NOWINY LEKARSKIE DWUMIESIĘCZNIK NAUKOWY UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO IM. KAROLA MARCINKOWSKIEGO W POZNANIU MEDICAL NEWS

Transkrypt

1 NOWINY LEKARSKIE DWUMIESIĘCZNIK NAUKOWY UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO IM. KAROLA MARCINKOWSKIEGO W POZNANIU MEDICAL NEWS A BIMONTHLY SCIENTIFIC JOURNAL PUBLISHED BY POZNAN UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCES POLAND Rok założenia Founded in 1889 Suplement II 2010 (79) ISSN ISBN Indeksowane w/indexed in: Index Copernicus, Polska Bibliografia Lekarska Pełne teksty prac/full texts on line:

2

3 Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Marek Karczewski Wczesne biomarkery ostrego i przewlekłego odrzucania w surowicy i moczu pacjentów poddanych allogenicznemu przeszczepowi nerki Early biomarkers of acute and chronic rejection in serum and urine of patients undergoing allogeneic kidney transplantation Poznań 2010

4 4 Recenzenci prof. dr hab. Dorota Zozulińska-Ziółkiewicz prof. UM dr hab. Zbigniew Krasiński Redaktor Naukowy prof. dr hab. Marian Grzymisławski

5 5 WYKAZ SKRÓTÓW 99m Tc-DTPA 99m Tc-MAG3 ACTH ADCC AMR APC AR ARE ARF ATN AZA CADI CAN CD CML CMV CR CRE CsA DGF DSA DTH EDV Gs HLA IFN Ig IL IRMA MAC MHC MLR MMF MR MV (ang. technetium-99m diethylenetriaminepentaacetic acid) kwas dietylotriaminopentaoctowy znakowany technetem (ang. technetium-99m mercaptoacetyltriglycine) trójglicynian merkaptoacetylowy znakowany technetem (ang. adrenocorticotropic hormone) hormon adrenokortykotropowy (ang. antibody-dependent cellular cytotoxicity) reakcja cytotoksyczna zależna od przeciwciał (ang. antibody-mediated rejection) odrzucanie związane z obecnością przeciwciał (ang. antigen presenting cell) komórka prezentująca antygen (ang. acute rejection) odrzucenie ostre (ang. acute rejection episode) epizod odrzucenia ostrego (ang. acute renal failure) ostra niewydolność nerek (ang. acute tubular necrosis) ostra martwica cewek nerkowych azatiopryna (ang. chronic allograft disease index) wskaźnik zaawansowania przewlekłej nefropatii przeszczepu (ang. chronic allograft nephropathy) przewlekła nefropatia przeszczepu (ang. cluster of differentiation) antygen różnicowania (ang. cell-mediated lympholysis) limfoliza zależna od komórek (ang. cytomegalovirus) cytomegalowirus (ang. chronic rejection) odrzucenie przewlekłe (ang. chronic rejection episode) epizod odrzucenia przewlekłego cyklosporyna A (ang. delayed graft function) opóźniona czynność przeszczepu (ang. donor-specific antibodies) przeciwciała przeciwko antygenom dawcy (ang. delayed-type hypersensitivity) nadwrażliwość typu późnego (ang. end-diastolic velocity) prędkość końcowo-rozkurczowa glikokortykosteroid (ang. human leukocyte antigen) ludzki antygen leukocytarny interferon immunoglobulina interleukina (ang. immunoradiometric assay) metoda immunoradiometryczna (ang. membrane attack complex) kompleks ataku błonowego (ang. major histocompatibility complex) główny układ zgodności tkankowej (ang. mixed lymphocyte reaction) reakcja mieszanych limfocytów mykofenolan mofetilu (ang. magnetic resonance) rezonans magnetyczny (ang. mean velocity) średnia prędkość przepływu

6 6 NKC NONARE NPV PFN PI PRA% PSV RIA STABLE RAPA RI Tac TCR Th TNF TGF (ang. natural killer cell) naturalny zabójca, komórka NK (ang. non-acute rejection episode) brak epizodu odrzucenia ostrego (ang. negative-predictive value) wartość predykcyjna ujemna (ang. perforin) perforyna (ang. pulsatility index) wskaźnik pulsacyjności poziom surowiczych przeciwciał alloreaktywnych (ang. peak systolic velicity) szczytowa prędkość skurczowa (ang. radioimmunoassay) metoda radioimmunologiczna stabilny przeszczep przez okres 5 lat rapamycyna (ang. resistive index) wskaźnik oporności takrolimus (ang. T cell receptor) receptor komórki T (ang. T helper) T pomocniczy (ang. tumor necrosis factor) czynnik martwicy nowotworów (ang. transforming growth factor) czynnik transformujący wzrostu

7 7 Streszczenie Wstęp. Przeszczepienie nerki jest uznaną metodą leczenia schyłkowej niewydolności nerek. Jednym z głównych powodów utraty przeszczepionej nerki jest proces odrzucania narządu. W 10-letnim okresie po przeszczepieniu, proces ostrego odrzucania jest odpowiedzialny za utratę przeszczepu u 4,1 5,4% pacjentów, a przewlekłe odrzucanie u 16,1 20,3% biorców. Jednym z ważniejszych problemów, przed którymi stoi współczesna transplantologia nerek jest wczesne wykrywanie epizodów odrzucania. Cel pracy. Cytokiny są istotnymi mediatorami odpowiedzi immunologicznej pośredniczącymi w reakcji odrzucania przeszczepionego narządu allogenicznego. Poniższy projekt miał na celu określenie skuteczności zastosowania oznaczeń cytokin Th1/Th2 w surowicy i moczu pacjentów poddanych allogenicznemu przeszczepieniu nerki, jako wczesnych biomarkerów ostrego (ARE) i przewlekłego (CRE) odrzucania narządu. Metodyka. Badaniem objęto pacjentów poddanych przeszczepieniu nerki na Oddziale Transplantologii i Chirurgii Ogólnej Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu w latach Badanie otrzymało zgodę Komisji Bioetycznej. Pomiar stężenia cytokin Th1/Th2 w surowicy i moczu pacjentów przeprowadzono z wykorzystaniem metody Th1/Th2 Cytometric Beads Array i cytometrii przepływowej. Wyniki. U pacjentów ze zdiagnozowanym odrzutem ostrym zaobserwowano podwyższone stężenie IFN-γ i IL-10 w surowicy i moczu w okresie przed- i pozabiegowym. Z kolei grupa pacjentów z przewlekłym odrzucaniem charakteryzuje się podwyższonym poziomem cytokin typu Th2 w surowicy: IL-4, IL-6, IL-10 oraz obniżonym poziomem IFN-γ w stosunku do pacjentów ze stabilnym przeszczepem przez okres 5 lat i pacjentów ze zdiagnozowanym odrzutem ostrym. Wnioski. Cytometryczna analiza cytokin Th1/Th2 zastosowana w projekcie wydaje się przydatną klinicznie metodą monitoringu immunologicznego w procesach ostrego i przewlekłego odrzucania narządu. Zebrane dane wskazują również na istnienie odrębnych profili cytokinarnych w różnych stanach dysfunkcji przeszczepionej nerki. SŁOWA KLUCZOWE: przeszczepienie nerki, cytokiny, Th1/Th2, odrzucanie przeszczepu.

