Spis treści...1 Wstęp...4

Transkrypt

1 1 Spis treści Spis treści...1 Wstęp Pochodzenie i historia genomu mitochondrialnego Różnorodność mtdna współczesnych eukariontów Genetyka mitochondrialna drożdży Drożdże jako organizm modelowy Klasyczna analiza genomu mitochondrialnego drożdży i oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych Struktura i funkcjonowanie mtdna S. cerevisiae zarys Oddziaływania jądrowo-mitochondrialne u S. cerevisiae- zarys Podsumowanie...25 Badania nad funkcją i ewolucją genu SUV Wprowadzenie. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p Rola oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych w regulacji stabilności mitochondrialnych RNA Klonowanie i wstępna analiza fenotypowa różnych alleli genu SUV Analiza sekwencji produktu genu SUV Białka współdziałające z suv3p hipotetyczny kompleks białkowy degradosomu mitochondrialnego Cele badań Analiza fenotypowa szczepów niosących delecję genu SUV3 Saccharomyces cerevisiae gen SUV3 jest konieczny dla utrzymania stabilności transkryptów mitochondrialnych zawierających introny Wprowadzenie Wpływ inaktywacji genu SUV3 na ekspresję bezintronowych alleli genów cytb oraz cox Obróbka transkryptów genów cytb i cox1 zawierających różne kombinacje intronów w szczepie z inaktywacją genu SUV3 w kontekście mutacji sub Dyskusja Porównanie genów SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii wpływ zależnej od zmian DNA mitochondrialnego specjacji na ewolucję oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych Wprowadzenie Klonowanie i sekwencjonowanie genu SUV3 Saccharomyces douglasii Analiza sekwencji genu SUV3 S. douglasii Gen SUV3 jest niezbędny do funkcjonowania mitochondrialnego aparatu genetycznego S. douglasii Geny SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii są w pełni wymienialnymi odpowiednikami funkcjonalnymi Podsumowanie i dyskusja ogólna...81

2 2 Inżynieria genomu mitochondrialnego. Relokalizacja aktywnego genu jądrowego RIP1 do mitochondriów drożdży S. cerevisiae Wstęp Wprowadzenie Dotychczasowe doświadczenia nad relokalizacją genów mitochondrialnych i jądrowych Wybór relokalizowanego genu gen RIP1 Saccharomyces cerevisiae Transformacja balistyczna mitochondriów drożdżowych technika i strategia Założenia i cele projektu podsumowanie Wyniki Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych dla wyrażania genu RIP1 w mitochondriach S. cerevisiae Transformacja balistyczna i selekcja syntetycznych Komplementacja dysrupcji genu RIP1 w jądrze przez gen relokalizowany do mitochondriów Badanie stabilności szczepów eksprymujących gen relokalizowany do mitochondriów Uzyskanie genomu + zawierającego wrekombinowany gen RIP Dyskusja Prace nad bazą danych sekwencji mitochondrialnych (MitBASE) Wstęp Banki i bazy danych. Założenia projektu MitBASE Techniczna i organizacyjna struktura projektu MitBASE Cele projektu Wyniki Dane sekwencyjne mtdna grzybów pochodzące z pierwotnych banków danych Struktura i narzędzia bazy danych wariantów sekwencyjnych Zawartość bazy danych wariantów sekwencji mtdna grzybów Dyskusja i podsumowanie Podsumowanie wyników Materiały i metody Podłoża i hodowle Szczepy Plazmidy i oligonukleotydy Metody Techniki genetyki klasycznej Transformacja Techniki molekularne Metody bioinformatyczne Dodatek A VI. Bibliografia...154

3 3

4 Część I. Wstęp

5 Rozdział 1. Wstęp Pochodzenie i historia genomu mitochondrialnego Różnorodne formy życia spotykane na Ziemi można najogólniej podzielić na trzy równorzędne domeny, stanowiące najwyższy poziom taksonomii: Bacteria, Archaea i Eukarya (Woese i wsp., 1990). Każda z tych domen obejmuje kilka różnych królestw, stanowiących w tradycyjnej taksonomii najwyższe jednostki. Dwie pierwsze z wymienionych trzech domen określane są często wspólnym mianem Prokaryota, ze względu na strukturę ich komórek, odróżniającą je od tworzących trzecią domenę eukariontów. Należy jednak pamiętać, że jak wynika z badań przy użyciu metod filogenetyki molekularnej, dwie domeny zaliczane do Prokaryota są w istocie równorzędne i oddzieliły się od wspólnego przodka (Progenota) na najwcześniejszym etapie ewolucji, być może wcześniej, niż nastąpiło oddzielenie przodka dzisiejszych Eukaryota od gałęzi Archaea. Komórki eukariontów są bardziej skomplikowane od prokariotycznych zawierają szereg oddzielonych systemem błon kompartmentów (organelli), wśród których wyróżniają się mitochondria i plastydy. Struktura tych dwóch typów organelli swym poziomem złożoności przypomina proste komórki prokariotyczne, w szczególności posiadają one własny, niezależny od jądrowego materiał genetyczny w postaci genomu zbudowanego z DNA. Mitochondria obecne są w nieomal wszystkich liniach ewolucyjnych eukariontów, ich brak u niektórych beztlenowych Protista jest przypuszczalnie wtórny. Plastydy obecne są u wszystkich fotosyntetyzujących eukariontów, wielo i jednokomórkowych. Zasadniczą rolą mitochondriów jest dostarczanie komórkom ATP w procesie oddychania tlenowego, oprócz tego pełnią one istotną rolę w procesach metabolizmu, np. niektórych aminokwasów i kwasów tłuszczowych. Zagadnienie pochodzenia tych organelli, a ogólniej problem powstania złożonej struktury komórkowej współczesnych eukariontów jest od dawna przedmiotem zainteresowania badaczy (patrz Gray, 1992). Problem ten można rozpatrywać w kontekście ogólniejszego pytania, dotyczącego drogi, na której proces ewolucji prowadzi ogólnie do wzrostu złożoności. Każdy system biologiczny ma bowiem określony poziom inherentnej złożoności, ograniczonej zasadniczo jego możliwościami przechowywania i odczytywania informacji. Musi jednak istnieć mechanizm ewolucyjny pozwalający na przekroczenie tej bariery i osiągnięcie kolejnego, wyższego poziomu złożoności. Jedną z możliwych dróg jest wytwarzanie złożoności przez opartą na współdziałaniu fuzję systemów niższego poziomu. Mechanizm taki został zaproponowany dla najwcześniejszej fazy ewolucji prebiotycznej w świecie RNA. Według koncepcji hipercyklu (Eigen i Schuster, 1977), pierwotne replikatory RNA, których złożoność była silnie

