Reakcja fotodynamiczna a stres oksydacyjny wpływ efektu fotodynamicznego na aktywność enzymów antyoksydacyjnych

Transkrypt

1 Reakcja fotodynamiczna a stres oksydacyjny wpływ efektu fotodynamicznego na aktywność enzymów antyoksydacyjnych STRESZCZENIE Terapia fotodynamiczna PDT polega na selektywnym niszczeniu tkanki nowotworowej tlenem singletowym lub innymi reaktywnymi formami tlenu (ROS), które tworzą się w wyniku oddziaływania światła o odpowiedniej długości fali z fotouczulaczem. Selektywną destrukcję wywołują reaktywne formy tlenu wygenerowane przez zaabsorbowany w tkance nowotworowej barwnik o właściwościach fotoutleniających. Fotouczulacz znajdujący się w komórce nowotworowej poddany działaniu energii świetlnej zapoczątkowuje szereg reakcji fotochemicznych, podczas których powstają reaktywne utleniacze. W komórkach działają mechanizmy utrzymujące stężenie tych utleniaczy na minimalnym poziomie. Do antyoksydacyjnej ochrony należą przede wszystkim witaminy A, C i E, glutation, koenzym Q10, karotenoidy oraz enzymy z grupy oksydoreduktaz, takie jak dysmutazy ponadtlenkowe, katalaza, peroksydazy glutationowe i reduktaza glutationowa. Ich aktywność może mieć zasadnicze znaczenie dla przebiegu i powodzenia terapii fotodynamicznej. WPROWADZENIE Dobroczynne działanie światła lub światła w połączeniu z preparatami chemicznymi znano już od dawna. Podstawą leczenia w PDT (ang. PhotoDynamic Therapy) jest efekt fotodynamiczny odkryty przed ponad stu laty przez Raaba. Oskar Raab, niemiecki uczony zauważył, że naświetlanie kultur bakterii w obecności akrydyny i jej pochodnych skutkuje śmiercią komórek. Jako pierwszy wpływ efektu fotodynamicznego na organizm ludzki zaprezentował w 1913 roku Meyer Betz wstrzykując sobie roztwór 200 mg hematoporfiryny, a następnie po ekspozycji na światło słoneczne spowodował u siebie poważne poparzenia części ciała odkrytych i wystawionych na działanie światła. Kilka dekad później w 1942 roku Auler i Banzer zaobserwowali efekt fluorescencji oraz nekrozy u zwierząt po podaniu im porfiryny i naświetleniu UV. W 1961 roku Lipson i jego współpracownicy zaobserwowali zjawisko selektywnego gromadzenia się HpD w tkankach nowotworowych. W 1976 roku Kelly i Smell opisali kliniczne zastosowanie PDT w leczeniu nowotworu pęcherza moczowego [1]. Anna Romiszewska * Agata Nowak-Stępniowska Instytut Optoelektroniki, Wojskowa Akademia Techniczna, Warszawa * Instytut Optoelektroniki, Wojskowa Akademia Techniczna, ul. Kaliskiego 2, Warszawa; aromiszewska@wat.edu.pl Artykuł otrzymano 18 marca 2014 r. Artykuł zaakceptowano 2 czerwca 2014 r. Słowa kluczowe: terapia fotodynamiczna, efekt fotodynamiczny, fotouczulacz, stres oksydacyjny, antyoksydanty, aktywność enzymu Wykaz skrótów: PDT terapia fotodynamiczna; SOD dysmutaza ponadtlenkowa; CAT katalaza; GPx peroksydaza glutationowa; GR reduktaza; Prz peroksyredoksyny, ROS reaktywne formy tlenu; RNS reaktywne formy azotu; SDT terapia sonodynamiczna (z wykorzystaniem ultradźwięków); HpD pochodne hematoporfiryny; PDI fotodynamiczna inaktywacja bakterii Wkrótce po tym Dougherty wraz ze swoim zespołem przeprowadził rozszerzone badania kliniczne, które w następstwie doprowadziły do zarejestrowania pierwszego fotouczulacza Photofrinu. W 1993 roku Photofrin został wprowadzony do leczenia nowotworów pęcherza moczowego w Kanadzie, a nieco później do leczenia różnych typów nowotworów w USA, Japonii i w krajach Europy [1,2]. Obecnie w klinikach z pełnym sukcesem stosuje się PDT do leczenia wielu rodzajów nowotworów, takich jak nowotwory skóry, jamy brzusznej, płuc, przełyku, pęcherza, guzy głowy i szyi, narządów rodnych, oka, a także do leczenia schorzeń nienowotworowych głównie w dermatologii [2-5]. Ponadto metodę PDT wykorzystuje się w okulistyce do leczenia starczej degeneracji plamki żółtej, a także do sterylizacji preparatów krwi, niszczenia płytek miażdżycowych oraz jako terapię wspomagającą po zabiegach chirurgicznych. Pojawiły się również doniesienia na temat zastosowania metody fotodynamicznej do leczenia przewlekłych owrzodzeń, źle leczących się, zainfekowanych oparzeń, leiszmaniozy skórnej oraz rozmaitych infekcji ustnych, a także do odkażania powierzchni przemysłowych i szpitalnych. Wykorzystuje się często do tych celów fotouczulacze pochodzenia roślinnego. Są to wyciągi z kwiatów, nasion lub korzeni niektórych roślin pochodzących z Ameryki Południowej i Północnej. Proces niszczenia bakterii przy udziale fotouczulaczy i światła nazwano PDI (ang. Photodynamic Inactivation) [6]. Od kilku lat do leczenia nowotworów stosuje się również tzw. metodę sonodynamiczną (SDT, ang. Sonodynamic Therapy), w której zamiast światła i fotouczulacza (PDT) stosuje się połączone działanie ultradźwięków z preparatami Postępy Biochemii 60 (3)

2 wrażliwymi na ich działanie. Sonouczulacze (lub fonouczulacze) to często pochodne porfirynowe. SDT jest nieinwazyjną, obiecującą metodą leczenia nowotworów, gdyż w przeciwieństwie do światła, ultradźwięki mogą bez trudu przenikać w głąb obszarów organizmu zwłaszcza tych położonych głęboko np. w mózgu oraz takich, które nie mogą być poddane zabiegom chirurgicznym [7]. MECHANIZMY REAKCJI W PROCESIE FOTODYNAMICZNYM PDT wymaga obecności trzech składników: barwnika fotouczulającego, światła i tlenu cząsteczkowego. Źródło światła musi być odpowiednio dobrane do stosowanego barwnika. Długość fali światła powinna pokrywać się z maksimum absorpcji barwnika. Fotouczulacze mogą być aplikowane do organizmu doustnie lub pozajelitowo (parenteralnie) [8]. Jedną z najważniejszych właściwości dobrego fotouczulacza jest jego zdolność do selektywnej kumulacji w tkance nowotworowej. Podczas gdy proces selektywnej lokalizacji fotouczulacza w tkance nowotworowej nie jest do końca wyjaśniony, proces fotonekrozy chorej tkanki jest mechanizmem dość dobrze poznanym i opisanym. Fotodestrukcja tkanki nowotworowej przebiega według trzech głównych mechanizmów: Typu I, Typu II i Typu III. Wzbudzanie fotouczulacza przez światło wywołuje reakcję fotoutleniania. W reakcji tej fotouczulacz absorbuje foton i jest aktywowany do stanu wzbudzonego singletowego o krótkim czasie życia, po czym następuje jego przejście do niższego stanu wzbudzonego, jakim jest stan tripletowy (Ryc. 1). Będący w stanie wzbudzonym fotouczulacz reaguje z sąsiadującymi biomolekułami np. lipidami błonowymi, które mogą dalej reagować z tlenem