8 8 Summary Introduction. Kidney transplantation is a recognized treatment method of end-stage renal failure. The rejection process is one of the major reasons for kidney allograft loss. During a 10-year posttransplantation period acute rejection results in allograft loss in % of transplanted patients, while chronic rejection results in allograft loss in % of transplanted patients. One of the most important issues the contemporary kidney transplantology faces is the early diagnosis of rejection episodes. Aim. Cytokines are crucial inflammatory mediators involved in the development of immune response leading to allograft rejection. This project was aimed to determine the effectiveness of analyzing the serum and urine Th1/Th2 cytokines of patients undergoing allogeneic kidney transplantation as early biomarkers of acute (ARE) and chronic (CRE) rejection. Method. The study included patients undergoing allogeneic kidney transplantation at the Department of Transplantation and General Surgery of the District Hospital in Poznań during The project was approved by the local bioethics committee. Measurements of serum and urine Th1/Th2 cytokines were performed using flow cytometry and Th1/Th2 Cytometric Beads Array method. Results. Higher pre- and posttransplant concentrations of serum and urine IFN-γ and IL-10 were observed in ARE patients. Furthermore, CRE patients were characterized by higher concentrations of serum Th2-type cytokines (IL-4, IL-6, IL-10) and lower concentration of IFN-γ comparing to ARE patients and patients with stable graft 5 years. Conclusions. The cytometric analysis of Th1/Th2 cytokines performed in this project proved to be a clinically effective method of immune monitoring of acute and chronic rejection processes. The collected data also suggests that distinct cytokine patterns exist among different states of kidney allograft function. KEY WORDS: kidney transplantation, cytokines, Th1/Th2, allograft rejection.

9 9 1. WSTĘP 1.1. Zarys historii przeszczepiania nerek u ludzi Przeszczepianie komórek, tkanek i narządów, w tym nerek, jest od wielu lat uznaną praktyką kliniczną. Z chirurgicznego punktu widzenia bardzo szybko opracowano skuteczne metody przeszczepiania nerki, natomiast przez długi czas trudnymi do pokonania pozostawały przeszkody biologiczne, jakimi są reakcje organizmu na obcy narząd. Dopiero w 1933 roku ukraiński chirurg Voronoy przyczynił się do postępu w dziedzinie transplantologii. Przeszczepił on nerkę dawcy grupy krwi B pacjentowi grupy krwi 0. Biorca zmarł po dwóch dniach z powodu nadostrego odrzucenia przeszczepu wywołanego niezgodnością w obrębie układu AB0 [1]. W czasie II wojny światowej zwiększyło się zainteresowanie immunologią, a tym samym transplantologią. W roku 1953 Simonsen w Dani i Dempster w Londynie opublikowali wnioski ze swoich badań, że przyczyną zatrzymania funkcji przeszczepionej nerki są procesy immunologiczne oraz, że preferowanym miejscem umieszczenia graftu jest dół biodrowy [1 2]. Na początku lat 50-tych Kuss, Dubost i Servelle przeszczepili kilka nerek w okolicy miednicznej, nie stosując żadnej immunosupresji. W tym samym okresie Lawler w Chicago przeszczepił nerkę w podobny sposób. W 1953 roku Hume przedstawił swoje wyniki przeszczepiania nerek z użyciem ACTH lub kortyzonu [3]. Stwierdził, że przetoczenie krwi przed przeszczepem może być korzystne, ale istotną rolę odgrywa zgodność grupowa krwi. Dopiero udane przeszczepy u bliźniaków jednojajowych przeprowadzone przez Murraya w Bos- tonie, spowodowały dalszy rozwój i badania nad transplantologią. Lata 60. to dalszy rozwój technik przetrzymywania narządów i typowania tkankowego. Lata 70. przyniosły rutynowe typowanie HLA-DR (Morris). W 1976 roku została odkryta przez Borela cyklosporyna, wykorzystana do leczenia przez Calne a, co stanowiło przełom w leczeniu immunosupresyjnym pacjentów po przeszczepieniu narządów [3]. W Polsce profesor Jan Nielubowicz przeprowadził pierwsze udane przeszczepienie nerki pobrane ze zwłok 26 stycznia W ostatnich latach w Polsce dało się zauważyć bujny rozwój transplantologii klinicznej. Przeszczepianie nerek jest obok hemodializ i dializ otrzewnowych uznaną metodą leczenia nerkozastępczego. Stało się to jednak możliwe dzięki rozwojowi immunologii transplantacyjnej, poznaniu mechanizmów niedokrwienia narządów oraz stosowaniu leczenia immunosupresyjnego Przeszczepianie nerek w Polsce Przeszczepianie nerek w Polsce rozpoczęło się w 1966 roku i po początkowym okresie wzrostu liczby wykonywanych zabiegów przeszczepiania, ich liczba utrzymuje się na poziomie blisko 800 rocznie. Liczba oczekujących na przeszczepienie nerki w Polsce w 2009 roku wynosiła 1209 osób. W tym samym roku przeszczepiono w Polsce nerki 785 biorcom (20,6/1 mln mieszkańców). W liczbie tej 762 biorców (20/1 mln) otrzymało nerki pochodzące od dawców zmarłych, 23 biorców od dawców żywych (0,6/1 mln) [4]. W latach 1994 do 2010 w Szpitalu Wojewódzkim w Poznaniu przeszczepiono ponad 1665 nerek, z czego w 2009 roku wykonano 134 przeszczepy [Tabela I]. Nerki Nerki pobrane Przekazane Otrzymane Zdyskwalifikowane Przeszczepione Tabela I. Liczba przeszczepionych nerek w stosunku do liczby pobrań przeprowadzonych przez zespół z Oddziału Transplantologii Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu [opracowanie własne] Table I. Ratio of kidney transplantations to kidney harvestings performed at the Department of Transplantation and General Surgery, District Hospital in Poznan [own study]

