Ocena dotkliwości procedur u ryb w świetle badań nad stresem i wskaźnikami dobrostanu

Transkrypt

1 Ocena dotkliwości procedur u ryb w świetle badań nad stresem i wskaźnikami dobrostanu Hanna Kalamarz-Kubiak Zakład Genetyki i Biotechnologii Morza, Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk Polskie Towarzystwo Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych

2 Problemy związane z oceną dotkliwości procedur u ryb Środowisko naturalne Specyficzność gatunkowa Rozpoznawanie i łagodzenie bólu, cierpienia, dystresu Wysoka śmiertelność Postrzeganie społeczne

3 Naturalne środowisko ryb czyli woda Usunięcie ryb z wody zwiększa dotkliwość procedur; wiele protokołów obejmuje chwytanie i manipulowanie rybami, co nie jest łatwe, a niektóre protokoły obejmują wystawianie ryb na działanie powietrza co wiąże się z niedotlenieniem organizmu, gwałtownym wzrostem kortyzolu, glukozy, kwasu mlekowego i katecholamin. Ponadto ryby narażone są na uszkodzenia mechaniczne skóry, utratę łusek oraz sklejanie listków blaszek skrzelowych co zmniejsza powierzchnię wymiany gazowej. Dobrą praktyką jest unikanie manipulowania i ograniczenie kontaktu z powietrzem przy zastosowaniu sedacji lub anestezji. Najlepiej gdyby środek znieczulający lub środek uspokajający dodano do zbiornika domowego, aby uniknąć manipulacji, chociaż nie zawsze jest to możliwe. Możliwe jest ograniczenie negatywnego wpływu stresorów, takich jak przełowienie, poprzez szkolenie ryb, aby powiązać je z pozytywnymi wydarzeniami. Dobre wyniki tylko u ryb akwariowych Zmiany w poziomie kortyzolu u dorady (Sparus aurata) narażonej na 3 minutowe niedotlenienie lub unieruchomienie. Arends i wsp

4 Specyficzność gatunkowa ryb o Istnieje ponad gatunków ryb żyjących w szerokim zakresie siedlisk. Traktowanie "ryb jako jednorodnej grupy jest błędne ponieważ ryby są najbardziej zróżnicowaną grupą kręgowców. o Wpływ danej procedury będzie różny dla różnych gatunków ryb. Zatem kryteria oceny dotkliwości w ramach poszczególnych projektów powinny uwzględniać specyficzne gatunkowo i indywidualne różnice w reakcji ryb na procedury i inne stresujące zdarzenia, takie jak handling, unieruchamianie, w szczególności gdy procedury są wykonywane poza wodą. o Oprócz wysokiego stopnia zmienności międzygatunkowej, wiele gatunków ryb podlega zmianom fizjologicznym jako naturalna część ich cyklu życiowego. Oznacza to, że ta sama procedura wpłynie na różne grupy wiekowe, płcie w różny sposób. o Różnice w odpowiedziach na stres mogą występować wśród populacji tego samego gatunku ryb, ich hybryd oraz między rybami dziko żyjącymi a rybami pochodzącymi z hodowli. W interpretacji dotkliwości powinno się uwzględniać biologię każdego gatunku.

5

6 Iwama et al., 2004 Rozpoznawanie i łagodzenie bólu, cierpienia, dystresu u ryb o o o o Ryby pozbawione są wyraźnej mimiki, a większość gatunków hodowlanych również nie posiada zdolności wokalnych. Ryby w środowisku produkcyjnym mają bardzo ograniczony behawior, który trudno obserwować. Obecnie rozpoznawanie bólu, cierpienia i dystresu obejmuje objawy kliniczne indywidualnych ryb (na przykład częstość oddechów, spożycie pokarmu i stan zdrowia) lub grupy ryb (takie jak zachowanie społeczne i poziom aktywności). Podstawowe wskaźniki dobrostanu to kortyzol, glukoza i katecholaminy. Obecnie dobrymi kandydatami na nowe wskaźniki dobrostanu u ryb wydają się być wazotocyna argininowa (AVT), izotocyna (IT) oraz melatonina. Lepsze wskaźniki nie tylko ułatwiłyby prawidłowe przewidywanie i klasyfikację dotkliwości, ale również pomogłyby zapewnić odpowiednie łagodzenie bólu, co pozwoliłoby na przeniesienie procedury do łagodniejszej klasy dotkliwości. Hormony stresu i glukoza w odpowiedzi na ostry stres u ryb. poziom adrenaliny wzrasta szybko ale ma krótki okres półtrwania w osoczu, wzrost kortyzolu w osoczu utrzymuje się dłuższy czas po zadziałaniu stresora, poziom glukozy w osoczu wzrasta powoli i utrzymuje się także dłuższy czas.

