Andrzej Tokarz, Barbara Bobrowska, Grzegorz Grynkiewicz 1), Magdalena Matysiak

Transkrypt

1 BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XL, 2007, 2, str Andrzej Tokarz, Barbara Bobrowska, Grzegorz Grynkiewicz 1), Magdalena Matysiak WPŁYW WYBRANYCH POLIFENOLI NA PROCES UTLENIANIA BIAŁEK W WA TROBACH SZCZURÓW Z NOWOTWORAMI INDUKOWANYMI DMBA Katedra i Zakład Bromatologii Akademia Medyczna w Warszawie Kierownik Zakładu: prof. ndzw. dr hab. A. Tokarz 1) Instytut Farmaceutyczny w Warszawie Kierownik: doc. dr. W. Szelejewski W pracy określono zależność między stosowana dieta, zróżnicowana pod względem zawartości polifenoli (ich dawki i rozpuszczalnika, w którym zwia zki były podawane), a procesem peroksydacji białek. Stosownym biowskaźnikiem oksydacyjnych uszkodzeń białek były grupy karbonylowe aminokwasów. W badaniach określono stopień powstawania zwia zków karbonylowych jako skutek równoczesnego działania czynnika kancerogennego 9,10-dimetylobenzantracenu (DMBA). W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że obecność zwia zków polifenolowych w diecie może decydować o intensywności przebiegu procesów oksydacyjnych w organizmie. Hasła kluczowe: grupy karbonylowe, polifenole, DMBA. Key words: Protein carbonyl, polyphenols, DMBA. W wyniku działania reaktywnych form tlenu z elementami komórkowymi może dochodzić do zmian w strukturze białek, lipidów, cukrów czy kwasów nukleinowych (1, 2, 3). Oksydacyjne uszkodzenia białek, polegające na modyfikacji reszt aminokwasowych, grup prostetycznych, agregacji lub fragmentacji cząsteczki, prowadzą zazwyczaj do utraty ich aktywności biologicznej. Z uwagi na liczne ważne funkcje pełnione przez białka (min. katalityczne, strukturalne, ochronne, regulatorowe, transportowe) wszelkie modyfikacje, którym one podlegają, w konsekwencji mogą stać się niebezpieczne dla organizmu i być przyczyną wielu groźnych chorób, takich jak choroby neurodegeneracyjne, nowotwory. Z tego względu ważne jest poszukiwanie czynników, które mogłyby zapobiegać lub zmniejszać stopień uszkodzeń wywołanych przez reaktywne formy tlenu (RFT) (1, 2, 3). Taką rolę potencjalnie mogą spełniać przeciwutleniacze, a wśród nich związki polifenolowe. Istnieją dowody potwierdzające ich zdolność do zmiatania wolnych rodników, tworzenia kompleksów z jonami metali katalizującymi powstawanie wolnych rodników, a także do hamowania niektórych enzymów uczestniczących w procesach oksydacyjnych. Jednak kierunek działania związków polifenolowych jest złożony i zależy od wielu czynników środowiskowych, od stanu organizmu, dawki i czasu stosowania tych związków (4, 5, 6).

2 188 A. Tokarz i inni Nr 2 Celem podjętych badań było określenie zależności między stosowaną dietą, zróżnicowaną pod względem zawartości polifenoli (ich dawki i rozpuszczalnika, w którym związki były podawane), a procesem peroksydacji białek. Stosownym biowskaźnikiem oksydacyjnych uszkodzeń białek były grupy karbonylowe aminokwasów. W badaniach określono stopień powstawania związków karbonylowych jako skutek równoczesnego działania czynnika kancerogennego 9,10-dimetylobenzantracenu (DMBA). MATERIAŁ I METODYKA W badaniach wykorzystano samice szczurów rasy Sprague-Dawley (o ciężarze ok. 200 g). Zwierzęta pochodziły z Pracowni Zwierząt Laboratoryjnych Katedry i Zakładu Patologii Ogólnej i Doświadczalnej Akademii Medycznej w Warszawie. Badania uzyskały aprobatę Komisji Etycznej przy Akademii Medycznej w Warszawie. Szczury miały zapewniony ciągły dostęp do wody i paszy. Ryc. 1. Produkty oksydacyjnej modyfikacji lizyny, argininy, proliny i histydyny (1). Fig. 1. The structure of carbonyl derivatives produced by oxidation of lysine, arginine, proline and histidine (1).

