GLIKOZOAMINOGLIKANY: metody rozdziału i oznaczania

Transkrypt

1 GLIKOZOAMINOGLIKANY: metody rozdziału i oznaczania Glikozoaminoglikany (GAG) stanowią heterogenną grupę polisacharydów wchodzących w skład substancji podstawowej (matrix) tkanki łącznej. Razem z kolagenem i elastyną warunkują mechaniczne właściwości tkanki łącznej, są odkształcalne i względnie nieprzepuszczlne dla wody. Ponadto GAG pełnią ważne role biologiczne jako: 1/ stabilizatory, kofaktory i/lub koreceptory dla czynników wzrostu, cytokin i chemokin; 2/ cząsteczki regulujące aktywność enzymów; 3/ cząsteczki sygnałowe w odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia, infekcje i inicjacje kancerogenezy; 4/ cząsteczki regulujące adhezję drobnoustrojów patogennych i funkcjonowanie układu odpornościowego. Łańcuchy polisacharydowe GAG zbudowane są z powtarzających się podjednostek dwucukrowych, złożonych z heksozoaminy i kwasu uronowego. Wyjątek stanowi siarczan keratanu, którego podjednostka zbudowana jest z glukozoaminy i galaktozy. Charakterystycznym składnikiem chondroitynosiarczanów jest galaktozoamina. Pozostałe związki zawierają glukozoaminę. W skład GAG wchodzi głównie kwas beta-d-glukuronowy (Ryc. 1), jednak siarczan dermatanu (chondroitynosiarczan B) zawiera kwas alfa-l-iduronowy (izomer kwasu glukuronowego) a siarczan heparanu i heparyna zarówno kwas glukuronowy, jak i iduronowy. Ryc. 1. Kwas glukuronowy Z wyjątkiem kwasu hialuronowego i chondroityny, wszystkie GAG zawierają grupy siarczanowe, połączone przez atom tlenu a heparyna i siarczan heparanu zawierają też grupy

2 siarczanowe połączone przez atom azotu. Ugrupowania te, razem z grupami N-acetylowymi, warunkują ujemny ładunek cząsteczek GAG (Tabela 1). 2 Tabela 1. Budowa różnych klas glikozoaminoglikanów Rodzaj GAG Disacharyd U H Modyfikacje Kwas hialuronowy GlcA( 1,3) H NAc ( 1,4) GlcA glukozoamina brak Siarczan chondroityny/siarczan dermatanu U 2X ( / 1,3) H NAc, 4X, 6X ( 1,4) Siarczan keratanu Gal 6X ( 1,4) H NAc, 6X ( 1,3) IdoA/ GlcA galaktozoamina X - siarczan Gal glukozoamina X - siarczan Heparyna/siarczan U 2X ( / 1,4) IdoA/ GlcA glukozoamina X - siarczan heparanu H NY, 3X, 6X ( 1,4) Y - acetyl/siarczan GlcA - kwas -D-glukuronowy; IdoA - kwas -L-iduronowy; H - / -D-glukozoamina (GlcNAc) lub -D-galaktozoamina (GalNAc); Gal - -D-galaktoza; W warunkach in vivo GAG występują w postaci połączeń z białkami jako proteoglikany. Łańcuch polisacharydowy połączony jest z polipeptydem wiązaniem kowalencyjnym a region wiązania posiada specyficzna sekwencję: galaktoza-galaktoza-ksyloza-treonina. Proteoglikany chrząstek występują jako kompleksy z kwasem hialuronowym (Ryc. 2). Organizacja molekularna łańcucha GAG wokół rdzenia białkowego spełnia funkcję porównywalną z działaniem gąbki. Proteoglikany wchłaniają niezwykle duże ilości wody ze środowiska, w którym są zanurzone. Tzw. współczynnik pęcznienia wynosi 30-50x wartości suchej masy proteoglikanu. Właściwości te wynikają z budowy przestrzennej proteoglikanu. Ujemnie naładowane łańcuchy GAG obracają się wokół rdzenia białkowego jak na zawiasach i wystają na zewnątrz cząsteczki. Pozwala to na penetrację dużych ilości rozpuszczalnika, czyli wody. Jednak w warunkach in vivo proteoglikany w substancji podstawowej tkanki łącznej nie chłoną maksymalnej ilości wody, powstrzymywane przez siatkę kolagenową, względnie nierozciągliwą. Takie właściwości hydrodynamiczne pozwalają na połączenie cech sztywności i odkształcalności. Z upływem wieku, siarczan chondroityny w chrząstce ustępuje miejsca siarczanowi keratanu, co usztywnia tkankę.

