Zestawy i odczynniki do barwienia metod¹ Grama

Transkrypt

1 Zestawy i odczynniki do barwienia metod¹ Grama JAA 2008/06 Polski Gram Stain Kit 1 Nr kat Gram Crystal Violet Do ró nicowego barwienia bakterii. Gram Iodine (Stabilizowany) Gram Stain Kit Gram Crystal Violet Do ró nicowego barwienia bakterii. Gram Iodine (Niestabilizowany) Gram Crystal Violet Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L Gram Iodine (Stabilizowany) Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L Gram Iodine (Niestabilizowany) Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L Gram Basic Fuchsin Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L PRZEZNACZENIE Zestaw i odczynniki do barwienia metod¹ Grama stosowane s¹ do barwienia drobnoustrojów z hodowli i próbek za pomoc¹ ró nicowej metody Grama. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIA Barwienie metod¹ Grama zosta³o wynalezione w roku 1884 przez Christiana Grama podczas prób ró nicowania komórek bakteryjnych z zaka onych tkanek. Pomimo e Gram zaobserwowa³ to, co obecnie nazywane jest reakcj¹ Grama, nie dostrzeg³ taksonomicznej wartoœci tej techniki. Barwienie metod¹ Grama stosowane jest do ró nicowania nieuszkodzonych, morfologicznie podobnych bakterii na dwie grupy na podstawie koloru komórki po barwieniu. Ponadto wyraÿne s¹ kszta³t, rozmiar oraz szczegó³y strukturalne komórki. Te wstêpne informacje stanowi¹ wa ne wskazówki odnoœnie do rodzaju obecnych organizmów i sugeruj¹, jakie dodatkowe techniki nale y zastosowaæ do ich scharakteryzowania. Poniewa nieorganiczny jod jest szybko utleniany i traci swoj¹ skutecznoœæ jako substancja trawi¹ca 1, Gram Stain Kit (Nr kat ) ró ni siê od oryginalnego zestawu Grama tym, e zawiera bardziej stabilny zwi¹zek organiczny jodu, L-poliwinylopyrolidono-jod. ZASADY PROCEDURY Procedura barwienia metod¹ Grama 2 obejmuje: Barwienie utrwalonego rozmazu za pomoc¹ fioletu krystalicznego. Zastosowanie jodu jako substancji trawi¹cej. Odbarwienie pierwszego barwnika za pomoc¹ alkoholu/acetonu i zastosowanie barwnika kontrastowego safraniny lub zasadowej fuksyny. Kompleks fiolet krystaliczny-jod tworzy siê w protoplaœcie (nie w œcianie komórki) wszystkich organizmów barwionych za pomoc¹ tej procedury. Organizmy zdolne zachowaæ kompleks barwi¹cy po odbarwieniu klasyfikowane s¹ jako gramdodatnie, natomiast te, które mo na odbarwiæ i zabarwiæ kontrastowo, klasyfikowane s¹ jako gram-ujemne. Po pêkniêciu lub usuniêciu œciany komórkowej protoplast komórek gram-dodatnich (jak równie gram-ujemnych) mo na odbarwiæ i utracona zostanie cecha gram-dodatnia. Dlatego mechanizm barwienia metod¹ Grama wydaje siê zwi¹zany z obecnoœci¹ nienaruszonej œciany komórkowej, dzia³aj¹cej jako bariera chroni¹ca przed odbarwieniem pierwszego barwnika. Zasadniczo œciana komórkowa jest przepuszczalna w sposób nieselektywny. Istnieje teoria, e podczas procedury barwienia metod¹ Grama œciana komórkowa komórek gram-dodatnich ulega odwodnieniu przez alkohol zawarty w odbarwiaczu i traci przepuszczalnoœæ, zatrzymuj¹c pierwotny barwnik. Œciana komórkowa komórek gram-ujemnych ma natomiast wiêksz¹ zawartoœæ lipidów i staje siê bardziej przepuszczalna podczas traktowania alkoholem, co powoduje utratê pierwszego barwnika. Podstawy molekularne barwienia metod¹ Grama nie zosta³y dotychczas okreœlone.