tworząc rodniki nadtlenkowe lub inne rodniki tlenowe (Typ I), lub mogą reagować bezpośrednio z tlenem cząsteczkowym produkując wysoko reaktywny tlen singletowy (Typ II) [9]. Mechanizm Typu III polega na bezpośrednim toksycznym oddziaływaniu fotouczulacza z tkanką nowotworową bez udziału tlenu [10]. Formy rodnikowe powstają w wyniku przeniesienia wodoru lub elektronu pomiędzy wzbudzoną cząsteczką fotouczulacza, a tkanką nowotworową. Rycina 1. Zmodyfikowany diagram Jabłonskiego, fotouczulacz porfirynowy oznaczono literą P [12]. Reaktywne utleniacze, które tworzą się podczas efektu fotodynamicznego, mogą atakować liczne struktury wewnątrzkomórkowe. Na reakcję ze strony czynników fotoutleniających najbardziej narażone są związki zawierające wiązania podwójne w błonach komórkowych oraz fragmenty tych białek, które zawierają reszty aminokwasowe z wiązaniami podwójnym. Poza tym uszkodzeniu ulega DNA, w którym na atak głównie narażone są zasady występujące jako czynnik mostkujący w podwójnej spirali (guanina) [11]. Udział mechanizmu Typu I (przez wolne rodniki) lub Typu II (przez tlen singletowy) zależy od różnych parametrów, takich jak: stężenie tlenu w miejscu reakcji, struktura barwnika, stałe dielektryczne tkanek, ph. REAKTYWNE FORMY TLENU I AZOTU Tlen jest cząsteczką dwurodnikową i czasami zdarza się, że jest tylko częściowo redukowany (przez dodanie jednego elektronu). Ocenia się, że 1 2% tlenu zużywanego przez organizmy żywe, służy do generowania reaktywnych form tlenu, ROS [13-14]. Reaktywne formy tlenu występują w postaci wolnych rodników: anionorodnik ponadtlenkowy ( - ), rodnik wodoronadtlenkowy (H ), rodnik hydroksylowy (HO ), rodnik alkoksylowy (R ) oraz jako formy nierodnikowe czyli nie posiadające niesparowanego elektronu, do których należą: tlen singletowy ( 1 ), ozon (O 3 ) i nadtlenek wodoru (H 2 ) (Ryc. 2). Do endogennych źródeł powstawania reaktywnych form utleniających należą głównie mitochondrium (łańcuch oddechowy), makrofagi, neutrofile, peroksysomy, a także działanie niektórych enzymów, takich jak oksydaza NADPH, oksydaza ksantynowa, syntaza NO (NOS), cyklooksygenaza, lipooksygenaza [15,17]. Przewlekłe stany zapalne są również źródłem powstawania utleniających form wolnorodnikowych. Oprócz endogennych czy fizjologicznych reaktywnych form tlenu organizm jest narażony na działanie utleniaczy egzogennych, pochodzących ze środowiska. Należą do nich bez wątpienia, zanieczyszczenie powietrza, dym papierosowy (jeden puff z papierosa zawiera wolnych rodników) i spaliny. Cząsteczki reaktywnych form tlenu reagują z biomolekułami powierzchni skóry, a niektóre z nich wnikają głębiej i przedostają się do układu krążenia. Kolejnym źródłem powstawania aktywnych form utleniających jest promieniowanie słoneczne (UV) absorbowane przez chromofory skóry, a także chemioterapia, leki (antybiotyki, ksenobiotyki), promieniowanie jonizujące, infekcje oraz stres. Wolne rodniki są cząsteczkami posiadającymi co najmniej jeden niesparowany elektron, co powoduje, że są one niestabilne i dążą do uzyskania pary elektronowej poprzez przemieszczenie elektronu (reakcje utleniania i redukcji). Ze względu na krótki czas życia ich zasięg działania jest jednak niewielki, niszczą głównie struktury komórkowe w najbliższym sąsiedztwie ich tworzenia. Anionorodnik ponadtlenkowy, rodnik hydroksylowy oraz nadtlenek wodoru należą do najbardziej reaktywnych form utleniających. Rodniki po

3 Innym przedstawicielem grupy biologicznych utleniaczy jest tlenek azotu, NO, przekaźnik drugiego rodzaju, który tworzy się w reakcji tlenu w obecności różnych syntaz tlenku azotu (NOS) [23], zgodnie z reakcją: + arginina + NADPH + H + NO + cytrulina + H 2 O + NADPH + Tlenek azotu (NO) należy do grupy reaktywnych form azotu (RNS) i jest nieco podobny w swoich właściwościach do rodnika ponadtlenkowego. Dość łatwo reaguje z innymi wolnymi rodnikami (na przykład z rodnikiem alkilowym i nadtlenowym). W reakcji z anionorodnikiem ponadtlenkowym tlenek azotu tworzy inny silny utleniacz, jakim jest jon nadtlenoazotynowy (ONOO ) [24]. STRES OKSYDACYJNY Poza mikroorganizmami beztlenowymi wszystkie żywe organizmy wymagają obecności tlenu cząsteczkowego jako akceptora elektronów do efektywnej produkcji energii. W celu określenia stanów występujących w organizmach aerobowych, kiedy produkty utlenienia nie są skutecznie neutralizowane i prowadzą do upośledzenia metabolizmu, obniżenia funkcji fizjologicznych i chorób, wprowadzono pojęcie stresu oksydacyjnego [13]. Stres oksydacyjny jest wynikiem braku równowagi pomiędzy wytwarzaniem form utleniających a ich degradacją. Rycina 2. Przykłady reakcji otrzymywania reaktywnych form tlenu w różnych procesach biochemicznych wewnątrz organizmu [15]. nadtlenkowe i nadtlenek wodoru mogą reagować z metalami przejściowymi, takimi jak żelazo czy miedź, z utworzeniem silnie utleniającego rodnika hydroksylowego (OH ) [18]. Rodnik hydroksylowy jest również produktem reakcji Habera-Weissa, katalizowanej przez jony żelaza, jony miedzi, a także inne metale przejściowe, takie jak: kobalt, nikiel, mangan, chrom oraz ich kompleksy [19,20]. Rodnik hydroksylowy bierze udział w peroksydacji lipidów. Peroksydacji ulegają głównie reszty wielonienasyconych kwasów tłuszczowych fosfolipidów, które są składnikiem błon komórkowych. Utworzone nadtlenki lipidowe powodują zaburzenia właściwości błon komórkowych (zmiany przepuszczalności, płynności, utrata ich funkcji). Modyfikują lipoproteiny o małej (LDL) i dużej gęstości (HDL), co prowadzi do procesów promiażdżycowych i prozapalnych [21]. Do nierodnikowych reaktywnych form tlenu należy tlen singletowy. Może on tworzyć się w niektórych biochemicznych procesach utleniania z udziałem peroksydazy i lipooksygenazy, w reakcjach pomiędzy różnymi reaktywnymi formami tlenu lub w obecności światła, tlenu i fotouczulacza np. porfiryny (PDT) [22]. Reaktywne formy tlenu są zaangażowane w patogenezę lub progresję wielu schorzeń, do których należą między innymi choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Huntingtona, Parkinsona i Alzheimera oraz choroby nowotworowe i zaburzenia zwyrodnieniowe siatkówki oka [25-27]. Natomiast w przypadku procesów starzenia nie ma jednoznacznej odpowiedzi czy rzeczywiście wolne rodniki przyspieszają te procesy. Badania przeprowadzone na zwierzętach wskazują, iż brak jest jednoznacznych dowodów na to, że wolne rodniki