7 Nowe wskaźniki dobrostanu ryb

8 WAZOTOCYNA AGININOWA IZOTOCYNA FED NON- FED Kulczykowska et al., 2001 Działanie stresu osmotycznego (O), niepokojenia (D) lub obu (O+D) na poziom AVT u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss). Mancera et al., 2008 Stężenie AVT i IT w przysadce dorady (Sparus aurata) przy zastosowaniu okresowego głodzenia.

9 Babka bycza (Neogobius melanostomus) Hodowla tkankowa perfuzyjna in vitro

10 Kalamarz-Kubiak et al., 2015 Uwalnianie AVT i IT z kompleksu podwzgórze przysadka mózgowa babki byczej (Neogobius melanostomus) w odpowiedzi na działanie różnych dawek kortyzolu.

11 MELATONINA Stężenie melatoniny w osoczu dorady (Sparus aurata) po iniekcji kortyzolu w dawce 50µg/g masy ciała. Mancera et al., 2009 Działanie kortyzolu w różnych dawkach na wydzielanie melatoniny z hodowli szyszynki dorady (Sparus aurata) przeprowadzonej w ciemności. Nikaido et al., 2010

12 Kontrola Kortyzol 250 ng/ml Kulczykowska et al., 2018

13 Problemy związane z oceną dotkliwości procedur u ryb Środowisko naturalne Specyficzność gatunkowa Rozpoznawanie i łagodzenie bólu, cierpienia, dystresu Wysoka śmiertelność Postrzeganie społeczne

14 Wysoka śmiertelność Ocena stopnia zaawansowania zabiegu może być uwarunkowana wysokimi wskaźnikami śmiertelności, często obserwowanymi w naturalnych populacjach, szczególnie w fazie rozwojowej. Może to utrudniać odróżnienie zgonów spowodowanych przez eksperyment od naturalnej śmiertelności. Śmiertelność dorosłych ryb jest najczęściej wynikiem złych standardów hodowlanych i brakiem zapewnienia dobrostanu w przeciwieństwie do śmiertelność larw.

15 Postrzeganie społeczne o o o Doktryna uznająca zwierzęta za istoty pozbawione jakiejkolwiek rozumności wprowadzona przez Arystotelesa i perypatetyków w Starożytności jest ciągłe żywa a człowiek współczesny nadal uznaje siebie samego za istotę wyższą ignorując teorię ewolucji, uwarunkowania anatomiczne i fizjologiczne w tym rozwinięty mózg i narządy zmysłów wspólne wszystkim kręgowcom. Wyniki dotychczasowych badań bezspornie dowodzą, że ryby są zdolne do odczuwania bólu i stresu na równi lub nawet silniej, niż inne zwierzęta. Ryby mają lepiej niż ssaki rozwinięty dotyk, wzrok, słuch, węch oraz smak. Ponadto ryby posiadają narządy zmysłów, których nie posiadają wyższe kręgowce narząd linii nabocznej, wytwarzania i percepcji impulsu elektrycznego czy wreszcie aparat Webera. Jak się okazuje, ryby to społecznie wysoko rozwinięte i inteligentne zwierzęta, które są zdolne do uczenia się i logicznej dedukcji. Skalę trudności w interpretowaniu wyników badań naukowych z zakresu fizjologii ryb pogłębia sceptycyzm niektórych środowisk, w tym także naukowych, w odniesieniu do zjawiska odczuwania przez ryby bólu, strachu i cierpienia (Rose i wsp., 2014; Key, 2015).

16 Klasyfikacje dotkliwości procedur

17 Klasyfikacja dotkliwości procedur (załącznik VIII dyrektywy UE) terminalne łagodne umiarkowane dotkliwe

18 Norwegian Consensus-Platform for the Replacement, Reduction and Refinement of animal experiments (Norecopa) nadprogowe dotkliwe umiarkowane łagodne podprogowe

19 Procedury podprogowe, zwierzęta nie mogą odczuwać poziom bólu, cierpienia lub dystresu równego lub wyższego niż ten spowodowany wprowadzeniem igły. Podawanie znieczulenia do celów naukowych (z wyłączeniem eutanazji) powoduje zaklasyfikowanie procedury jako łagodnej lub wyższej. Stosowanie kilku procedur podprogowych u jednego zwierzęcia może wymagać zaklasyfikowania tej procedury jako łagodnej lub wyższej. Procedury łagodne, które eksponują zwierzęta na bodźce szkodliwe, które są związane z łagodnym bólem, cierpieniem lub dystresem. Procedury bez znaczącego pogorszenia samopoczucia lub ogólnego stanu zdrowia. Procedury umiarkowane, w wyniku których zwierzęta mogą doświadczać krótkotrwałego umiarkowanego bólu, cierpienia lub dystresu, lub długotrwałego łagodnego bólu, cierpienia lub dystresu. Procedury, które mogą powodować umiarkowane pogorszenie samopoczucia lub ogólnego stanu zdrowia. Procedury dotkliwe, w wyniku których zwierzęta mogą doświadczać silnego bólu, cierpienia lub dystresu, lub długotrwałego umiarkowanego bólu, cierpienia lub dystresu. Procedury, które mogą powodować poważne pogorszenie samopoczucia lub ogólnego stanu zdrowia. Procedury nadprogowe, w wyniku których zwierzęta mogą odczuwać silny ból, cierpienie lub dystres, które mogą być długotrwałe i których nie można złagodzić.

