ANALIZA I ROZDZIAŁ MIESZANINY NATURALNYCH BARWNIKÓW ORGANICZNYCH

Transkrypt

1 ANALIZA I ROZDZIAŁ MIESZANINY NATURALNYCH BARWNIKÓW ORGANICZNYCH Cel ćwiczenia i wprowadzenie Celem ćwiczenia jest potwierdzenie przydatności chromatografii kolumnowej do rozdziału barwników zawartych w liściach roślin, a następnie ich identyfikacji i analizie ilościowej metodą spektroskopii absorbcyjnej. Chlorofil jest barwnikiem obecnym we wszystkich roślinach zielonych, algach (glonach) i bakteriach fotosyntetycznych, którego zadaniem jest generowanie pod wpływem światła widzialnego wolnych elektronów, które są następnie spoŝytkowywane w dalszych etapach fotosyntezy. Zielony kolor chlorofilu spowodowany jest bardzo niską absorpcją w "zielonej" części spektrum światła. Inne barwniki, które bardzo często znajdują się w roślinach to karotenoidy (np. luteina, wiolaksantyna, neoksantyna itp.). Stosunki ilościowe chlorofili w roślinach zaleŝą między innymi od warunków siedliskowych: rośliny cieniolubne mają więcej chlorofilu b, światłolubne chlorofilu a. Rysunek 1. Wzór strukturalny chlorofilu Chlorofile są dosyć nietrwałe. W Ŝywych tkankach występują w formie związanej np. z białkami, fosfolipidami, co powoduje stabilność zielonej barwy. Z kolei zniszczenie Ŝywej tkanki roślinnej oraz struktury chlorofili poprzez np. ogrzewanie, odwadnianie, kontakt z rozpuszczalnikami, enzymami, prowadzi do przemian chlorofili i zmiany barwy. Rozpad chlorofilu przyśpiesza równieŝ działanie światła i tlenu. W środowisku kwaśnym następuje przemiana chlorofilu, związana z zastąpieniem jonu magnezu poprzez dwa jony wodoru i powstanie feofityny (oliwkowozielona) lub przy niŝszym ph, równieŝ odszczepienie fitolu i powstanie feoforbidyny (brunatna barwa). Środowisko zasadowe prowadzi do hydrolizy wiązań estrowych, z zachowaniem jonu magnezu w strukturze chlorofilu a produktami reakcji są chlorofiliny (zielona barwa), które pod wpływem enzymu chlorofilazy tracą fitol i przekształcają chlorofilidy. Chlorofile z

2 łatwością ulegają reakcji wymiany jonów magnezu na jony metali dwuwartościowych, takich jak Ŝelazo (barwa szarobrunatna), miedź (zielona barwa) czy cynk (równieŝ barwa zielona). Barwniki chlorofilowe, jak równieŝ ich pochodne, znajdują zastosowanie w przemyśle spoŝywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym. Z uwagi na obecność podwójnych wiązań sprzęŝonych chlorofile są efektywnymi fotoreceptorami. Charakterystyczną cechą takich związków jest bardzo silna absorpcja w zakresie światła widzialnego wyraŝona poprzez wysokie molowe współczynniki absorpcji, jedne z najwyŝszych, jakie znane są dla związków organicznych (rysunki poniŝej). Metaloporfiryny podobnie jak porfiryny charakteryzują się obecnością dwóch pasm absorpcji w zakresie UV-VIS. Pierwsze, to dość ostre pasmo, zwane pasmem Soreta (nazwisko francuskiego fizyka Charlesa Soreta) znajduje się w zakresie nm a molowy współczynnik absorpcji jest rzędu Drugie pasmo Q, składające się z czterech części składowych (wolne porfiryny) jest około 10 razy słabsze i leŝy w zakresie nm. W przypadku metalopochodnych porfiryny ilość pasm Q ulega zmniejszeniu z czterech do dwóch lub trzech, natomiast pasmo Soreta przesunięciu wraz ze zmianą molowego współczynnika absorpcji. Karoten jest naturalnie występującym barwnikiem z grupy karotenoidów. Karotenoidy występują w liściach, lecz ich Ŝółto-pomarańczowa barwa jest zwykle maskowana przez intensywną, zieloną barwę chlorofilu. Odpowiedzialne są za piękną barwę wielu owoców (ananas, owoce cytrusowe, pomidory, papryka), kwiatów (narcyz, pozłotka), skorupiaków, ryb (łosoś) i Ŝółtka jaj. Karotenoidy zbudowane są z ośmiu jednostek izoprenowych (40 atomów węgla) i naleŝą do grupy tetraterpenów. NaleŜą do nich karoteny i ksantofile. Warto tu wspomnieć o ß-karotenie, który stanowi około 80 % wszystkich karotenów, z