6 Rozdział 1. Wstęp 6 ograniczona przez niską dokładność mechanizmu powielania informacji łączyły się we współzależne sieci wyższego rzędu (zwane hipercyklami). Współdziałanie większej liczby niezależnych początkowo replikatorów pozwoliło na pokonanie bariery zawartości informacyjnej pojedynczego systemu. Motyw współdziałania niezależnych początkowo systemów pojawia się również w koncepcji endosymbiontycznego pochodzenia struktury komórki eukariotycznej, sformułowanej po raz pierwszy przez Lynn Margulis (Margulis, 1970). Teoria ta zakłada, że współczesne komórki eukariotyczne powstały przez fuzję pierwotnej komórki ( urkarionta ), pochodzącej najprawdopodobniej od Archaea z komórkami z linii Bacteria, które dały początek mitochondriom i plastydom. W klasycznej wersji teorii endosymbiontycznej anaerobowa komórka będąca przodkiem dzisiejszych eukariontów wchłonęła (aktywnie, lub została zainfekowana) aerobową komórkę z linii Bacteria (prawdopodobnie zbliżoną do dzisiejszych proteobakterii), przy czym wytworzyła się endosymbioza oparta na oddychaniu tlenowym, jako głównej dla gospodarza korzyści z symbiozy. Obecnie proponuje się również kilka różnych alternatywnych scenariuszy endosymbiontycznego pochodzenia komórki eukariotycznej. W hipotezie wodorowej (Martin i Muller, 1998) w najwcześniejszych etapach endosymbioza opierała się nie na korzyściach z oddychania, lecz na wykorzystaniu przez gospodarza wydzielanego przez oddychającego symbionta wodoru i dwutlenku węgla (te uboczne produkty metabolizmu zaobserwowano także u niektórych współczesnych proteobakterii). Gospodarz wykorzystywał wodór i dwutlenek węgla jako źródła energii i węgla, podobnie jak niektóre współczesne Archaea. Dopiero później nastąpiło przejście gospodarza na heterotrofię i uzależnienie symbionta od dostarczanych przez niego związków organicznych. Symbiont stał się mitochondrium, a zależność została przypieczętowana transferem genów z genomu symbionta do genomu gospodarza, czyli jądra. Niektórzy badacze uważają też, że niezależnie od endosymbiozy prowadzącej do powstania mitochondriów, wcześniej zaszła endosymbioza komórki pochodzącej z linii Archaea z komórką linii Bacteria, która dała początek systemowi jądra i błon retikulum (Gupta i Golding, 1996). W myśl tej koncepcji gospodarz, który przyjął przodka mitochondriów sam był już wynikiem wcześniejszego procesu endosymbiontycznego. Niezależnie od tego, który ze scenariuszy endosymbiontycznej eukariogenezy jest prawdziwy, pochodzenie mitochondriów od endosymbiontycznych -proteobakterii wydaje się dobrze ugruntowane. Genom mitochondrialny byłby w myśl tej koncepcji resztką genomu symbionta. Analizy sekwencji, głównie SSU-rRNA umieszczają (Gray, 1993)

7 Rozdział 1. Wstęp 7 genomy mitochondrialne na jednej gałęzi drzewa filogenetycznego, co sugeruje ich monofiletyzm. Badania te wskazują, że najbliższymi mitochondriom współczesnymi bakteriami jest grupa -proteobakterii obejmująca wewnątrzkomórkowe pasożyty eukariontów takie, jak Rickettsia, Ehrlichia i Anaplasma. Interesujące w tym kontekście jest częste wśród -proteobakterii występowanie zjawisk endosymbiozy i endopasożytnictwa (np. Agrobacterium, Rhizobium, Rickettsia). Oczywiście pamiętać należy, że współczesne endopasożytnicze lub endosymbiontyczne -proteobakterie nie są przodkami mitochondriów, dzielą jednak z nimi wspólnego przodka, który musiał być szczególnie predysponowany do wchodzenia w ścisłe relacje z komórkami innych organizmów. Obecnie uważa się (Palmer, 1997; Germot i wsp., 1996), że wspólny przodek wszystkich współczesnych eukariontów posiadał mitochondria, zaś amitochondrialne eukarionty żyjące obecnie (Diplomonadina, Trichomonadina, Microsporidia) utraciły je wtórnie w wyniku przejścia na metabolizm beztlenowy. Hydrogenosomy, organella spotykane w komórkach tych organizmów pochodzą najprawdopodobniej właśnie od mitochondriów. Nie można jednak wykluczyć, że przynajmniej niektóre amitochondrialne eukarionty (np. Giardia lamblia z grupy Diplomonadina) nigdy mitochondriów nie posiadały i pochodzą bezpośrednio od pozbawionych mitochondriów urkariontów (Gray 1992), choć przeczy temu obecność w nich niektórych białek pochodzenia mitochondrialnego, np. Hsp60 (Palmer, 1997). Obecność tego białka tłumaczyć jednak można (Henze i wsp., 1995) zajściem kryptycznej, abortywnej endosymbiozy, która nie doprowadziła do trwałego wykształcenia organelli. Pozycja amitochondrialnych eukariontów w ewolucji wciąż jest przedmiotem ożywionej dyskusji (Palmer, 1997; Leblanc i wsp., 1997; Horner i wsp., 1996; Henze i wsp., 1995). Zawiązanie się trwałego związku endosymbiontycznego między mitochondriami a ich gospodarzami pociągnęło za sobą redukcję genomu symbionta i transfer genów do jądra. Ewolucja miała więc tutaj przebieg degeneratywny (Andersson i Kurland, 1998), redukujący autonomię organellum. Przykładem wcześniejszego stadium takiej ewolucji może być genom Rickettsia prowazekii, wewnątrzkomórkowego pasożyta z grupy -proteobakterii (Andersson i wsp., 1998). Utracił on częściowo autonomię, zachowując jedynie około 900 genów, prawdopodobnie około połowy wyjściowej liczby. Co ciekawe, zachowały się w nim wszystkie geny odpowiadające za procesy oddychania tlenowego, takie jak geny białek z kompleksów łańcucha oddechowego, enzymów cyklu kwasów trójkarboksylowych itp. Rickettsia straciła jednak wszystkie geny kodujące enzymy wcześniejszych, beztlenowych etapów katabolizmu związków organicznych, np. glikolizy a także geny, których produkty

