Dr hab. Leszek Fiedor Kraków, 7 maj 2014 Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński

Transkrypt

1 Dr hab. Leszek Fiedor Kraków, 7 maj 2014 Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński Recenzja rozprawy doktorskiej pani mgr Magdaleny Góreckiej p.t. Inter- and intracellular signalling for regulation od ASCOBATE PEROXIDASE 2 expression and acclimatory and defence responses in higher plants Rozprawa wykonana i napisana została w Katedrze Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin na Wydziale Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu, Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, pod kierunkiem prof. dr hab. Stanisława Karpińskiego. Współpromotorem pracy jest dr inż. Magdalena Szechyńska-Hebda z Instytutu Fizjologii Roślin im. Franciszka Górskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie. Rozprawa została przygotowana w niedawno dopuszczonym, lecz nadal niepowszechnym, formacie polegającym na włączeniu w skład rozprawy opublikowanych już prac oraz na opatrzeniu ich wspólnym wstępem i podsumowaniem. Forma ta jest dość powszechnie przyjęta w wielu krajach zachodnich. Cała rozprawa, a właściwie jej część wstępna została napisana w języku angielskim. Wydaje się to mieć pewne uzasadnienie w fakcie iż pewna część opublikowanych wyników została uzyskana w ramach współpracy naukowej z grupą prof. P.M. Mullineaux z School of Biological Sciences, z Uniwersytetu Essex, UK. Trzeba przyznać, że taka forma rozprawy w pewnym sensie stawia recenzenta wobec faktów dokonanych i wymusza skupienie się na części napisanej stricte przez autora rozprawy, czyli na części wstępnej, wspólnej dla załączonych publikacji. Wrócę do tego w dalszej części recenzji. Cele rozprawy, które zawarto w rozdziale "Hypotheses and aims", sformułowano w postaci trzech hipotez. Dotyczą one roli dwóch enzymów roślinnych, persoksydazy askorbianowej 2 (APX2) i syntazy izochoryzmonianowej 1 (ICS1), oraz mechanizmów regulacji ich ekspresji w kontekście odpowiedzi przystosowawczych i obronnych organizmów roślin wyższych na różnorodne bodźce stresowe. W szczególności, poczynione są następujące założenia i) istnieją elementy cis zawarte w promotorze enzymu APX2, odpowiedzialne za regulację ekspresji tego enzymu ii) enzym APX2 bierze udział w propagacji sygnału wzdłuż wiązki przewodzącej iii) enzym ICS1 bierze udział w regulacji odpowiedzi rośliny na stres wywołany nadmiarem energii świetlnej. Ten ostatni postulat znajduje uzasadnienie w fakcie istnienia relacji pomiędzy poziomem kwasu salicylowego a poziomem ekspresji białka APX2. Tematyka ta oraz przyjęte podejście badawcze ściśle wpisuje się w nurt badań prowadzonych w renomowanym zespole prof. Stanisława Karpińskiego, zaliczającego się do światowej czołówki grup badawczych podejmujących badania mechanizmów i molekularnych podstaw procesów fizjologicznych 1