przyśpieszają starzenie, a suplementy w postaci antyoksydantów obniżają ryzyko śmierci. Starzenie jest procesem złożonym, w którym należy uwzględnić również takie zjawiska jak nadaktywność pewnych procesów biologicznych [28]. Reaktywne formy tlenu mają nie tylko działanie szkodliwe dla organizmu. Rola jaką pełnią wolne rodniki w znacznym stopniu zależy od ich rodzaju oraz stężenia. Jak wskazują wyniki badań, mogą wykazywać działanie korzystne, a nawet prozdrowotne. Reaktywne formy tlenu czy azotu pełnią kilka fizjologicznych funkcji w układzie nerwowym, w układzie naczyniowym kontrolują ciśnienie krwi, hamują agregację płytek krwi i zabijają pewne chorobotwórcze mikroorganizmy. Ponadto ROS pełnią rolę cząsteczek sygnałowych (przekaźniki drugiego rodzaju) w procesie nazywanym sygnalizacją redoks. Uruchamiają wewnętrzne mechanizmy obronne i naprawcze organizmu, aktywują system obrony antyoksydacyjnej [29-31]. Natomiast kiedy stężenie wolnych rodników rośnie stają się niebezpieczne ze względu na rozmaite uszkodzenia, które są ich udziałem [32]. Reaktywne formy tlenu biorą również udział w terapii PDT, gdzie ich rola polega na selektywnym uśmiercaniu komórek nowotworowych. Postępy Biochemii 60 (2)

4 Rycina 3. Uproszczony schemat szlaku oksydacyjnego i antyoksydacyjnego w komórce [37]. OCHRONA ANTYOKSYDACYJNA NIEENZYMATYCZNE ENDOGENNE ANTYOKSYDANTY Wszystkie organizmy, które mogą lub muszą żyć w obecności tlenu są wyposażone w dość sprawnie działający system ochrony przed szkodliwym wpływem tlenu i produktów jego reakcji (Ryc. 3). Do systemu antyoksydacyjnej ochrony organizmu należą enzymatyczne i nieenzymatyczne antyoksydanty. Do grupy nieenzymatycznych antyoksydantów należą m.in.: glutation, ubichinon-koenzym Q10, kwas liponowy, kwas askorbinowy (witamina C), retinoidy (witamina A) i karotenoidy, tokoferol (witamina E), tioredoksyny, selen (jon Se -2 ), peroksyredoksyny, transferyna, laktoferyna, ceruloplazmina, kwas moczowy, tauryna, cysteamina, cysteina. Metabolizm glutationu jest jednym z najważniejszych układów ochronnych w komórce [33]. Główny mechanizm antyoksydacyjny składa się z kolejnych etapów [34]: oddziaływanie utleniaczy i czynników utleniających z kwasem askorbinowym i zredukowanym glutationem (GSH); usuwanie wolnych rodników i wygaszanie tlenu singletowego przez tokoferol, kwas askorbinowy, β-karoten i dysmutazę ponadtlenkową; redukowanie nadtlenku wodoru przez peroksydazę glutationową i katalazę; wiązanie metali przejściowych przez różne chelatory, naprawa uszkodzeń oksydacyjnych powstałych w wyniku procesów metabolicznych. ENZYMATYCZNE ANTYOKSYDANTY Do najbardziej efektywnych endogennych antyoksydantów należą również enzymy z grupy oksydoreduktaz: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), peroksydaza glutationowa (GPx), katalaza (CAT), reduktaza glutationowa, glutationowa-s-transferaza, reduktaza tioredoksyny, aldoketoreduktaza. Odpowiedni poziom aktywności enzymów antyoksydacyjnych zapewnia sprawne funkcjonowanie organizmu. Natomiast zaburzenia w ich aktywności są powodem różnych poważnych chorób np. stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) w przypadku zaburzeń aktywności Cu/ZnSOD (SOD1). Zmiany w aktywności tych enzymów zaobserwowano w przypadku niektórych schorzeń np. w erytrocytach osób z zespołem Downa zanotowano zwiększoną aktywność SOD-1 o ok. 37%, GPx o 8,4%, GR o 37,4% i o 24,3% CAT, w porównaniu do grupy kontrolnej [35]. Jeszcze inne wyniki badań wskazują nawet na 50% wzrost aktywności SOD-1 w przypadku dzieci z zespołem Downa [36]. Dysmutazy ponadtlenkowe EC Dysmutazy ponadtlenkowe (SOD) stanowią grupę enzymów, które katalizują reakcję dysmutacji anionorodników ponadtlenkowych. Dysmutazy ponadtlenkowe są sklasyfikowane w zależności od rodzaju metalu pełniącego rolę kofaktora oraz miejsca ich lokalizacji: Cu/ZnSOD (SOD-1) miedziowo-cynkowa, wewnątrzkomórkowa; MnSOD (SOD-2) manganowa, mitochondrialna; EC-Cu/ZnSOD (SOD-3) miedziowo-cynkowa, zewnątrzkomórkowa; Fe-SOD żelazowa; Ni-SOD niklowa. Pierwszą poznaną dysmutazą ponadtlenkową była wewnątrzkomórkowa dysmutaza Cu/Zn SOD (miedziowo- -cynkowa) zwana też SOD-1. Nazwana początkowo erytrocupreiną została odkryta przez Fridovicha i McCorda podczas badań dotyczących redukcji cytochromu c. Gen kodujący SOD-1 znajduje się w chromosomie 21q22. W narządach ssaków najwyższe stężenie Cu/ZnSOD stwierdzono w: wątrobie, nerkach, erytrocytach i centralnym układzie nerwowym [38]. Zewnątrzkomórkowa dysmutaza ponadtlenkowa (EC-SOD), jest głównym izoenzymem SOD w płynach zewnątrzkomórkowych, takich jak: osocze, limfa, płyn maziowy. Znajduje się również w płynie mózgowo-rdzeniowym i nasieniu. Występująca u ssaków EC-SOD jest glikoproteiną. Mimo iż EC-SOD jest enzymem występującym głównie poza komórką, są doniesienia, że jest on znajdowany również wewnątrz komórki. MnSOD, czyli manganowa dysmutaza ponadtlenkowa (SOD-2), jest obok Cu/ZnSOD ważnym izoenzymem rodziny SOD. Znajduje się głównie w matriks mitochondrialnym i jej zadaniem jest usuwanie anionorodników ponadtlenkowych w mitochondrium. Najwyższe stężenie MnSOD znaleziono w tkankach serca, mózgu, wątroby i nerek. Uważa się, że stężenie MnSOD oraz zmiany jego aktywności mają istotny wpływ na rozwój wielu schorzeń, w tym chorób nowotworowych [39]. Mitochondrialna MnSOD pełni prawdopodobnie ważną rolę w apoptozie szybko proliferujących komórek nowotworowych. Wprowadzenie do komórek ludzkiego czerniaka MnSOD powoduje zmniejszenie szybkości wzrostu nowotworu in vivo [40]. Synteza MnSOD jest w przeciwieństwie do Cu/ZnSOD wywołana przez stres oksydacyjny oraz przez tioredoksyny [41]

