Dobór naturalny w sekwencjach genów. Metody analizy

Transkrypt

1 Dobór naturalny w sekwencjach genów Metody analizy

2 Podstawy ewolucji molekularnej Ewolucja sekwencji DNA i białek

3 Zmiany genetyczne w ewolucji } Mutacje } tworzą nowe allele genów } Inwersje } zmieniają układ genów na chromosomach } mogą uniemożliwić rekombinację na danym odcinku i doprowadzić do utrwalenia haplotypu } Duplikacje } dotyczą fragmentów DNA, w tym całych genów } lub całych chromosomów i całych genomów } główne źródło innowacji ewolucyjnej } Transfer horyzontalny } w tym zdarzenia symbiotyczne 3

4 Substytucje } Tranzycje zachodzą w naturze częściej od transwersji } mimo tego, że możliwych transwersji jest więcej } stosunek ts/tv od ~2 (ndna) do ~15 (mtdna człowieka) } wyjątek mtdna roślin } duże różnice ts/tv u różnych grup organizmów 4

5 Tranzycje i transwersje } Dlaczego tranzycje są częstsze? } Wyjaśnienia selekcyjne (tranzycje rzadziej zmieniają aminokwas i częściej są neutralne) } Ale: } tranzycje są częstsze też w genach rrna, pseudogenach i obszarach niekodujących } tranzycje są częstsze w pozycjach 4-krotnie zdegenerowanych (kodony typu CUN Leu) 5

6 Tranzycje i transwersje } Dlaczego tranzycje są częstsze? 6 } Wyjaśnienia mechanistyczne mechanizmy powstawania i naprawy mutacji } Tranzycje powstają w wyniku m. in.: } przejść tautomerycznych } deaminacji (np. oksydacyjnej) } Tranzycje w mniejszym stopniu zaburzają strukturę podwójnej helisy podczas replikacji } mniejsza wydajność naprawy przez system MMR } Korelacje z: } zawartością par G/C w genomie } aktywnością transkrypcyjną } tempem metabolizmu

7 Modele ewolucji sekwencji } Badając ewolucję nie dysponujemy z reguły sekwencją przodka } Liczbę mutacji musimy oszacować na podstawie różnic między sekwencjami współczesnymi } Konieczne jest uwzględnienie wielokrotnych mutacji w tej samej pozycji, zwłaszcza dla bardziej odległych sekwencji 7

8 Modele ewolucji sekwencji } Modele Markova stan w pokoleniu n +1 zależy tylko od stanu w pokoleniu n i reguł przekształcenia (macierz prawdopodobieństw zmiany stanów) } Modele o różnym stopniu skomplikowania } Mogą uwzględniać: } mutacje wielokrotne w tej samej pozycji (poprawka Poissona) } różne prawdpodobieństwa zmian nukleotydowych (lub białkowych) } różne prawdopodobieństwo mutacji w różnych pozycjach sekwencji } różne częstości nukleotydów 8

9 Modele ewolucji sekwencji } Modele Markova stan w pokoleniu n +1 zależy tylko od stanu w pokoleniu n i reguł przekształcenia (macierz prawdopodobieństw zmiany stanów) } Modele o różnym stopniu skomplikowania } Mogą uwzględniać: } mutacje wielokrotne w tej samej pozycji (poprawka Poissona) } różne prawdpodobieństwa zmian nukleotydowych (lub białkowych) } różne prawdopodobieństwo mutacji w różnych pozycjach sekwencji } różne częstości nukleotydów 9

10 Modele ewolucji DNA model Jukesa- Cantora } Jednakowe częstości nukleotydów (f=0,25) } Jednakowe prawdopodobieństwo każdej substytucji A C G T A 1-3α α α α C α 1-3α α α G α α 1-3α α T α α α 1-3α } } Odległość po poprawce wynosi: D JC = 3 4 ln(1 4 3 D) Przykładowo: D OBS =0.43 => D JC =