8 Rozdział 1. Wstęp odpowiadają za 8 procesy syntezy aminokwasów i nukleotydów. Pasożytnictwo wewnątrzkomórkowe upodobniło ją zatem z metabolicznego i genetycznego punktu widzenia do mitochondrium. Można spekulować, że podobnie mogły wyglądać najwcześniejsze etapy procesu prowadzącego do powstania mitochondriów. U współczesnych eukariontów, mimo ogromnej różnorodności organizacji ich genomów mitochondrialnych liczba zachowanych w nich genów jest bardzo nieduża. Większość genomów mitochondrialnych zawiera około kilkudziesięciu genów, z czego kilkanaście zaledwie koduje białka (wszystkie genomy mitochondrialne kodują komplet trna i przynajmniej dwa typy rrna). Wyjątkową pozycję ma tutaj genom mitochondrialny Reclinomonas americana, dosyć prymitywnego słodkowodnego heterotroficznego wiciowca (Lang i wsp., 1997). Spośród wszystkich znanych genomów mitochondrialnych zachował on najwięcej cech genomu eubakteryjnego. Zawiera największą liczbę genów 97, z czego 44 geny kodujące białka. Są wśród nich wszystkie geny występujące w mtdna innych organizmów a ponadto kilkanaście genów nie występujących w żadnych innych genomach mitochondrialnych. Są wśród nich geny wielopodjednostkowej polimerazy RNA typu eubakteryjnego, nie przypominającej polimeraz mitochondrialnych innych organizmów, liczne geny białek rybosomalnych, trzy rrna (LSU, SSU i 5S rrna) oraz podjednostka RNA RNazy P. Mitochondria R. americana zachowały standardowy kod genetyczny oraz oddziaływanie SSU rrna z mrna typu Shine-Dalgarno. Ponadto widoczne są ślady organizacji operonowej, z zachowanymi u różnych bakterii grupami genów. Porównanie mtdna R. americana z innymi stosunkowo prymitywnymi genomami mitochondrialnymi, np. Marchantia polymorpha i Acanthoamoeba castellani sugeruje, że pochodzi on z tej samej linii ewolucyjnej, co inne genomy mitochondrialne, zgodnie z koncepcją ich monofiletyzmu, wykazuje jedynie wyjątkowo silnie zachowane cechy pierwotne, przypominające przodka eubakteryjnego. Porównanie genomów wewnątrzkomórkowego pasożyta o zbliżonym do mitochondrialnego metabolizmie (Rickettsia), pierwotnego genomu mitochondrialnego o wyraźnych cechach bakteryjnych (Reclinomonas) oraz współczesnych, silnie zredukowanych genomów mitochondrialnych wykazuje, że ewolucja mtdna przebiegała drogą postępującej redukcji zawartości informacyjnej, upraszczania systemów regulacyjnych (zwłaszcza na poziomie transkrypcyjnym) oraz pojawiania się odstępstw od powszechnych mechanizmów genetycznych (np. zmienionego kodu genetycznego). W przypadku endosymbiontów proces ten połączony jest z transferem genów symbionta do jądra, u endopasożytów, których obecność nie jest dla komórki niezbędna ani korzystna, procesu takiego się nie obserwuje.

9 Rozdział 1. Wstęp 9 W przypadku genomów mitochondrialnych, podobnie jak i endopasożytów mamy do czynienia z reduktywną ewolucją, zmniejszającą zawartość informacyjną genomu. Głównym mechanizmem odpowiedzialnym za tę tendencję jest tzw. zapadka Mullera (Muller, 1964; Felsenstein, 1974; Andersson i Kurland, 1998). Jest to mechanizm działający na populacje o niskiej liczebności i pozbawione mechanizmów rekombinacji polegający na nagromadzaniu w nich niekorzystnych mutacji, czyli nieodwracalnej degeneracji informacji genetycznej. Mutacje o niekorzystnym adaptacyjnie efekcie są statystycznie znacznie częstsze od mutacji korzystnych. W dużych populacjach nagromadzanie się niekorzystnych mutacji jest równoważone przez dobór naturalny i wytwarza się równowaga. Przy znacznej redukcji liczebności ( wąskie gardło populacyjne) na skutek fluktuacji może zdarzyć się, że w określonym momencie wszystkie osobniki będą obciążone mutacją. Przy braku rekombinacji (która pozwoliłaby na odtworzenie prawidłowego allelu z dwóch różnych alleli zmutowanych) takie obniżenie wartości przystosowawczej populacji będzie nieodwracalne (gdyż mutacje powrotne są dużo mniej częste). Na tym polega nieodwracalność mechanizmu zapadkowego obciążenie populacji mutacjami nieuchronnie będzie wzrastać. Efekty działania zapadki Mullera obserwuje się w wielu przypadkach populacji endopasożytów, np. wirusów (Chao, 1990, 1997; Chao i Tran, 1997). Wyraźne też są ślady działania tego mechanizmu w genomie Rickettsia prowazekii (Andersson i wsp., 1998). Geny, których produkty nie są niezbędne dla funkcjonowania tej bakterii zostały usunięte z genomu, część z nich pozostaje w DNA w postaci rozpoznawalnych pseudogenów. Gen metk jest przykładem początkowych faz tego procesu pewne szczepy Rickettsia posiadają jego funkcjonalny allel, w innych zawiera on już mutacje uniemożliwiające ekspresję. Zanik tego genu dopiero się rozpoczął. Efekty niedawnego działania zapadki Mullera można również obserwować w genomie mitochondrialnym drożdży z rodzaju Saccharomyces na przykładzie genu ens2 oraz ORF intronów bi2 i ai4 (omówione dokładniej w rozdziale 1.3). Genomy mitochondrialne stanowią końcowy etap reduktywnej ewolucji, w której jednym z głównych mechanizmów jest omówiona powyżej zapadka Mullera. Endosymbioza, która dała początek mitochondriom była pierwszym i najważniejszym etapem znacznego zawężenia populacji endosymbionta. Wszystkie dzisiejsze eukarionty są pod względem mitochondrialnym monofiletyczne, a zatem powstały w wyniku jednej skutecznej endosymbiozy, która dała im przewagę selekcyjną. Wąskie gardło liczebności populacji związane z tym wydarzeniem musiało zainicjować proces degeneratywnej ewolucji mtdna. U wielu, chociaż nie wszystkich współczesnych eukariontów mitochondria są zasadniczo aseksualne i nie zachodzi w nich rekombinacja (najprawdopodobniej tak jest u wszystkich

10 Rozdział 1. Wstęp 10 Metazoa). U grzybów i roślin stwierdzono rekombinację mtdna, lecz nadal przez większą część trwania mitochondria tworzą małe i odizolowane populacje. Pojawiają się w związku z tym zasadnicze pytania: w jaki sposób możliwe jest utrzymanie funkcjonalnego mtdna i dlaczego redukcja genomu mitochondrialnego nie doprowadziła do jego całkowitego zaniku? Za utrzymywanie się funkcjonalnego mtdna w komórkach współczesnych eukariontów, mimo presji zapadki Mullera mogą odpowiadać silne mechanizmy selekcyjne (Bergstrom i Pritchard, 1998), związane z tym, ze produkty genów mitochondrialnych są w tej chwili absolutnie niezbędne dla funkcjonowania całego organizmu. U niższych eukariontów (np. grzybów) mtdna może rekombinować, co również może przyczynić się do uniknięcia efektu zapadki. Utrzymywanie się mitochondrialnych genów kodujących niektóre białka kompleksów łańcucha oddechowego tłumaczyć można tym, że ich silnie hydrofobowy charakter może uniemożliwić ich prawidłowy posttranslacyjny transport i osadzanie w kompleksach (Saccone, 1994). Wiadomo jednak, że niektóre geny mtdna, np. atp8 i atp9 (Law i wsp., 1988) można przenieść do genomu jądrowego (patrz rozdział 3.1) bez utraty aktywności kodowanych przez nie białek. Inna teoria mówi, że istnienie genomu mitochondrialnego umożliwia koordynację funkcjonowania organellum i komórki, poprzez dwustronną wymianę sygnałów (Parikh i wsp., 1987; Liao i Butow, 1993; Saccone, 1994). Przykładem regulacyjnej funkcji mtdna jest też uczestnictwo produktu mitochondrialnego genu nd1 u ssaków w tworzeniu kompleksu antygenów zgodności tkankowej (Lindahl i wsp., 1991). Prawdopodobnie za utrzymywanie się szczątkowego genomu mitochondrialnego u współczesnych eukariontów odpowiedzialne są zarówno czynniki biochemiczne, związane z fizykochemicznymi właściwościami kodowanych w mtdna białek, jak i jego rola regulacyjna. Końcowym etapem reduktywnej ewolucji endosymbiontów są spotykane u amitotycznych eukariontów hydrogenosomy (Palmer, 1997), które są zapewne pozbawionymi mtdna potomkami mitochondriów. Utraciły one jednak również funkcję oddechową i pełnią odmienną rolę w metabolizmie. Genom mitochondrialny towarzyszy wszystkim oddychającym tlenem eukariontom. Podsumowując: mitochondria (podobnie jak plastydy) powstały w wyniku endosymbiozy przodka eukariontów, którego genom zbliżony był do Archaea z bakterią z grupy -proteobakterii. W wyniku reduktywnej ewolucji endosymbiont utracił samodzielność, zaś jego genom posiada obecnie formę szczątkową, o zawartości informacyjnej nie przekraczającej 100 genów.