5 Syntezę MnSOD indukują również antynowotworowe cytokiny TNF (ang. Tumor Necrosis Factor) i limfotoksyna (LT, ang. Lymphotoxin), pełniące ważną rolę w ochronie komórek przed stresem oksydacyjnym i w immunologicznej reakcji organizmu. Wzrost produkcji MnSOD hamuje czynnik tempa wzrostu komórek nowotworowych zarówno in vitro jak i in vivo [40]. Komórki nowotworowe mają ogólnie niską aktywność MnSOD i czasami również niską aktywność Cu/ZnSOD [42]. Nadmierna ekspresja genów kodujących enzymy z grupy SOD zwiększa stopień różnicowania komórki nowotworowej, obniża jej wzrost i proliferację. Może zmienić jej złośliwy fenotyp na niezłośliwy w warunkach in vitro. W warunkach in vivo jest to proces bardziej złożony ze względu na wielorakie oddziaływania komórek guza z jego otoczeniem. Komórki ludzkiego glejaka mają relatywnie wyższą aktywność MnSOD w porównaniu z innymi typami nowotworów. Jest to prawdopodobnie związane z dużym stężeniem nadtlenków tworzących się podczas normalnego metabolizmu tlenowego w komórkach mózgu [42]. Prawdopodobnie wysokie stężenie dysmutaz ponadtlenkowych może być związane z lekoopornością na cytostatyki i radioterapię [43,44]. Badania różnych typów nowotworów wskazują, że synteza antyoksydacyjnych czynników w guzach przerzutowych może być inna niż w guzach pierwotnych. Poziom MnSOD w zmianach przerzutowych w nowotworze prostaty był obniżony w stosunku do nowotworu pierwotnego [45]. Fe-SOD jest to najprostszy w budowie typ dysmutazy ponadtlenkowej. Występuje u wielu bakterii, sinic, a także u niektórych pierwotniaków i glonów. Enzym ten jest obecny również u roślin wyższych, ale nie występuje u zwierząt. Ma budowę dimeru lub tetrameru, a w centrum katalitycznym znajduje się jon żelaza [46]. Ni-SOD, niklowa dysmutaza ponadtlenkowa została odkryta i wyizolowana z bakterii rodzaju Streptomyces. W 1996 roku została scharakteryzowana przez Youna i jego współpracowników, jako nowy typ Ni-zależnej dysmutazy ponadtlenkowej. Ni-SOD jest obecna również u Escherichia coli [47]. Peroksydazy glutationowe EC Peroksydaza glutationowa jest odpowiedzialna za rozkład większości powstającego w komórkach nadtlenku wodoru. Jednak przy dużych stężeniach H 2 w komórkach to katalaza pełni główną rolę w jego rozkładzie. Wszystkie peroksydazy glutationowe wykorzystują glutation jako substrat, co nie znaczy, że nie mogą wykorzystać innego reduktora. Głównym źródłem osoczowej formy GPx są nerki. Wysoki poziom cytosolowej peroksydazy glutationowej znaleziono także w tkankach wątroby, nerek, płuc i erytrocytach. Natomiast nie zaobserwowano aktywności GPx w roślinach [48]. Działanie peroksydazy glutationowej wspomaga transferaza glutationowa, która bierze udział w rozkładaniu produktów peroksydacji lipidów oraz reduktaza glutationowa, która katalizuje przemiany utlenionej formy glutationu do formy zredukowanej. Podczas badań nad aktywnością peroksydazy glutationowej u szczurów z niedoborem selenu, odkryto przypadkowo obecność drugiej peroksydazy glutationowej, której aktywność nie była zmniejszona przez niedobór selenu. Masa cząsteczkowa nowo odkrytego białka była dwukrotnie mniejsza od masy białka znanej już GPx wątroby szczura. Druga różnica dotyczyła powinowactwa do nadtlenowych substratów. Podczas gdy selenozależna GPx (Se-GPx) reagowała z liczną grupą wodoronadtlenków w tym również z H 2, to nowo odkryty enzym nie reagował z H 2, natomiast chętnie wchodził w rekcję z wodoronadtlenkami organicznymi. Obecność selenoniezależnej GPx (ang. non-selene-gpx) jest bardzo istotna w ochronie komórek ssaków przed peroksydacją lipidów i może pomóc wyjaśnić zmiany zachodzące w różnych tkankach przy niedoborach lub braku selenu [49]. Selenoniezależna peroksydaza glutationowa jest izoenzymem S-transferazy glutationowej, enzymu zależnego od glutationu, podobnie jak GPx i GR. Transferazy lub S-transferazy glutationowe [EC ] Transferazy lub S-transferazy glutationowe są grupą enzymów, które katalizują reakcje zachodzące między zredukowanym glutationem (GSH) a związkami elektrofilowymi (także ksenobiotykami). Biorą one udział w usuwaniu poza komórkę utlenionego glutationu (GSSG) tworzącego się w reakcji rozkładu nadtlenku wodoru [50]. Katalaza [EC ] Katalaza jest enzymem odpowiedzialnym za redukcję nadtlenku wodoru, który powstaje w reakcjach katalizowanych m.in. przez dysmutazę ponadtlenkową oraz w wielu reakcjach nieenzymatycznych (utlenianie związków tiolowych, askorbinianu i in.). Jest enzymem wewnątrzkomórkowym, obecnym głównie w peroksysomach, gdzie katalizuje reakcję dysmutacji (dysproporcjonowania) nadtlenku wodoru, wytwarzanego w czasie α-oksydacji kwasów tłuszczowych. U ssaków katalaza występuje głównie w tkankach wątroby, nerek, błonach śluzowych, szpiku oraz w erytrocytach. Wykazuje najwyższą aktywność katalityczną ze wszystkich znanych enzymów. Z badań przeprowadzonych przez Kirkmana wynika, że cząsteczka ludzkiej katalazy jest mocno związana z czterema cząsteczkami NADPH, co chroni enzym przed inaktywacją i obniżeniem jego sprawności katalitycznej. Jej katalityczna aktywność jest proporcjonalna do stężenia H 2 w szerokim zakresie stężeń [51]. Katalaza nie jest skuteczna w usuwaniu niewielkich ilości nadtlenku wodoru, ponieważ w jej katalitycznym cyklu potrzebne są aż dwie cząsteczki H 2 na jedno miejsce aktywne enzy- Postępy Biochemii 60 (3)

6 mu. Dlatego przy niskich stężeniach nadtlenku wodoru nie należy oczekiwać znaczącej roli katalazy. Reduktaza glutationowa [EC ] Reduktaza glutationowa jest flawoproteiną, zawiera dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) jako grupę prostetyczną. Reduktaza glutationowa (GR) pełni bardzo ważną rolę w metabolizmie glutationu, ściśle współpracuje z peroksydazą glutationową dostarczając jej odtworzoną postać zredukowanego glutationu, kosztem utleniania NADPH. EFEKT FOTODYNAMICZNY A ZMIANY AKTYWNOŚCI ENZYMÓW ANTYOKSYDACYJNYCH Terapia fotodynamiczna (PDT) prowadzi do zwiększenia stężenia toksycznych form utleniających. Liczne badania dotyczące wpływu PDT na zachowanie komórki wskazywały na wyraźny wzrost liczby wytwarzanych rodników ponadtlenkowych w komórkach naświetlanych [52]. Dlatego badania wpływu PDT na aktywność enzymów takich jak SODs, które katalizują ich rozkład, są ważnym czynnikiem w antynowotworowej skuteczności tej terapii. Badania wykonane na linii komórkowej gruczolakoraka okrężnicy z użyciem Photofrinu wskazują na wzrost stężenia enzymu manganowej dysmutazy ponadtlenkowej MnSOD. Nie zanotowano natomiast takich zmian w przypadku dysmutazy ponadtlenkowej Cu/ZnSOD [53]. Wcześniejsze badania na linii komórkowej HeLa również potwierdzały indukcję mrna MnSOD wywołaną działaniem Photofrinu w PDT. Wysoki poziom aktywności SOD obniżał efektywność metody PDT. Uzyskane wyniki sugerują, że hamowanie aktywności SOD może zwiększyć skuteczność antynowotworowego działania PDT. Wyniki badań wykonanych przez zespół Gołąba na trzech mysich i pięciu ludzkich liniach komórkowych wykazują, że hamowanie aktywności SOD w komórkach guza przez preinkubowanie ich z 2-metoksyestradiolem (2-MeOE 2 ) wytwarzały synergistyczny antynowotworowy efekt w połączeniu z