11 Inne modele } Kimura (K80, dwuparametrowy) - różne prawdopodobieństwo tranzycji i transwersji } Felsenstein (F81), Hasegawa-Kishino-Yano (HKY85) - różne częstości nukleotydów (F81) + różne prawd. tranzycji i transwersji (HKY85) } GTR (General Time Reversible, Tavare 86) 11

12 Model GTR } Różne prawdopodobieństwo każdej substytucji (ale symetrycznie, czyli np. A T = T A) - 6 parametrów } Różne częstości nukleotydów - 4 parametry 12

13 Rozkład gamma } Proste modele zakładają jednakowe prawdopodobieństwo zmiany w każdej pozycji - nierealistyczne } Rozkład prawdopodobieństw zmian w różnych pozycjach rozkład gamma 13

14 Mutaje na poziomie kodu } Mutacje mogą: } zmienić kodon na inny, ale kodujący ten sam aminokwas } mutacje synonimiczne } zmienić kodon na kodujący inny aminokwas } mutacje niesynonimiczne } zmienić kodon na kodon STOP } mutacje nonsens } spowodować zmianę fazy odczytu } wpłynąć na ekspresję genu 14

15 Mutacje i dobór naturalny } Efekty działania mutacji obserwujemy pośrednio } różnice sekwencji między populacjami (gatunkami) } polimorfizm sekwencji w obrębie populacji } Na allele wytworzone przez mutacje może działać dobór } Za zmiany częstości powstających alleli może odpowiadać dryf genetyczny } Obserwujemy mutacje utrwalone całkowicie lub częściowo (polimorfizmy) w puli genowej 15

16 Podstawowe pytanie ewolucji molekularnej } Jaka jest rola dryfu i doboru w wyjaśnieniu obserwowanego zróżnicowania sekwencji? } wewnątrzpopulacyjnego (polimorfizmy) } międzygatunkowego } Pytanie dotyczy zróżnicowania ilościowego! } Nikt nie podaje w wątpliwość tego, że adaptacje w ewolucji powstają dzięki działaniu doboru! 16

17 Dobor czy dryf? } Selekcjonizm } większość utrwalonych mutacji została wyselekcjonowana przed dobór } większość polimorfizmów jest utrzymywana przez dobór } dobór równoważący, naddominacja, dobór zależny od częstości } Neutralizm (Kimura, 1968) } większość utrwalonych mutacji została utrwalona przez dryf } za większość polimorfizmów odpowiada dryf } mutacje utrwalane przez dobór są rzadkie, nie mają wpływu na ilościową analizę zmienności molekularnej 17

18 Mutacje i dobór } niekorzystne (szkodliwe) } s < 0 } eliminowane przez dobór (oczyszczający/negatywny) } neutralne } s 0 (a konkretniej, s 1/4N) } utrwalane przez dryf } korzystne } s > 0 } utrwalane przez dobór (z udziałem dryfu dla niewielkich s) 18

19 Selekcjonizm i neutralizm } Selekcjonizm: } większość mutacji jest niekorzystna } większość utrwalonych mutacji jest korzystna } mutacje neutralne są rzadkie (nie częstsze od korzystnych) } Neutralizm } większość mutacji jest niekorzystna lub neutralna } większość utrwalonych mutacji jest neutralna } mutacje korzystne są rzadkie (znacznie rzadsze od neutralnych) 19

20 Selekcjonizm i neutralizm selekcjonizm neutralizm pan-neutralizm Neutralizm nie oznacza pan-neutralizmu, czyli negowania znaczenia selekcyjnego mutacji! 20

21 Przesłanki teorii neutralnej } Tempo zmian sekwencji i polimorfizm są zbyt duże, by dały się wyjaśnić doborem } Stałe tempo ewolucji molekularnej (zegar molekularny) } Sekwencje o mniejszym znaczeniu funkcjonalnym (pseudogeny, mniej istotne obszary białek) ewoluują szybciej, niż obszary kluczowe dla funkcji 21

22 Stałe tempo ewolucji molekularnej } Wiele sekwencji ewoluuje w stałym tempie } Tempo to jest różne dla różnych sekwencji, ale stałe w czasie ewolucji dla danej sekwencji } Tzw. zegar molekularny Różnice sekwencji globin kręgowców 22

