BH3 antyapoptotycznych bia³ek rodziny Bcl-2 neutralizuje œmiercionoœn¹ aktywnoœæ bia³ek proapoptotycznych (12,13). Zdolnoœæ bia³ek rodziny Bcl-2 do heterodimeryzacji jest niezbêdna w kontroli ycia lub œmierci komórki. Œmieræ komórki jest konsekwencj¹ procesów prowadz¹cych do aktywacji kaspaz, która nastêpuje bezpoœrednio lub przy udziale receptorów œmierci i/lub aktywacji proapoptotycznych czynników mitochondrialnych (12-14). Czêsto sygna³ apoptotyczny przekazywany jest do mitochondrium poprzez wzbudzenie, modyfikacjê i przemieszczenie proapoptotycznych bia³ek, które posiadaj¹ tylko domenê BH3 (zaliczono tu bia³ka oznaczone jako Bid, Bad, Bim, Bik/Nbk, Blk, Hrk, Bnip3, Nix, NOXA, PUMA i Bcl-G s ) (2,13). Aktywowane bia³ka, zawieraj¹ce tylko BH3, u³atwiaj¹ tworzenie heterodimerycznych kompleksów z proapoptotycznymi bia³kami rodziny Bcl-2 typu multi-domain czyli posiadaj¹cymi wiêcej ni jedn¹ domenê homologii (zaliczono tu bia³ka Bax, Bak, Bok/Mtd oraz Bcl-rambo) (2,13). Bia³ka proapoptotyczne u³atwiaj¹ tworzenie porów albo kana³ów jonowych w b³onie mitochondrium. Wynikiem tych procesów jest uwolnienie z przestrzeni miêdzyb³onowej mitochondrium do cytozolu czynników apoptotycznych takich jak: cytochrom c, bia³ko Smac/DIABLO, czynnik AIF i endonuklezy G (2). Uwalnianie tych czynników mo e byæ zahamowane przez bia³ka antyapoptotyczne rodziny Bcl-2, do których zalicza siê Bcl-2, Bcl-x l, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl1 i Bcl-B (2,13). Na tym etapie wa ¹ siê dalsze losy komórki. Decyzja ycie albo œmieræ zale y od wzajemnych relacji iloœciowych miêdzy bia³kami pro- i antyapoptotycznymi. W przypadku przewagi bia³ek proapoptotycznych dochodzi do obni enia potencja³u b³onowego mitochondrium, zwiêkszenia przepuszczalnoœci tej b³ony oraz wyp³ywu wspomnianych czynników apoptotycznych. Cytochrom c wraz z prokaspaz¹ 9 oraz czynnikiem Apaf 1 tworzy strukturê zwan¹ apoptosomem. Apoptosom z kolei aktywuje kaspazy wykonawcze za poœrednictwem kaspazy inicjuj¹cej 9. Kaspazy wykonawcze odpowiedzialne s¹ za œmieræ komórki, która nastêpuje w wyniku proteolizy bia³ek cytoszkieletu i b³on komórkowych, bia³ek odpowiedzialnych za organizacjê przestrzenn¹ DNA oraz samego DNA (2,14). 3. Bia³ka proapoptotyczne Najdok³adniej poznanym bia³kiem rodziny Bcl-2 o dzia³aniu proapoptotycznym jest Bax. Pierwsze doniesienie na jego temat, powsta³e w oparciu na badaniach prowadzonych na pêcherzykach jajnikowych szczura, wskazywa³o na wystêpowanie korelacji miêdzy jakoœci¹ komórek wzgórka jajonoœnego a ekspresj¹ genu bax (15). 92 PRACE PRZEGL DOWE

4 Rola bia³ek rodziny BCL-2 w kontroli apoptozy w pêcherzykach jajnikowych Prawid³owe komórki wzgórka jajonoœnego wykazywa³y obni on¹ ekspresjê genu bax, natomiast ekspresja genów bcl-2 i bcl-x utrzymywana by³a na niezmienionym poziomie (15). Kolejne doœwiadczenia na jajnikach szczura, ma³py, a tak e kobiety potwierdzi³y wystêpowanie zale noœci miêdzy podwy szon¹ ekspresj¹ genu bax na poziomie mrna oraz bia³ek a obni on¹ jakoœci¹ komórek wzgórka jajonoœnego i wystêpowaniem atrezji pêcherzyków jajnikowych (16-18). Podobne wyniki uzyskano w badaniach na komórkach somatycznych i na jajnikach p³odowych myszy. Wykazano, e apoptozie towarzyszy zwiêkszona ekspresja bia³ka Bax. Jednoczeœnie nie obserwowano zmian w poziomie antyapoptotycznego bia³ka Bcl-2 (19). Rolê bia³ka Bax we wzbudzaniu