PDT [54]. Hamowanie aktywności SOD przez pochodne estrogenu może selektywnie uśmiercać komórki białaczkowe. Zastosowanie w badaniach 2-MeOE 2, powodowało kilka antynowotworowych efektów, takich jak antyproliferacja, apoptoza, indukcja białka p-53, depolimeryzacja tubuliny i hamowanie angiogenezy. Badania z 2-MeOE 2 były przeprowadzone głównie na guzach eksperymentalnych oraz w dwóch klinicznych przypadkach u pacjentów z rozwiniętym guzem litym. Podobnie jak w poprzednich badaniach nie zauważono zmian aktywność Cu/ZnSOD [53]. Autorzy eksperymentu tłumaczą ten fakt wewnątrzkomórkową lokalizacją fotouczulacza Photofrin, który początkowo lokalizował się w błonie komórkowej, a po 24 godzinach inkubowania znajdował się głównie w mitochondrium [55]. Wyniki wielu badań wykazały, że dysmutaza ponadtlenkowa jest ważnym antyoksydacyjnym enzymem regulującym wrażliwość komórek nowotworowych na różne metody leczenia. Stwierdzono, że synteza MnSOD jest negatywnie skorelowana z czułością komórek nowotworowych na działanie leków antynowotworowych i radioterapię [53,56]. Wzrost aktywności MnSOD pociąga za sobą wzrost stężenia H 2, który jest produktem ich reakcji z rodnikiem ponadtlenkowym. Obniżenie aktywności katalazy lub peroksydazy glutationowej, enzymów rozkładających nadtlenek wodoru prowadzi do gromadzenia się jego nadmiaru, co następnie powoduje uszkadzanie DNA i/lub śmierć komórki. Zatem, zmiany aktywności jednego z enzymów antyoksydacyjnych mogą prowadzić do zaburzeń aktywności innych enzymów tej grupy. Antynowotworowy efekt PDT wynika nie tylko z jego bezpośredniego oddziaływania w komórce nowotworowej, ale także z jego wpływu na rozwój stanów zapalnych i antynowotworową odpowiedź układu immunologicznego. W przeciwieństwie do chemio- i radioterapii, które z natury są immunosupresyjne, PDT daje możliwość oddziaływania na układ immunologiczny przez jego stymulację [57]. Wyniki badań wykonanych na linii komórkowej ludzkiego czerniaka (G361, ang. amelanotic cell), z wykorzystaniem hyperycyny jako fotouczulacza, wskazują na wzrost aktywności SOD, natomiast aktywność katalazy i peroksydazy glutationowej oraz poziom glutationu były znacznie obniżone [58]. Rozwój guza nowotworowego w dużym stopniu zależy od angiogenezy. Wyniki przedstawione przez Marikovskiego, pokazują zależność, jaka istnieje między aktywnością SOD-1 a angiogenezą oraz wpływ disulfiramu, inhibitora SOD-1 na angiogenezę. Disulfiram podawany w formie doustnej transgenicznym myszom hamował angiogenezę nowotworu [59]. Wyniki tych badań mogą być przydatne w leczeniu różnych patologii zależnych od angiogenezy. Na aktywność enzymów antyoksydacyjnych podczas działania efektu fotodynamicznego ma wpływ zarówno energia świetlna, typ fotouczulacza, jak i oba te czynniki razem. Okazało się, że sam barwnik fotouczulający jak i obecność samej energii świetlnej może powodować zmiany aktywności tych enzymów. Znane są badania, z których wynika, że światło czerwone (bez obecności fotouczulacza) obniżało aktywność SOD oraz katalazy (CAT) w limfocytach. Spadek aktywności tych enzymów pociągał za sobą wzrost stężenia reaktywnych utleniaczy (H 2 ) uszkadzających komórki. Inne wyniki tych badań pokazały, że obecność samego fotouczulacza (PPIX) obniżała aktywność katalazy w limfocytach. Natomiast obecność energii świetlnej oraz fotouczulacza powodowało wzrost aktywności tego enzymu w komórkach. W badaniach tych został również zaobserwowany niewielki spadek wartości stosunku glutationu zredukowanego do utlenionego(gsh/gssg) w limfocytach pod wpływem światła czerwonego. Zmiana ta była prawdopodobnie spowodowana obniżoną aktywnością reduktazy glutationowej [60]. W innych badaniach odnotowano wzrost aktywności peroksydazy glutationowej pod wpływem efektu fotodynamicznego [61]. Oznaczenie zmiany aktywności enzymów antyoksydacyjnych pod wpływem PDT wykonane na erytrocytach szczura rasy Wistar, wskazywały na spadek aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy i peroksydazy glutationowej. W doświadczeniach tych dodatkowo wprowadzono chitosan (CS), liniowy polisacharyd, który wykazywał właściwości immunoadiuwanta (wspomagającego 360

7 odporność) in vivo. Wspólne działanie chitosanu i 5-ALA powodowało redukcję peroksydacji lipidów w tkankach nowotworowych. Chitosan wykazywał ponadto działanie ochronne dla dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy. Dzięki jego obecności aktywność tych enzymów była utrzymana na niezmienionym poziomie. Nie zaobserwowano takich zmian w przypadku peroksydazy glutationowej, której aktywność pozostała na obniżonym poziomie. Spadek aktywności enzymów antyoksydacyjnych w erytrocytach poddanych działaniu efektu fotodynamicznego, był prawdopodobnie wynikiem uszkodzenia błon komórkowych krwinek i naruszenia struktury białek enzymatycznych [62]. Tlen singletowy, jeden z najbardziej toksycznych czynników uszkadzających komórki, jest odpowiedzialny za tworzenie się wodoronadtlenków lipidowych (LOOH) podczas PDT. Peroksydacja lipidów błonowych jest wywołana przez stres oksydacyjny. Prowadzi ona do naruszenia struktury i funkcji błon komórkowych, co jest przyczyną uszkodzeń komórki lub jej śmierci. Wykazano, że usuwanie z błon komórkowych wodoronadtlenków lipidowych (LOOHs) za pośrednictwem peroksydazy glutationowej PhGPx redukuje cytotoksyczny efekt działania tlenu singletowego [63]. Wysoka ekspresja genu kodującego PhGPx w linii komórkowej raka sutka (MCF-7) powodowała wyraźny wzrost przeżywalności komórek. PhGPx jest niezwykle skutecznym enzymem w ochronie komórki przed szkodliwym działaniem wodoronadtlenków lipidowych powstających podczas PDT. W fotodynamicznej terapii enzymy antyoksydacyjne, takie jak katalaza czy dysmutaza ponadtlenkowa Cu/ZnSOD mogą hamować proces fotodegradacji fotouczulacza. Przypuszcza się, że część fotowzbudzonych cząsteczek HpD może utleniać białka komórki tworząc nadtlenki proteinowe (PPO), które są obecnie traktowane jako nowy rodzaj reaktywnych form tlenu. Mogą one inaktywować enzymy komórkowe, uszkadzać błony komórkowe i DNA [64]. Niemal dwukrotny spadek aktywności SOD-1 w czerwonych krwinkach uzyskano pod wpływem działania PDT z udziałem hyperycyny i światła widzialnego. Redukcję aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w tym przypadku autorzy eksperymentu tłumaczą zmianami w miejscu aktywnym enzymu, utlenianie jonu Zn i Cu i/ lub selektywnym