20

21 Procedury podprogowe Badania behawioralne. Nieinwazyjna obserwacja normalnego zachowania bez przeszkadzania zwierzęciu, na przykład obserwacja wyboru schronienia lub ukazanie atrapy drapieżnika przed którym można szybko się schronić. Badania żywieniowe, w których ograniczenie jedzenia a co za tym idzie utrata masy ciała (dorosły) lub zmniejszenie przyrostu masy ciała (formy larwalne i juwenilne) nie są na tyle wysokie aby spowodować konsekwencje dla zdrowia lub dobrostanu (w zależności od wieku, płci i stanu fizjologicznego). Znakowanie za pomocą nietoksycznych i niedyspersyjnych w wodzie barwników (np. barwniki na bazie tetracykliny do znakowania otolitów lub obojętne markery podawane w diecie w celu przejścia przewodu pokarmowego). Manipulacje fotoperiodem, na przykład w celu opóźnienia lub przyspieszenia dojrzewania. Manipulacje temperaturą w zakresie temperatur tolerowanych przez gatunek w jego naturalnym środowisku, w którym szybkość zmian pozwala na przystosowanie się bez stresu fizjologicznego. Manipulacje gazami i poziomami jonów, które mieszczą się w zakresach tolerowanych przez gatunek w jego naturalnym środowisku.

22 nadprogowe dotkliwe umiarkowane łagodne podprogowe

23 Procedury łagodne Badania behawioralne polegające na krótkotrwałym ukazaniu atrapy drapieżnik gdy ucieczka nie jest możliwa. Krótkotrwałe ( 24 godz.) unieruchomienie ryb. Badania dotyczące krótkookresowej izolacji, bez możliwości ukrycia się. Badania żywieniowe, w których nie ma zmniejszenia ilości lub jakości paszy, ale które wiążą się z ważeniem i mierzeniem w warunkach znieczulenia, przekraczającym poziom wymagany do celów hodowlanych. Łagodne i krótkotrwałe manipulacje poza wodą w celu wstrzyknięcia lub zastosowanie minimalnie inwazyjnej metody identyfikacji. Pobieranie krwi w znieczuleniu, w objętości i przy zastosowaniu technik zalecanych przez opublikowane wytyczne (1ml). Podawanie substancji drogą podskórną, domięśniową lub dootrzewnową, gdy substancja ma jedynie łagodny wpływ na zwierzę, a objętości mieszczą się w odpowiednich granicach dla wielkości i gatunku. Usunięcie niewielkiej części płetwy lub niewielkiej liczby łusek do celów genotypowania lub określania wieku, przy przewidywanym szybkim gojeniu. Płukanie żołądka pod znieczuleniem lub wprowadzanie urządzenia telemetrycznego do żołądka przez zgłębnik pod znieczuleniem ogólnym, przy czym waga, kształt lub objętość urządzenia nie będą miały znaczącego wpływu na funkcję fizjologiczne.

24 Procedury łagodne Utrzymywanie zewnętrznych pasożytów na rybach żywych, kiedy objawy kliniczne lub zmiany behawioru są niewielkie lub przemijające. Badania nad niektórymi chorobami, w których humanitarne punkty końcowe stosuje się przy pierwszym klinicznym objawie choroby lub wcześniej. Badania toksykologiczne, w których zwierzęta są humanitarnie uśmiercane przed wystąpieniem objawów klinicznych, co może mieć zastosowanie w przypadku wysoce toksycznych środków. Hodowla genetycznie zmienionych zwierząt, która wywoła łagodne zmiany fenotypu. Nieinwazyjne obrazowanie z odpowiednią sedacją lub znieczuleniem. Przy seryjnych obrazowaniach należy wziąć pod uwagę skumulowany efekt wielokrotnego uspokojenia lub znieczulenia oraz usunięcie z wody co może powodować zaklasyfikowanie procedury jako umiarkowanej lub wyższej.