2 zachodzących w organizmach roślinnych. Cel pracy jest jak najbardziej dobrze obrany i pożądany, a przyjęte podejście badawcze jest niewątpliwie oryginalne i nowoczesne, a przede wszystkim skuteczne. Strona formalno-edytorska Całość rozprawy obejmuje część opisową oraz wydruki trzech prac, spięte i oprawione razem. Część opisowa rozprawy zawarta jest na 38-miu stronach i obejmuje trzy główne podrozdziały (Introduction, Hypotheses and aims, Results and discussion), dwa krótsze podrozdziały (Conclusions/Summary i Future perspective), oraz listę cytowanych prac. Najobszerniejsze z nich to Introduction oraz Results and discussion. Napisana jest w języku angielskim, na ogół dość poprawnym, jednakże nie bez zastrzeżeń. Przykładowo, często nieprzestrzegane są zasady interpunkcji j. angielskiego i reguły tworzenia liczby mnogiej. W tej części umieszczono 10 rycin a lista odnośników literaturowych zawiera 130 pozycji. Układ tekstu w części opisowej jest logiczny i w odpowiedni sposób uzasadnia podjęcie proponowanego w rozprawie celu badawczego. Przybliża również, choć skrótowo, obecny stan wiedzy w zakresie procesów sygnałowych zachodzących w organizmach roślinnych w odpowiedzi na stres wywołany nadmiarem zaabsorbowanej energii świetlnej. Prezentacja graficzna wyników jest staranna, przejrzysta i spójna. Drobne zastrzeżenie odnośnie strony edytorskiej dotyczy zastosowania niepraktycznego systemu cytowania literatury. W tekście umieszczono nazwisko autora i rok publikacji a na końcu wprowadzenia odnośniki zgrupowane są w porządku alfabetycznym i ponumerowane. System taki nie ułatwia orientacji i odnajdywania do której konkretnie pracy lub prac następuje odniesienie w tekście. Kolejne zastrzeżenie dotyczy przyjętego w tej części rozprawy niespójnego systemu użycia skrótów i zasadności ich użycia. Na przykład: 1) po co skracać słowo "catalyse" do "CAT", skoro jest to krótki wyraz i występuje w tekście niewiele razy? 2) po co wprowadzać skróty terminów użytych tylko jednokrotnie? 3) dlaczego dla etylenu wprowadzono skrót "ET" zamiast przyjętego na świecie (UIPAC) C 2 H 4? Uczyniono tak z nadtlenkiem wodoru (H 2 O 2 ). 4) definicję skrótu dla "ascorbate peroxidase" wprowadzono stanowczo za późno, dopiero na str. 11, podobnie definicja komórek pochwy okołowiązkowej (BSC) pojawia się dopiero na str. 23 5) w liście skrótów nieco niepotrzebnie definiuje się ATP i NADP a zabrakło w niej miejsca np. na często stosowane w tekście ABA, GPX i PAR. Strona merytoryczna rozprawy Jak wspomniałem powyżej, trudno występować w roli superrecenzenta i powtórnie oceniać prace już opublikowane, jak też wyniki w nich zawarte. Moim zdaniem zostało to już wykonane na etapie recenzji prac przez redakcje odpowiednich czasopism. Ponadto, ponieważ chodzi o prace posiadające wielu autorów trudno oszacować rzeczywisty wkład p. Góreckiej w uzyskanie publikowanych wyników i przygotowanie samych prac. Dlatego też w niniejszej recenzji chciałbym się skupić na ocenie części opisowej, której 2

3 autorstwo nie pozostawia wątpliwości. Jednakże, jeśli chodzi o zawartość merytoryczną to niestety lista zastrzeżeń jest dosyć długa i są one poważniejszego kalibru. 1) Wprowadzenie. Strona 1. Autorka wyjaśnia mechanizm konwersji energii świetlnej jako przebiegający poprzez wzbudzone stany trypletowe chlorofilu, wspominając o przeniesieniu elektronu z chlorofilu w stanie trypletowym na cząsteczkę plastochinonu, pierwotnego akceptora. Ponadto, wg Autorki, to elektron przechodzi do stanu trypletowego wzbudzonego, co fizycznie jest niemożliwe (krotność dotyczy spinu całkowitego atomów lub cząsteczek). Natomiast powszechnie obowiązującym mechanizmem działania aparatu fotosyntetycznego jest, niejako z definicji, tzw. singletowy przekaz energii a przekaz z udziałem stanów trypletowych jest stanowczo niepożądanym procesem. Stąd też mnogość mechanizmów fotoprotekcyjnych obecnych w aparacie fotosyntetycznym (wszystkich organizmów fotosyntetyzujących), mających na celu niedopuszczenie do tworzenia stanów trypletowych. To są najbardziej pierwotne sposoby fotoprotekcji, służące jako pierwsza linia dyssypacji nadmiaru pochłoniętej energii świetlnej. Są one szczególnie aktywne i ważne w przypadku roślin wyższych, producentów tlenu cząsteczkowego, czyli potencjalnego źródła tlenu singletowego i innych aktywnych form tlenu! 2) Ta sama strona, poniżej. Niezbyt zrozumiałe jest stwierdzenie "excitation amplification in the form of electron resonance in LHC" (wzmocnienie wzbudzenia w formie rezonansu elektronowego w LHC)? I następnie, "...is focused on chlorophyll molecules in RC..."? 3) Wprowadzenie. Strona 6. Kolejne niezrozumiałe stwierdzenie: "...upon coupling two electrons and two protons..." (... po sprzężeniu dwóch elektronów i dwóch protonów...). Efektem takiego "sprzężenia" może być wyłącznie atom wodoru. 4) Ta sama strona, poniżej. Niezrozumiałe stwierdzenie: "...light activation of PSI chlorophyll b molecules..." (...aktywacja światłem cząsteczek chlorofilu b fotosystemu I...). O który Chlb chodzi? I jak miałby on być wybiórczo wzbudzany? 5) Ta sama strona, dalej. Na ryc. 1 enzym katalizujący syntezę ATP oznaczony jest jako F-ATPase, podobnie w tekście poniżej Autorka dla tego enzymu używa skrótu ATP-ase, więc nie jest to przejęzyczenie. ATPazy to całkiem odrębna grupa enzymów rozkładających ATP. W błonie tylakoidów znajduje się syntaza ATP, katalizująca fosforylację ADP. 6) Wprowadzenie. Strona 7. Cały podrozdział zatytułowany jest "Energy quenching" (wygaszanie energii). Nie wiem, co Autorka ma na myśli, skoro pierwsze prawo termodynamiki mówi o niezniszczalności energii, więc która nie może ulec wygaszeniu, lecz co najwyżej transformacji. Wygaszeniu może ulegać wzbudzenie lub stany wzbudzone. 7) Ten sam podrozdział, w którym omawiane są mechanizmy fotoprotekcyjne. Dlaczego nie ma w nim wzmianki o najbardziej pierwotnych i uniwersalnych mechanizmach fotoprotekcyjnych, niejako zakodowanych w strukturze układów fotosyntetycznych, o których wspomniałem powyżej? A już na poziomie reakcji bardziej fizjologicznych, wypadało wspomnieć np. o translokacji chloroplastów. Dalsza część rozprawy, w której zawarto nowe niepublikowane wcześniej wyniki, jest zdecydowanie lepiej napisana, wskazując na to, że są to obszary w których Autorka porusza się z dużo większą swobodą. 3