10 Proces odrzucania po przeszczepieniu nerki Proces odrzucania przeszczepionej nerki jest głównym procesem powodującym jego utratę, a statystycznie dotyczy co czwartego przeszczepionego narządu. W 10- letnim okresie po przeszczepieniu, proces ostrego odrzucania jest odpowiedzialny za utratę przeszczepu u 4,1 5,4% pacjentów, a przewlekłe odrzucanie u 16,1 20,3% biorców [5]. Wprowadzenie nowych schematów immunosupresyjnych znacznie zmniejszyła częstość występowania epizodów ostrego odrzucania. W większości ośrodków transplantacyjnych roczne przeżycie przeszczepu wynosi ok. 90% [6]. Poniższa tabela [Tabela II] prezentuje wyniki przeszczepiania nerek pobranych od dawców zmarłych w Oddziale Transplantologii i Chirurgii Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu. Wyniki uzyskiwane w ośrodku poznańskim zbliżone są do wyników z innych ośrodków na świecie. nięcia oraz chemotaksję neutrofilów prowadzą do niedokrwienia i martwicy ścian naczyń, a następnie całego miąższu nerki. W procesie tym dochodzi do zmniejszenia diurezy (oliguria, anuria), powiększenia i bolesności graftu, podwyższenia temperatury. Objawy te są niespecyficzne i mogą w ogóle nie wystąpić [7]. W różnicowaniu bierze się najczęściej pod uwagę zakrzepicę w żyle lub tętnicy nerkowej. Stan taki wymaga natychmiastowej operacji, a definitywnym rozpoznaniem jest biopsja śródoperacyjna. Wczesne odrzucanie typu komórkowego Ostre odrzucanie przeszczepu jest reakcją typową w przypadkach występowania różnic w zakresie antygenów zgodności tkankowej pomiędzy dawcą a biorcą. W warunkach eksperymentalnych (przy użyciu modelu zwierzęcego) reakcja osiąga największe natężenie w cią- Tabela II. Wyniki przeszczepiania nerek pobranych od dawców zmarłych w Oddziale Transplantologii i Chirurgii Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu [4] Table II. Results of cadaveric kidney transplantations performed at the Department of Transplantation and General Surgery, District Hospital in Poznan [4] Przeżycie Liczba biorców objętych obserwacją Przeżycie biorcy % przeżycia biorcy Przeżycie przeszczepu % przeżycia przeszczepu 3 mies % % 12 mies % % 36 mies % % 60 mies % % Wczesne odrzucanie po przeszczepieniu nerki Przyspieszone ostre odrzucanie Przyspieszone ostre odrzucanie jest spowodowane immunizacją biorcy przed przeszczepieniem nerki. Odpowiedzialne za ten proces są przeciwciała skierowane przeciwko obcym antygenom, głównie antygenom zgodności tkankowej (human leukocyte antigens, HLA) dawcy oraz antygenom krwinkowym układu AB0. Wytwarzanie dużych ilości takich przeciwciał przez organizm biorcy powoduje trwałe i nieodwracalne uszkodzenie przeszczepionego narządu. Jeżeli pojawia się bezpośrednio po przeszczepieniu wywołuje nadostre odrzucanie, ale może pojawić się również w kilka dni po zabiegu. Powikłanie to występuje niezwykle rzadko, jako że w procesie selekcji dawców wykonuje się próbę krzyżową (cross-match) przed przeszczepieniem narządu. W procesie nadostrego odrzucania faza powstawania przeciwciał przeciwko alloantygenom następuje przed przeszczepieniem narządu, na skutek kontaktu układu immunologicznego biorcy z obcym antygenem, głównie w czasie transfuzji krwi, wcześniejszym przeszczepom tkanek i narządów oraz ciążom. Po wypełnieniu łożyska naczyniowego przeciwciała biorcy łączą się z komórkami śródbłonka naczyniowego i aktywując układ dopełniacza i układ krzep- gu tygodnia od dokonania przeszczepu. W warunkach klinicznych odrzucanie ostre może zajść w przeciągu kilku dni do kilku miesięcy od transplantacji, ze szczególnym nasileniem epizodów w trzydziestodniowym okresie pooperacyjnym. Występują tutaj dwa typy reakcji, opóźniona reakcja nadwrażliwości DTH (Delayed-type hypersensitivity) i reakcja cytotoksyczności limfocytów T [Rycina I]. W pierwszym mechanizmie, cytotoksyczne limfocyty T (CD8+) produkują cytokiny, które zwiększają przepuszczalność naczyń krwionośnych i stymulują miejscowy proces zapalny poprzez naciek komórek jednojądrzastych (limfocyty, makrofagi/monocyty). W drugim mechanizmie, cytotoksyczne limfocyty T rozpoznają swoisty alloantygen dawcy i niszczą komórki dawcy poprzez ich lizę albo na skutek działania perforyn i granzymów albo na drodze indukcji apoptozy, po interakcji między cząsteczką CD178 (Fas ligand) na limfocycie, a cząsteczką CD95 (Fas) na powierzchni komórek przeszczepu. Pomimo przewagi limfocytów T cytotoksycznych CD8+ oraz makrofagów/monocytów w nacieku, decydującą rolę w procesie odrzucania ostrego pełną limfocyty pomocnicze T CD4+. Ich rola polega na aktywacji limfocytów cytotoksycznych oraz indukcji odpowiedzi o typie nadwrażliwości późnej z udziałem makrofagów. Dodatkowo, komórki te mogą wywierać

11 11 bezpośredni efekt cytotoksyczny na komórki przeszczepionego narządu poprzez cząsteczkę Fas i indukcję apoptozy [7]. Najistotniejszą rolę w procesie ostrego odrzucania komórkowego wydają się zatem pełnić limfocyty pomocnicze Th1, które są zdolne do nasilania reakcji typu cytotoksycznego. W naciekach obecne są również komórki pamięci T CD8+, które mogły powstać w wyniku wcześniejszych immunizacji (ciąża, transfuzja, wcześniejsze przeszczepienie, etc). Limfocyty te mogą wywierać efekt cytotoksyczny na komórki przeszczepionego narządu z pominięciem etapu ekspansji klonalnej i różnicowania, co znacznie przyspiesza reakcję odrzucenia. Istnieją dane wskazujące, że komórki pamięci powstałe w wyniku wcześniejszych immunizacji mogą wchodzić w reakcje krzyżowe z innymi antygenami allogenicznymi [8]. Wczesne odrzucanie typu komórkowego najczęściej występuje w końcu pierwszego tygodnia po przeszczepieniu nerki. W procesie tym zostaje zachowany przepływ przez nerkę, więc obraz w scyntygrafii lub badaniu dopplerowskim umożliwia zróżnicowanie z przyspieszonym ostrym odrzucaniem, w którym z reguły brak jest przepływu krwi przez nerkę. Biopsja nerki jest ostatecznym i jedynym rozpoznaniem. Rycina I. Główne mechanizmy ostrego odrzucania przeszczepu allogenicznego (objaśnienia w tekście). Skróty: DTH (ang. Delayed type hypersensitivity) nadwrażliwość typu późnego, ADCC (ang. Antibody dependent cellular cytotoxicity) reakcja cytotoksyczna zależna od przeciwciał, PFN perforyna, GNZ granzym, Fas antygen powierzchniowy CD95, limfocyt Tc limfocyt T cytotoksyczny. Illustration I. Major mechanisms underlying the acute allograft rejection (description in text). Abbreviations: DTH Delayed type hypersensitivity; ADCC Antibody dependent cellular cytotoxicity; PFN Perforin; GNZ Granzyme; FAS CD95 antigen; Tc lymphocyte Cytotoxic T lymphocyte. Wczesne odrzucanie typu humoralnego W procesie tym, po wcześniejszym przekształceniu limfocytów B w komórki plazmatyczne, produkowane są przeciwciała przeciwko antygenom MHC dawcy (klasy I i II), oraz innym antygenom zlokalizowanym w obrębie przeszczepionego narządu, głównie antygenom śródbłonka. Przeciwciała aktywują układ dopełniacza na drodze klasycznej, powodując powstanie kompleksu MAC (C5- C9), który niszczy błony komórkowe i powoduje lizę komórek przeszczepu. Liza komórek może nastąpić także w reakcji cytotoksycznej zależnej od przeciwciał ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), na skutek niespecyficznego łączenia alloprzeciwciał z receptorem dla fragmentu Fc komórek zapalnych, takich jak monocyty, granulocyty i komórki NK [7]. Zmiany w tym typie odrzucania zarówno kliniczne, jak i histopatologiczne, są znacznie mniej zaznaczone, niż w typie komórkowym. Występuje on z reguły w pierwszych kilku miesiącach po