3 Nr 2 Wpływ polifenoli na proces utleniania białek 189 Zwierzęta podzielono na dwie grupy badawcze: Grupa I grupa badana szczury, którym podawano 9,10-dimetylo-1,2-benzantracen (DMBA) w dawce 80 mg/kg masy ciała w celu wywołania nowotworów sutka. Grupa II grupa kontrolna szczury, które przebywały w identycznych warunkach jak zwierzęta z grupy badanej i którym nie podawano DMBA. Zwierzęta w obu grupach badawczych otrzymywały diety zróżnicowane pod względem rodzaju i dawki związków polifenolowych (resweratrol, kwercetyna, genisteina) oraz rodzaju rozpuszczalnika, w którym je podawano (układ wodny i olej rzepakowy). Powyższe diety podawano zwierzętom od 40 dnia do 20 tygodnia życia. Materiał do badań stanowiły wątroby pobrane po dekapitacji szczurów w 20 tyg. życia. Zebrane wątroby przechowywano w temp. 70 C do czasu wykonywania analiz. Metoda zastosowana w omawianej pracy wykorzystuje fakt, że niektóre RFT atakują aminokwasy w białkach (szczególnie histydynę, argininę, lizynę i prolinę), utleniając je z wytworzeniem grup karbonylowych (ryc. 1). Grupy te reagując z 2,4-dinitrofenylohydrazyną tworzą 2,4-dinitrofenylohydrazony, które następnie oznaczane są spektrofotometrycznie, przy dł. fali 370 nm (7, 8). W celu uzyskania odpowiedzi na pytanie, w jakim stopniu białko uległo peroksydacji, stężenie związków karbonylowych przeliczano na mg białka (9). Otrzymane wyniki poddano weryfikacji statystycznej z zastosowaniem testu t-studenta (10). WYNIKI Porównanie zawartości grup karbonylowych aminokwasów w wątrobach szczurów traktowanych i nietraktowanych DMBA, otrzymujących resweratrol, kwercetynę lub genisteinę w zawiesinie olejowej (ryc. 2) pozwala stwierdzić, że stężenia oznaczanych biowskaźników w grupie kontrolnej i badanej są zbliżone we wszystkich przypadkach. Dla żadnego z zastosowanych polifenoli nie uzyskano różnic istotnych statystycznie. Podobnie w przypadku podawania wybranych polifenoli w zawiesinie wodnej, zawartości grup karbonylowych aminokwasów w wątrobach były podobne u zwierząt otrzymujących, Ryc. 2. Wpływ DMBA i wybranych polifenoli (resweratrolu, kwercetyny i genisteiny), podawanych zwierzętom w zawiesinie olejowej, na zawartość grup karbonylowych aminokwasów (nmol/mg białka). Fig. 2. Effect of DMBA and selected polyphenols (resveratrol, quercetin, genistein,) administered to animals in aqueous or oil suspension on aminoacid carbonyl group content (nmol/mg protein).