4 Potwierdza ona również znajomość i biegłość Autorki w posługiwaniu się narzędziami biologii molekularnej. Tym niemniej, powyższe zastrzeżenia i braki obniżają jakość recenzowanej rozprawy. Trzeba przecież mieć na uwadze fakt, że rozprawa p. Góreckiej jest w całości poświęcona badaniom nad mechanizmami obronnymi, ich kontrolą i powiązaniami w organiźmie roślinnym. Autorka musi więc sobie zdawać dogłębnie sprawę przed czym organizmy roślinne muszą się bronić i jaka jest kluczowa relacja tych szkodliwych lub potencjalnie szkodliwych procesów z procesem fotosyntezy. Dlatego też nie można się dziwić, że pojawienie się tak jaskrawych błędów merytorycznych budzi moje zdziwienie. Sugeruję więc Autorce przemyślenie i wyjaśnienie (sobie) następujących zagadnień: i) etapy i mechanizm konwersji energii świetlnej w aparacie fotosyntetycznym roślin wyższych ii) mechanizmy generowania czynników zagrożenia pod wpływem światła i ich związek z tzw. fazą jasną fotosyntezy. Inne uwagi Cele rozprawy (zawarte w "Hypotheses") rozmijają się dość istotnie z opublikowanymi wynikami. Uważam, że rozprawa powinna raczej zawierać całościowe podsumowanie wyników i wnioski końcowe, a nie tylko skupiać się na wnioskach wycinkowych, zawężonych do wyników umieszczonych w części "Results and discusion". Publikacje wchodzące w skład rozprawy Kolejną częścią rozprawy są publikacje, stanowiące jej zasadniczy element. Trzy publikacje wchodzące w skład rozprawy zostały opublikowane w czasopismach o niewątpliwej renomie: J. Exp. Bot., Phil. Trans. R. Soc. B oraz The Plant Cell. Zwłaszcza to ostatnie czasopismo należy do tych, które wyznaczają główne nurty światowej nauki. Do takich też bez wątpienia należy opublikowana w nim praca z r. 2010, której współautorką jest p. Górecka. O znaczeniu tej pracy świadczy choćby fakt iż w ciągu czterech lat od daty opublikowania, w chwili powstawania niniejszej recenzji, liczba odwołań do tej pracy wynosi aż 23 w chwili sporządzenia niniejszej recenzji. Taką liczbę cytowań należy uznać za wysoką, zwłaszcza że chodzi i pracę typowo eksperymentalną oraz biorąc pod uwagę całkowicie rodzime pochodzenie tej pracy (brak współautorów z ośrodków zagranicznych). Podobnie, godny zauważenia jest fakt rodzimego autorstwa trzeciej publikacji. Świetna jakość i znaczenie wyników tych prac nie budzi najmniejszych zastrzeżeń. Publikacja 1 pt "Abscinic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposed Arabidopsis leaves", Phil. Trans. R. Soc. B, 2014 Kw. abscysynowy jest jednym z fitohormonów zaangażowanym m.in. w kontrolę ekspresji enzymu peroksydazy askorbinianowej 2 w liściach poddanych stresowi świetlnemu. Praca dotyczy udziału kw. abscysynowego w regulacji podatności komórek roślinnych na fotoinhibicję w warunkach stresu wywołanego silnym światłem. W szczególności, wykazano różnice pomiędzy komórkami pochwy 4