12 12 przeszczepieniu, szczególnie u pacjentów wysoko immunizowanych. W badaniach surowicy najczęstszym odchyleniem jest izolowany wzrost poziomu kreatyniny. Ostateczne rozpoznanie dokonywane jest na podstawie biopsji nerki, a markerem uszkodzenia humoralnego jest rozlane gromadzenie się złogów fragmentu C4d dopełniacza w badaniu immunofluorescencyjnym. Odrzucanie to jest łatwe do przeoczenia i trudne do zróżnicowania na podstawie obrazu klinicznego i metod obrazowych z martwicą cewek nerkowych (ATN). Odrzucanie typu humoralnego może być powikłane dodatkowo odrzucaniem komórkowym, co znacznie utrudnia rozpoznanie i skuteczne leczenie Późne odrzucanie po przeszczepieniu nerki Chociaż proces ostrego odrzucania występuje głównie we wczesnym okresie pooperacyjnym, to jednak w niektórych przypadkach dochodzi do procesu ostrego odrzucania w kilka miesięcy lub lat po przeszczepieniu narządu. Nie ma jednoznacznej granicy dzielącej epizody ostrego odrzucania na wczesne (AR) i późne (CR), ale częstym jest z podział opublikowany przez Bassadonnę i wsp., i uznający za wczesne toczące się w ciągu 60 dni od przeszczepu, a za późne występujące po tym okresie [9]. W badaniu pediatrycznym, Tejani i wsp. granicę pomiędzy AR i CR ustalili na 12 miesięcy od przeszczepienia narządu [10]. Obecnie większość ośrodków transplantacyjnych przyjmuje granicę pomiędzy AR a CR po 3. miesiącu od przeszczepienia narządu [11]. U podłoża CR leży niezgodność antygenów HLA odpowiedzialnych za rozpoznanie pośrednie alloantygenu i wtórną aktywację limfocytów B, co prowadzi do produkcji przeciwciał. Mechanizm polega na przetworzeniu przez komórki dendrytyczne biorcy antygenów dawcy i ich prezentację subpopulacji limfocytów pomocniczych Th, które aktywują odporność komórkową i humoralną (w pierwszych tygodniach dominuje mechanizm bezpośredniej prezentacji alloantygenu) [Rycina II]. W 40% przypadków w CR występują złogi C4d w kapilarach okołocewkowych [12]. Markerem CR są przeciwciała przeciwko antygenom HLA klasy I dawcy (donor specific antibodies; DSA) [13]. Późne odrzucanie, zwane inaczej przewlekłą nefropatią (chronic allograft nephropathy; CAN), jest zaraz po zgonie pacjenta, główną przyczyną utraty przeszczepu. Według rejestrów transplantacyjnych śmierć biorcy jest przyczyną utraty przeszczepu w 54%, a CAN w 40% [7]. W przewlekłej nefropatii biorą udział czynniki immunologiczne i nieimmunologiczne [Tabela III]. Mimo że pojęcie przewlekłej nefropatii jest przez to pojęciem znacznie szerszym (czynniki immunologiczne i nieimmunologiczne), to jednak w moich badaniach stosuję zamiennie pojęcia przewlekłej nefropatii i przewlekłego odrzucania (tylko czynniki immunologiczne). Wśród czynników ryzyka późnego odrzucania wymienia się: młody wiek biorcy, dawcę marginalnego, płeć żeńską dawcy, infekcję wirusem CMV, wysokie miano surowiczych przeciwciał alloreaktywnych (PRA), niezgodność w klasie I układu HLA, niedostateczną immunosupresję [7]. Epizody ostrego odrzucania mają wpływ na przeżywalność przeszczepu. Wystąpienie epizodu ostrego odrzucania w ciągu pierwszego półrocza po przeszczepieniu zwiększa do 50% ryzyko utraty przeszczepu [7]. Istotny jest również czas wystąpienia epizodów AR po przeszczepieniu [14]. Najgorsze rokowanie dotyczy bior- Rycina II. Dwa typy rozpoznawania alloantygenu. Skróty: TCR (ang. T cell receptor) receptor komórki T, MHC (ang. Major histocompatibility complex) główny układ zgodności tkankowej, APC (ang. Antigen presenting cell) komórka prezentująca antygen. Illustration II. Two types of alloantigen recognition. Abbreviations: TCR T cell receptor; MHC Major histocompatibility complex; APC Antigen presenting cell.

13 13 ców, u których rozpoznano ostre odrzucanie po 12 miesiącach od przeszczepienia [15]. Istota samej korelacji pomiędzy epizodami ostrego odrzucania graftu a rozwinięciem CR nie jest jasna, ale ilość epizodów oraz burzliwość przebiegu procesu zwiększają ryzyko przewlekłej niewydolności przeszczepu. Istnieją podstawy, aby stwierdzić, że proces ostrego odrzucania po pierwszych trzech miesiącach po przeszczepieniu jest gorszym czynnikiem rokowniczym dla przeżycia przeszczepu, niż proces odbywający się w pierwszych trzech miesiącach po przeszczepieniu [7]. W przebiegu CR wyróżnia się dwa okresy. W pierwszym roku dominują procesy immunologiczne, głównie epizody ostrego odrzucania, odrzucanie subkliniczne oraz opóźnione ostre odrzucanie, które nakładają się na uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne. Po roku od przeszczepienia dominuje szkliwienie w tętniczkach, stwardnienie w kłębuszkach i włóknienie śródmiąższowe. W dużym, prospektywnym badaniu Nankivell i wsp. przedstawili hipotezę, że dominującym procesem jest neurotoksyczność inhibitorów kalcyneuryny [16]. Dwufazowość CR w tym ujęciu jest oczywiście zbytnim uproszczeniem. U 50% biorców z CR występuje swoista alloreaktywność komórkowa wobec antygenów dawcy, podczas gdy w grupie bez CAN odsetek wynosi 28% [17]. Udowodniono ścisły związek pomiędzy zgodnością antygenową MHC (major histocompatibility complex) dawcy i biorcy a rozwojem przewlekłej nefropatii i utraty przeszczepu. Pełna zgodność warunkuje lepsze długotrwałe przeżycie przeszczepu, mniej znaczący jest wpływ niezgodności kolejnych, od 1 do 6, alloantygenów układu MHC [7]. Kolejnym czynnikiem korelującym z przeżywalnością przeszczepu jest obecność przeciwciał preformowanych. Aż u 60% pacjentów z przewlekłą nefropatią stwierdza się obecność przeciwciał [7]. U podłoża CR może leżeć wspomniana neurotoksyczność inhibitorów kalcyneuryny, ale równocześnie mogą występować: subkliniczne odrzucanie, glomerulopatia i waskulopatia na skutek nieadekwatnego leczenia immunosupresyjnego. W związku z tym, że proces przewlekłej nefropatii może zacząć się i przebiegać przy stałym poziomie kreatyniny w surowicy krwi, wydaje Tabela III. Immunologiczne i nieimmunologiczne czynniki ryzyka późnego odrzucania przeszczepu [7] Table III. Immune and non-immune risk factors of chronic nephropathy [7] Czynniki ryzyka Czynniki immunologiczne Czynniki nieimmunologiczne Ostre odrzucanie przeszczepu Reakcja typu humoralnego Niezgodność w układzie HLA Immunizacja biorcy przed przeszczepem Niski poziom immunosupresji Opóźniona czynność przeszczepu (DGF) Dawca marginalny Dysproporcja masy dawcy i biorcy Nefrotoksyczność inhibitorów kalcyneuryny Nadciśnienie Hiperlipidemia Nikotyna Hiperhomocysteinemia Zakażenia wirusowe (CMV) Proteinuria Wolne rodniki tlenowe Brak współpracy biorcy w zakresie leczenia się, że istotnym byłoby wykonywanie biopsji protokolarnych w 3. i 12. miesiącu po przeszczepieniu [18]. Objawami klinicznymi CR są: białkomocz, zwykle w przedziale 1 2 g/dobę i nadciśnienie tętnicze Diagnostyka procesu odrzucania przeszczepionej nerki Ostre odrzucanie jest główną przyczyną utraty przeszczepionego narządu w krótkim okresie pooperacyjnym, jak i głównym czynnikiem ryzyka wystąpienia przewlekłej dysfunkcji przeszczepu. Kliniczne objawy ostrego odrzucania nerki występują dość późno i manifestują się: powiększeniem przeszczepionego narządu, bolesnością uciskową, zmniejszeniem diurezy i podwyższoną temperaturą. Dodatkowo, ważnym wykładnikiem mogącym świadczyć o procesie odrzucania jest wzrost poziomu kreatyniny w surowicy krwi o ponad 20%.

