(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) T3 (51) Int. Cl. C12N5/06 C12N5/00 ( ) ( ) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 2009/38 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Podłoże hodowlane nazwane MV06 dla komórek śródbłonkowych i sercowych (30) Pierwszeństwo: US (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2008/27 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 03/2010 (73) Uprawniony z patentu: Institut de Recherche en Hematologie et Transplantation, Mulhouse, FR PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: Pasquet-Vallejo Stéphanie, Mulhouse, FR (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Kossowska Janina Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy podłoża hodowlanego nazwanego MV06 umożliwiającego wzrost in vitro zarówno śródbłonkowych jak i sercowych komórek progenitorowych z komórek CD34+. Tło wynalazku [0002] W celu dalszych zastosowań klinicznych wymagane jest przeprowadzenie różnicowania i namnażania ex vivo śródbłonkowych jak i sercowych komórek progenitorowych z komórek CD34+ wcześniej oczyszczonych przez immunoselekcję. [0003] Zasadniczą kwestią jest udowodnienie, że wyspecjalizowane różnicowanie się i zdolności funkcjonalne podgrupy komórek CD34+ nie będą zmodyfikowane po namnożeniu się ex-vivo. Stan techniki [0004] Donoszono w literaturze o różnych podłożach hodowlanych jako zdolnych do indukowania różnicowania in vitro ludzkich dorosłych komórek macierzystych albo w komórki śródbłonkowe albo komórki mięśnia sercowego. [0005] Dla komórek śródbłonkowych (EC) Hernandez i wsp. opracowali podłoże hodowlane umożliwiające różnicowanie się komórek jednojądrzastych (MNC) uzyskanych z aferezy krwi w komórki śródbłonkowe. Tutaj MNC hodowane były na żelatynie i fibronektynie w podłożu M199 uzupełnionym płodową surowicą cielęcą (FCS), insuliną, transferyną, uniwersalnym suplementem wzrostu śródbłonka (ang. endothelial allgrowth suplement) heparyną. Kolonie EC rozwinęły się w 6 z 7 hodowli z MNC pochodzących z leukaferezy. Komórki rozwinęły morfologię EC w 15,5± 2 dni z dodatnim czynnikiem von Willebrandta (vwf) i immunobarwieniem VEGFR-2. [0006] Porat i wsp. stosowali również MNC ludzkiej krwi obwodowej dla różnicowania komórek śródbłonkowych po hodowli na podłożu X-VIVO15, uzupełnionym autologiczną surowicą, Naczyniowym Endotelialnym Czynnikiem Wzrostu (VEGF) i heparyną. Komórki określone Populacją Komórek Synergetycznych (SCP) hodowano przez 5 dni w szalkach wcześniej powleczonych fibronektyną lub autologicznym osoczem do wytworzenia Prekursorowych Komórek Angiogennych (ACP). ACP wyrażały CD34, CD133,VEGFR-2, Tie-2, CD144, vwf, CD31 Bright z towarzyszącym wychwytem acetylowanych lipoprotein o niskiej gęstości (Ac-LDL) wydzielały VEGF i tworzyły struktury podobne do rurki in vitro z zestawem do badania angiogenezy in vitro (Chemicon). [0007] Endocult jest dostępnym w handlu podłożem firmy Stem Cells Technologies do wytwarzania CFU- Endotelial Cells (CFU-EC). To podłoże umożliwia ilościowe określenie subpopulacji śródbłonkowych komórek macierzystych albo krążących we krwi obwodowej (PB) albo istniejących w szpiku kostnym wśród całkowitych MNC. Jednak, ta metoda hodowli wydaje się być niewłaściwą, gdy wysiewa się oczyszczone komórki krwi CD34+ zamiast MNC, ponieważ przechodzą one apoptozę po 2 dniach tylko w warunkach tej hodowli. [0008] Z tego punktu widzenia Peichev i wsp. zidentyfikowali krążące prekursory śródbłonkowe wyrażające CD34, VEGFR-2 i CD133 w ludzkich PB, mobilizowanych PB i w płodowej wątrobie (1,2± 0,3%; 0,4± 0,2% i 2± 0,5% odpowiednio). Również osiągnęli sukces w idukowaniu znaczącego śródbłonkowego różnicowania się z tych EPC przy użyciu podłoża M199 uzupełnionego Bydlęcą Surowicą Płodową (FBS), Czynnikiem Wzrostu Fibroblastów 2 (FGF2) i heparyną. Po 3 dniach komórki nieadherentne przeniesiono na płytki 1