3 uwagi na fakt, Ŝe jest prekursorem witaminy A (rysunek poniŝej). Karoten występuje między innymi w korzeniu marchwi, stąd jego nazwa. Zawartość chlorofilu oraz karotenu oznacza się metodą spektrofotometryczną, z uwagi na wspomniane wysokie molowe współczynniki absorpcji. Wartości molowych współczynników absorpcji podano w Załączniku 1, 2 i 3, na końcu opisu ćwiczenia.

4 Odczynniki: eter naftowy o t wrz = C aceton izopropanol silica gel 60 (Merck) NaCl CaCO 3 Na 2 SO 4 50 g próbka materiału roślinnego (np. szpinak, natka pietruszki, brokuły) Aparatura i szkło: moździerz szklana kolumna chromatograficzna lejek szklany cylinder miarowy (50ml) kapilary (lub pipety Pasteura) kolbki miarowe (25 ml) bibuła filtracyjna, sączki cylinder miarowy 25 ml rozdzielacz 200 ml pipeta 5 ml, 20 ml erlenmajerki 100 ml zlewki 100 oraz 500 ml Wykonanie: Ekstrakcja barwników z liści Porcję świeŝych liści rozciera się w moździerzu z 22 ml acetonu i 3 ml eteru naftowego i niewielką ilością CaCO 3 (ok. 1 g). Po dokładnym roztarciu liści, zabarwiony ekstrakt odsącza się. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza dodaje 20 ml eteru naftowego, a następnie przemywa 20 ml 10% wodnego roztworu NaCl. Całość dokładnie wytrząsa się przez około 5 minut i odstawia do rozdzielenia. Dolną warstwę (wodną) spuszcza się z rozdzielacza, a warstwę organiczną przemywa 4-krotnie za pomocą 10 ml wody destylowanej. Po przemyciu ekstrakt przenosi się do erlenmajerki i suszy za pomocą bezwodnego Na 2 SO 4. Ciecz odsącza się i zatęŝa do objętości 3-5 ml (Uwaga!! NaleŜy bardzo ostroŝnie podgrzewać, ze względu na moŝliwość rozkładu barwników). Przygotowanie eluentów Eluentem jest mieszanina eteru naftowego i acetonu w stosunku 4:1 (v/v). Napełnianie kolumny

5 Sposób napełniania kolumny ma decydujący wpływ na poprawny rozdział substancji z uŝyciem chromatografii kolumnowej. Czystą i suchą kolumnę umieszcza się na statywie w pozycji pionowej. Przy wylocie kolumny naleŝy umieścić zlewkę do odbierania eluentu. W zlewce przygotować zawiesinę Ŝelu krzemionkowego w eterze naftowym (w stosunku 1:5). Następnie zawiesinę w zlewce naleŝy zamieszać i zdecydowanie, ale niezbyt szybko wlać do kolumny do około 2/3 wysokości. Nie moŝna dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza oraz szczelin wewnątrz złoŝa. Na warstwie Ŝelu krzemionkowego moŝna umieścić odpowiednio dopasowany krąŝek bibuły. W trakcie napełniania kran powinien być nieznacznie otwarty, aby umoŝliwić sączenie się rozpuszczalnika z kolumny. Po napełnieniu pozostawić kran minimalnie otwarty, aby umoŝliwić upakowanie poprawne upakowanie fazy nieruchomej. Pozostawić w kolumnie tyle rozpuszczalnika, aby sięgał kilka mm powyŝej powierzchni piasku. Bardzo waŝne jest, aby nie dopuścić do wysuszenia kolumny, tzn. poziom cieczy nie moŝe obniŝyć się poniŝej powierzchni piasku. Rozdzielanie substancji na kolumnie chromatograficznej Ekstrakt eterowy wprowadzić ostroŝnie za pomocą pipety bezpośrednio na adsorbent, starając się aby roztwór nie spływał po ściankach kolumny. Odczekać, aŝ ekstrakt wsiąknie w powierzchnię Ŝelu krzemionkowego, a następnie dodać eluent (eter naftowy). Gdy poziom rozpuszczalnika obniŝy się w kolumnie do poziomu adsorbenta, naleŝy dodać następną porcję eluentu. Przy uŝyciu pipety 10 ml ekstraktu z liści dodaje się ostroŝnie na warstwę adsorbentu, starając się aby roztwór nie spływał po ściankach kolumny. Odczekać, aŝ ekstrakt wsiąknie w powierzchnię Ŝelu krzemionkowego, a następnie dodać eluent. Następnie eluent dodaje się powoli tak, aby nie spowodować wzajemnego mieszania się. Po dodaniu eluentu naleŝy otworzyć kran. Faza ruchoma zaczyna przepływać przez kolumnę, na cząsteczkach adsorbentu zachodzi rozwijanie chromatogramu. W trakcie przepływu fazy ruchomej następuje rozdział składników ekstraktu. śółte pasmo pochodzące od ß-karotenu powinno wędrować pierwsze, podczas gdy zielone pasmo (nierozdzielone chlorofile a i b) pozostaje dłuŝej na szczycie warstwy adsorbenta. Wypływającą fazę ruchomą naleŝy zbierać, w erlanmajerkach, które naleŝy zmieniać, jeśli następuje zmiana koloru wypływającej fazy ruchomej. Aby przyspieszyć zbieranie następnych frakcji, moŝna zwiększyć polarność eluentu poprzez dodatek niewielkiej ilości np. acetonu do eteru naftowego (ok. 5%). Zebrane frakcje przenieść (ilościowo) do kolbek miarowych o objętości 25 ml, dopełnić do kreski eterem naftowym i dokładnie wymieszać. Wykonać widma UV-vis otrzymanych roztworów, stosując eter naftowy jako roztwór odniesienia. Opisać widma i przeprowadzić interpretację. Następnie oznaczyć ilościowo zawartość chlorofilu a i b.