14 Obrazowanie w procesie odrzucania ostrego nerki Obrazowanie radiologiczne jest ważnym narzędziem w diagnostyce procesu odrzucania, choć definitywne rozpoznanie opiera się na biopsji nerki wykazującym naciek limfocytarny w kanalikach i śródmiąższu (interstitium), włącznie z uszkodzeniem naczyń w ciężkich przypadkach. Ultrasonografia w projekcji B (B-mode) może wprowadzić wiele sugestii, co do toczącego się procesu ostrego odrzucania w postaci: powiększenia przeszczepionej nerki, zatarcia granicy rdzeniowo-korowej, powiększenia piramid rdzeniowych, zwiększenia lub zmniejszenia echogeniczności kory, pogrubienia ścian układu zbiorczego, rozproszenia obszarów heteroechogennego wzrostu echogeniczności, prawdopodobnie odpowiadającym ogniskom krwotocznym. Cechy te są subiektywne i niespecyficzne oraz charakteryzują się słabą powtarzalnością. Wartość predykcyjna ujemna (negative-predictive value; NPV) mieści się pomiędzy 17% a 50% [19 24]. Badanie duplex-doppler początkowo wydawało się być bardzo ważnym narzędziem diagnostycznym. Głównym parametrem w badaniu jest wskaźnik oporności (impedancji), wyrażony jako procentowa redukcja wartości przepływu końcowo-rozkurczowego względem wartości szczytowego przepływu skurczowego. Wskaźnik oporności (resistive index; RI) = szczytowa prędkość skurczowa (peak systolic velicity; PSV) prędkość końcowo-rozkurczowa (end-diastolic velocity; EDV)/szczytową prędkość skurczową. Drugi wskaźnik, to wskaźnik pulsacyjności (pulsatility index; PI) = PSV prędkość końcowo-rozkurczową/średnia prędkość przepływu (mean velocity; MV) [25]. Sam objaw podwyższenia wartości RI jest nieswoisty i trudno ustalić korelację pomiędzy wysokimi wartościami RI a procesem ostrego odrzucania naczyniowego [23 24, 26 28]. Wartości RI 0,80 są obserwowane w różnych procesach zachodzących w nerce przeszczepionej, takich jak ostre odrzucanie i ostro przebiegające martwice cewek nerkowych, zakrzepice żyły nerkowej, odmiedniczkowe zapalenie nerki przeszczepionej, nefrotosyczność inhibitorów kalcyneuryny, itd. Zmiany wartości RI spowodowane są zaburzeniem mikrokrążenia w korze nerki, poprzez bezpośrednie uszkodzenie ścian naczyń i pośrednio, poprzez ucisk kapilar spowodowany obrzękiem śródmiąższu kory nerki. Wielkość hypoperfuzji ma wpływ na stopień wzrostu RI. Większość badań nie potwierdza korelacji statystycznej pomiędzy wartościami RI, a wynikiem klinicznym w perspektywie 12-miesięcznej [29]. Badanie duplex-doppler łączy obraz dwuwymiarowy B-mode z danymi dotyczącymi przepływu, tzn. obrazu w kolorze, Dopplera pulsacyjnego i Dopplera mocy (power Doppler, angio-doppler). Techniki te wykorzystują fale dźwiękowe jak w obrazowaniu rzeczywistym, ale mierzą częstotliwość i energię przesunięć ech dopplerowskich po odbiciu od płynących krwinek, co pozwala na określenie wielkości, kierunku i prędkości przepływu. Doppler mocy wykorzystujący sondę wysokiej częstotliwości dokonuje pomiarów mocy sygnałów dopplerowskich i pokazuje szerszy zakres siły sygnału, zwiększając czułość w wykrywaniu przepływów. Pozwala to obrazować nawet drobne naczynia w całym obszarze kory nerki [30]. W ostrym odrzucaniu nerki przy upośledzonym przepływie, obserwuje się ogniskowe lub uogólnione zaniki sygnału z obszaru międzypłatowego. Zmiany te są odwracalne w procesie leczenia i decydują o gorszej funkcji nerki w perspektywie roku [29]. Odczyt rzeczywistych prędkości i obliczanie wskaźnika oporności i pulsacyjności dokonuje się przy wykorzystaniu spektrum z Dopplera pulsacyjnego. Do obliczenia wartości przepływów konieczne jest wyznaczenie kąta zawartego między osią ultradźwięków a kierunkiem przepływu krwi. Obraz w rezonansie magnetycznym (MR T1) też nie daje jednoznacznego rozpoznania. Przeszczep może być powiększony w procesie ostrego odrzucania, ale nie zawsze do tego dochodzi. Obserwowane zatarcie granicy korowo-rdzeniowej (corticomedullary diferentiation; CMD) w sekwencjach T1 nie jest specyficzne dla żadnej nefropatii [31]. Zatarcie granicy korowo-rdzeniowej może być spowodowane zmniejszeniem intensywności sygnału z obrzękniętej kory nerki lub zwiększeniem intensywności sygnału z rdzenia na skutek zmniejszenia przepływu cewkowego lub odkładania się elementów krwi (białko, hemoglobina). W ostrym uszkodzeniu nerki (ARF), obraz CMD może nie ulec zmianie przez 2 tyg. od rozpoczęcia procesu i pozostać niezmiennym bez względu na poziom kreatyniny [32]. Podobnie zmiany w obrazie T2 są nieprzewidywalne. Zróżnicowanie pomiędzy ostrym odrzucaniem a ATN jest trudne również w scyntygrafii, przy wykorzystaniu trójglicynianu merkaptoacetylowego znakowanego technetem ( 99m Tc-MAG3) lub starszego znacznika, kwasu dietylotriaminopentaoctowego znakowanego technetem ( 99m Tc- DTPA) [33]. Diagnoza oparta jest na opóźnionym lub zmniejszonym wychwycie znacznika, związanym z nasilającym magazynowaniem w miąższu, bez śladu usuwania [34]. Głównymi stosowanymi parametrami są: opóźnione przechodzenie, wydłużony czas maksymalnej aktywności (T max ), opóźniony czas połowiczej aktywności maksymalnej (T 1/2 ) są najczęściej używanymi parametrami. Parametry te nie różnicują jednoznacznie pomiędzy ATN a ostrym odrzucaniem nerki, a jedynie wskazują na poważną dysfunkcję narządu. Tylko seryjne badania pozwalają na zróżnicowanie tych procesów. W ATN, perfuzja jest upośledzona szczególnie w pierwszych 24 godzinach a następnie ulega poprawie, podczas gdy w procesie ostrego odrzucania obraz ulega pogorszeniu wraz z czasem trwania procesu