utlenianiem aminokwasów. Wzrost stężenia form utleniających podczas działania efektu fotodynamicznego powoduje niekontrolowaną modyfikację, denaturację i fragmentację białek, co prowadzi do utraty biologicznej aktywności enzymu. Autorzy tego eksperymentu wykazali również, jak można zmienić typ mechanizmu fotodynamicznej reakcji stosując dodatkowo w PDT antyoksydanty, takie jak kwas askorbinowy, czy kwercetynę. W zależności od stężenia dodanego antyoksydanta, reakcja niszczenia komórek w procesie fotodynamicznym może zmienić się z Typu I na Typ II i odwrotnie (Ryc. 4). Ponadto okazało się, że zdolność kwercetyny do ochrony erytrocytów przed fotodestrukcją w wyniku działania efektu fotodynamicznego jest większa niż kwasu askorbinowego. Naświetlanie erytrocytów inkubowanych wcześniej z hyperycyną, prowadzi do fotodestrukcji (hemolizy) krwinek wywołanej głównie przez tlen singletowy. W tym przypadku zachodzi reakcja fotodynamiczna według mechanizmu typu II. Dodanie do erytrocytów z hyperycyną antyoksydanta (kwercetyny) w małym stężeniu nie zmienia typu mechanizmu reakcji fotodynamicznej i nadal proces niszczenia erytrocytów przebiega przez tlen singletowy (mechanizm typu II). Natomiast przy większym stężeniu antyoksydanta jest bardzo prawdopodobne, że cząsteczki hyperycyny reagują z nim i następuje przeniesienie elektronu z anionu antyoksydanta na cząsteczkę hyperycyny (HY -.H + ). Tworzy się nadmiar form rodnikowych i reakcja przebiega wówczas zgodnie z mechanizmem typu I [67]. Wyniki tych badań mają duże znaczenie w doborze warunków fotodynamicznej reakcji. Stosując fotouczulacz razem z antyoksydantem można zastosować jego niższe stężenie i osiągnąć tą samą lub lepszą skuteczność PDT [67]. Obecnie wiadome jest, że bezpośredniemu działaniu na Promieniowanie UVB ( nm) wpływa również na aktywność enzymów z grupy SOD i w różny sposób aktywuje enzymy Cu/ZnSOD i MnSOD w ludzkich keratynocytach. Według hipotezy autorów badań, stężenie i aktywność Cu/ZnSOD gwałtownie wzrosły bezpośrednio po naświetlaniu, ponieważ enzym ten pełniąc rolę obronną jest silnie zaangażowany w usuwanie skutków działania stresu oksydacyjnego. Następnie aktywność enzymu stopniowo maleje z powodu jego inaktywacji powodowanej reaktywnymi formami tlenu, jakie wytworzyły się podczas naświetlania. Natomiast aktywność MnSOD rosła w późniejszej fazie po naświetlaniu, rekompensując tym samym spadek aktywności Cu/ZnSOD [65,66]. Rycina 4. Możliwe mechanizmy reakcji fotodynamicznej z udziałem hyperycyny (HYP-PDT) w połączeniu z antyoksydantem. Eksperyment wykonano na krwinkach czerwonych [67]: A - anionorodnik antyoksydanta; A anion antyoksydanta; AH cząsteczka antyoksydanta; HY cząsteczka hyperycyny w stanie podstawowym; HY* cząsteczka hyperycyny w stanie wzbudzonym (trypletowym); RBC krwinki czerwone. Postępy Biochemii 60 (3)

8 Rycina 5. Uproszczony schemat zmiany typu mechanizmu reakcji fotodynamicznej w zależności od stężenia antyoksydanta w HYP-PDT [67]. komórki efektu fotodynamicznego towarzyszy efekt dodatkowy tzw. bystandar effect [68]. Bezpośredni kontakt komórek uszkodzonych przez efekt fotodynamiczny z komórkami zdrowymi powoduje przenoszenie na nie uszkodzeń, nawet kiedy czynnik uszkadzający przestaje działać. Można więc przypuszczać, że bystandar effect stanowi mechanizm uzupełniający działanie PDT w warunkach in vivo [69,70]. Poznanie różnych oddziaływań efektu fotodynamicznego zarówno na komórki nowotworowe oraz ich otoczenie, które mogą mieć działanie wspomagające jak i hamujące terapię, pozwoli w większym stopniu sterować terapią fotodynamiczną, aby zwiększyć jej skuteczność. Od kilku lat prowadzi się zaawansowane eksperymenty, w których bada się połączone działanie niektórych leków i efektu fotodynamicznego. Uszkodzone w wyniku utlenienia w procesie fotodynamicznym komórkowe makromolekuły, w tym liczne białka, powinny ulegać degradacji poprzez szlak proteasomowy. Podanie wcześniej preparatów hamujących aktywność proteasomów, takich jak np. Bortezomid, powoduje wzrost liczby nagromadzonych w komórkach uszkodzonych białek, które uległy karbonylacji i ubikwitylacji. W następstwie takich procesów następuje uszkodzenie i/lub śmierć komórki. Należy więc sądzić, że inhibitory proteasomów skutecznie uwrażliwiają komórki na cytotoksyczny efekt działania PDT. W badaniach in vivo zauważono także wyraźne zahamowanie wzrostu guza [71,72]. PODSUMOWANIE Reaktywne formy tlenu i azotu są produktami prawidłowego metabolizmu komórkowego. Każdy organizm posiada system ich wytwarzania jak i usuwania w celu zachowania równowagi. W przypadku zaburzenia tej równowagi dochodzi do nadmiernego nagromadzenia form utleniających i wówczas mamy do czynienia ze stresem oksydacyjnym. Wywołuje on w organizmie wiele negatywnych zmian. Dlatego organizmy tlenowe zostały wyposażone w sprawnie działający system ochrony antyoksydacyjnej. PIŚMIENNICTWO Są jednak przypadki, kiedy reaktywne formy tlenu czy azotu odgrywają ważną pożyteczną rolę. Jednym z takich przypadków jest metoda fotodynamiczna leczenia nowotworów, gdzie głównym celem jest zniszczenie komórek nowotworach za pomocą silnie cytotoksycznych reaktywnych form tlenu: tlenu singletowego lub wolnych rodników. W metodzie fotodynamicznej należy dobrać takie warunki aby skuteczność niszczenia zmian nowotworowych była jak największa. Można to osiągnąć między innymi hamując aktywność enzymów antyoksydacyjnych, które uczestniczą w usuwaniu reaktywnych, cytotoksycznych form tlenu. Dlatego możliwość oddziaływania na aktywność tych enzymów, dobierając odpowiednio warunki fotodynamicznej terapii (stężenie, typ fotouczulacza, dawka energii) jest taka istotna. 