23 Tempo ewolucji i dryf } Neutralny dryf jest procesem losowym, ale jego tempo będzie stałe w odpowiednio długim czasie } Zależy tylko od częstości mutacji (jedna zmiana na 1/µ pokoleń) } Dla doboru stałe tempo zmian oznacza stałe tempo zmian środowiska } Tempo zmian adaptacyjnych nie wydaje się być stałe 23

24 Zegar molekularny } Jest konsekwencją neutralnego modelu ewolucji } Tempo akumulacji zmian w danej sekwencji jest stałe } ale różne dla różnych sekwencji } Weryfikacja test względnego tempa K AC - K BC = 0 A B C } W rzeczywistości testuje stałość tempa pomiędzy gałęziami, ale nie w czasie 24

25 Zegar molekularny - problem } W modelu neutralnym tempo utrwalania mutacji: 2Nµ 1 2N = µ } Powinno być stałe w przeliczeniu na pokolenie } Czas generacji jest różny u różnych organizmów } Czyli nie powinna być obserwowana stałość tempa w czasie rzeczywistym } A często jest (w tych sekwencjach, które zachowują zegar) 25

26 Problem czasu generacji } Czas generacji różnych organizmów jest istotnie różny ~3 pokolenia/rok,03 pokolenia/rok } Dlaczego nie wpływa to na tempo utrwalania mutacji? 26

27 Zmiany prawie neutralne } Model Kimury dotyczy zmian neutralnych (s = 0), takie nie są częste } Mutacje zachowują się jak neutralne gdy spełnione jest: s 1 4N e } Mutacje o niewielkim współczynniku doboru s będą zachowywały się jak neutralne w małych populacjach, a w większych populacjach będą podlegały doborowi 27

28 Zmiany prawie neutralne } Istnieje odwrotna korelacja między czasem generacji a wielkością populacji 28

29 Zmiany prawie neutralne s 1 4N e ~3 pokolenia/rok ~0,03 pokolenia/rok Długi czas generacji Mniej mutacji na rok Krótki czas generacji Więcej mutacji na rok Populacja nieliczna (małe N e ) Populacja liczna (duże N e ) Więcej mutacji zachowuje się jak neutralne i utrwala przez dryf Więcej mutacji podlega doborowi (i jest eliminowane przez dobór oczyszczający) 29 Efekty czasu generacji i wielkości populacji się znosząc, dając stałe tempo w czasie (Ohta

30 Zegar molekularny } Dla sekwencji białek i zmian niesynonimicznych w DNA zmiany jednostajne w czasie } Na poziomie DNA, } dla mutacji synonimicznych } pseudogenów } niektórych sekwencji niekodujących } tempo ewolucji zależy od czasu generacji 30

31 Tempo ewolucji sekwencji a funkcja Sekwencje o mniejszym znaczeniu funkcjonalnym (pseudogeny, mniej istotne obszary białek) ewoluują szybciej, niż obszary kluczowe dla funkcji 31

32 Degeneracja w kodzie 32 miejsce 4-krotnie zdegenerowane miejsce 2-krotnie zdegenerowane

33 Tempo ewolucji sekwencji a funkcja Sekwencje o mniejszym znaczeniu funkcjonalnym (pseudogeny, mniej istotne obszary białek) ewoluują szybciej, niż obszary kluczowe dla funkcji 33

34 Tempo zmian jednostka: PAM/10 8 lat Jednostka czasu ewolucyjnego: ile lat (w milionach, 10 6 ) potrzeba do utrwalenia 1 mutacji/ 100 aa (1 PAM) } Białka zaangażowane w podstawowe funkcje komórki ewoluują wolniej. } W sekwencji białka obszary kluczowe dla funkcji ewoluują wolniej. 34