4 190 A. Tokarz i inni Nr 2 Ryc. 3. Wpływ wybranych polifenoli (resweratrolu, kwercetyny i genisteiny) podawanych w zawiesinie wodnej na zawartość grup karbonylowych aminokwasów (nmol/mg) białka] u zwierząt traktowanych i nietraktowanych DMBA. Fig. 3. Effect of selected polyphenols (resveratrol, quercetin, genistein) administered in aqueous suspension on aminoacid carbonyl group content (nmol/mg protein) in animals treated and non-treated with DMBA. bądź nie DMBA (ryc. 3). Natomiast w przypadku stosowania diet bez dodatku związków polifenolowych różnice między grupą kontrolną, a badaną są wyraźne. Przeprowadzone badania wykazały, że w wątrobach szczurów karmionych dietą standardową, bądź wzbogaconą w sam olej rzepakowy, zawartość grup karbonylowych aminokwasów jest znacznie wyższa w grupie otrzymującej DMBA w porównaniu do grupy kontrolnej (DMBA ) (ryc. 2 i 3). Uzyskano istotną statystycznie różnicę (przy α = 0,05). Stwierdzono, że zawartość utlenionych form białek w wątrobach szczurów karmionych dietami wzbogaconymi w polifenole zmieniła się w stosunku do zwierząt, którym nie podawano tych związków. Wszystkie zastosowane związki polifenolowe wykazywały taką samą tendencję działania. W przypadku szczurów traktowanych DMBA i związkami polifenolowymi następowało obniżenie stężenia grup karbonylowych aminokwasów, w porównaniu do grupy pozbawionej wsparcia ze strony polifenoli. Takie działanie polifenoli zaobserwowano zarówno przy podaniu ich w zawiesinie wodnej, jak i zawiesinie olejowej. Istotne statystycznie różnice (przy α = 0,05) wystąpiły dla wszystkich polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej, względem danych dotyczących diety standardowej (ryc. 3). Przy podaniu polifenoli w zawiesinie olejowej istotne statystycznie różnice (przy α = 0,05) uzyskano tylko w przypadku kwercetyny (ryc. 2). W pozostałych dietach spadek zawartości grup karbonylowych białek był wyraźny, lecz nie istotny statystycznie. U zwierząt, nie otrzymujących DMBA, podawanie polifenoli w diecie prowadziło do podwyższenia zawartości grup karbonylowych aminokwasów w wątrobie. Istotne statystycznie różnice (przy α = 0,05) wystąpiły dla wszystkich polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej. Natomiast przy podaniu ich w zawiesinie olejowej istotne statystycznie różnice uzyskano tylko dla resweratrolu i genisteiny (przy α = 0,1). W badaniach starano się również uzyskać odpowiedź, czy dawka danego związku polifenolowego wpływa na siłę jego działania. W tym celu porównano zawartość grup karbonylowych w wątrobie szczurów otrzymujących genisteinę w zawiesinie wodnej w dawce 0,375 mg/cm 3 lub 0,1 mg/cm 3. Nie stwierdzono istotnych różnic w zawartościach grup karbonylowych (ryc. 3). Mimo zastosowania ponad 3-krotnie wyższej dawki, skuteczność działania przeciwutleniającego genisteiny nie zwiększyła się, nie zmieniła się także siła niepożądanego działania prooksydacyjnego.

5 Nr 2 Wpływ polifenoli na proces utleniania białek 191 Ryc. 4. Wpływ wybranych polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej i olejowej na zawartość grup karbonylowych aminokwasów u zwierząt nietraktowanych DMBA. Fig. 4. Effect of selected polyphenols administered in aqueous or oil suspension on aminoacid carbonyl group content (nmol/mg protein) in animals non-treated with DMBA. Ryc. 5. Wpływ wybranych polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej i olejowej na zawartość grup karbonylowych aminokwasów u zwierząt traktowanych DMBA. Fig. 5. Effect of selected polyphenols administered in aqueous or oil suspension on aminoacid carbonyl group content (nmol/mg protein) in animals treated with DMBA.