2 ODCZYNNIKI Przybli ony sk³ad* na litr Gram Crystal Violet PIERWSZY BARWNIK Fiolet krystaliczny ,0 g Izopropanol ,0 ml Etanol/Metanol ,0 ml Woda destylowana ,0 ml Gram Iodine ŒRODEK TRAWI CY (Roztwór roboczy przygotowywany z Gram Diluent (rozcieñczalnik) oraz Gram Iodine (jod) 100X) Kryszta³ki jodu ,3 g Jodek potasu ,6 g Woda destylowana ,0 L Stabilized Gram Iodine ŒRODEK TRAWI CY Kompleks poliwinylopyrolidono-jod ,0 g Jodek potasu ,0 g Woda destylowana ,0 L ODBARWIACZ Aceton ,0 ml Izopropanol ,0 ml BARWNIK KONTRASTOWY Safranina O w proszku (czysty barwnik) ,0 g Etanol/Metanol ,0 ml Woda destylowana ,0 ml Gram Basic Fuchsin BARWNIK KONTRASTOWY Fuksyna zasadowa ,08 g Fenol ,6 g Alkohol izopropylowy ,5 ml Woda destylowana ,0 ml *Skorygowany i/lub uzupe³niony zgodnie z wymaganiami kryteriów dzia³ania. Ostrze enia i œrodki ostro noœci: Do stosowania w diagnostyce in vitro. W miarê up³ywu czasu w Gram Basic Fuchsin (fuksyna zasadowa) mog¹ wytr¹ciæ siê delikatne precypitaty. Nie wp³ywa to na dzia³anie produktu. Gram Crystal Violet (fiolet krystaliczny): Szkodliwy przy wdychaniu oraz w razie spo ycia. Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Istnieje ryzyko nieodwracalnych dzia³añ niepo ¹danych. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Przechowywaæ z dala od Ÿróde³ zap³onu nie paliæ. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne i rêkawiczki. Gram Iodine 100X (jod): Szkodliwy przy wdychaniu, kontakcie ze skór¹ oraz po po³kniêciu. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne. Stabilized Gram Iodine (stabilizowany jod): Szkodliwy przy kontakcie ze skór¹. Powoduje oparzenia. Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne. (odbarwiacz): Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty i w dobrze wentylowanym miejscu. Przechowywaæ z dala od Ÿróde³ zap³onu nie paliæ. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. (safranina): Szkodliwy przy wdychaniu oraz w razie spo ycia. Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Przechowywaæ z dala od Ÿróde³ zap³onu nie paliæ. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne i rêkawiczki. Gram Basic Fuchsin (fuksyna zasadowa): Mo e powodowaæ nowotwory. Mo e powodowaæ dziedziczne uszkodzenia genetyczne. Dra ni¹cy dla oczu. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Nie wdychaæ py³u. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne. W razie przedostania siê do oczu natychmiast przemyæ oczy du ¹ iloœci¹ wody i zg³osiæ siê do lekarza. Gram Iodine 100X: Natychmiast zdj¹æ ca³e zanieczyszczone ubranie. Po kontakcie ze skór¹ natychmiast sp³ukaæ du ¹ iloœci¹ wody. W razie wdychania wynieœæ poszkodowanego na œwie e powietrze. Je eli poszkodowany nie oddycha, zastosowaæ sztuczne oddychanie. W razie trudnoœci z oddychaniem podaæ tlen. Zg³osiæ siê do lekarza. W razie po³kniêcia natychmiast zg³osiæ siê do lekarza i pokazaæ opakowanie lub etykietê. Przechowywanie: Po otrzymaniu przechowywaæ w temperaturze C. Data przydatnoœci do u ytku dotyczy produktu w nieotwartych butelkach, przechowywanego wed³ug zaleceñ. Nie otwieraæ do chwili u