3 3 Oligosacharydy połączone przez atom azotu Rdzeń białkowy Siarczan keratanu Sairczan chondroityny Kwas hialuronowy Ryc. 2. Struktura cząsteczki proteoglikanu Kwas hialuronowy (HA) jako składnik proteoglikanów odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu integralności tkanek, przede wszystkim skóry, chrząstek i innych rodzajów tkanek łącznych, ułatwia również migrację i proliferację komórek w procesach zapalnych, gojeniu się ran, rozwoju zarodkowym i angiogenezie. Kwas hialuronowy zapewnia właściwe nawodnienie tkanek i amortyzuje urazy. Ten polisacharyd odpowiada również za prawidłowe wykształcenie i funkcjonowanie strun głosowych, zapewniając im odpowiednią elastyczność. W chrząstkach proteoglikany zawierające HA agregują z białkami tworząc kompleksy agrekany, nadające chrząstkom unikalne cechy żelu i właściwości mechaniczne. Skóra, gałka oczna i chrząstka szklista są tkankami o największej zawartości kwasu hialuronowego w organizmie ludzkim. Kwas hialuronowy zbudowany jest z naprzemiennie ułożonych czasteczek kwasu glukuronowego i N-acetyloglukozoaminy, powtórzenia tych podjednostek wystepują ok. 2000x. Jego synteza następuje na powierzchni błony komórkowej, dzięki reakcjom katalizowanym przez syntazę hialuronianową. W porównaniu z innymi cząsteczkami środowiska zewnątrzkomórkowego, HA charakteryzuje się szybkim metabolizmem. Jego degradacja zachodzi w odległych gruczołach limfatycznych a fragmenty zdegradowanego HA krążą z limfą. W katabolizmie HA biorą udział dwa typy hialuronidaz, enzymy lizosomalne: betaglukuronidaza i beta-n-acetyloglukozoaminidaza oraz receptor dla produktów rozpadu hialuronianu, znajdujący się na powierzchni komórek wątroby, dzięki któremu te fragmenty wchodzą do komórek na drodze endocytozy. Katabolizm HA przebiega wieloetapowo, produktem każdego etapu są krótsze łańcuchy glikozoaminoglikanu, o zróżnicowanych