3 pokryte kolagenem i hodowano w tym samym podłożu przez 2 tygodnie. Hodowle uzyskano w różnicowaniu w komórki adherentne z CD133, VEGFR-2+ i kolonii +Ac-LDL ze skutecznością wysiewania 3%. [0009] Tylko bardzo niewiele grup opracowało podłoże hodowlane, dla komórek mięśnia sercowego, umożliwiające różnicowanie in vitro ludzkich dorosłych komórek macierzystych w komórki mięśnia sercowego. Część różnicowania śródbłonkowego, grupa Porata interesowała się również różnicowaniem PB-MNC w komórki mięśnia sercowego i stosowała podłoże zawierające 5-azacytydynę. Morfologicznie, Prekursory Komórek Sercowych pojawiły się wydłużone, wyrażały sercową Troponinę T i konneksynę 43. Analiza cytometrią przepływową wykazała wyrażanie dezminy i sercowej Troponiny T (w 19,7% i 52,3% komórek odpowiednio). Ale ta metoda nie promowała spontanicznego różnicowania się komórek macierzystych, gdy czynnikiem mutagennym jest 5-azacytydyna. Ponadto, ten mechanizm mutagenny powoduje również, że dalsze końcowe kliniczne stosowanie zróżnicowanych komórek staje się niebezpieczne. [0010] Inną drogą stosowaną do różnicowania in vitro ludzkich dorosłych komórek macierzystych w kardiomiocyty jest wspólne hodowanie komórek macierzystych z kardiomiocytami noworodków szczurzych w hodowli pierwotnej. Yoon i wsp. stosowali tę metodę do indukowania różnicowania linii komórkowej ludzkiego szpiku kostnego (hbmsc) w komórki serca. Na 3 dzień hbmsc dodano do hodowanych NRCM w stosunku 1:4 i hodowano aż do 2 tygodni. Obrazowanie immunofluorescencyjne wykazało wyrażanie sercowej Troponiny 1, przedsionkowego peptydu natriuretycznego i łańcucha ciężkiego α-miozyny. Wykryto ekspresję mrna GATA4 i Nkx2-5 tylko po współhodowli. Badorff i wsp. zmieszali ludzkie komórki CD34+ ze świeżo wyizolowanym NRCM w stosunku 1:4 w podłożu zawierającym 10% surowicę końską (HS) i 5% FCS. Po 2 dniach zmieniono podłoże na 5% HS na 4 dni. 10% komórek CD34+ różnicowało się do komórek dodatnich względem α-aktyny sarkomeru. Jednak taka współhodowla komórek ludzkich i szczurzych może promować mechanizm fuzji między dwoma typami komórek, co sprawia, że taka metoda jest niewłaściwa dla dalszego potencjalnego zastosowania klinicznego. Dominacja różnicowania się i fuzji oszacowana przez Yoon i wsp. wynosiła 3,2± 0,9% i 2,9 ± 1,1% odpowiednio. [0011] Zatem, nawet biorąc pod uwagę wszystkie te próby hodowlane, nikt nie opracował dzisiaj jednego jedynego podłoża mającego zdolność do indukowania różnicowania tak zwanych hematopoetycznych komórek macierzystych zarówno w komórki śródbłonkowe jak i komórki mięśnia sercowego w sposób podobny do tego, który może pojawić się po ponownej dosercowej iniekcji komórki. Wyjaśnienie wynalazku: [0012]Podłoże hodowlane MV06 umożliwiające wzrost in vitro komórek progenitorowych zarówno śródbłonkowych jak i sercowych zgodnie z wynalazkiem składa się z: - Podłoża Dubellco w modyfikacji Iscove a - Płodowej surowicy cielęcej - Surowicy końskiej - L-Glutaminy 200 mm (100x) - Penicyliny (10000j./ml)/Streptomycyny (1000 µg/ml) - Ludzkiego rekombinantowego (hu-r) Białka Morfogenetycznego Kości-2 (BMP-2) - Hu-R Czynnika Wzrostu Fibroblastów-2 (FGF-2) -Hu-R Naczyniowego Czynnika Wzrostu Śródbłonka (VEGF) 2