ycia. Tradycyjny roztwór roboczy Gram Iodine nale y zu yæ w ci¹gu 3 miesiêcy od przygotowania, nie przekraczaj¹c daty przydatnoœci do u ytku adnego ze sk³adników. Pogorszenie jakoœci produktu: Po rozpuszczeniu, niestabilizowany Gram Iodine mo e powodowaæ zmiennoœæ w barwieniu metod¹ Grama, je eli w roztworze nie jest ju dostêpna odpowiednia iloœæ jodu. Chroniæ roztwór jodu przed nadmiern¹ ekspozycj¹ na powietrze, œwiat³o i ciep³o, aby sprawdziæ, czy roztwór zapewnia odpowiedni¹ aktywnoœæ trawi¹c¹. POBIERANIE I PRZYGOTOWYWANIE PRÓBEK Nanieœæ badan¹ próbkê na czyst¹ p³ytkê szklan¹ w taki sposób, aby powsta³ cienki jednorodny rozmaz. Zemulgowaæ kolonie z hodowli h w soli, aby otrzymaæ odpowiedni¹ gêstoœæ. Poczekaæ, aby rozmaz wysech³ na powietrzu. Utrwaliæ rozmaz na szkie³ku, stosuj¹c jedn¹ z poni szych technik: 1. Utrwaliæ termicznie, przesuwaj¹c szkie³ko 2-3 razy przez s³aby p³omieñ. Przed barwieniem och³odziæ szkie³ko do temperatury pokojowej. UWAGA: Nie przegrzewaæ szkie³ka; nadmierne ogrzanie spowoduje atypowe barwienie. 2. Utrwaliæ szkie³ko metanolem, zanurzaj¹c w metanolu absolutnym na 1 2 min i wyp³ukaæ pod wod¹ z kranu przed barwieniem 3. UWAGA: W celu odpowiedniego utrwalenia przechowywaæ metanol absolutny w br¹zowej butelce zamykanej nakrêtk¹ i uzupe³niaæ roztwór roboczy co dwa tygodnie. 2

3 PROCEDURA Przygotowanie odczynnika Przygotowaæ tradycyjny roztwór roboczy jodu Grama, dodaj¹c ca³¹ 2,5 ml ampu³kê Gram Iodine 100X do 250 ml Gram Diluent lub ca³¹ fiolkê 40 ml Gram Iodine 100X do 3,8 L Gram Diluent; dok³adnie wymieszaæ. Materia³y dostarczone: Gram Crystal Violet, Gram Iodine lub Stabilized Gram Iodine, i lub Gram Basic Fuchsin. Materia³y wymagane, ale niedostarczane: Szkie³ka mikroskopowe, palnik Bunsena lub metanol, eza bakteriologiczna, waciki, bibu³a, mikroskop z obiektywem immersyjnym oraz szkie³ko Grama. Procedura testowa: 1. Zanurzyæ utrwalony rozmaz w pierwszym barwniku (Gram Crystal Violet) i barwiæ przez 1 min. 2. Usun¹æ pierwszy barwnik, delikatnie przep³ukuj¹c zimn¹ wod¹ z kranu. 3. Zanurzyæ szkie³ko w œrodku trawi¹cym (Gram Iodine lub Stabilized Gram Iodine) i moczyæ przez 1 min. 4. Usun¹æ œrodek trawi¹cy, delikatnie przep³ukuj¹c zimn¹ wod¹ z kranu. 5. Odbarwiaæ (), dopóki rozpuszczalnik sp³ywaj¹cy ze szkie³ka nie bêdzie bezbarwny (3 60 s). 6. Przep³ukaæ szkie³ko delikatnie zimn¹ wod¹ z kranu. 7. Zanurzyæ szkie³ko w barwniku kontrastowym ( lub Gram Basic Fuchsin) i barwiæ przez s. 8. Przep³ukaæ szkie³ko zimn¹ wod¹ z kranu. 9. Osuszyæ bibu³¹ lub papierowym rêcznikiem lub pozostawiæ do wyschniêcia na powietrzu. 10. Oceniæ rozmaz w mikroskopie z obiektywem immersyjnym. Kontrola jakoœci przez u ytkownika Nale y postêpowaæ zgodnie z obowi¹zuj¹cymi wymaganiami kontroli jakoœci, wynikaj¹cymi z przepisów lokalnych, krajowych lub federalnych, wymogami akredytacji oraz standardowymi procedurami kontroli jakoœci w danym laboratorium. Zaleca siê, aby u ytkownik stosowa³ siê do odpowiednich wytycznych CLSI (dawniej NCCLS) i przepisów CLIA, dotycz¹cych sposobów kontroli jakoœci. Przeprowadzaæ barwienie kontrolne, stosuj¹c BBL Gram