11 Rozdział 1. Wstęp Różnorodność mtdna współczesnych eukariontów Pomimo tego, że mitochondria współczesnych eukariontów są najprawdopodobniej monofiletyczne ich różnorodność pod względem organizacji i ekspresji zawartego w nich materiału genetycznego jest zdumiewająca. Dotyczy to zwłaszcza obszarów niekodujących i różnych mechanizmów ekspresji genów, gdyż zawartość informacyjna wszystkich mtdna jest stosunkowo niewielka w najbardziej rozbudowanym genomie mitochondrialnym (Reclinomonas americana) nie przekracza 100 genów. Wielkość mtdna różnych organizmów waha się w bardzo szerokim zakresie, którego granice wyznaczają z jednej strony rośliny wyższe (do 2400 kb), zaś z drugiej strony Metazoa (14 42 kb). Najmniejszym znanym genomem mitochondrialnym jest mtdna pierwotniaka Plasmodium falciparum o długości 6 kb (Feagin, 1992). Na jednym krańcu spektrum umieścić można genomy mitochondrialne zwierząt (Metazoa) (Wolstenholme, 1992). Są to małe koliste genomy o wielkości od 14 kb (C. elegans) do 42 kb (Plactopen magellanicus), najczęściej spotyka się rozmiar rzędu 16 kb. Ich zawartość informacyjna jest bardzo zbliżona - posiadają 13 genów kodujących białka: trzy podjednostki oksydazy cytochromowej, apocytochrom b, siedem podjednostek dehydrogenazy NADH i dwie podjednostki ATP-azy. Jedynie u nicieni nie stwierdzono jednego z genów ATP-azy (atp8). Poza tym występują dwa geny rrna i zestaw trna. Wyjątkiem jest tu genom mitochondrialny ukwiała Metridium senile, w którym stwierdzono tylko 2 geny trna. W genomie tym stwierdzono też, jedyne u Metazoa, introny (w genach cytb i nd5), należące do grupy I. U wszystkich pozostałych zbadanych Metazoa nie stwierdzono intronów, a sekwencje międzygenowe są zasadniczo bardzo krótkie. Genomy mitochondrialne zwierząt charakteryzują się więc bardzo silnym upakowaniem, w tej grupie ewolucja doprowadziła do maksymalnej redukcji rozmiaru, przy pozostawieniu niezbędnych sekwencji kodujących. W mtdna Metazoa stwierdza się stosunkowo szybkie tempo mutacji (głównie podstawień). Związane jest to z faktem, że ze względu na czysto matczyny sposób dziedziczenia oraz brak rekombinacji na genomy te bardzo silnie działa mechanizm zapadki Mullera. Kod genetyczny funkcjonujący w mitochondriach Metazoa różni się od standardowego i dostosowany jest do maksymalnie zredukowanego zestawu trna (22). Uproszczony jest mechanizm transkrypcji - z jednego dwukierunkowego promotora powstają dwa główne transkrypty, które następnie podlegają złożonej i słabo poznanej obróbce posttranskrypcyjnej, stanowiącej zapewne główny poziom regulacyjny. Na drugim biegunie znajdują się genomy mitochondrialne roślin lądowych, osiągające najwyższe rozmiary (do 2400 kb u Cucumis melo) (Hanson i Folkerts, 1992).

12 Rozdział 1. Wstęp 12 Rozpiętość rozmiarów mtdna roślin jest ogromna od ponad 2000 kb do 184 kb (mszak Marchantia polymorpha). Za różnice te odpowiadają przeważnie sekwencje międzygenowe, w mniejszym stopniu introny i sekwencje pochodzące z DNA jądrowego i chloroplastowego. Cechą charakterystyczną mtdna roślin jest bardzo wysoka częstość rekombinacji, prowadząca do powstania sytuacji "płynności genetycznej". mtdna większości roślin zawiera liczne sekwencje powtórzone, które powodują różnego rodzaju rearanżacje, prowadzące do wytworzenia się całej populacji subgenomowych kolistych DNA w stanie dynamicznej równowagi. Częsta jest też, zwłaszcza u okrytonasiennych dwukierunkowa wymiana genetyczna miedzy mitochondriami (i chloroplastami) a jądrem (Schuster i Brennicke, 1994). Bardziej różnorodne są też u roślin zestawy kodowanych w mtdna genów. W większości ich genomy zawierają podstawowe geny kodujące białka (podjednostki oksydazy cytochromowej, apocytochrom b, podjednostki ATP-azy) a także kilkanaście genów kodujących białka mitorybosomu (u innych eukariontów wszystkie, lub nieomal wszystkie białka mitorybosomalne są kodowane w jądrze). Poza typowymi dla wszystkich eukariontów genami rrna SSU i LSU u roślin (oraz niektórych glonów) stwierdzono występowanie genu 5S rrna. Poza linią fotosyntetyzujących Eukaryota (roślin i zielenic) gen ten stwierdzono jedynie w prymitywnym mtdna pierwotniaka Reclinomonas americana, zawierającym wszystkie znane geny mitochondrialne. Geny mitochondrialne, niespotykane u innych Eukaryota odpowiedzialne są u roślin za szereg nietypowych fenotypów, np. męską niepłodność, wrażliwość na pewne toksyny grzybowe czy zaburzenia wybarwienia liści (Hanson i Folkerts, 1992). Rośliny wykorzystują w mitochondriach uniwersalny kod genetyczny, a cześć ich mitochondrialnych trna kodowana jest w genomie jądrowym i chloroplastowym. Nietypowym elementem ekspresji genów mitochondrialnych roślin jest redagowanie (editing), polegające przeważnie na posttranskrypcyjnej zamianie C>U (Hanson i Folkerts, 1992). U roślin często występują tez introny, spotyka się nietypowe warianty mechanizmu składania RNA (tzw. trans-splicing, czyli składanie RNA z oddzielnie transkrybowanych prekursorów). Genomy mitochondrialne grzybów wykazują cechy pośrednie w stosunku do systemów zwierząt i roślin. Wykazują stosunkowo wysoką zmienność rozmiarów (17 do 180 kb) i zawartości genetycznej (Clark-Walker, 1992). Większość z nich koduje podobny zestaw białek, jak mitochondria zwierząt, u niektórych grzybów (np. S. cerevisiae) mtdna nie zawiera jednak genów dehydrogenazy NADH, wiele natomiast zawiera trzy geny ATPazy. U grzybów powszechnie występują introny, stanowiące główny czynnik zmienności międzygatunkowej. Również obszary niekodujące mogą zajmować istotna część genomu, nie