4 [0013] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku podłoże Dubellco w modyfikacji Iscove a stanowi 83% objętości. [0014] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku płodowa surowica cielęca stanowi 12,5% objętości. [0015] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku surowica końska stanowi 2,5% objętości. [0016] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku L-glutamina 200 mm (100X) stanowi 1% objętości. [0017] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku penicylina (10000 j./ml)/streptomycyna (1000 µg/ml) stanowi 1% objętości. [0018] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku stężenie Hu-R BMP-2 wynosi 1 ng/ml. [0019] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku stężenie Hu-R FGF2 wynosi 5 ng/ml. [0020] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku stężenie hu-r VEGF wynosi 10 ng/ml. [0021] Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania podłoża według wynalazku podłoże wytwarza się na macierzy zewnątrzkomórkowej złożonej z: -Fibronektyny -Żelatyny [0022] Korzystnie, fibronektyna stanowi 0,0005 % objętości, a żelatyna stanowi 0,02% objętości. [0023] Korzystnie żelatyna jest typu B ze skóry bydlęcej. [0024] Kompozycja według niniejszego wynalazku jest doceniana ze względu na jej zdolność zarówno do utrzymania komórek CD34+ przy życiu w hodowli przez 7 dni i więcej, jak i do skierowania tych komórek na drogi różnicowania w komórki śródbłonkowe i komórki mięśnia sercowego. Do różnicowania śródbłonkowego stosuje się FGF2 i VEGF; BMP-2 (znane jako główny induktor do sercowego różnicowania w czasie rozwoju embrionalnego) i FGF2 stosuje się do różnicowania w mięsień sercowy. Dodatkowo szalki hodowlane powleczone zarówno fibronektyną jak i żelatyną w próbie bardziej lub mniej ściśle odtwarzały bliznę tkanki sercowej po zawale. Krótki opis rysunków: [0025] Niniejszy wynalazek i jego zalety będą bardziej oczywiste na podstawie następującego opisu korzystnego wykonania z odniesieniem do załączonych rysunków, podanego w nieograniczających przykładach, w których: - Figura 1 stanowi graficzne przedstawienie ekspresji genu zarówno śródbłonkowego jak i sercowego w komórkach CD34+ rosnących na podłożu MV06. -Figura 2 stanowi fotografie pokazujące wyniki wzrostu z komórek CD34+ śródbłonkowych komórek progenitorowych ujawnionych przez fluorescencję, i -Figura 3 stanowi fotografie komórek sercowych znakowanych immunofluorescencyjnie rosnących z komórek CD34+. 3

5 Ilustracja wynalazku: [0026] Podłoże hodowlane MV06, które zostało opracowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem pozwala na różnicowanie in vitro komórek CD34+ zarówno do śródbłonkowych jak i sercowych komórek progenitorowych, co wykazano ich znaczącą ekspresją genów markerowych każdego typu komórki. [0027] Figura 1 przedstawia progresywną ekspresję z komórek CD34+ markerów biologii molekularnej zarówno dla komórek progenitorowych śródbłonka (1A) jak i komórki mięśnia sercowego (1B), gdy hodowane są na podłożu MV06. [0028] Figura 2 wizualizuje przez immunofluorescencję progresywne różnicowanie w komórki śródbłonkowe części komórek progenitorowych CD34+ rosnących w hodowli in vitro na podłożu MV06 znakowanych przeciwciałem przeciwko czynnikowi von Willebrandta (vwf) i wbudowanie diacetyl-ldl. [0029] Figura 3 stanowi fotografie wyników, otrzymanych przez immunofluorescencję, komórek sercowych rosnących z komórek CD34+ na podłożu hodowlanym według wynalazku, znakowanych przez przeciwciała monoklonalne przeciw Troponinie T i przeciw α -aktynie sarkomeru. [0030] Zgodnie z wynalazkiem podłoże hodowlane MV06 składa się z: - Podłoża Dubellco w modyfikacji Iscove a (GibcoBRL#21980) 83% - Płodowej surowicy cielęcej 12,5% - Surowicy końskiej 2,5% - L-Glutaminy 200 mm (100x) 1% - Penicyliny (10000 j. /ml)/streptomycyny (1000 µg/ml) 1% - Ludzkiego rekombinantowego(hu-r) Białka Morfogenetycznego Kości 2 (Eurobio) 1 