15 15 [33]. Znaczniki z jodem 131 J nie są idealne, gdyż emisja β daje istotną ilość promieniowania, co z kolei ogranicza możliwości zwiększonego dawkowania. Częściej wykonywanym badaniem jest scyntygrafia dynamiczna nerek. W pierwszej fazie angiograficznej ocenia się perfuzję przeszczepu. W fazie miąższowej określa się kumulowanie znacznika w obrębie miąższu nerki, a w fazie wydzielniczej oznacza się stopień oczyszczania znacznika. Z wszystkich trzech faz wyznaczana jest krzywa aktywności nerki w jednostce czasu Obrazowanie w procesie odrzucania przewlekłego nerki W procesie przewlekłego odrzucania następuje stopniowe pogarszanie funkcji nerki, a sam przeszczep ulega zmniejszeniu. W badaniu dopplerowskim ulega podwyższeniu RI, choć jest to wskaźnik niespecyficzny, jak również obraz angiograficzny, ze zmniejszonym przepływem korowym i redukcją liczby naczyń. Pomimo faktu, iż wartość RI nie jest diagnostyczna, to jednak może stanowić narzędzie prognostyczne dla długoterminowego utrzymania się przeszczepu. Doniesienia wskazują, że wartości RI 0,80, mierzone w okresie powyżej 3 miesięcy po przeszczepieniu prognozują pogarszanie funkcji nerki i utraty przeszczepu [34]. Również scyntygrafia jest niecharakterystyczna i z reguły cechuje się mniejszą perfuzją, zmniejszonym wydzielaniem oraz prawostronnym przesunięciem szczytu renogramu. W obrazie nerek dominuje zmniejszenie rozmiarów, z zatarciem granicy korowo-rdzeniowej, a czasami umiarkowanym poszerzeniem kielichów i miedniczki nerkowej. Większość technik obrazowych koncentruje się na utracie właściwego unaczynienia kory nerkowej Diagnostyka histopatologiczna Biopsje protokolarne Od początku lat 70. biopsja jest ciągle złotym standardem w ocenie zmian strukturalnych w przeszczepionym narządzie. Materiał pochodzi z całego usuniętego narządu lub, głównie w celach diagnostycznych, z biopsji gruboigłowej. Biopsja cienkoigłowa praktycznie nie ma zastosowania w diagnostyce zmian w przeszczepionej nerce. Czułość analizy mikroskopowej przypadku pojedynczego bioptatu wynosi 90%, a w przypadku dwóch bioptatów 99%. Pełna analiza bioptatu obejmuje ocenę w mikroskopii świetlnej, barwienia HE, PAS, srebrzenie, barwienie na włókna elastynowe, analizę na obecność złogów składowej dopełniacza C4d metodami immunohistochemicznymi. Od 1995 roku wprowadzono ujednoliconą ocenę zmian histopatologicznych w oparciu o klasyfikację banffijską [Tabela IV]. U blisko 30% pacjentów ze stabilną funkcją nerki przeszczepionej może rozwinąć się proces subklinicznego odrzucania, bez pogorszenia funkcji nerki i bez wzrostu poziomu kreatyniny w surowicy krwi. Wydaje się, że wprowadzenie ujednoliconego protokołu wykonywania biopsji w ściśle określonych odstępach czasu po transplantacji miałoby wpływ na wyniki odległe po przeszczepie. Wskazania Najczęściej wykonuje się biopsje w przypadku pogorszenia funkcji nerki przeszczepionej, gdy obraz kliniczny i badania obrazowe nie pozwalają na jednoznaczną ocenę rodzaju procesu patologicznego. W wielu ośrodkach stosuje się biopsje protokolarne, w celu wcześniejszego wykrycia stanów subklinicznych. Technika biopsji Dla wykonania biopsji niezbędna jest świadoma zgoda pacjenta, ze względu na możliwe powikłania zabiegowe. Przed samą biopsja wymagane jest zbadanie układu krzepnięcia i ustabilizowanie ciśnienia tętniczego krwi w przedziale poniżej 160/100 mmhg. W przypadku pacjentów dializowanych ważne jest, aby zabieg nie był wykonywany tuż po lub tuż przed hemodializą. Do umiejscowienia nerki stosuje się technikę palpacyjną, lub obrazowanie ultrasonograficzne. Dla optymalnego umiejscowienia igły biopsyjnej, zwykle w najbardziej dostępnym palpacyjnie biegunie nerki, wskazana jest asysta ultrasonograficzna. W niektórych ośrodkach sto- Tabela IV. Klasyfikacja z Banff zaktualizowana w 2005 Table IV. The Banff classification (2005 update) Klasyfikacja z Banff Prawidłowy obraz 2. Odrzucanie związane z obecnością przeciwciał (Ab-mediated rejection; AMR): a. Natychmiastowe (nadostre odrzucanie) b. Ostre odrzucanie humoralne AMR (delayed, de novo) c. Przewlekłe aktywne AMR 3. Podejrzenie odrzucania komórkowego (suspicious of cellular rejection; dawniej: borderline changes) 4. Ostre odrzucanie komórkowe: a. Ostre: śródmiąższowo-cewkowe (IA, IB) naczyniowe (IIA, IIB, III) b. Przewlekłe aktywne odrzucanie komórkowe (arteriolopatia przeszczepu)

16 16 suje się przystawkę biopsyjną. Praktycznym standardem w biopsjach jest automatyczny pistolet z mechanizmem sprężynowym oraz igły jednorazowe Tru-cat (śrenica 18 mm). Na Oddziale Transplantologii Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu stosowany jest pistolet Bard Magnum Instrument MG1522. Dla otrzymania reprezentatywnego materiału zalecane jest pobranie dwóch bioptatów. Obraz histopatologiczny Najczęściej obserwowane są trzy typy odrzucania: nadostre, ostre i przewlekłe, choć możliwe jest równoczesne występowanie tych procesów. Każdy z nich posiada inny obraz morfologiczny. Nadostre odrzucanie Nadostre odrzucanie wywołane jest obecnością preformowanych przeciwciał cytotoksycznych i jest zjawiskiem rzadko spotykanym w przypadku wykonywania testów krzyżowych cross-match. Charakterystyczna jest gwałtownie rozwijająca się zakrzepica w naczyniach krwionośnych, głównie tętnicach, tętniczkach i kapilarach kłębuszkowych. W czasie pierwszych godzin po przeszczepieniu w naczyniach tych gromadzą się głównie neutrofile i płytki krwi, które zaczynają przylegać do komórek śródbłonka. Sama nerka jest zwykle silna, nieznacznie obrzęknięta, natomiast klinicznie obserwuje się gwałtowny spadek produkcji moczu lub całkowity brak podjęcia funkcji przez przeszczep. W badaniu immunofluorescencyjnym stwierdza się obecność immunoglobulin (Ig) klasy G lub M, składowej dopełniacza C3, włóknika w ścianie naczyń tętniczych, kapilar okołocewkowych i kapilar kłębuszkowych oraz w obrębie zakrzepów. W mikroskopie elektronowym we wczesnym okresie obserwuje się związaną z perfuzją degenerację i martwicę komórek śródbłonka naczyń. Ostre odrzucanie Występuje najczęściej w pierwszych tygodniach i miesiącach po transplantacjach. Wyróżnia się ostre odrzucanie komórkowe i ostre odrzucanie humoralne. W 70% jest to odrzucanie komórkowe, w 25% mieszane odrzucanie komórkowo-humoralne, w 5% odrzucanie humoralne. Ostre odrzucanie komórkowe Najczęstsza forma odrzucania we wczesnym okresie po przeszczepieniu, rozwijająca się de novo po transplantacji. W zależności od lokalizacji zmian wyróżnia się postacie: śródmiąższowo-cewkową i naczyniową. Główną procedurą diagnostyczną jest stwierdzenie obecności złogów C4d w badaniu immunofluoroscencyjnym oraz analiza w mikroskopie świetlnym. W postaci śródmiąższowo-cewkowej ostrego odrzucania komórkowego w tkance śródmiąższowej dochodzi do rozległego obrzęku i nacieku komórek leukocytarnych, głównie transformowanych, dojrzałych limfocytów T CD4+ i T CD8+ oraz monocytów i plazmocytów. Cechą charakterystyczną jest tubulitis, czyli naciekanie błony podstawnej cewek nerkowych przez limfocyty T i monocyty oraz naciek nabłonka cewkowego [Tabela V] [25]. W ostrym odrzucaniu naczyniowym dochodzi do nacieku rejonu podśródbłonkowego naczyń tętniczych przez limfocyty, monocyty i komórki piankowate, z reguły bez naciekania błony mięśniowej. Widoczny jest obrzęk i wakuolizacja komórek śródbłonka, podczas gdy martwica ściany tętnic nie jest charakterystycznym obrazem [Tabela VI]. Tabela V. Obraz morfologiczny w ostrym odrzucaniu komórkowym Table V. Morphology of acute cell-mediated renal rejection Naciek zapalny w nabłonku cewkowym (tubulitis) Zmiany zapalne śródmiąższowe Ostre odrzucanie śródmiąższowo-cewkowe T1 miernie nasilone tubulitis (na przekroju poprzecznym < 4 jednojądrowych komórek zapalnych) T2 umiarkowanie nasilone tubulitis (na przekroju poprzecznym 5 10 jednojądrowych komórek zapalnych) T3 nasilone tubulitis (na przekroju poprzecznym > 10 jednojądrowych komórek zapalnych) i1 miernie nasilone ostry naciek zapalny obejmuje 10 do 25% dostępnej ocenie powierzchni kory nerki i2 umiarkowanie nasilone ostry naciek zapalny obejmuje > 25% dostępnej ocenie powierzchni kory nerki i3 miernie nasilone ostry naciek zapalny obejmuje > 50% dostępnej ocenie powierzchni kory nerki Podejrzenie odrzucenia komórkowego (suspicious of rejection): i1 współistniejące z t1, t2, t3, lub t1 współistniejące z i2 lub i3 Ostre odrzucanie śródmiąższowo-cewkowe: IA miernie nasilone (t2 współistniejące z i2 lub i3) IB nasilone (t3 współistniejące z i2 lub i3)