Slide (Nr kat ) lub h hodowle znanych drobnoustrojów gram-dodatnich i gram-ujemnych. Zalecane jest zastosowanie nastêpuj¹cych szczepów kontrolnych: Drobnoustroje ATCC Oczekiwane wyniki Staphylococcus aureus gram-dodatni ziarniak Escherichia coli gram-ujemna pa³ka OGRANICZENIA PROCEDURY Barwienie metod¹ Grama daje wy³¹cznie wstêpn¹ informacjê odnoœnie do identyfikacji, nie zastêpuje natomiast szczegó³owych badañ hodowli próbki. Wyniki barwienia metod¹ Grama nale y potwierdziæ za pomoc¹ dodatkowych procedur, takich jak bezpoœredni test antygenowy lub hodowla na pod³o ach. Wczeœniejsze leczenie antybiotykami mo e powodowaæ, e drobnoustroje gram-dodatnie wydaj¹ siê gram-ujemne. W celu uzyskania najlepszych wyników zaleca siê stosowanie hodowli h, poniewa œwie e komórki wykazuj¹ wiêksze powinowactwo do wiêkszoœci barwników ni komórki stare. Dotyczy to szczególnie wielu bakterii tworz¹cych spory, które s¹ silnie gram-dodatnie w œwie ych hodowlach, a póÿniej staj¹ siê gram-zmienne lub gram-ujemne. Reakcja barwienia metod¹ Grama ulega zmianie w razie fizycznego zniszczenia œciany komórki bakteryjnej lub protoplastu. Œciany komórkowe bakterii gram-dodatnich tworz¹ barierê, która zapobiega wyciekaniu kompleksu barwnika z cytoplazmy. Œciany komórkowe bakterii gram-ujemnych zawieraj¹ lipidy rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, które pozwalaj¹ na odbarwienie cytoplazmy. Dlatego drobnoustrój, który zostanie fizycznie zniszczony przez nadmierne ogrzewanie, nie bêdzie w odpowiedni sposób reagowa³ z barwnikiem Grama. W celu uzyskania prawid³owych wyników nale y dok³adnie przestrzegaæ procedury i kryteriów interpretacyjnych. Dok³adnoœæ zale y od wyszkolenia i umiejêtnoœci mikrobiologa 2. Na wyniki barwienia metod¹ Grama, w tym równie na morfologiê drobnoustrojów, mo e wp³ywaæ wiek izolatu, bakterie zawieraj¹ce system enzymów autolitycznych, hodowle przeniesione z pod³o a zawieraj¹cego antybiotyk, jak równie próbki pobrane od pacjentów leczonych antybiotykami 4. Materia³ t³a i artefakty mog¹ równie utrudniaæ interpretacjê. Wytr¹cony barwnik gram-dodatni wygl¹da zazwyczaj jak nieregularne kszta³ty ziarniakowe lub jak wzory przypominaj¹ce strzêpki grzyba 4. OCZEKIWANE WYNIKI I CHARAKTERYSTYKA DZIA ANIA 1-4 Reakcja Wykorzystuj¹ca Wykorzystuj¹ca Gram Basic Fuchsin Gram-dodatnie Komórki fioletowoczarne Komórki jasnofioletowe do fioletowoczarnych Gram-ujemne Komórki ró owe do czerwonych Komórki jasnoró owe do purpurowych PIŒMIENNICTWO 1. Magee, C.M., G. Rodenheaver, M.T. Edgerton, and R.F. Edlich A more reliable Gram staining technique for diagnosis of surgical infections. Am. J. Surg. 130: Kruczak-Filipov, P., and R.G. Shively Gram stain procedures, p In H.D. Isenberg (ed.), Clinical microbiology procedures handbook, vol.1. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindley Methanol fixation. An alternative to heat-fixation of smear. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2: Chapin, K Clinical microscopy, p , In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3

4 4

5 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.