ng/ml - Hu-R Czynnika Wzrostu Fibroblastów-2 (Eurobio ) 5 ng/ml -Hu-R Naczyniowego Czynnika Wzrostu Śródbłonka (Eurobio) 10 ng/ml [0031] Podłoże wytwarza się na zewnątrzkomórkowej macierzy złożonej z -Fibronektyny (roztwór z osocza bydlęcego, SIGMA #1141) 0,0005%, Żelatyny(typu B, ze skóry bydlęcej, SIGMA #G1393) 0,02% [0032] W pierwszej fazie podłoże hodowlane MV06 według wynalazku będzie stosowane tylko do określania namnażania się komórek CD34+. Należy zauważyć, że rzeczywiście zawiera ono różne składniki pochodzenia zwierzęcego (głównie bydlęce) sprawiające, że jest nieodpowiednie do bezpośredniego klinicznego zastosowania. [0033] Jednak obecnie jest badana możliwość zastąpienia składników zwierzęcych składnikami pochodzenia ludzkiego tak, aby można było stosować dalej podłoże hodowlane według wynalazku bezpośrednio jako podłoże do namnażania komórek uczestniczące w całkowicie schematycznej procedurze klinicznej. Bibliografia: [0034] Hernandez DA, Townsed LE, Uzieblo MR, Haan ME. Human endothelial cell cultures from progenitor cells obtained by leukapheresis. The American Surgeon, 2000: 66(4): [0035] Porat Y, Porozov S, Belkin D, Shimoni D et al. Isolation of an adult blood-derived progenitor cell population capable of differentiation into angiogenic myocardial and neural lineages, British Journal of Haemathology, 2006; 135(5): ; 4

6 [0036] Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, Zhu Z et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors, Blood, 2000; 95(3): [0037] Yoon Y-S, Wecker A, Heyd L, Park J-S et al. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infection. The Journal of Clinical Investigation. 2005; 115(2) : [0038] Badorff C, Brandes RP, Popp R, Rupp S et al. Transdifferentiation of blood-derived human endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes. Circulation, 2003; 107(7): Zastrzeżenia 1. Podłoże hodowlane nazwane MV06 umożliwiające wzrost in vitro zarówno śródbłonkowych komórek progenitorowych jak i sercowych komórek progenitorowych złożone z: - Podłoża Dubellco w modyfikacji Iscove a - Płodowej surowicy cielęcej - Surowicy końskiej - L-Glutaminy 200 mm (100x) - Penicyliny (10000 j. /ml)/streptomycyny (1000µg/ml) - Ludzkiego rekombinanatowego(hu-r) Białka Morfogenetycznego Kości 2(BMP-2) - Hu-R Czynnika Wzrostu Fibroblastów-2 (FGF-2) -Hu-R Naczyniowego Czynnika Wzrostu Śródbłonka (VEGF) 2. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym podłoże Dubellco w modyfikacji Iscove a stanowi 83% objętości. 3. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym płodowa surowica cielęca stanowi 12,5% objętości. 4. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym surowica końska stanowi 2,5% objętości. 5. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym L-Glutamina 200 mm (100x) stanowi 1% objętości. 6. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym penicylina (10000j./ml)/streptomycyna (1000 µg/ml) stanowi 1% objętości. 7. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym hu-r BMP-2 ma stężenie 1 ng/ml. 8. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym podstawowy hu-r FGF-2 ma stężenie 5 ng/ml. 9. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym hu-r VEGF ma stężenie 10 ng/ml. 10. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym jest ono wytwarzane na zewnątrzkomórkowej macierzy złożonej z -Fibronektyny, i -Żelatyny 11. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym fibronektyna stanowi 0,0005% objętości. 12. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym żelatyna stanowi 0,02% objętości. 13. Podłoże hodowlane według zastrz. 1, w którym żelatyna jest typu B, ze skóry bydlęcej. 5

7 6

8 7