13 Rozdział 1. Wstęp 13 osiągając jednak takich rozmiarów, jak w przypadku mtdna roślin. DNA mitochondrialny grzybów jest zdolny do rekombinacji, co spowalnia degenerację wywołaną działaniem zapadki Mullera. U wielu grzybów stwierdzono w mitochondriach odstępstwa od uniwersalnego kodu genetycznego, brak jednak doniesień o redagowaniu RNA. Dane dotyczące pozostałych niższych Eukaryota, określanych wspólną nazwa Protista są dosyć fragmentaryczne. Jest to zresztą grupa niejednorodna filogenetycznie, stąd stwierdza się w niej bardzo różne warianty organizacji genomów mitochondrialnych. mtdna orzęsków (a także Chlamydomonas i Plasmodium) jest liniowy. Dla orzęsków charakterystyczny jest też niekompletny zestaw kodowanych w mtdna trna, musi zatem zachodzić u nich import trna kodowanych w genomie jądrowym (Cummings, 1992). Najbardziej niezwykłą organizację genomu mitochondrialnego stwierdzono u wiciowców z rzędu Kinetoplastida (Stuart i Feagin, 1992). Ich mitochondria, zwane kinetoplastami, zawierają dwa rodzaje kolistych DNA maksichromosomy (maxicircles) i minichromosomy (minicircles). Są one połączone na zasadzie ogniw łańcucha w jedną sieć, składająca się z kilkudziesięciu maksichromosomów i kilku tysięcy minichromosomów. Wszystkie geny kodujące białka zawarte są w maksichromosomach. Podlegają one zachodzącemu na niespotykaną nigdzie indziej skalę redagowaniu, wszystkie transkrypty zmieniane są w wielu miejscach, liczne nukleotydy wstawiane są posttranskrypcyjnie. Redagowaniem kierują specjalne RNA, tzw. grna (guide RNA), kodowane w minichromosomach. Znaczenie tak niezwykłego mechanizmu nie jest do tej pory znane, wiadomo jednak, że zachodzą na tym poziomie procesy regulacyjne.

14 Rozdział 1. Wstęp Genetyka mitochondrialna drożdży Drożdże jako organizm modelowy Drożdże z rodzaju Saccharomyces, a szczególnie S. cerevisiae stanowią podstawowy organizm modelowy dla badania procesów związanych z biogenezą i funkcjonowaniem mitochondriów, zwłaszcza w odniesieniu do roli genomu mitochondrialnego i jego interakcji z genomem jądrowym. Istnieje ku temu wiele powodów. Po pierwsze, drożdże są najlepiej pod względem genetycznym poznanym organizmem eukariotycznym, zarówno z punktu widzenia genetyki klasycznej, jak i molekularnej. Znana jest obecnie pełna sekwencja DNA genomu drożdży (The Yeast Genome Directory, 1997), trwają prace nad systematyczną analizą funkcjonalną odkrytych genów. Żaden organizm eukariotyczny nie może też równać się z S. cerevisiae pod względem różnorodnych możliwości manipulacji genetycznych. Znane są od dawna proste i skuteczne techniki wydajnej transformacji, ukierunkowanej inaktywacji genów szczególnie łatwej ze względu na wysoką częstość rekombinacji homologicznej (Orr-Weaver i wsp., 1983), izolacji kwasów nukleinowych i białek i wiele innych. Opracowano szereg dogodnych wektorów bifunkcjonalnych, replikujących się autonomicznie w komórkach drożdży i bakterii, łatwych do izolacji i pozwalających na regulowanie w pewnym zakresie liczby kopii w komórce. Podobnie z punktu widzenia genetyki klasycznej drożdże stanowią idealny organizm badawczy dają się łatwo hodować w dużych ilościach na rozmaitych podłożach, w tym syntetycznych o ściśle określonym składzie, łatwo poddają się mutagenezie, bez trudu prowadzi się krzyżówki oraz analizę potomstwa mejotycznego metodą mikromanipulacji. Powyższe zalety wystarczyły do uczynienie z drożdży podstawowego organizmu modelowego Eukaryota. Istnieją jednak dodatkowe powody, dla których ich rola w genetyce mitochondrialnej jest nieporównywalna z jakimkolwiek innym organizmem. Do powodów tych zaliczyć należy przede wszystkim ich fakultatywnie tlenowy metabolizm. Drożdże są w stanie uzyskiwać energię zarówno w procesach tlenowych (oddychanie), jak i beztlenowych (fermentacja) zależnie od warunków, dostępności tlenu i źródła węgla. Niektóre źródła węgla pozwalają na uzyskiwanie energii w obu tych procesach (np. glukoza, galaktoza) inne zaś, zwane niefermentowalnymi, mogą być wykorzystywane jedynie w procesach oddechowych (np. glicerol, etanol, mleczan). Komórki S. cerevisiae u których zaburzona zostanie oddechowa funkcja mitochondriów są w stanie przeżyć i dzielić się, pod warunkiem dostępności fermentowalnego źródła węgla. Możliwe jest zatem hodowanie na takim podłożu drożdży, u których zaburzone jest funkcjonowanie łańcucha oddechowego na

15 Rozdział 1. Wstęp 15 skutek, między innymi, utraty funkcjonalności mitochondrialnego aparatu genetycznego. Szczepy drożdży całkowicie pozbawione mtdna ( 0) są w stanie rosnąć na podłożu fermentowalnym, jedynie na podłożu niefermentowalnym ich wzrost będzie zahamowany. Stanowi to podstawę dla konstrukcji bardzo prostych testów wzrostowych umożliwiających zastosowanie metod genetyki klasycznej i molekularnej do badania funkcjonowania genomu mitochondrialnego i jego oddziaływań z genomem jądrowym. Ponadto genom mitochondrialny drożdży wykazuje zdolność do rekombinacji, ze stosunkowo wysoką częstością, co umożliwia zastosowanie metod genetyki klasycznej do analizy mutantów w mtdna, co nie jest możliwe w przypadku mitochondriów zwierzęcych. Ponieważ mutacje w genach jądrowych zaburzające funkcje mitochondrialną będą w większości miały podobny fenotyp, jak mutacje w DNA mitochondrialnym, ta sama strategia badawcza może być zastosowana do analizy oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. W połączeniu z możliwościami oferowanymi przez analizę funkcjonalną genomu drożdżowego otwiera się więc po raz pierwszy możliwość systematycznego zbadania zależności jądrowomitochondrialnych, w tym określenia zestawu genów jądrowych niezbędnych do utrzymania funkcji mitochondrialnej. Aktualne zbiorcze dane dotychczasowych prac tego typu można znaleźć dzięki projektowi bazy danych sekwencji mitochondrialnych (MitBASE) (Attimonelli i wsp., 1999), którego część stanowi baza genów jądrowych zaangażowanych w biogenezę mitochondrium (patrz też rozdział 4). Na podstawie zawartych tam danych można oszacować, że w proces ten zaangażowanych jest około 500 genów, z czego dla ponad 300 potwierdzono, lub sugeruje się mitochondrialną lokalizację ich produktu. Liczba ta, zgodna z wcześniejszymi oszacowaniami (Tzagoloff i Dieckmann, 1990), może być nieco zaniżona, gdyż niektóre geny zaangażowane w biogenezę mitochondrium nie mają wyraźnej sekwencji kierującej do tego organellum, wiele z nich jest niezbędnych do funkcjonowania komórki (a przez to mutacje w nich są letalne) a znacząca cześć genomu drożdży nie została jeszcze objęta analizą funkcjonalną. Można jednak przypuszczać, że dalsze postępy badań pozwolą na pełne określenie zestawu genów jądrowych zaangażowanych w funkcje mitochondrialne i przez to dadzą po raz pierwszy pełny obraz oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. Różnorodność organizacji i ekspresji genomów mitochondrialnych, zarysowana w poprzednim rozdziale, skłania do postawienia pytania, na ile informacje uzyskane w wyniku badań nad drożdżami mogą być przydatne w poszukiwaniach odpowiedzi na problemy dotyczące funkcjonowania mitochondriów innych organizmów, a zwłaszcza człowieka. Na pełną odpowiedź na to pytanie jest jeszcze stanowczo za wcześnie, zwłaszcza że wiedza na temat funkcjonowania mitochondriów ludzkich, a zwłaszcza zależności jądrowo-