apoptozy w komórkach p³ciowych p³odu myszy potwierdzi³o równie doœwiadczenie Rucker i wsp. (20). Badacze ci wykazali, e inaktywacja bia³ka Bax, przy jednoczesnym braku bia³ka Bcl-x, zapobiega masowej apoptozie oocytów. Natomiast wstrzykniêcie bia³ka Bax do izolowanych oocytów wywo³ywa³o apoptozê (21). Stwierdzono ponadto, e eliminacja z jajnika oocytów, w których powsta³y anomalie na skutek b³êdów w mejozie nastêpuje bez udzia³u bia³ka Bax (22). Doœwiadczenie to wskazuje, e w eñskich komórkach p³ciowych istniej¹ inne, niezale ne od bia³ka Bax, szlaki sygnalizacji proapoptotycznej (22). Zale noœæ miêdzy ekspresj¹ genu bax a apoptoz¹ w jajniku dobrze dokumentuj¹ badania nad mechanizmem œmierci oocytu pod wp³ywem policyklicznych wêglowodorów aromatycznych (PAH). Wiadomo, e wiele zwi¹zków chemicznych mo e spowodowaæ uszkodzenia gonady eñskiej, jednak zwi¹zki tej klasy s¹ szczególnie niebezpieczne z uwagi na obecnoœæ w oocytach wewn¹trzkomórkowego bia³ka wi¹- ¹cego PAH, które nazwane zosta³o receptorem AHR (ang. aryl hydrocarbon receptor) (23,24). W dotychczas przeprowadzonych badaniach wskazuje siê, e aktywacja receptora AHR bezpoœrednio reguluje ekspresjê genów zaanga owanych w kontrolê œmierci oocytu (9). U myszy, którym podawano PAH, obserwowano gwa³towny wzrost ekspresji genu bax w oocytach, po czym wkrótce nastêpowa³a apoptoza (9,10). Na podstawie wyników tych doœwiadczeñ wskazuje siê, e œmieræ oocytów spowodowana dzia³aniem PAH, przy udziale bia³ka wi¹ ¹cego AHR, nastêpuje wed³ug ustalonej œcie ki genetycznej, niezale nie od stadium rozwoju jajnika. Wykorzystuj¹c model ksenograficzny stwierdzono, e PAH wywo³uj¹ in vivo ekspresjê bax i apoptozê w oocytach ludzkich (9), co potwierdza ewolucyjny konserwatyzm tej œcie ki apoptozy. Podobnie jak w przypadku bia³ka Bax, wykazano pozytywn¹ korelacjê miêdzy ekspresj¹ wiêkszoœci proapoptotycznych bia³ek rodziny Bcl-2 a wystêpowaniem apoptozy. Nadekspresja bia³ek Mtd/Bok (25) czy Bad (26) w komórkach wzgórka jajonoœnego wywo³uje ich œmieræ. Ciekawostk¹ jest, e bia³ko Mtd/Bok heterodimeryzuje specyficznie z antyapoptotycznym bia³kiem Mcl-1 (25). Stwierdzono, e komórki wzgórka jajonoœnego w rosn¹cych pêcherzykach jajnikowych charakteryzuje wczesny i ci¹g³y wzrost transktyptów mrna genu mcl-1, które najprawdopodobniej maj¹ zrównowa yæ proapoptotyczne dzia³anie bia³ka Mtd/Bok (25). BIOTECHNOLOGIA 1 (72)

5 Jolanta Opiela, Lucyna K¹tska-Ksi¹ kiewicz 4. Bia³ka antyapoptotyczne Najlepiej poznanym przedstawicielem bia³ek rodziny Bcl-2 o dzia³aniu antyapoptotycznym jest bia³ko Bcl-2. Wy³¹czenie genu bcl-2 w jajnikach transgenicznej myszy skutkowa³o obni eniem liczby pierwotnych komórek p³ciowych oraz pêcherzyków jajnikowych (27). Natomiast w wyniku nadekspresji bia³ka Bcl-2 nastêpowa³ spadek apoptozy w komórkach pêcherzyka oraz tworzenie siê guzów wywodz¹cych siê z komórek p³ciowych (28). W przeciwieñstwie do Bcl-2, wy³¹czenie genu bcl-x nie powodowa³o zmniejszenia liczby pêcherzyków jajnikowych myszy (29). Doœwiadczenie to wskazuje, e ekspresja Bcl-x nie jest konieczna dla zachowania zdrowych pêcherzyków jajnikowych, a tak e dowodzi istnienia mechanizmu kompensuj¹cego brak bia³ka Bcl-x, najprawdopodobniej poprzez dzia³anie innych bia³ek antyapoptotycznych. Mo liwe, e nawet minimalna iloœæ bia³ka Bcl-x wystarcza dla zachowania zdrowego, prawid³owego pêcherzyka w warunkach