6 192 A. Tokarz i inni Nr 2 Ponadto otrzymane wyniki wyraźnie wskazują, że stężenie grup karbonylowych aminokwasów w wątrobach szczurów karmionych dietami wzbogaconymi w zawiesiny olejowe polifenoli, jest znacznie wyższe niż w przypadku podawania ich w zawiesinach wodnych (ryc. 4 i 5). Przy czym różnice w zawartości analizowanych biowskaźników jakie wystąpiły między tymi grupami (wodne i olejowe) były istotne statystycznie (przy α = 0,05) dla wszystkich badanych polifenoli, zarówno w przypadku zwierząt otrzymujących, jak i nie otrzymujących DMBA. Można zatem wnioskować, że podwyższona zawartość tłuszczów w diecie jest czynnikiem stymulującym peroksydację białek. DYSKUSJA W ostatnich latach przybywa badań, potwierdzających występowanie podwyższonego poziomu grup karbonylowych aminokwasów w wielu stanach patologicznych. Zwiększona zawartość tak zmodyfikowanych oksydacyjnie białek może być przyczyną choroby lub pojawiać się w konsekwencji rozwoju danego schorzenia. Obecnie, do chorób związanych w różny sposób z obecnością grup karbonylowch aminokwasów, zalicza się: chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona, cukrzycę, miażdżycę, reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe choroby płuc, dysplazję oskrzelowo-płucą, przewlekłą niewydolność nerek, mocznicę, łuszczycę, zaćmę, sepsę, stwardnienie zanikowe boczne, zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, mukowiscydozę, nowotwory (11, 12, 13, 14). Na uwagę zasługuje również fakt istnienia zależności między procesem starzenia (naturalnego i w zespołach przedwczesnego starzenia), a zawartością grup karbonylowych (15). Wzrost stężenia białkowych pochodnych karbonylowych związanych z wiekiem wykryto m.in. w nerkach i wątrobie szczurów, w mózgu ludzi, w ludzkich czerwonych krwinkach, mięśniach, fibroblastach (16). Związki karbonylowe mogą być biomarkerami w takich chorobach jak progeria Hutchinsona-Gilforda i zespół Wernera (zespoły przedwczesnego starzenia się) (1). Obecność związków polifenolowych w diecie może decydować o intensywności przebiegu procesów oksydacyjnych w organizmie. Świadczą o tym m.in. nasze badania, w których stwierdziliśmy, że polifenole (resweratrol, genisteina i kwercetyna) hamują powstawanie oksydowanych białek stymulowane działaniem kancerogenu (7,8-dimetylobenzantracenu), zaś przy jego braku następowało nasilenie powstawania uszkodzeń oksydacyjnych. Spostrzeżenia te potwierdzają wyniki prac innych autorów, nie mniej jednak istnieją też doniesienia przedstawiające odmienne dane. I tak np. Misra i współpr. (17), podając napar z czarnej herbaty (20 g/dm 3 )świnkom morskim eksponowanym na działanie dymu papierosowego (5 papierosów na świnkę na dzień) wykazali również protekcyjne działanie polifenoli i obniżenie zawartości grup karbonylowych białek w płucach, wątrobie i sercu badanych zwierząt w stosunku do grupy kontrolnej, która zamiast naparu herbaty otrzymywała wodę. Young i współpr. (18) badając wpływ soku z czarnej porzeczki i soku jabłkowego (w ilościach odpowiadających 4,8; 6,4; 9,6 mg kwercetyny/dzień) podawanych zdrowym pacjentom przez tydzień stwierdzili podwyższenie stężenia 2-aminoadipilosemialdehydu w osoczu (produktu oksydacyjnych uszkodzeń lizyny) i brak wpływu na zawartość glutamylosemialdehydu (pochodna argininy) u badanych osób. Autorzy tej pracy tłumaczą jednak uzyskane wyniki prooksydacyjnego działania możliwością wpływu innych składników zawartych w wyżej wymienionych sokach, a nie wyłącznie obecnością kwercetyny. Wzrost zawartości karbonylowanych grup aminokwasów u zwierząt nie traktowanych DMBA może być związany między innymi z samym metabolizmem polifenoli i ich wpływem na układ cytochromów w wątrobie, jednak potwierdzenie tej tezy wymaga dalszych badań (19). Natomiast Young i współpr. (20) podając przez 7 dni ekstrakt z pestek winogron (210 cm 3 zawiera 31,3 mg polifenoli i katechiny) nie stwierdzili zmian w zawartości 2-aminoadipilosemialdehydu w albuminach osocza osób badanych. Podobnie