35 Tempo zmian } Czynnikiem decydującym o tempie zmian jest dobór oczyszczający (negatywny) } w ważniejszych sekwencjach więcej zmian będzie niekorzystnych (eliminacja przez dobór) } w mniej istotnych sekwencjach więcej zmian będzie neutralnych (utrwalanie przez dryf) } zmiany bez znaczenia dla funkcji będą neutralne } pseudogeny } niekodujące obszary międzygenowe? } podstawienia synonimiczne? 35

36 Status neutralizmu } Wyjaśnia wiele zjawisk obserwowanych w ewolucji molekularnej } wysoki polimorfizm sekwencji DNA i białek } zegar molekularny } ale jest wiele odstępstw, nie istnieje globalny zegar prawdziwy dla wszystkich gałęzi drzewa życia } wolniejsza ewolucja sekwencji o kluczowym znaczeniu } to też można wyjaśnić modelem, w którym większość mutacji jest albo niekorzystna, albo korzystna, ale niekorzystnych jest więcej } Jest bardzo przydatny jako hipoteza zerowa do badania doboru naturalnego na poziomie sekwencji! 36

37 Status neutralizmu } Dane molekularne, zwłaszcza genomowe, pozwoliły ocenić zgodność modelu neutralnego z obserwacją zmienności sekwencji } Kimura: 1968 nie były wtedy znane metody sekwencjonowania DNA! 37

38 Status neutralizmu } Smith & Eyre-Walker % podstawień aminokwasowych w ewolucji Drosophila sp. utwalonych przez dobór dodatni } Andolfatto 2005 pomiędzy D. melanogaster i D. simulans dobór dodatni odpowiada za utrwalenie: } 20% podstawień w DNA w intronach i obszarach międzygenowych } 60% podstawień w DNA w sekwencjach UTR 38

39 Status neutralizmu } Głównym i nieprzemijającym osiągnięciem jest stworzenie matematycznego opisu współdziałania dryfu i doboru naturalnego (dodatniego i oczyszczającego) w ewolucji molekularnej } Dzięki tym modelom opracowano testy poszukujące śladów doboru w sekwencjach (model neutralny jako hipoteza zerowa) } Istnieje znacząca liczba pozycji i sekwencji ewoluujących według modelu neutralnego } można dobrać sekwencje tak, by uzyskać zegar molekularny 39

40 Status neutralizmu } Dryf genetyczny ma w ewolucji molekularnej bardzo znaczącą, ale nie wyłączną rolę } znaczne obszary genomu ewoluują w sposób bliski neutralnemu 40

41 Jak szukać śladów działania doboru } Większość sekwencji genów zmienia się jednostajnie, w tempie wyznaczanym przez eliminację mutacji niekorzystnych zegar molekularny } Odstępstwa od jednostajnego tempa w określonej gałęzi dobór specyficzny dla tej gałęzi Orangutan Goryl Szympans Człowiek Orangutan Goryl Szympans Człowiek Orangutan Goryl Szympans Człowiek Równomierne tempo zmian Przyspieszone zmiany Spowolnione zmiany

42 Badanie doboru } Założenie: mutacje synonimiczne są neutralne, sekwencje porównywane są parami Ka (dn) liczba mutacji niesynonimicznych na liczbę możliwych miejsc niesynonimicznych Ks (ds) liczba mutacji synonimicznych na liczbę możliwych miejsc synonimicznych Stosunek Ka/Ks (ω) jest miarą działania doboru ω=1 ewolucja neutralna ω<1 dobór negatywny (oczyszczający) ω>1 dobór pozytywny

43 Badanie doboru } Wartość ω rzadko przekracza 1 dla całej sekwencji (wyjątek np. geny MHC) } Średnia wartość ω w porównaniach między naczelnymi a gryzoniami wynosi 0,2, między człowiekiem a szympansem 0,4 } Odchylenie ω od średniej dla konkretnego genu w konkretnej linii ewolucyjnej może świadczyć o działaniu doboru } W sekwencji mogą występować obszary o różnej wartości ω, wskazując na działanie doboru na poszczególne regiony a nawet pozycje aminokwasowe w białku

44 Badanie doboru II } Porównanie zmian synonimicznych i niesynonimicznych w obrębie populacji danego gatunku i pomiędzy gatunkami.