16 Rozdział 1. Wstęp 16 mitochondrialnych jest wciąż bardzo fragmentaryczna. Dotychczasowe wyniki wykazują jednak, że drożdże są zadziwiająco dobrym modelem podstawowych funkcji komórki eukariotycznej, również w odniesieniu do komórek ludzkich. Porównanie sekwencji genów drożdżowych ze znanymi dotychczas genami człowieka (Botstein i wsp., 1997) wykazuje, że co najmniej 30% z nich wykazuje znaczącą homologię z genami ssaków. Podstawowe mechanizmy funkcjonowania komórki są na tyle podobne, że doświadczenia na drożdżach przyczyniły się nie tylko ich poznania na najprostszym poziomie, lecz również dostarczyły modeli pozwalających na badanie problemów tak szczególnych, jak niektóre wady genetyczne u ludzi (Botstein i wsp., 1997). Najbardziej spektakularnym przykładem może tu być pełniący podobne funkcje u drożdży i u człowieka gen SGS1 (WRN), kodujący helikazę DNA, którego mutacje powodują u ludzi występowanie zespołu Wernera, choroby o charakterze progerii (Watt i wsp., 1996; Gray i wsp., 1997). W przypadku będących tematem tej pracy oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych brak jest, jak na razie, podobnie spektakularnych przykładów użyteczności modelu drożdżowego. Badania nad drożdżami przyczyniły się jednak do ogólnego poznania mechanizmów funkcjonowania genów mitochondrialnych, z których większość ma swoje odpowiedniki w mtdna ludzkim. Badania nad mtdna drożdży doprowadziły do dokładnego poznania genów kodujących na przykład apocytochrom b (cytb), czy podjednostki oksydazy cytochromowej (cox1, cox2 i cox3). Produkty tych genów z mitochondriów ludzkich mają strukturę na tyle wyraźnie zachowaną, że możliwe jest, po odpowiednim uliniowaniu, ekstrapolowanie wyników analizy mutacyjnej genów drożdżowych na geny ludzkie, co może przyczynić się do zbadania mechanizmów prowadzących do powstania patologii związanych z mutacjami mtdna u człowieka. Mimo znacznych różnic w strukturze i ekspresji mtdna między drożdżami i człowiekiem, wiele podstawowych mechanizmów funkcjonuje podobnie, co zgodne jest z koncepcją monofiletycznego pochodzenia mitochondriów, nawet u odległych ewolucyjnie eukariontów. Przykładowo, funkcję podstawowego czynnika transkrypcyjnego u drożdży i u człowieka spełniają ortologiczne białka mtf1 (Clayton, 1992). Można oczekiwać, że wiele poznanych u drożdży mechanizmów ekspresji genomu mitochondrialnego znajdzie swe odpowiedniki w układzie komórek człowieka, co potwierdzi rolę, jaką ten organizm modelowy spełnia w badaniach nad funkcjonowaniem komórek eukariotycznych.

17 Rozdział 1. Wstęp Klasyczna analiza genomu mitochondrialnego drożdży i oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych Jak wspomniano powyżej, droga do poznania mitochondrialnego systemu genetycznego u drożdży rozpoczęła się od izolacji i analizy mutantów, których fenotyp sugeruje zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów. Podstawowe typy takich mutantów zostaną podsumowane poniżej. (rho-) zwane również petitami cytoplazmatycznymi ( cytoplasmic petites ). Są to najdłużej znane mutacje mitochondrialne (Ephrussi i wsp., 1949a;b; Dujon, 1983). Mutanty charakteryzują się niewydolnością oddechową na fermentowalnym źródle węgla takim, jak glukoza rosną wolniej niż dzikie szczepy i tworzą mniejsze kolonie stąd nazwa petite; nie są natomiast w stanie wykorzystywać niefermentowalnych źródeł węgla takich, jak glicerol, etanol czy mleczan. Na podstawie analizy mtdna tych mutantów stwierdzono, że wykazują one bardzo znaczne delecje dużych fragmentów DNA mitochondrialnego (Mounolou i wsp., 1966), powstałe spontanicznie bądź indukowane działaniem czynników interkalujących takich, jak bromek etydyny i akryflawiny (Slonimski i wsp., 1968). Delecje kompensowane są przez reiterację (powtórzenie) pozostającego fragmentu; tak zmieniony mtdna jest replikowany, mimo iż nie zawsze zawiera normalne miejsce startu replikacji (Faye i wsp., 1973; Fukuhara i wsp., 1974; Michaelis i wsp., 1976). W mitochondriach nie zachodzi oddychanie ani synteza białek mitochondrialnych (Slonimski i Ephrussi, 1949; Slonimski, 1953). 0 (rho0) to skrajny przypadek zmian typu odpowiadający całkowitej utracie mtdna. Efekt fenotypowy jest taki sam, jak w przypadku. Podobnie jak w poprzednim przypadku, mutacje 0 powstają spontanicznie lub w wyniku działania czynników interkalujących. Inaktywacja niektórych genów jądrowych może też prowadzić do powstawania komórek 0 (Myers i wsp., 1985). mit są to punktowe mutacje (lub niewielkie delecje) w mtdna, powodujące utratę aktywności produktów konkretnych genów mitochondrialnych. Liczne mutacje tego typu powodujące niewydolność oddechową zlokalizowano m. in. w genach mitochondrialnych kodujących elementy łańcucha oddechowego (Tzagoloff i wsp., 1975a,b,c; Slonimski i Tzagoloff, 1976; Kotylak i Slonimski, 1976, 1977). W mitochondriach mit zachodzi normalna synteza białek. Mutacje mit stanowią źródło informacji o funkcjonowaniu konkretnych genów mitochondrialnych (np. di Rago i wsp., 1990a,b,c), posłużyły