5 okołowiązkowej a komórkami mezofilu w kontekście regulacji ekspresji tego enzymu i obecności ścieżki sygnałowej z udziałem kw. abscysynowego. Jak wykazano, kontrola ta polega na oddziaływaniu ABAzależnej ścieżki sygnałowej na jeden z procesów fotoprotekcyjnych niefotochemiczne wygaszanie. Oświetlenie silnym światłem powoduje intensyfikację tego procesu w komórkach wiązki, co przekłada się na obniżeniu sprawności funkcjonowania fotosystemu II. Publikacja 2 pt "Evidence for light wavelength-specific photoelectrophysiological signaling and memory of excess light episodes in Arabidopsis", The Plant Cell, 2010 Praca dotyczy procesów sygnałowych związanych z adaptacją organizmu roślinnego do zmiennych warunków oświetleniowych, w szczególności jego odpowiedzi na stres wywołany nadmiarem absorbowanej energii świetlnej. Wykazano w niej związek pomiędzy funkcjonowaniem enzymu peroksydazy askorbinianowej 2 a propagacją indukowanego światłem sygnału elektrofizjologicznego w tkance fotosyntetycznej. Wskazuje to na możliwość zapamiętywania przez liście, na poziomie fizjologicznym, epizodów stresu świetlnego. Ponadto, reakcje te posiadają wyraźne widmo czynnościowe. Wyniki te pozwalają na odmienne, nowatorskie, spojrzenie na organizm roślinny, posiadający zdolność chemicznej memoryzacji zmian w poziomie najważniejszego dla roślin czynnika - światła, pozwalającej na lepszą adaptację tkanki fotosyntetycznej do radzenia sobie z nadmiarem energii. Wymaga to współdziałania i integracji wielu różnych procesów, wskazując na ich wzajemne powiązania i wysoki stopień skomplikowania tego systemu. Publikacja 3 pt " Isochorismate synthase 1 is required for thylakoid organization, optimal platoquinone redox status, and state transitions in Arabidopsis thaliana", J. Exp. Bot., 2013 Syntaza izochoryzmianowa 1 jest ważnym enzymem, katalizującym przemianę kw. choryzmowego w kw. izochoryzmowy, co jednocześnie jest ważnym etapem głównej ścieżki biosyntezy kw. salicylowego. Ten ostatni fitohormon to istotne ogniwo systemu obrony roślin przed patogenami, którego akumulacja w miejscu ataku patogena jest uruchamiana poprzez gwałtowny wzrost poziomu aktywnych form tlenu. Ponadto, enzym ten bierze udział w biosyntezie fyllochinonu, jednego z kofaktorów wiązanych w centrum reakcji fotosystemu I. W w/w pracy wykazano, że enzym ten jest ważnym elementem wpływającym na zbalansowaną odpowiedź obronną rośliny oraz na procesy adaptacyjne zachodzące podczas stresu wywołanego światłem. Obecność tego enzymu jest konieczna do utrzymania optymalnego poziomu redoksowego puli plastochinonu oraz relokacji podjednostek antenowych aparatu fotosyntetycznego podczas adaptacji do stresu wywołanego silnym światłem. Podsumowanie Oceny Rozprawy Jak wynika z powyższej recenzji, do części wstępnej niniejszej rozprawy zakradło się kilku poważnych błędów. Rzecz jasna, zastrzeżenia te nie dotyczą wyników zamieszczonych w rozprawie, jednakże wskazują 5

6