4 4 funkcjach biologicznych. Oligomery o masie rzędu 1x10 4 kda działają jako wypełniacze przestrzeni międzykomórkowych, utrzymują ich nawodnienie, zapobiegają angiogenezie (tworzeniu nowych naczyń krwionośnych) oraz działają immunosupresyjnie. Mniejsze polimery o masie ok 20 kda działają stymulująco na układ odpornościowy i angiogenezę oraz prozapalnie. Obecność kwasu hialuronowego o krótkich łańcuchach w płynie stawowym pogarsza jego lepkość i odpowiada za dolegliwości bólowe w zapaleniu stawów. Dalsza degradacja kwasu hialuronowego produkuje jeszcze krótsze łańcuchy, indukujące syntezę białek szoku cieplnego i hamujących apoptozę (programowaną śmierć komórek). Pojedyncze cząsteczki sacharydowe, kwas glukuronowy i glukozoamina, uwalniane są z lizosomów komórek do cytoplazmy, gdzie staja się dostępne do dalszych przemian metabolicznych. W organizmie człowieka o masie ok. 70 kg znajduje się ok. 15 g kwasu hialuronowego, z czego dziennie ok. 5 g podlega katabolizmowi i resyntezie. Poziom wolnego kwasu hialuronowego w osoczu krwi jest niski, gdyż w warunkach prawidłowych HA zatrzymywany jest w tkankach przez włókna kolagenowe. Zwiększenie stężenia HA w krwi przyspiesza proces krzepnięcia. Heparyna powstaje i jest magazynowana w komórkach tucznych i jest z nich uwalniana podobnie jak histamina. Pokrewny GAG, siarczan heparanu, wbudowany w proteoglikan, znajduje się na powierzchni komórek wielu tkanek i w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Zlokalizowane na powierzchni komórek proteoglikany zawierające siarczan heparanu, pełnią istotne funkcje w rozwoju zarodkowym. Heparynie i siarczanowi heparanu przypisuje się działanie przeciwzapalne, niezależnie od działania przeciwkrzepliwego, charakterystycznego dla wszystkich siarczanowych GAG i ich proteoglikanów. Handlowa niefrakcjonowana heparyna jest mieszaniną min. 21 łańcuchów o zawartości od 6 do 30 podjednostek disacharydowych o różnym stopniu właściwości antykoagulacyjnych. Działania to polega na stymulacji antytrombiny (dawniej antytrombiny III), enzymu rozkładającego trombinę. Heparyna łącząc się z antytrombiną powoduje zmianę jej konformacji przestrzennej, stwarzając korzystniejsze miejsce wiązania enzymu z substratem. Obecność kwasu iduronowego i wielu grup siarczanowych szczególnie sprzyjają aktywności antykoagulacyjnej. Obecnie leczniczo stosuje się heparyny o niskiej masie cząsteczkowej i zdefiniowanej liczbie podjednostek, gdyż ta forma daje przewidywalne skutki terapeutyczne, zależne od dawki i jest przyczyną mniejszej liczby powikłań krwotocznych. Jako składniki ścian naczyń krwionośnych, heparyna i inne siarczanowe GAG nadają im właściwości antykoagulacyjne. Heparyna jest również aktywatorem enzymu lipazy lipoproteinowej, rozkładającej osoczowe triglicerydy. Trójwymiarowa struktura proteoglikanów w matrix tkanki łącznej ścian naczyń tętniczych stanowi filtr, na którym zatrzymują się makrocząsteczki, np. lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) i o bardzo niskiej gęstości (VLDL), tworząc lipidowe nacieczenia w ścianie naczynia. Te dodatnio naładowane

5 5 kompleksy białkowo-lipidowe tworzą wiązania jonowe z ujemnie naładowanymi cząsteczkami GAG a obecność w środowisku kationów dwuwartościowych, zwłaszcza Ca(II), zmniejsza rozpuszczalność tych złogów, stając się zaczątkiem blaszki miażdżycowej. Niskocząsteczkowe i niefrakcjonowane heparyny zakłócają procesy wzrostu nowotworów i przerzutowania, prawdopodobnie na drodze hamowania interakcji pomiędzy komórkami i opóźniania angiogenezy. Siarczan keratanu (KS I, łączy się z białkiem za pośrednictwem atomu azotu z aminokwasu asparaginy) jest głównym składnikiem proteoglikanów występujących w rogówce, w postaci kompleksów z białkami obfitującymi w leucynę lumikanu i keratokanu. Kompleksy te są niezbędne w zarodkowym rozwoju tkanek oka i ich funkcjonowaniu u dorosłego. Ich działanie polega na regulacji formowania się włókien kolagenu, ponadto lumikan oddziałuje na migrację komórek i gojenie się ran. W chrząstce występuje KS II, który łączy się z białkiem za pośrednictwem atomu tlenu z aminokwasów seryny lub treoniny. Zawartość i skład GAG i proteoglikanów ulega zmianom w procesach patologicznych przebiegających w obrębie tkanki łącznej. W genetycznie uwarunkowanych schorzeniach mukopolisacharydozach, obserwuje się wzrost poziomu GAG w tkankach i ich wzmożone wydalanie z moczem. Spowodowane to jest brakiem niektórych enzymów lizosomalnych degradujących GAG, dochodzi zatem do ich akumulacji w tkankach (głównie siarczanów heparanu, keratanu i dermatanu). Glikozoaminoglikany wydalane z moczem można wyizolować, wytrącając je czwartorzędowymi solami amoniowym (chlorek cetylopirydyniowy, CPC) i po oczyszczeniu poddać elektroforezie, co pozwala na stwierdzenie obecności poszczególnych GAG. Oznaczenie np. ilości kwasów uronowych lub aminocukrów w wyizolowanych GAG ocenia łączne stężenie tych związków w moczu. I. IZOLACJA GAG Z DOBOWEJ ZBIÓRKI MOCZU 1. Mocz z dobowej zbiórki wymieszać, doprowadzić ph do ok. 6, odmierzyć 20 ml do probówki o poj. 50 ml, dodać 10 ml wody dest. i 1 ml wodnego roztworu 5% chlorku cetylopirydyniowego, zamieszać bagietką i odstawić do temp. + 4 o C, na co najmniej 12 godz. 2. Odwirować 20 min. przy 3000 rpm w temp. + 4 o C, odrzucić nadsącz. 3. Do osadu dodać 10 ml 95% etanolu nasyconego chlorkiem sodowym, zamieszać bagietką i odstawić do temp. + 4 o C, na co najmniej 12 godz.