18 Rozdział 1. Wstęp 18 również przy konstrukcji mapy genetycznej genomu mitochondrialnego (Dujon i wsp., 1977). syn są to mutacje punktowe, zlokalizowane w genomie mitochondrialnym, których efektem jest zaburzenie syntezy białka w mitochondriach (Bolotin-Fukuhara i wsp., 1977). Dotyczą najczęściej genów trna, niektóre zlokalizowane są w genach rrna. antr te punktowe mutacje mitochondrialne nadają komórkom oporność na pewne antybiotyki hamujące funkcjonowanie mitochondriów (Dujon, 1981). Służą jako wygodne markery przy analizach genetycznych genomu mitochondrialnego. mim są to mutacje mitochondrialne będące supresorami defektów typu mit (Dujardin i wsp., 1980; Dujardin i wsp., 1982). pet zwane petitami jądrowymi ( nuclear petites ). Są to jądrowe mutacje powodujące niewydolność oddechową poprzez zaburzenie funkcjonowania mitochondriów. Od momentu ich odkrycia (Chen i wsp., 1950) otrzymano bardzo wiele tego typu mutantów należących do kilkuset grup komplementacji (Tzagoloff i Dieckmann, 1990). Defekty pet dotyczą zarówno struktury i metabolizmu mitochondriów, jak i ekspresji genów mitochondrialnych. jądrowe supresory defektów mitochondrialnych jest to bardzo zróżnicowana grupa mutacji, będących supresorami defektów typu mit lub syn. Mutacje takie nazwane zostały przez odkrywców NAM (Nuclear Accomodation of Mitochondria) (Dujardin i wsp., 1980), od tego czasu poznano bardzo wiele takich mutacji, których odkrywcy nie trzymają się jednolitej terminologii. Osobną grupę stanowią supresory wielokopiowe nadekspresja tych genów (poprzez wprowadzenie na plazmidzie wielokopiowym) prowadzi do supresji defektów mitochondrialnych (mit, syn ) lub jądrowych pet (Koll i wsp., 1987; Linder i Slonimski, 1989; Ben Asher i wsp., 1989). Dziedziczenie mutacji jądrowych opisanych powyżej nie różni się niczym od dziedziczenia innych genów drożdżowych i podlega prawom klasycznej genetyki. Dziedziczenie cech mitochondrialnych podlega natomiast odrębnym, specyficznym regułom (Bolotin i wsp., 1971). Diploid powstały w wyniku krzyżówki mitochondrialnej (np. antr x ants) posiada w cytoplazmie mieszaninę mitochondriów pochodzących od obu komórek rodzicielskich. Podziały mitotyczne takiej komórki będą, przez znaczną (niekiedy do kilkunastu) liczbę pokoleń dawały populacje mieszane. W trakcie tych podziałów zachodzi też rekombinacja między cząsteczkami DNA mitochondrialnego. Segregacja mitotyczna w fazie diploidalnej stanowi pierwszą zasadę dziedziczenia mitochondrialnego.

19 Rozdział 1. Wstęp 19 W wyniku licznych pasaży możliwe jest otrzymanie klonów jednorodnych pod względem genotypu mitochondrialnego. Mejoza w takim szczepie nigdy nie prowadzi do segregacji markerów mitochondrialnych genotyp mitochondrialny wszystkich spor jest taki sam jak wyjściowego diploida. Brak segregacji mejotycznej stanowi drugą zasadę dziedziczenia mitochondrialnego. Powyższe zasady stanowią o niemendlowskim charakterze dziedziczenia mitochondrialnego i odróżniają je od dziedziczenia jądrowego (Bolotin i wsp., 1971). Innym zjawiskiem typowym dla dziedziczenia pewnych cech mitochondrialnych jest polarność. W przypadku polarnej transmisji, zamiast normalnego, statystycznego (1:1) rozdziału cech rodzicielskich między potomstwo obserwuje się bardzo znaczną (do 95%) przewagę jednego z genotypów nad drugim. Zjawisko to zaobserwowano dla niektórych markerów antr (CR i ER), czynnik odpowiadający za polarność ich przekazywania nazwano 1 (Bolotin i wsp., 1971). Krzyżówka 1+ x 1- daje w wyniku prawie wyłącznie potomstwo 1+ wraz z kotransmisją markerów C i E. Późniejsze badania wykazały (Dujon, 1980), że ów czynnik 1 tożsamy jest z intronem w genie kodującym 21S rrna. Transpozycja tego intronu, przebiegająca za pośrednictwem kodowanego przezeń białka i pociągająca za sobą konwersję flankujących sekwencji stanowi podstawę molekularną zjawiska polarności (Colleaux i wsp., 1986; Macreadie i wsp., 1985) Struktura i funkcjonowanie mtdna S. cerevisiae zarys Genom mitochondrialny Saccharomyces cerevisiae jest dwuniciową, kolistą cząsteczką DNA o długości wynoszącej, zależnie od szczepu 74 do 85kb. Różnice między szczepami związane są głównie z fakultatywnym charakterem intronów, w mniejszym stopniu również z polimorfizmem obszarów międzygenowych. Genom mitochondrialny S. cerevisiae zawiera kilkadziesiąt genów, opisanych w skrócie poniżej Geny kodujące produkty białkowe W mtdna S. cerevisiae znajduje się 8 (w niektórych szczepach 9) genów kodujących białka. Nie wliczono tu produktów wewnątrzintronowych ramek odczytu, które omówione zostaną osobno. Geny te to: cytb koduje apocytochrom b, gen ten znajduje się w mtdna wszystkich eukariontów, kodowane przezeń białko jest stosunkowo silnie konserwowane ewolucyjnie. U S., cerevisiae gen ten zawiera introny: dwa w szczepie krótkim, pięć w szczepie długim (Lazowska i wsp., 1980; Nobrega i Tzagoloff, 1980; Bonitz i wsp., 1982).

20 Rozdział 1. Wstęp 20 cox1 koduje pierwszą podjednostkę oksydazy cytochromowej (cały enzym ma 9 podjednostek, patrz Hatefi, 1985). Również ten gen u wszystkich znanych eukariontów znajduje się w mtdna. U S. cerevisiae gen ten posiada od 5 do 7 intronów (Bonitz i wsp., 1980; Hensgens i wsp., 1983). cox2 koduje drugą podjednostkę oksydazy cytochromowej (Coruzzi i wsp., 1981). U większości eukariontów jest to gen mitochondrialny, znane wyjątki to Chlamydomonas reinhardtii i Plasmodium falciparum (Leblanc i wsp., 1997). cox3 koduje trzecią podjednostkę oksydazy cytochromowej (Thalenfeld i Tzagoloff, 1980). U większości eukariontów jest to gen mitochondrialny, znane wyjątki to Chlamydomonas reinhardtii i Paramecium aurelia (Leblanc i wsp., 1997). atp6 koduje szóstą podjednostkę kompleksu ATPazy (ATP syntetazy) mitochondrialnej o masie 20 kd (Hensgens i wsp., 1979). Gen ten występuje w mtdna zwierząt, roślin i grzybów, poza genomem mitochondrialnym znajduje się u niektórych Protista (Leblanc i wsp., 1997). atp8 koduje ósmą podjednostkę kompleksu ATPazy (ATP syntetazy) mitochondrialnej o masie 10 kd (Macreadie i wsp., 1983). Gen ten występuje w mtdna zwierząt (z wyjątkiem nicieni) i grzybów, poza genomem mitochondrialnym znajduje się u roślin, glonów i niektórych Protista (Leblanc i wsp., 1997). atp9 koduje podjednostkę 9 ATPazy mitochondrialnej o masie 7.6 kd (Macino i Tzagoloff, 1979). Występowanie genu atp9 w mtdna jest typowe dla grzybów, roślin i wielu Protista, poza mtdna występuje on natomiast u zwierząt. var1 Bardzo nietypowy gen, kodujący białko wchodzące w skład mitorybosomu (Terpstra i Butow, 1979). Występuje w nim szereg nieintronowych elementów opcjonalnych, co powoduje znaczną zmienność kodowanego produktu (Hudspeth i wsp., 1984). Białko var1 nie ma odpowiednika wśród innych białek rybosomalnych, a jego występowanie ograniczone jest do mitochondriów niektórych grzybów. ens2 gen, kodujący podjednostkę heterodimerycznej endonukleazy mitochondrialnej Endo-SceI uczestniczącej w rekombinacji mtdna (Nakagawa i wsp., 1991, 1992). Druga podjednostka Endo-SceI (ENS1) jest kodowana przez genom jądrowy i należy do rodziny białek szoku cieplnego o masie około 70 kd (Morishima i wsp., 1990). W niektórych szczepach ta opcjonalna ramka odczytu jest nieaktywna w wyniku nagromadzenia mutacji. Stanowi to ewidentny przykład działania zapadki Mullera (patrz poprzednie rozdziały), prowadzącej do degeneracji genów mitochondrialnych, nie będących niezbędnymi do życia. Warto zauważyć, że jest to sytuacja analogiczna z