brak efektu na stężenie tego samego biomarkera stwierdzono u osób, które otrzymywały dietę wzbogaconą w pietruszkę dostarczającą 3,73-4,49 mg apigeniny przez 7 dni (21). Z badań Funabiki i współpr. (22) wynika, że podawanie zwierzętom (szczurom) diety wzbogaconej w 2,5% wodny roztwór pochodnej rutyny (G-rutyny) przez 18 dni zmniejsza zawartość grup karbonylowych. W innej pracy osoby otrzymywały sok winogronowy w ilości 10 cm 3 /kg/dzień przez 2 tyg. (23). U osób badanych stwierdzono obniżenie zawartości białkowych grup karbonylowych w osoczu. Działanie przeciwutleniaczy powinno prowadzić do obniżenia zawartości biowskaźników, tymczasem podane przykłady badań pokazują jak nie jednoznaczne są uzyskane wyniki, co można tłumaczyć bardzo

7 Nr 2 Wpływ polifenoli na proces utleniania białek 193 skomplikowanymi mechanizmami zachodzącymi w organizmie, ale również być może nie doskonałością metod analitycznych stosowanych w prowadzonych analizach. Następnym poruszanym w pracy zagadnieniem jest fakt, że skuteczność działania antyoksydacyjnego danego przeciwutleniacza pozostaje w ścisłym związku z jego biodostępnością, którą określa między innymi środowisko rozpuszczalnika. W ciągu ostatnich lat pojawiło się wiele doniesień o wynikach badań nad absorbcją, biodystrybucją, metabolizmem i wydalaniem polifenoli, prowadzonych w warunkach in vitro i in vivo (24, 25). Szybkość i wydajność wchłaniania jelitowego, a także charakter powstających metabolitów w dużej mierze uzależniony jest od chemicznej struktury i masy cząsteczkowej związku. Faktem jest, że aglikony flawonoidowe źle rozpuszczają się w wodzie. Azuma i współpr. wykazali, że mieszanina lipidów i emulgatorów może zwiększać absorbcję aglikonów kwercetyny u szczurów (26). Wyniki przedstawione w pracy ukazują, że w tym przypadku, przy takim modelu badawczym kierunek działania związków polifenolowych podawanych w zawiesinie wodnej, bądź olejowej pozostawał taki sam, jednak dodatek oleju rzepakowego powodował wzrost zawartości białkowych grup karbonylowych w wątrobach szczurów. We wcześniej prowadzonych badaniach stwierdzono również taką tendencje dla oliwy i oleju słonecznikowego (27). Tłuszcze zawarte w diecie wykazują działanie synergistyczne z czynnikiem kancerogennym (DMBA) stymulując tworzenie się grup karbonylowych aminokwasów. WNIOSKI 1. Obecność związków polifenolowych w diecie może decydować o intensywności przebiegu procesów oksydacyjnych w organizmie. 2. Polifenole (resweratrol, genisteina, kwercetyna) hamują powstawanie zoksydowanych białek stymulowane działaniem kancerogenu DMBA, zaś przy jego braku następuje nasilenie powstawania uszkodzeń oksydacyjnych. 3. Tłuszcze zawarte w diecie wykazują działanie synergistyczne z czynnikiem kancerogennym (DMBA), stymulując tworzenie się grup karbonylowych aminokwasów. A. Tokarz, B. Bobrowska, G. Grynkiewicz, M. Matysiak THE INFLUENCE OF POLYPHENOLS UPON PROTEIN OXIDATION IN THE LIVER OF RATS WITH DMBA-INDUCED BREATS CANCERS Summary The aim of the present study was to assess the effect of diets with various content of polyphenols (polyphenol dose and solvent type) upon protein peroxidation. Aminoacid carboxyl groups were used as the biomarkers of the protein oxidative damage. The formation of carbonyl compounds was assessed as an effect of the simultaneous activity of a carcinogen, 9,10-dimethylbenzene anthracene (DMBA). Livers of 20-week Spraque-Dawley female rats killed by decapitation were used as the test material. Our results demonstrate that the polyphenol compounds in the diet may critically affect the intensity of the oxidative processes taking place in the system. The polyphenols (genistein, quercetin, resveratrol) acted to inhibit DMBA-induced formation of oxidated proteins; on the other hand, when DMBA was not present, the process of carbonyl group formation was more intense. The fats contained in the diet show a synergistic effect with the DMBA carcinogen to stimulate the process of aminoacid oxidation.