fizjologicznych (gdy nie dzia³a czynnik indukuj¹cy apoptozê), natomiast zwiêkszona ekspresja genu bcl-x jest konieczna w sytuacji gdy na komórkê dzia³aj¹ bodÿce apoptogenne (8). W jajnikach ssaków wykryto równie bia³ko Boo/Diva, o aktywnoœci antyapoptotycznej (30) i proapoptotycznej (31). Doœwiadczenie Russella i wsp., (32) przeprowadzone na jajnikach transgenicznej myszy z wy³¹czonym genem Boo/Diva nie wykaza³o adnych morfologicznych i fizjologicznych ró nic w porównaniu z jajnikami samicy nietransgenicznej (32). Najprawdopodobniej bia³ko Boo/Diva, podobnie jak Bcl-x, nale y do bia³ek, których funkcja pro- lub antyapoptotyczna uzale niona jest od wzajemnych interakcji z innymi przedstawicielami bia³ek rodziny Bcl Aplikacyjny aspekt badañ Badania nad ekspresj¹ genów bax i bcl-2 maj¹ aspekt aplikacyjny w medycynie ludzkiej. U kobiet poddanych terapii przeciwnowotworowej dochodzi do niep³odnoœci w wyniku utraty komórek p³ciowych, która nastêpuje na drodze apoptozy kontrolowanej przez bia³ko Bax. U ywaj¹c myszy jako zwierzêcia modelowego wykazano, zarówno in vitro jak i in vivo, e chemioterapeutyk, doxorubicin (Adriamycyna, 14-hydroxydaunomycyna) nie wywo³uje apoptozy w oocytach z wy³¹czonym genem bax (33). Najnowsze metody leczenia, zmierzaj¹ce do zminimalizowania szkodliwego wp³ywu chemio- i radioterapii, prowadzone s¹ dwutorowo, tj. albo poprzez inaktywacjê genu bax lub poprzez zwiêkszenie ekspresji bia³ka Bcl-2 w oocytach (34). Wyniki uzyskane na myszach wskazuj¹, e powy sze sposoby postêpowania mog¹ byæ skuteczne (34). W dobie dynamicznego rozwoju biotechnologii rozrodu zwierz¹t niezwykle wa - na jest jakoœæ materia³u u ywanego do doœwiadczeñ, a tak e ocena jakoœci oocytów i zarodków uzyskanych metodami in vitro. W oocytach i zarodkach byd³a wykazano 94 PRACE PRZEGL DOWE

6 Rola bia³ek rodziny BCL-2 w kontroli apoptozy w pêcherzykach jajnikowych wystêpowanie korelacji miêdzy ekspresj¹ bia³ek Bcl-2 i Bax a stopniem ich kompetencji rozwojowej (35). W prawid³owych oocytach i zarodkach obserwuje siê przewagê bia³ek Bcl-2 nad Bax, natomiast sytuacja odwrotna cechuje oocyty i zarodki o oznakach apoptozy. Podobne rezultaty obserwowano u myszy (36). Mo na zak³adaæ, e ekspresja bia³ek Bcl-2 i Bax mo e s³u yæ jako marker jakoœci oocytów i blastocyst. 6. Podsumowanie Proces apoptozy, odgrywaj¹cy niezwykle istotn¹ rolê zarówno w oogenezie jak i embriogenezie, znajduje siê pod kontrol¹ bia³ek rodziny Bcl-2. Poznanie molekularnych szlaków kieruj¹cych œmierci¹ oocytów otworzy nowe mo liwoœci doskonalenia warunków hodowli in vitro oocytów, które przeznaczane s¹ do celów eksperymentalnych jak i terapeutycznych. Z uwagi na fakt, e apoptoza odpowiedzialna jest za dziesi¹tkowanie oocytów ju od momentu powstawania jajników w yciu p³odowym, ograniczenie tego procesu pozwoli³oby na pe³niejsze wykorzystanie potencja³u rozrodczego samicy, a tak e przed³u enie zdolnoœci reprodukcyjnej samicy. Poznanie mechanizmów kieruj¹cych apoptoz¹ umo liwi³oby równie opracowanie nowych terapii niep³odnoœci, a tak e ulepszenie metod antykoncepcji. Kolejnym istotnym aspektem badañ nad apoptoz¹, o znaczeniu utylitarnym, jest mo liwoœæ opracowania bardziej skutecznych terapii antynowotworowych. Sterowanie bia³kami rodziny Bcl-2 mo e stanowiæ nieocenione narzêdzie badawcze we wszystkich wymienionych dziedzinach. Praca finansowana ze œrodków