21 Rozdział 1. Wstęp 21 opisaną przez (Andersson i wsp., 1998) dla genu metk Rickettsia prowazekii. W mtdna S. cerevisiae występują dwa inne nieaktywne już geny tego typu, oznaczane jako RF1 i RF2, stanowiące efekt działania tego samego procesu ewolucji reduktywnej Geny kodujące mitochondrialne RNA W mitochondriach S. cerevisiae znajduje się 25 genów trna, wystarczających dla zapewnienia translacji wszystkich genów mitochondrialnych. Oprócz tego, podobnie jak u wszystkich Eukaryota, w mtdna drożdży znajdują się dwa geny rrna (LSU i SSU rrna). gen LSU-rRNA zawiera jeden intron (Dujon, 1980), co jest typową cechą tego genu u grzybów. Dodatkowo w mtdna S. cerevisiae znajduje się gen kodujący rybozym RNazy P, enzymu odpowiadającego za obróbkę trna (Guerrier-Takada i wsp., 1983). Gen taki występuje w mitochondriach bardzo rzadko, poza drożdżami z rodzaju Saccharomyces i niektórymi innymi grzybami (np. Aspergillus nidulans) został stwierdzony jedynie w najbardziej pierwotnym znanym genomie mitochondrialnym pierwotniaka Reclinomonas americana (Lang i wsp., 1997) Introny i geny intronowe Występowanie intronów stwierdzono w mtdna wszystkich praktycznie grup Eukaryota. U Metazoa występowanie intronów ograniczone jest do jedynego znanego przypadku (ukwiał M. senile), we wszystkich pozostałych liniach ewolucyjnych geny mitochondrialne zawierają różne ilości intronów. Zawartość intronów może podlegać dużym wahaniom, nawet pomiędzy blisko ze sobą spokrewnionymi gatunkami (por. rozdział 2.3), co sugeruje, że są one w ewolucji elementami ruchomymi, z możliwością poziomego transferu międzygatunkowego. Biologia intronów mitochondrialnych została najlepiej zbadana u drożdży, zwłaszcza u S. cerevisiae. Różne szczepy tego gatunku zawierają do 13 intronów w trzech genach mitochondrialnych. Introny mitochondrialne różnią się strukturą i mechanizmem obróbki od intronów spotykanych w genach jądrowych Eukaryota. Na podstawie struktury i mechanizmu obróbki wyróżniono (Michel i wsp., 1982) dwie główne grupy grupę I i II. U S. cerevisiae stwierdzono w mitochondriach 9 intronów grupy I i 4 grupy II. Niektóre spośród intronów mitochondrialnych (obu grup) wykazują zdolność do samowycinania in vitro, wydaje się jednak, że in vivo w procesie tym biorą udział różne białka. Niezwykłą cechą niektórych intronów mitochondrialnych jest występowanie w nich otwartych ramek odczytu, których produkty pełnią istotne funkcje w biologii tych intronów.

22 Rozdział 1. Wstęp 22 Produkty genów wewnątrzintronowych u S. cerevisiae można zaliczyć do następujących grup: maturazy są to białka niezbędne do prawidłowego wycinania odpowiednich intronów. Ramki odczytu maturaz są połączone w fazie z poprzedzającymi je egzonami, powstające białko odpowiada za wycięcie intronu, co umożliwia translację kolejnego egzonu. Dojrzewanie mrna zawierającego takie introny ma zatem charakter kaskadowy, aktywność każdej maturazy jest niezbędna dla zapewnienia prawidłowej obróbki leżących poniżej, w kierunku 3 intronów. Typowymi maturazami są produkty ORF intronów cytb bi2 (Jacq i wsp., 1980; Lazowska i wsp., 1980), bi3 (Lazowska i wsp., 1989) i bi4 (De La Salle i wsp., 1982; Labouesse i wsp., 1984). Maturaza bi4 zapewnia również wycinanie intronu ai4 w genie cox1 (Labouesse i wsp., 1984). Produkt ORF ai4 nie posiada aktywności maturazy, może ją jednak odzyskać w wyniku pojedynczej mutacji (Dujardin i wsp., 1982). Aktywność maturazy wykazują również produkty ORF intronów cox1 ai1 i ai2 (Carignani i wsp., 1983, 1986), różnią się one jednak od typowych maturaz intronów cytb tym, że posiadają oprócz tego aktywność odwrotnej transkryptazy (Kennell i wsp., 1993) nadającej im mobilność (Lazowska i wsp., 1994). endonukleazy są to białka wykazujące aktywność specyficznych względem sekwencji endonukleaz DNA. Ich aktywność promuje rekombinację, nadająca intronom mobilność, czyli zdolność do aktywnej konwersji allelu pozbawionego intronu (Dujon i wsp., 1986). Aktywność taką mają produkty intronów: w genie LSU rrna (Macreadie i wsp., 1985; Colleaux i wsp., 1986), oraz ai3 (Perea i wsp., 1993; Sargueil i wsp., 1991), ai4 (Delahodde i wsp., 1989; Wenzlau i wsp., 1989) i ai5 (Moran i wsp., 1992) w genie cox1. U blisko spokrewnionego z S. cerevisiae gatunku S. capensis produkt ORF intronu bi2 cytb posiada zarówno aktywność maturazy (podobnie jak jego odpowiednik z S. cerevisiae) jak i endonukleazy (Szczepanek i Lazowska, 1996; Szczepanek i wsp., 1994). Zamiana zaledwie dwóch kodonów wystarczy, aby produkt ORF bi2 S. cerevisiae odzyskał aktywność endonukleazy (Szczepanek i Lazowska, 1996). Przedstawiony powyżej podział nie uwzględnia faktu, że niektóre białka intronowe mogą łączyć dwie aktywności. Poza intronami ai1 i ai2 (maturaza/odwrotna transkryptaza) przykładem może być też intron bi2 S. capensis (maturaza/endonukleaza). W biologii genów intronowych rodzaju Saccharomyces, podobnie jak w przypadku omówionego powyżej genu ens2, widać wyraźnie efekty działania degeneracyjnej ewolucji wywołanej przez mechanizm zapadki Mullera. Produkt ORF intronu ai4 utracił aktywność