8 194 A. Tokarz i inni Nr 2 PIŚMIENNICTWO 1. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. PWN, Warszawa, Stadtman E.R., Levine R.L.: Protein oxidation. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2000; 899: Griffiths H.R., Møller L., Bartosz G. i współpr.: Biomarkers. Mol. Aspects Med., 2002; 23: Rietjens I.M.C.M., Boersma M.G., de Haan L., Spenkelink B., Awad H.M., Cnubben N.H.P., van Zanden J.J., van der Woude H., Alink G.M., Koeman J.H.: The pro-oxidant chemistry of the natural antioxidants vitamin C, vitamin E, carotenoids and flavonoids. Enviro. Toxicol. Phar., 2002; 11: Heim K.E., Tagliaferro A.R., Bobilya D.J.: Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem., 2002; 13: Soobrattee M.A., Neergheen V.S., Luximon-Ramma A., Aruoma O.I., Bahorun T.: Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: Mechanism and actions. Mutat. Res., 2005; 579: Reznick A.Z., Packer L.: Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay. Method Enzymol., 1994; 233: Evans P., Lyras L., Halliwell B.: Measurment of protein carbonyls in human brain tissue. Method Enzymol., 1999; 300: Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951; 193: Platt C.: Problemy rachunku prawdopodobieństwa i statystyki matematycznej, PWN, Warszawa, Dalle-Donne I., Giustarini D., Colombo R., Rossi R., Milzani A.: Protein carbonylation in human diseases. Trends Mol. Med., 2003; 9: Beal M.F.: Oxidatively modified proteins in aging and disease. Free Rad. Biol. Med., 2002; 32(9): Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D., Milzani A., Colombo R.: Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim. Acta, 2003; 329: Yilmaz I.A., Akcay T., Cakatay U., Telci A., Ataus S., Yalcin V.: Relation between bladder cancer and protein oxidation. Int. Urol. Nephrol., 2003; 35(3): Levine R.L., Stadtman E.R.: Oxidative modification of proteins during aging. Exp. Gerontol., 2001; 36: Berlett B.S., Stadtman E.R.: Protein oxidation in aging, disease and oxidative stress. J. Biol. Chem., 1997; 272: Misra A., Chattopapadhyay R., Banerjee S., Chattopapadhyay J., Chatterjee I.B.: Black tea prevents cigarette smoke-induced oxidative damage of proteins in guinea pigs. J. Nutr., 2003; 133: Young J.F., Nielsen S.E., Haraldsdóttir J., Daneshvar B., Lauridsen S.T., Knuthsen P., Crozier A., Sandström B., Dragsted L.O.: Effect of fruit juice intake on urinary quercetin excretion and biomarkers of antioxidative status. Am. J. Clin. Nutr., 1999; 69: Malińska D., Kiersztan A.: Flawonoidy charakterystyka i znaczenie w terapii. Postępy Biochemii, 2004; 50(2): Young J.F., Dragsted L.O., Daneshvar B., Lauridsen S.T., Hansen M., Sandstrom B.: The effect of grape-skin extract on oxidative status. Br. J. Nutr., 2000; 84(4): Nielsen S.E., Young J.F., Daneshvar B., Laurindsen S.T., Knuthsen P., Sandstrom B., Dragsted L.O.: Effect of parsley (Petroselinum crispum) intake on urinary apigenin excretion, blood antioxidant enzymes and biomarkers of oxidative stress in human subjects. Br. J. Nutr, 1999; 81(6): Funabiki R., Takeshita K., Miura Y., Shibasato M., Nagasawa T.: Dietary supplement of G-rutin reduces oxidative damage in the rodent model. J. Agric. Food. Chem., 1999; 47(3): O Byrne D.J., Devaraj S., Grundy S.M., Jialal I.: Comparison of the antioxidant effects of Concord grape juice flavonoids alpha-tocopherol on markers of oxidative stress in healthy adults. Am. J. Clin. Nutr, 2002; 76(6): Tyszka-Czochara M., Knapik-Czajka M., Goździalska A., Francik R., Jaśkiewicz J.: Polifenole w diecie. Wybrane aspekty metabolizmu i biodostępności związków polifenolowych. Farmacja Polska, 2003; 59(13): Birt D.F., Hendrich S., Wang W.: Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids. Pharmacol Therapeut, 2001; 90: Murota K., Terao J.: Antioxidative flavonoid quercetin: implication of its intestinal absorbtion and metabolism. Arch. Biochem. Biophys., 2003; 417: Tokarz A., Sadurska B., Bobrowska B.: Wpływ tłuszczów roślinnych na zawartość grup karbonylowych białek w wątrobie szczurów. Bromat. Chem. Toksykol., 2006; Adres: Warszawa, ul. Banacha 1.