6 6 4. Odwirować 20 min. przy 3000 rpm w temp. + 4 o C, odrzucić nadsącz, dodać ponownie 10 ml 95% etanolu nasyconego chlorkiem sodowym, zamieszać bagietką i odstawić do temp. + 4 o C, na co najmniej 12 godz. 5. Odwirować 20 min. przy 3000 rpm w temp. + 4 o C, odrzucić nadsącz, osad wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza lub w eksykatorze próżniowym. Wysuszony osad rozpuścić: a/ w 5 ml 0,075 mol/l NaCl (do oznaczenia kwasów uronowych); b/ w 0,5 ml 0,075 mol/l NaCl (do elektroforezy) II. ELEKTROFOREZA GAG NA PASKACH OCTANU CELULOZY 1. Zanurzyć przycięte paski octanu celulozy w buforze (0,1 mol/l octan cynku) na 20 min. 2. Osuszyć pasek miedzy dwoma arkuszami bibuły i umieścić w komorze do elektroforezy. Podłączyć prąd (2 ma/cm szerokości paska). Preelektroforezę prowadzić przez 10 min. 3. Nałożyć po 5 l odpowiednich wzorców i roztworu GAG wyizolowanych z moczu. Elektroforezę prowadzić przez 2 godziny. 4. Po zakończeniu rozdziału elektroforetycznego paski barwić przez 15 min. w 0,25% roztworze Błękitu Alcjanu, rozpuszczonego w mieszaninie metanolu, kwasu octowego i wody (50:5:45). 5. Po zakończeniu barwienia paski przepłukać delikatnie pod bieżąca wodą i odbarwić tło zanurzając w 5% kwasie octowym (3x5 min.). III. OZNACZANIE GAG ELUOWANYCH Z OCTANU CELULOZY 1. Wyciąć z paska plamy odpowiadające rozdzielanym GAG (próba badana) i analogiczne co do wielkości fragmenty z niezabarwionego obszaru paska (próba odniesienia). 2. Wycięte próbki umieścić w probówkach chemicznych i dodać do każdej po 1, 5 ml 5% roztworu CPC. 3. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 min., w celu wyekstrahowania barwnika związanego z GAG. 4. Probówki ochłodzić, odczytać absorbancję prób badanych wobec odpowiadających im prób odniesienia, przy dł. fali 615 nm. Wyniki odczytać z krzywej wzorcowej.

7 7 IV. OZNACZANIE KWASÓW URONOWYCH W GAG WYIZOLOWANYCH Z MOCZU. 1. Do 3 ml zimnego roztworu 0,025 mol/l czteroboranu sodowego w stężonym kwasie siarkowym (probówki trzymać w lodzie) dodać 0,5 ml roztworu GAG. Do próby odniesienia dodać 0,5 ml 0,075 M chlorku sodowego. Ostrożnie zamieszać. 2. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 min. 3. Probówki ochłodzić do temp. pokojowej, dodać do każdej po 0,1 ml 0,125% karbazolu w bezwodnym metanolu. 4. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min. 5. Probówki oziębić, odczytać absorbancję przy dł. fali 530 nm, wobec próby odniesienia. Wyniki odczytać z krzywej wzorcowej. LITERATURA Obowiązujące podręczniki do nauki biochemii i dołączony artykuł (Postępy Biochemii, 1995, tom 41, str ). Chemia fizyczna: fizykochemiczne podstawy procesu elektroforezy.