17 17 Ostre komórkowe odrzucanie naczyniowe często współwystępuje z odrzucaniem śródmiąższowo-cewkowym. Ostra glomerulopatia przeszczepu jest jedną z form ostrego odrzucania komórkowego. W procesie tym dochodzi do gromadzenia limfocytów i monocytów w świetle kapilar kłębuszkowych i mezangium, co powoduje ich obrzęk. W ostrym odrzucaniu komórkowym badanie immunofluorescencyjne pokazuje najczęściej złogi włóknika w śródmiąższu, podczas gdy w glomerulopatii można stwierdzić obecność złogów IgM i C3 oraz włóknika w ścianie kapilar kłębuszków. Brak jest natomiast złogów C4d w kapilarach okołocewkowych [25]. Rycina III. Ostre komórkowe odrzucanie przeszczepu (IB). W śródmiąższu obfite nacieki złożone głównie z komórek typu limfocyta [HE, x180]. Illustration III. Acute cell-mediated renal rejection (IB). Severe interstitial infiltration with mononuclear cells (mostly lymphocyte-type) [HE, x180]. Tabela VI. Obraz morfologiczny w ostrym odrzucaniu naczyniowym Table VI. Morphology of acute vascular renal rejection Obraz morfologiczny w ostrym odrzucaniu naczyniowym Ostre odrzucanie naczyniowe V1 miernie nasilone endarteritis (redukcja światła tętnicy w stanie zapalnym < 25%) V2 nasilone endarteritis (redukcja światła tętnicy w stanie zapalnym > 25%) V3 nasilone pełnościenne lub martwicze zapalenie ściany tętnicy IIA miernie nasilone, gdy V1 IIB nasilone, gdy V2 III nasilone, gdy zapalenie obejmuje całą ścianę tętnicy, z ewentualną martwicą ściany tętnicy

18 18 Rycina IV. Ostre naczyniowe odrzucanie przeszczepu (IIA). Naczynie śródmiąższowe otoczone przez miernie nasilony naciek złożony głównie z komórek jednojądrzastych typu limfocyta. Widoczne obrzmienie cytoplazmy komórek śródbłonka [HE, x 200]. Illustration IV. Acute vascular kidney rejection (IIB). Mild infiltration of mononuclear cells (mostly lymphocyte-type) around the interstitial vessel. Swelling of the interstitial cell cytoplasm [HE, x 200]. Rycina V. Obecność złogów C4d w ścianach naczyń włosowatych okołocewkowych. Barwienie immunofluorescencyjne z użyciem przeciwciała anty-c4d. Illustration V. Complement C4d deposits in peritubular capillaries. Immunofluorescence staining with anti-c4d monoclonal antibodies.

19 19 Ostre odrzucanie humoralne Wyróżnia się dwa typy ostrego odrzucania: klasyczny naczyniowy i odrzucanie z obecnością złogów C4d, ale bez zmian w naczyniach. Naczyniowy typ jest rzadszy. Charakteryzuje się martwiczym zapaleniem ścian tętnic oraz śródściennymi złogami włóknika, naciekiem zapalnym limfocytów, neutrofili i monocytów. Śródbłonek jest w istotny sposób uszkodzony lub nie występuje. Często dochodzi do wykrzepiania w świetle naczyń. W obrazie immunofluorescencyjnym w odrzucaniu humoralnym stwierdza się obecność złogów IgG, niekiedy IgM i C3 w obrębie ścian tętnic [25]. W typie humoralnym odrzucania naczyniowego występuje martwica ścian tętnic, obecność nacieku neutrofilii oraz zakrzep w świetle naczyń. Częstszą formą jest obecność rozlanych złogów C4d w kapilarach okołocewkowych (peritubular capillaries; PTC). Złogi C4d są głównym kryterium rozpoznawczym odrzucania humoralnego i powstają z rozpadu zaktywowanej w procesie ostrego odrzucania, składowej dopełniacza C4. Najbardziej miarodajne wyniki oznaczenia złogów C4d otrzymuje się w preparatach z tkanki mrożonej [Rycina V]. Przewlekła nefropatia przeszczepu Jak już wspomniałem, określenie przewlekła nefropatia przeszczepu (chronic allograft nephropathy; CAN) praktycznie całkowicie wyparło z nazewnictwa określenie przewlekłe odrzucanie (chronic rejection; CR) [35 36]. Charakterystyczne są zmiany w tętnicach, cewkach, kłębuszkach i śródmiąższu [Rycina VI]. Patogeneza jest bardzo zróżnicowana i może być wynikiem wielokrotnego klinicznie ujawnionego lub subklinicznego procesu ostrego odrzucania. Przewlekłe zmiany mogą być wyrazem różnych form uszkodzenia o podłożu immunologicznym lub nieimmunologicznym. Zmiany patologiczne występują głównie w korze nerki, gdzie dochodzi do ogniskowego włóknienia zrębu, zaniku cewek wraz z naciekiem limfocytów, plazmocytów i komórek tucznych. W ścianach tętnic dochodzi do pogrubienia w związku z rozplemem tkanki łącznej włóknistej, szczególnie w obrębie błony wewnętrznej, czasami w błonie środkowej oraz nacieku jednojądrzastych komórek zapalnych [25]. W badaniu immunofluorescencyjnym stwierdza się obecność złogów IgG, IgM, C3 i włóknika w ścianie naczyń. W przypadku przewlekłej glomerulopatii przeszczepu, która jest wyrazem przewlekłego odrzucania humoralnego, ściany kapilar są pogrubiałe przez podwójne okonturowanie ich światła, a w badaniu immunomorfologicznym stwierdza się złogi IgM, C1q i C3 w mezangium i ścianach kapilar oraz linijne złogi włóknika w kapilarach. Błona podstawna kapilar jest pogrubiała i zwielokrotniona. W mikroskopii elektronowej obserwuje się przemieszczenie mezangium w rejon obwodowych kapilar, syntezę nowej błony podstawnej i obecność materiału w rejonie podśródbłonkowym [25]. Do oceny stopnia nasilenia zmian histopatologicznych w przewlekłej nefropa- Rycina VI. Przewlekłe odrzucanie przeszczepu. Ściana dużego naczynia śródmiąższowego. Światło wąskie. W ścianie, zwłaszcza w warstwie wewnętrznej nacieki zapalne. Niewielkie nacieki w sąsiedztwie [HE, x 200]. Illustration VI. Chronic nephropathy. Wall of large interstitial vessel. Narrow lumen. Visible inflammatory infiltrations. [HE, x 200].