1. Bonnet R, Martinez G (2001) Photobleaching of sensitizers used in photodynamic therapy. Tetrahedron 47: Ackroyd R, Kelty C, Brown N, Reed M (2001) The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochem Photobiol 74: Kostron H, Obwegeser A, Jakober R (1996) Photodynamic therapy in neurosurgery. J Photochem Photobiol B 36: Moor ACE (2000) Signaling pathways in cell death and survival after photodynamic therapy. J Photochem Photobiol B 57: Nowak-Stępniowska A, Pergoł P, Padzik-Graczyk A (2013) Metoda fotodynamiczna diagnostyki i leczenia nowotworów-mechanizmy i zastosowania. Postepy Biochem 5991: Mamone L, Venosa G, Di, Gandra L, Saenz D, Vallecorsa P, Schickinger S, Rossetti MV, Batlle A, Buzzola F, Cassas A (2014) Photodynamic inactivation of Gram-positive bacteria employing natural resources. J Photochem Photobiol B 133: Tsuru H, Shibaguchi H, Kuroki M, Yamashita Y, Kuroki M (2012) Tumor growth inhibition by sosnodynamic therapy using a novel sonosensitizer. Free Rad Biol Med 53: Kubler AC (2005) Photodynamic therapy. Med Laser App 20: Mitchel J (1985) Oxygen dependence of hematoporphyrin derivative-induced photoinactivation of Chinese hamster cells. Cancer Res 45: Allison R, Moghissi K (2013) Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action. Photodiag Photodyn Therapy 10: Straight RC, Spikes JD (1985) Photosensitized oxidation of biomolecules, In: Frimer AA (Ed), Singlet O2, vol. 4. CRC Press, Boca Raton, pp Bonnet R, Martinez G (2001) Photobleaching of sensitizers used in photodynamic therapy. Tetrahedron 57: Sorg O (2004) Oxidative stress: a theoretical model or a biological reality? C R Biol 327: Rao S, Kalva S, Yerramilli A, Mamidi S (2011) Free radicals and tissue damage: role of antioxidants. Free Rad Antiox 1: Betteridge DJ (2000) What is oxidative stress? Metabol 49: Kinnula LVL, Crapo JD (2004) Superoxide dismutases in malignant cells and human tumors. Free Radic Biol Med 36: Dasuri K, Zhang L, Kelner JN (2013) Oxidative stress, neurodegeneration, and the balance of protein degradation and protein synthesis. Free Radic Biol Med 62: Buettner GR, Jurkiewicz BA (1996) Catalitytic metals, ascorbate and free redicals: combinations to avoid. Radiat Res 145: Fridovich I (1999) Fundamental aspectsof reactive oxygen species, or what s the matter with oxygen? Ann NY Acad Sci 893: Halliwell B (1999) Antioxidant defence mechanisms: from the beginning the end (of the beginning). Free Radic Res 31: Niki E (2012) Do antioxidants impair signaling by reactive oxygen species and lipid oxidation products? Febs Let 587;

9 22. Kanofsky JR (1989) Singlet oxygen production by biological systems. Chem Biol Interact 70: Dawson TM, Dawson VL (1996) Nitric oxide synthase: role as a transmitter/mediator in brain and endocrine system. Annu Rev Med 47: Rubbo H, Radi R, Anselmi D, Kirk M, Barnes S, Butler J, Eiserich JP, Freeman BA (2000) Nitric oxide reaction with lipid peroxyl radicals spares alpha-tocopherol during lipid peroxidation. Greater oxidant protection from the pair nitric oxide/alphatocopherol than alpha-tocopherol/ascorbate. J Biol Chem 275: Hardy J, Selkoe DJ (2002) The amyloid hypothesis of Alzheimer s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297: Simpson EP, Yen AA, Appel SH (2003) Oxidative stress: a common denominator in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Rheumatol 15: Speciale SG (2002) MPTP: insights into parkinsonian neurodegeneration. Neurotoxicol Teratol 23: Gems D, de la Guardia Y (2012) Alternative perspectives on aging In Caenorhabditis elegants: Reactive oxygen species or hyperfuncion? Antioxid Redox Signal 19: Juranek I, Nikitovic D, Kouretas D, Wallace Hayes A, Tsatsakis M (2013) Biological importance of reactive oxygen species in relation to difficulties of treating pathologies involving oxidative stress by exogenous antioxidants. Food Chem Toxicol 61: Liochev SI (2013) Reactive oxygen species and the free radical theory of aging. Free Radic Biol Med 60: Murphy M, Holmgren A, Larsson N, Halliwel B, Chang C, Kalyanaraman B, Rhee S, Thornalley P, Patridge L, Gems D, Nystrom T, Belousov V, Schumacker P, Winterbourm C (2011) Unraveling the biological roles of reactive oxygen apecies. Cell Metabol 13: Hekimi S, Lapointe J, Wen Y (2011) Taking a good look at free radicals In the aging process. Trends Cell Biol 21: Erat M, Ciftci M (2006) Effect of melatonin on enzyme activities of glutathione reductase from human erythrocytes in vitro and from rat erythrocytes in vivo. Eur J Pharmacol 537: Ibrahim W, Lee US, Yen HC, Clair KS, Chow CK (2000) Antioxidant and oxidative status in tissues of manganese superoxide dismutase transgenic mice. Free Radic Biol Med 28: Pastor M-Cruz, Sierra C, Dolade M, Navarro E, Brandi N, Cabre E, Mira A, Seres A (1998) Antooxidant enzymes and fatty acid status in erythrocytes of Down syndrome patients. Clin Chem 44: Mehar Sultana S, Nandha Kumar S, Sridrar MG, Vishnu Bhat B, Ramachandra Rao K (2012) Antioxidant enzyme activity In children with Down syndrome. Curr Pediatr Res 16: Nordberg J, Arner ESJ (2001) Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med 31: Kinnula LVL, Crapo JD (2004) Superoxide dismutases in malignant cells and human tumors. Free Radic Biol Med 36: Beyer W, Imlay J, Fridovich I (1991) Superoxide dismutases. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 40: Arbiser JL (2003) Role of manganese superoxide dismutase in cancer. Nature Med 9: Das KC, Lewis-Molock Y, White CW (1997) Elevation of manganese superoxide dismutase gene expression by tioredoxin. Am J Respir Cell Mol Biol 17: Zhang HJ, T Yan, Oberley TD, Oberley LW (1999) Comparison of effects of two polymorphic variants of manganese superoxide dismutase on human breast MCF-7 cancer cell phenotype. Cancer Res 59: Cullen JJ, Weydert Ch, Hinkhouse MM, Ritchie J, Domann FE, Spitz D, Oberley LW (2003) The role of manganese superoxide dismutase in the growth of pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res 63: Kinnula LVL, Crapo JD (2004) Superoxide dismutases in malignant cells and human tumors. Free Radic Biol Med 36: Ursby T, Adinolfi BS, Al-Karadaghi S, De Vendittis E, Bocchini V (1999) Iron superoxide dismutase from the Archaeon Sulfolobus solfataricus: analysis of structure and thermostability. J Mol Biol 286: Eitinger T (2004) In vivo production of active Nickel superoxide dismutase from Prochlorococcus marinus MIT9313 is dependent on its cognate peptidase. J Bacteriol 186: Patel RN, Singh N, Gundla VLN (2007) Synthesis, characterization and superoxide dismutase activity of some octahedral nickel (II) complexes. Polyhedron 26: Lawrence RA, Burk RF (1978) Species, tissue and subcellular distribution of non-se-dependent glutathione peroxidase activity. J Nutr 108: Gałecka E, Jacewicz R, Mrowicka M, Florkowski A, Gałecki P (2008) Enzymy antyoksydacyjne-budowa, właściwości, funkcje. Pol Merk Lek XXV 147: Kirkman HN, Gaetani GF (2006) Mammalian catalase: a venerable enzyme with new mysteries. Trends Biochem Sci 32: Nichols P (2001) Enzymology and structure of catalases. Adv Inorg Chem 