45 Test McDonalda-Kreitmana } Stosunek mutacji synonimicznych do niesynonimicznych w obrębie populacji vs. taki sam stosunek dla różnic między gatunkami } Jeżeli zmiany są neutralne, wówczas stosunek ten powinien być w obu przypadkach taki sam

46 Przykład: gen ADH u trzech gatunków Drosophila synonimiczne niesynonimiczne stosunek wewnątrzpopulacyjne 42 2 ~0,05 międzygatunkowe 17 7 ~0,41 Wniosek: zmiany niesynonimiczne są szybko utrwalane w specjacji nie są neutralne

47 Inne testy } Test HKA (Hudson, Kreitman, Aguadé) statystyczna korelacja zmienności wewnątrzpopulacyjnej i międzygatunkowej dla mutacji synonimicznych i niesynonimicznych } Test Tajimy porównuje częstość polimorfizmów wewnątrzpopulacyjnych z przewidywaniami teorii neutralnej } Test Fu & Li podobny do testu Tajimy, wykorzystuje dane filogenetyczne

48 Testowanie hipotez } Kryterium wiarygodności } Program PAML (Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood) autor Ziheng Yang }

49 Wiarygodność (likelihood) } Wiarygodność=prawdopodobieństwo uzyskania danych przy założeniach modelu i jego określonych parametrach: P(dane model) } Prawdopodobieństwo dotyczy zdarzenia przyszłego przy znanym modelu - np. jeżeli rzucam idealną (symetryczną) monetą, to prawdopodobieństwo uzyskania orła = 1/2 (dwóch orłów 1/4 itd.) } Wiarygodność odnosi się do wyjaśnienia zjawiska, które już zaszło - np. jeżeli przy dużej liczbie rzutów monetą uzyskuje 50% orłów, to najbardziej wiarygodnym modelem jest ten, w którym moneta jest symetryczna

50 Test ilorazu wiarygodności } LRT (Likelihood Ratio Test) } Dla porównania dwóch zagnieżdżonych modeli o różnej liczbie parametrów } Dla każdego modelu oblicza się wiarygodność (L1, L2) LR = 2 [ln(l1) ln(l2)]# } Istotność LR określa się porównując z wartością χ2 dla df równego różnicy w liczbie parametrów obu modeli

51 Przykład #1 Model 0 wartość ω taka sama w całym drzewie: wiarygodność L0 Czy ewolucja w gałęzi #1 jest szybsza? LR = 2 [ln(l1) ln(l0)]# Czy LR większe od χ 2 dla df=1? Model 1 wartość ω w gałęzi #1 inna, niż w pozostałych gałęziach drzewa: wiarygodność L1

52 Pliki programu PAML } Sekwencje: format PHYLIP (np. z Clustal) } Drzewo: format Newick, ew. z zaznaczanymi gałęziami } plik kontrolny: codeml.ctl

53 Notacja nawiasowa (Newick) dla drzew (Macaca,Cerco,(Pongo,(Gorilla,(Homo,Chimp)))); (Macaca,Cerco,(Pongo,(Gorilla,(Homo#1,Chimp)))); #1 #1 #1 #1 #1 #1 (Macaca,Cerco,(Pongo,(Gorilla,(Homo,Chimp))$1)); #1 #1 #1 #2 #1 (Macaca,Cerco,(Pongo,(Gorilla,(Homo#2,Chimp))$1));