6 Wyniki i dyskusja 1) Analiza widm absorpcyjnych opisać pasma absorpcji charakterystyczne dla barwników porfirynowych i karotenu, wyznaczyć λ max pasm i wartości absorbancji. 2) Obliczyć zawartości chlorofilu a i b w badanej próbce, z wykorzystaniem podanych wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 1 i 2). W tym celu naleŝy odczytać molowe współczynniki absorpcji dla λ max pasm absorpcji chlorofilu a i b. Następnie ułoŝyć układ równań (prawo addytywności absorbancji) i obliczyć stęŝenie molowe chlorofilu a i b. 3) Na podstawie stęŝeń molowych wyznaczyć stosunek wagowy chlorofilu a do chlorofilu b w próbce. 4) Obliczyć zawartość karotenu w badanej próbce, korzystając z podanych wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 3). Masy molowe barwników: M chlorofil a = g/mol M chlorofil b = g/mol M karoten = g/mol Zagadnienia teoretyczne: Barwniki porfirynowe. Chlorofil a i b. Karotenoidy. Karoten. Budowa chemiczna, występowanie, właściwości fizyko-chemiczne, zastosowanie chlorofilu i karotenu. Spektrofotometria. Prawa absorpcji. Chromatografia cieczowa. Zasada rozdziału substancji metodą chromatografii kolumnowej. Szereg eluotropowy.

7 ZAŁĄCZNIK 1. Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu a w eterze dietylowym The molar extinction coefficient of Chlorophyll a, diethyl ether dissolved in diethyl ether based on the absorbance measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Co rkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, , 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of at nm [H. H. Strain, M. R. Thomas, and J. J. Katz, "Spectral absorption properties of ordinary and fully deuteriated chlorophylls a and b," Biochim. Biophys. Acta, 75, , 1963]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm ), multiply by the -1molar concentration and , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,00 450

8 ZAŁĄCZNIK 2. Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu b w eterze dietylowym The molar extinction coefficient of Chlorophyll b dissolved in diethyl ether based on the absorbance measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, , 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of at nm [L. P. Vernon and G. R. Seely, The chlorophylls, Academic Press, 1966]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm ), multiply by the molar concentration and , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

9 ZAŁĄCZNIK 3. Molowy współczynnik absorpcji beta-karotenu w heksanie The molar extinction coefficient of Beta-carotene dissolved in hexane based on the absorbance measurements made by R. A. Fuh on summer, 95 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, , 1998]. The absorbance data was normalized to have an extinction coefficient of at 451 nm [L. Zechmeister, cis-trans Isomeric carotenoids vitamins A and arylpolyenes, Springer-Verlag, 1962]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm ), multiply by the molar concentration and