51: Salet C, Moreno G, Ricchelli (1997) Effects of Photofrin photodynamic action on mitochondrial respiration and superoxide radical generation. Free Radic Res 26: Bourghardt J, Bergström G, Krettek A, Sjöberg S, Boren J, Tivesten A (2007) The endogenous estradiol metabolite 2-Methoxyestradiol reduces atherosclerotic lesion formation in female apolipoprotein E-Deficient Mice. Endocrinology 148: Gołąb J, Nowis D, Skrzycki M, Czeczot H, Barańczak-Kużma A, Wilczyński GM, Makowski M, Mróz P, Kozar K, Kamieński R, Jalili A, Kopeć M, Grzela T, Jakobisiak M (2003) Antitumor effects of photodynamic Therapy are potentiated by 2-Methoxyestradiol. J Biol Chem 278: Wilson BC, Olivo M, Singh G (1997) Subcellular localization of Photofrin and aminolevulic acid and photodynamic cress-resistance in vitro in radiation-induced fibrosarcoma cells sensitive or resistant to Photofrin-mediated photodynamic therapy. Photochem Photobiol 65: Kuroda M, Himei K, St. Clair DK, Urano M, Yoshino T, Akagi T, Asaumi J, Akaki S, Takeda Y, Kanazawa S, Hiraki Y (2000) Overexpression of manganese superoxide dismutase gene suppresses spontaneous apoptosis without a resultant alteration in in vivo growth of the mouse fibrosarcoma, FSa-II. Anticancer Res 20: Nowis D, Stoklosa T, Legat M, Issat T, Jakóbisiak M, Gołąb J (2005) The influence of photodynamic Therapy on the immune response. Photodiag Photodyn Therapy 2: Hadjur C, Richard MJ, Parat MO, Jardon P, Favier A (1997) Photodynamic effects of hypericin on lipid peroxidation and antioxidant status in melanoma cells. Photochem Photobiol 64: Marikovsky M, Nevo N, Vadai E, Harris-Cerruti C (2002) Cu/Zn superoxide dismutase plays a role in angiogenesis. Int J Cancer 97: Casas A, Perotti C, Fukuda H, del C Batlle AM (2002) Photodynamic therapy of activated and resting lymphocytes and antioxidant adaptive response. Lasers Med Sci 17: Paoletti F, Aldinucci D, Mocali A, Caparrini A (1986) A sensitive spectrophotometric method for the determination of superoxide dismutase activity in tissue extracts. Anal Biochem 154: Doina D, Filip A, Clichici S, Suciu S, Muresan A, Decea N, Dreve S (2008) Oxidative effects after photodynamic therapy in rats. Vet Med 65: Wang HP, Qian SY, Schafer FQ, Downann FE, Oberley LW, Buettner GR (2001) Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase protects against singlet oxygen-induced cell damage of photodynamic therapy. Free Radic Biol Med 30: Chekulayeva LV, Chekulayev VA (2008) Shevchuk Active oxygen intermediates in the degradation of hematoporphyrin derivative in tumor cells subjected to photodynamic therapy. J Photochem Photobiol B 93: Postępy Biochemii 60 (3)

10 65. Sasaki H, Akamatsu H, Horio T (1997) Effects of a single exposure to UVB radiation on the acivities and protein levels of cooper-zinc and manganese superoxide dismutase in cultured human keratinocytes. Photochem Photobiol 65: Saczko J, Kulbacka J, Chwilkowska A, Pola A, Lugowski M, Marcinkowska A, Malarska A, Banas T (2007) Cytosolic superoxide dismutase activity after photodynamic therapy, intracellular distribution of Photofrin II and hypericin, Andy-glycoprotein localization In human colon adenocarcinoma. Folia Histochem Et Cytobiol 45: Martirosyan AS, Vardapetyan HR, Tiratsuyan SG, Hovhannisyan AA (2011) Biphasic dose-response of antioxidants In hypericin-induced photohemolysis. Photodiag Photodyn Therapy 8: Castano AP, Nemidowa TN, Hamblin MR (2005) Mechanisms in photodynamic therapy: Part three-photosensitizer pharmacokinetics, biodistribution, tumor localization and modes of tumor destruction. Photodiag Photodyn Therapy 2: Dąbrowska A (2002) Udział efektu towarzyszącego bystander effect w modelach in vitro terapii fotodynamicznej i termokoagulacji. Rozprawa doktorska wyk. w Zakładzie Biologii Komórki Centrum Onkologii-Instytutu im. Marii-Curie Skłodowskiej w Warszawie 70. Poyer F, Thomas CD, Garcia G, Croisy A, Carres D, Maillard P, Lupu M, Mispelter J (2012) PDT induced bystander effect on human xenografted colorectal tumors as evidenced by sodium MRI. Photodiag Phototodyn Therapy 9: Szokalska A, Makowski M, Nowis D, Wilczyński GM, Kujawa M, Wójcie C, Młynarczyk-Biały I, Salwa P, Bil J, Janowska S, Agostinis P, Verfaillie T, Bugajski M, Gietka J, Issat S, Grodkowska E, Mrówka P, Stokłosa T, Hamblin MR, Mróz P, Jakóbisiak M, Golab J (2009) Proteasome inhibition potentiates antitumor effects of photodymiac therapy In mice through induction of ER stress and unfolded protein response. Cancer Res 69: Li Z, Agharkar P, Chen B (2013) Therapeutic enhancement of vascular-targeted photodynamic therapy by inhibiting proteasomal function. Cancer Lett 339: Photodynamic reaction and oxidative stress influence of the photodynamic effect on the activity antioxidant enzymes Anna Romiszewska *, Agata Nowak-Stępniowska Institute of Optoelectronics, Military Institute of Technology, 2 Kaliskiego St., Warsaw, Poland * aromiszewska@wat.edu.pl Key words: photodynamic therapy, photodynamic effect, photosensitizer, oxidative stress, antioxidant, activity enzyme ABSTRACT The interaction of light with a photosensitizer, accumulated in a tissue in the presence of oxygen, leads to formation of reactive oxygen species, mainly of singlet oxygen and free radicals. These factors react with biomolecules producing their oxidized states. Reactive oxygen species, such as singlet oxygen and free radicals are able to damage membranes, DNA, enzymes, structural peptides and other cellular structures leading to cell death. An antioxidant protection of cell is formed by enzymes belonging to the family of oxidoreductases: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR). Photodynamic therapy leads to the increased production of oxidizing toxic forms. It is important to analyze impact of PDT on the activity of antioxidant enzymes, such as SOD, CAT, GPx. The activity of antioxidant enzymes during the photodynamic effect is influenced by both the light energy dose and the concentration of photosensitizer. The presence only of the photosensitizer or only the light energy may also result in changes in the activity of these enzymes. The differences in changes in the activity of these enzymes depend on the type of used photosensitizer. A phenomenon of selective accumulation of photosensitizer in tumor tissues is used in the photodynamic method of tumor diagnosis and treatment