54 seqfile = treefile = outfile = noisy = 9 verbose = 2 runmode = 0 * 0,1,2,3,9: how much rubbish on the screen * 1: detailed output, 0: concise output * 0: user tree; 1: semi-automatic; 2: automatic * 3: StepwiseAddition; (4,5):PerturbationNNI seqtype = 1 * 1:codons; 2:AAs; 3:codons-->AAs CodonFreq = 2 * 0:1/61 each, 1:F1X4, 2:F3X4, 3:codon table clock = 0 * 0: no clock, unrooted tree, 1: clock, rooted tree model = 0 * models for codons: * 0:one, 1:b, 2:2 or more dn/ds ratios for branches NSsites = 0 icode = 0 * dn/ds among sites. 0:no variation, 1:neutral, 2:positive * 0:standard genetic code; 1:mammalian mt; 2-10:see below fix_kappa = 0 * 1: kappa fixed, 0: kappa to be estimated kappa = 2 * initial or fixed kappa fix_omega = 0 * 1: omega or omega_1 fixed, 0: estimate omega = 1 * initial or fixed omega, for codons or codon-transltd AAs fix_alpha = 1 * 0: estimate gamma shape parameter; 1: fix it at alpha alpha =.0 * initial or fixed alpha, 0:infinity (constant rate) Malpha = 0 * different alphas for genes ncatg = 4 * # of categories in the dg or AdG models of rates getse = 0 * 0: don't want them, 1: want S.E.s of estimates RateAncestor = 1 * (1/0): rates (alpha>0) or ancestral states (alpha=0) fix_blength = 1 * 0: ignore, -1: random, 1: initial, 2: fixed method = 0 * 0: simultaneous; 1: one branch at a time

55 Modele } Modele gałęzi (branch models) - czy ω w którejś gałęzi drzewa (lub grupie gałęzi) odbiega od pozostałych gałęzi drzewa } Modele miejsc (site models) - jakie są klasy miejsc (kodonów) w sekwencji pod względem parametru ω (czy we wszystkich pozycjach tak samo działa dobór)? } Modele gałęzi i miejsc (branch and site models) - czy w którejś gałęzi drzewa pojawiają się klasy kodonów, na które inaczej działa dobór?

56 Modele gałęzi } Hipoteza zerowa - ω takie samo we wszystkich gałęziach drzewa } Hipoteza testowana - istnieją gałęzie o ω innym, niż w reszcie drzewa } Model swobodny - każda gałąź ma inną wartość ω } df = różnica liczby parametrów (każda wyróżniona gałąź dodaje 1)

57 Modele gałęzi seqfile = treefile = outfile = noisy = 9 verbose = 2 runmode = 0 * 0,1,2,3,9: how much rubbish on the screen * 1: detailed output, 0: concise output * 0: user tree; 1: semi-automatic; 2: automatic * 3: StepwiseAddition; (4,5):PerturbationNNI seqtype = 1 * 1:codons; 2:AAs; 3:codons-->AAs CodonFreq = 2 * 0:1/61 each, 1:F1X4, 2:F3X4, 3:codon table clock = 0 * 0: no clock, unrooted tree, 1: clock, rooted tree model = 0 * models for codons: * 0:one, 1:b, 2:2 or more dn/ds ratios for branches NSsites = 0 icode = 0 * dn/ds among sites. 0:no variation, 1:neutral, 2:positive * 0:standard genetic code; 1:mammalian mt; 2-10:see below fix_kappa = 0 * 1: kappa fixed, 0: kappa to be estimated kappa = 2 * initial or fixed kappa fix_omega = 0 * 1: omega or omega_1 fixed, 0: estimate omega = 1 * initial or fixed omega, for codons or codon-transltd AAs fix_alpha = 1 * 0: estimate gamma shape parameter; 1: fix it at alpha alpha =.0 * initial or fixed alpha, 0:infinity (constant rate) Malpha = 0 * different alphas for genes ncatg = 4 * # of categories in the dg or AdG models of rates getse = 0 * 0: don't want them, 1: want S.E.s of estimates RateAncestor = 1 * (1/0): rates (alpha>0) or ancestral states (alpha=0) fix_blength = 1 * 0: ignore, -1: random, 1: initial, 2: fixed method = 0 * 0: simultaneous; 1: one branch at a time

58 Modele miejsc } Przeprowadzane przy założeniu stałego ω we wszystkich gałęziach drzewa } Hipoteza zerowa (M1a): dwie klasy kodonów: neutralne (ω=1) i selekcjonowane negatywnie (ω<1) } Hipoteza testowana (M2a): trzy klasy kodonów: neutralne (ω=1), selekcjonowane negatywnie (ω<1) i selekcjonowane pozytywnie (ω>1) } Są też bardziej złożone modele o innej dystrybucji miejsc