20 20 tii wprowadzono wskaźnik zaawansowania przewlekłej nefropatii przeszczepu (chronic allograft disease index; CADI). Może on być pomocny w określeniu rokowania i oceny interwencji terapeutycznej Nowoczesne metody rozpoznawania procesu odrzucania nerki Ze względu na fakt, że biopsje są inwazyjną techniką monitorowania i nie mogą być wykonywane zbyt często, nie są również optymalnym narzędziem diagnostycznym w transplantologii. Idealna metoda monitorowania reakcji odrzucenia przeszczepionego narządu powinna charakteryzować się: i) wczesną wykrywalnością procesu odrzucania; ii) możliwością stałego monitorowania odpowiedzi allogenicznej w trakcie leczenia immunosupresyjnego; iii) małoinwazyjnością; iv) relatywnie niskim kosztem procedury. Pomimo faktu, że biopsja jest wciąż uznawana za złoty standard w diagnostyce transplantacji nerek [37], poszukuje się nowych metod monitorowania różnorodnych biomarkerów wskazujących na stan układu immunologicznego biorcy. Metody te powinny umożliwić wczesne wykrycie zagrożenia odrzucenia alloprzeszczepu, optymalizację schematu leczenia immuno-supresyjnego oraz odróżnienie reakcji odrzucenia od innych stanów patologicznych narządu. Oprócz rozpoznawania niespecyficznych symptomów, które mogą towarzyszyć procesowi odrzucania nerki, takich jak: spadek produkcji moczu, nadciśnienie tętnicze, nadwrażliwość przeszczepu czy obrzęk graftu, najczęściej stosowaną metodą monitoringu w okresie posttransplantacyjnym jest kontrola poziomu kreatyniny w surowicy krwi. Metoda ta jest stosunkowo prosta i tania, lecz niesatysfakcjonująca, istnieje bowiem szereg procesów patologicznych powodujących spadek filtracji kłębuszkowej i wzrost stężenia kreatyniny w surowicy krwi. Poszukiwanie odpowiednich wczesnych markerów ostrego odrzucania i przewlekłej nefropatii jest wciąż wyzwaniem w dziedzinie transplantologii. Jednym z najstarszych testów alloreaktywności jest reakcja mieszanych limfocytów (mixed lymphocyte reaction; MLR). W teście tym miesza się inaktywowane komórki dawcy z limfocytami biorcy i ocenia stopień proliferacji komórek biorcy, głównie limfocytów T CD4. Na podstawie pomiaru stopnia wbudowania tymidyny znakowanej trytem do dzielących się komórek w odpowiedzi na HLA klasy II limfocytów dawcy możliwe jest określenie zdolności odpowiedzi limfocytów biorcy. Kolejny test to limfoliza zależna od komórek (cellmediated lympholysis; CML), w którym mierzy się stopień niszczenia komórek dawcy przez limfocyty T CD8+. Ocena intensywności tej reakcji określa zdolność limfocytów T cytotoksycznych do wiązania antygenów HLA klasy I dawcy. Zastosowanie kliniczne tych testów jest jednak ograniczone w związku z brakiem ścisłej korelacji MLR i CML z klinicznym przebiegiem procesu odrzucania. Inny sposób badania odpowiedzi immunologicznej po przeszczepieniu polega na mieszaniu limfocytów T biorcy z peptydami odpowiadającymi sekwencji aminokwasów cząsteczek MHC dawcy. Wynik tego badania może odzwierciedlać pośrednie rozpoznanie antygenu i może być przydatne w celach prognostycznych w kierunku przewlekłego odrzucania. Kolejną metodą, którą stosuje się przy monitorowaniu stanu układu immunologicznego biorcy jest pomiar liczby alloreaktywnych limfocytów T we krwi za pomocą ELI- SPOT (enzyme-linked immunosorbent assay). Metoda ta umożliwia ocenę liczby alloreaktywnych limfocytów T produkujących IFN-γ w reakcji na komórki lub peptydy. Nie ustalono jednak dokładnej korelacji między klinicznym obrazem odrzucania a liczbą komórek produkujących IFN-γ. W innych testach ocenia się również czynność limfocytów B lub liczbę swoistych alloprzeciwciał. Jednym z bardziej obiecujących w ostatnim czasie narzędzi monitorowania odpowiedzi immunologicznej jest pomiar ekspresji genów cząsteczek odgrywających rolę w niszczeniu przeszczepu oraz cytokin. Przykładem mogą być badania, w których wykazano stosunkowo duży stopień korelacji pomiędzy obrazem histopatologicznym odrzucania a stężeniem mrna dla perforyny, granzymu B i ligandu Fas [38 39] oraz różnych cytokin prozapalnych [40 41] w materiale biopsyjnym. Metody te wymagają jednak wcześniejszego wykonania biopsji oraz stosunkowo wysokich nakładów finansowych. W celu redukcji stopnia inwazyjności oraz uproszczenia procedury coraz częściej w transplantologii próbuje się stosować monitoring immunologiczny biorców z wykorzystaniem płynów ustrojowych, takich jak krew pełna, surowica i mocz [42 43]. Takie podejście ma wiele zalet. Przede wszystkim metody te nie stanowią dodatkowego zagrożenia dla pacjenta ze względu na swą mało- lub nieinwazyjność. Procedury pobierania próbek są łatwe i zapewniają pełną powtarzalność oraz stały monitoring immunologiczny. Odpowiednie przechowywanie oraz obróbka próbek zapewniają stabilność pod względem temperatury, ph i okresu przechowywania. Z kolei sam proces analizy próbek najczęściej charakteryzuje się stosunkowo niskim kosztem i dużą wydajnością. Dotychczasowym ograniczeniem monitoringu immunologicznego opartego na analizie próbek płynów ustrojowych jest natomiast brak jednoznacznych wczesnych biomarkerów procesu odrzucania przeszczepionego narządu. Stosowane metody powinny bowiem charakteryzować się wysoką czułością i swoistością w kierunku procesu odrzucania narządu. Powinny również umożliwiać rozróżnianie różnych stanów dysfunkcji przeszczepionego narządu Cytokiny jako biomarkery ostrego i przewlekłego odrzucania przeszczepu W roku 1986 Mosmann i Coffman zaobserwowali, że długotrwała stymulacja mysich pomocniczych limfocytów T (Th) CD4+ odpowiednimi antygenami skutkuje ściśle ukierunkowanym rozwojem komórek [44]. U ludzi przejawia się to restrykcyjnym wzorem produkowanych