25 nadprogowe dotkliwe umiarkowane łagodne podprogowe

26 Procedury umiarkowane Przedłużone utrzymywanie ryb bez wody lub niepokojenie ryb w celu wywołania reakcji stresowej. Zaleca się bardzo ostrożne podejście ponieważ procedura ta może być zaklasyfikowana jako dotkliwa. Stosowanie klatek metabolicznych powodujących umiarkowane ograniczenie ruchu przez dłuższy czas (do 5 dni). Wywoływanie reakcji ucieczki i unikania, gdy zwierzę nie jest w stanie uciec lub uniknąć bodźca i oczekuje się, że spowoduje umiarkowany stres. Badania nad niektórymi śmiertelnymi chorobami, toksycznością przewlekłą/ testy rakotwórcze, bez wywołania śmierci lub poważnego narażania na utratę zdrowia. Pobieranie moczu przez wprowadzenie cewnika do pęcherza i przymocowanie go wokół kloaki (w znieczuleniu ogólnym).

27 Procedury umiarkowane Kaniulacja naczyń krwionośnych w celu ciągłego pobrania krwi w dopuszczalnych granicach nie wymagających adaptacji fizjologicznej lub nie powodujących niedokrwistości. Pobieranie próbek krwi w przypadku, gdy objętości są większe niż zalecane w opublikowanych wytycznych i / lub przepisach krajowych (10% objętości krwi) lub gdy techniki pobierania próbek mogą powodować więcej niż łagodne skutki uboczne. Śródotrzewnowe wstrzyknięcie substancji powodujących zrosty. Zabiegi chirurgiczne w znieczuleniu ogólnym i odpowiednia analgezja w celu uniknięcia bólu pooperacyjnym, cierpienia lub upośledzenia ogólnego stanu. Obcinanie płetw w warunkach, w których może wystąpić infekcja (w cieplejszej wodzie u gatunków przystosowanych do zimnej wody). Usunięcie łusek w celu wywołania wzrostu grzybów. Implantacja domięśniowa lub śródotrzewnowa lub zewnętrzne mocowanie urządzeń telemetrycznych metodami chirurgicznymi (w znieczuleniu ogólnym), przy których istnieje ryzyko zakłócenia normalnej aktywności i zachowań.

28 nadprogowe dotkliwe umiarkowane łagodne podprogowe

29 Procedury dotkliwe Wysokie zagęszczenie powodujące znaczne szkody w funkcjonowaniu organizmu ryb. Poważne ograniczenie ruchu, które zakłóca normalne czynności przez dłuższy czas. Całkowita izolacja na długie okresy gatunków społecznych. Badania związane z wymianą wody słonej na słodką i odwrotnie (poza normalnymi procedurami hodowli właściwych dla gatunków), w których ryby nie przystosują się bez poważnych skutków lub śmiertelności. Badania dotyczące chorób śmiertelnych, gdzie nie można kontrolować badania w celu uniknięcia śmiertelności. Infekcje wywołujące choroby o przedłużonym przebiegu, przy których następuje istotna utrata zdrowia lub inne objawy kliniczne, powodujące również znaczną i długotrwałą utratę zdrowia. Badanie siły działania szczepionek charakteryzujące się uporczywym upośledzeniem stanu zdrowia, postępującą chorobą prowadzącą do śmierci lub związane jest z długotrwałym umiarkowanym bólem, dystresem lub cierpieniem.

30 Procedury dotkliwe Badanie toksyczności, w którym śmierć jest punktem końcowym, lub może wywołać poważne stany patofizjologiczne. Interwencje chirurgiczne i inne interwencje w znieczuleniu ogólnym, które mogą powodować ciężki lub utrzymujący się umiarkowany ból pooperacyjny, cierpienie, dystres lub poważne i uporczywe upośledzenie ogólnego stanu zdrowia. Hodowla zwierząt z zaburzeniami genetycznymi z poważnym lub ciągłym upośledzeniem ogólnego stanu zdrowia. Metody znakowania ryb, które powodują zwiększoną śmiertelność lub znaczną ingerencję w normalne zachowanie, takie jak niektóre znaczniki szczęki.

31 nadprogowe dotkliwe umiarkowane łagodne podprogowe

32 Procedury nadprogowe Badania patofizjologiczne chorób, które wymagają późnej oceny interakcji gospodarz-patogen, a zwierzęta doświadczają długotrwałego dotkliwego bólu, cierpienia lub dystresu. Opis krzywych przeżycia lub podobnych testów (na przykład po ekspozycji na substancję chemiczną), gdzie śmierć jest punktem końcowym i gdzie śmierć jest poprzedzona długotrwałym i dotkliwym bólem, cierpieniem lub dystresem. Art. 55 dyrektywy 2010/63 / UE zezwala państwom członkowskim, które uznają za konieczne, aby umożliwić korzystanie z procedury, która przekracza górny próg. Państwo członkowskie musi następnie poinformować Komisję, która przedstawi sprawę Komitetowi, który podejmie decyzję o dopuszczeniu tymczasowego środka lub zażądaniu jego uchylenia. W raporcie grupy roboczej UE nie podano przykładów procedur powyżej górnego progu.

33