KBN nr grantu promotorskiego 2P06D Literatura 1. Kim M-R., Tilly J. L., (2004), Biochim. Biophys. Acta, 1644, Tilly J. L., (2001), Nature Rev., 2, Richardson S. J., Senikas V., Nelson J. F., (1987), J. Clin. Endocrinol. Metab., 65, K¹tska L., (2001), Post. Biol. Kom., 28, Pepling M. E., Spradling A. C., (2001), Dev. Biol., 234, Perez G. I., Robles R., Knudson C. M., Flaws J. A., Korsmeyer S. J., Tilly J. L., (1999), Nat. Genet., 21, Hughes Jr., F.M., Gorospe W. C., (1991), Endocrinology, 129, Johnson A. L., (2003), Anim. Reprod. Sci., 78, Matikainen T., Perez G. I., Jurisicova A., Schlezinger J. J., Ryu H.-Y., Pru J. K., Sakai T., Korsmeyer S. J., Casper R. F., Sherr D. H., Tilly J. L., (2001), Nat. Genet., 28, Matikainen T., Moriyama T., Morita Y., Perez G. I., Korsmeyer S. J., Sherr D. H., Tilly J. L., (2002), Endocrinology, 143, Cleary M. L., Smith S. D., Sklar J., (1986), Cell, 47, Rapp U. R., Rennefahrt U., Troppmair J., (2004), Biochim. Biophys. Acta, 1644, Borner C., (2003), Mol. Immunol., 39, BIOTECHNOLOGIA 1 (72)

7 Jolanta Opiela, Lucyna K¹tska-Ksi¹ kiewicz 14. Joza N., Kroemer G., Penninger J. M., (2002), Trends Gen., 18, Tilly J. L., Tilly K. I., Kenton M. L., Johnson A. L., (1995), Endocrinology, 136, Yoon S. J., Choi K. H., Lee K. A., (2002), Mol. Reprod. Dev., 61, Kugu K., Ratts V. S., Piquette G. N., Tilly K. I., Tao X.-J., Martimbeau S., Aberdeen G. W., Krajewski S., Reed J. C., Pepe G. J., Albrecht E. D., Tilly J. L., (1998), Cell Death Differ., 5, Uma J., Muraly P., Verma-Kumar S., Medhamurthy R., (2003), Biol. Reprod., 69, de Felici M., Di Carlo A., Pesce M., Iona S., Farrace M. G., Piacentini M., (1999), Cell Death Differ., 6, Rucker E. B., Dierisseau P., Wagner K. U., Garrett L., Wynshaw-Boris A., Flaws J. A., Hennighausen L., (2000), Mol. Endocrinol., 14, Morita Y., Perez G. I., Paris F., Miranda S., Ehleiter D., Haimovitz-Friedman A., Fuks Z., Xie Z., Reed J. C., Schuchman E. H., Kolesnick R. N., Tilly J. L., (2000), Nat. Med., 6, Morita Y., Maravei D. V., Bergeron L., Wang S., Perez G. I., Tsutsumi O., Taketani Y., Asano M., Horai R., Korsmeyer S. J., Iwakura Y., Yuan J., Tilly J. L., (2001), Cell Death Differ., 8, Wilson C. L., Safe S., (1998), Toxicol. Pathol., 26, Valdez K. E., Petroff B. K., (2004), Reprod. Biol., 4, Hsu S. Y., Kaipia A., McGee E., Lomeli M., Hsueh A. J. W., (1997), Proc. Natl. Acad. USA., 94, Kaipia A., Hsu S. Y., Hsueh A. J. W., (1997), Endocrinology, 138, Ratts V. S., Flaws J. A., Kolp R., Sorenson C. M., Tilly J. L., (1995), Endocrinology, 136, Hsu S. Y., Lai R. J., Finegold M., Hsueh A. J., (1996), Endocrinology, 137, Riedlinger G., Okagaki R., Wagner K. U., Rucker III, E. B., Oka T., Miyoshi K., Flaws J. A., Hennighausen L., (2002), Biol. Reprod., 66, Song Q., Kuang Y., Dixit V. M., Vincenz C., (1999), EMBO J., 18, Lee R., Chen J., Matthews C. P., McDougall J. K., Neiman P. E., (2001), Biochim. Biophys. Acta, 1520, Russell H. R., Lee Y., Miller H. L., Zhao J., McKinnon P. J., (2002), Mol. Cell Biol., 22, Perez G. I., Knudson C. M., Leykin L., Korsmeyer S. J., Tilly J. L., (1997), Nat. Med., 3, Morita Y., Perez G. I., Maravei D. V., Tilly K. I., Tilly J. L., (1999), Mol. Endocrinol., 13, Yang M. Y., Rajamahendran R., (2002), Anim. Reprod. Sci., (2002), 70, Exley G. E., Tang C. Y., McElhinny A. S., Warner C. M., (1999), Biol. Reprod., 61, PRACE PRZEGL DOWE