59 Modele miejsc seqfile = treefile = outfile = noisy = 9 verbose = 2 runmode = 0 * 0,1,2,3,9: how much rubbish on the screen * 1: detailed output, 0: concise output * 0: user tree; 1: semi-automatic; 2: automatic * 3: StepwiseAddition; (4,5):PerturbationNNI seqtype = 1 * 1:codons; 2:AAs; 3:codons-->AAs CodonFreq = 2 * 0:1/61 each, 1:F1X4, 2:F3X4, 3:codon table clock = 0 * 0: no clock, unrooted tree, 1: clock, rooted tree model = 0 * models for codons: * 0:one, 1:b, 2:2 or more dn/ds ratios for branches NSsites = 0 icode = 0 * dn/ds among sites. 0:no variation, 1:neutral, 2:positive * 0:standard genetic code; 1:mammalian mt; 2-10:see below fix_kappa = 0 * 1: kappa fixed, 0: kappa to be estimated kappa = 2 * initial or fixed kappa fix_omega = 0 * 1: omega or omega_1 fixed, 0: estimate omega = 1 * initial or fixed omega, for codons or codon-transltd AAs fix_alpha = 1 * 0: estimate gamma shape parameter; 1: fix it at alpha alpha =.0 * initial or fixed alpha, 0:infinity (constant rate) Malpha = 0 * different alphas for genes ncatg = 4 * # of categories in the dg or AdG models of rates getse = 0 * 0: don't want them, 1: want S.E.s of estimates RateAncestor = 1 * (1/0): rates (alpha>0) or ancestral states (alpha=0) fix_blength = 1 * 0: ignore, -1: random, 1: initial, 2: fixed method = 0 * 0: simultaneous; 1: one branch at a time

60 Modele gałęzi i miejsc } Zmienna ω w wyróżnionych gałęziach, w gałęziach tych pojawia się dodatkowa klasa kodonów o ω>1 } Trzy klasy kodonów neutralne (ω=1), selekcjonowane negatywnie (ω<1) i selekcjonowane pozytywnie (ω>1) } Hipoteza zerowa: w trzeciej klasie ω=1 (brak selekcji pozytywnej)

61 Modele gałęzi i miejsc seqfile = treefile = outfile = noisy = 9 verbose = 2 runmode = 0 * 0,1,2,3,9: how much rubbish on the screen * 1: detailed output, 0: concise output * 0: user tree; 1: semi-automatic; 2: automatic * 3: StepwiseAddition; (4,5):PerturbationNNI seqtype = 1 * 1:codons; 2:AAs; 3:codons-->AAs CodonFreq = 2 * 0:1/61 each, 1:F1X4, 2:F3X4, 3:codon table clock = 0 * 0: no clock, unrooted tree, 1: clock, rooted tree model = 2 * models for codons: * 0:one, 1:b, 2:2 or more dn/ds ratios for branches NSsites = 2 icode = 0 * dn/ds among sites. 0:no variation, 1:neutral, 2:positive * 0:standard genetic code; 1:mammalian mt; 2-10:see below fix_kappa = 0 * 1: kappa fixed, 0: kappa to be estimated kappa = 2 * initial or fixed kappa fix_omega = 0 * 1: omega or omega_1 fixed, 0: estimate omega = 1 * initial or fixed omega, for codons or codon-transltd AAs fix_alpha = 1 * 0: estimate gamma shape parameter; 1: fix it at alpha alpha =.0 * initial or fixed alpha, 0:infinity (constant rate) Malpha = 0 * different alphas for genes ncatg = 4 * # of categories in the dg or AdG models of rates getse = 0 * 0: don't want them, 1: want S.E.s of estimates RateAncestor = 1 * (1/0): rates (alpha>0) or ancestral states (alpha=0) fix_blength = 1 * 0: ignore, -1: random, 1: initial, 2: fixed method = 0 * 0: simultaneous; 1: one branch at a time