PL B1. ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL BUP 14/12

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12P 7/18 ( ) C12P 7/40 ( ) C07C 31/20 ( ) B01D 61/36 ( ) B01D 61/00 ( ) (54) Sposób fermentacji glicerolu z jednoczesnym usuwaniem produktów ubocznych (73) Uprawniony z patentu: ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 14/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/14 (72) Twórca(y) wynalazku: MAREK GRYTA, Szczecin, PL AGATA MARKOWSKA-SZCZUPAK, Szczecin, PL WIRGINIA TOMCZAK, Bydgoszcz, PL ANTONI WALDEMAR MORAWSKI, Szczecin, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Renata Zawadzka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób fermentacji glicerolu. Podczas produkcji biopaliw powstają znaczne ilości odpadowego glicerolu. Jedną z możliwości jego zagospodarowania jest uzyskanie na drodze fermentacji poszukiwanych związków, jak 1,3 propanodiol lub kwasy karboksylowe, np. mlekowy lub octowy. Właściwości mikroorganizmów występujących w środowisku naturalnym oraz specyfika procesu fermentacji sprawiają, że proces biokonwersji glicerolu do nowych, użytecznych produktów jest trudny i mało efektywny. Znane mikroorganizmy z reguły wytwarzają z glicerolu różne związki. Z tego względu mieszaninę po fermentacji należy podać wieloetapowemu oczyszczaniu i rozdziałowi. W patencie WO 2004/ do oczyszczania roztworu 1,3 propanodiolu otrzymanego podczas fermentacji zastosowano najpierw trójetapową filtrację (mikro-, a po niej ultrafiltrację i nanofiltrację), co pozwala uzyskać klarowny roztwór z częściowo usuniętymi jonami wielowartościowymi. Obecne w otrzymanym filtracie kwasy organiczne i pozostałe jonowe zanieczyszczenia oddzielono następnie metodą wymiany jonowej. Tak oczyszczoną ciecz rozdestylowano metodą kilkukolumnowej destylacji, uzyskując jako jeden z destylatów czysty 1,3 propanodiol. Podobnie rozbudowany system oczyszczania zaprezentowano we wcześniejszym zgłoszeniu WO 01/ W tym przypadku po etapie mikrofiltracji (oddzielanie mikroorganizmów) zaproponowano selektywne wydzielanie bioproduktów za pomocą ich sorpcji na złożach zeolitowych sit molekularnych. Ciecz wypływającą z kolumn sorpcyjnych zaproponowano zawrócić do bioreaktora, co umożliwia prowadzenie ciągłego procesu fermentacji. Niezależnie od rodzaju zastosowanych mikroorganizmów proces fermentacji jest inhibitowany przez powstające produkty. Wytwarzane przez komórki metabolity z reguły są dla nich trujące, stąd trudno jest w bioreaktorze uzyskać wysokie końcowe stężenie produktów. Tą niedogodność można ograniczyć poszukując mikroorganizmów wykazujących większą odporność na metabolity lub dobierając odpowiednio warunki prowadzenia fermentacji. W zgłoszeniu WO 2011/ zaproponowano stosować bioreaktory z wypełnieniem, na którego powierzchni mikroorganizmy tworzą specyficzną błonę biologiczną. Żyjące w takiej warstwie mikroorganizmy są w pewien sposób odizolowane od bezpośredniego negatywnego wpływu środowiska bioreaktora, co pozwala zastosować wysokie stężenie substratów i uzyskać wyższe końcowe stężenia produktów. Takie rozwiązanie nie zapobiega jednak powstawaniu mieszaniny bioproduktów. W przypadku powstawania lotnych metabolitów można je selektywnie wydzielić z bioreaktora metodą odparowania. Z opisu patentowego PL znany jest układ do fermentacji połączony z instalacją do destylacji membranowej (MD), którą zastosowano do ciągłego wydzielania etanolu z fermentującej brzeczki. W rozwiązaniu zastosowano membrany uformowane w kształcie cienkich porowatych rurek, wykonanych z polipropylenu. Zadaniem zamontowanych membran jest utrzymywanie szczeliny gazowej pomiędzy fermentującym roztworem i skroplonym roztworem etanolu. Membrany nie są zwilżane przez fermentujący roztwór jak i roztwór etanolu, co umożliwia odparowanie oraz zapobiega filtracji stosowanej w typowych bioreaktorach membranowych. W patencie membrany kapilarne zamontowano w pozycji pionowej, a fermentująca brzeczka przepływała wewnątrz kapilar, natomiast roztwór chłodzący przestrzenią pomiędzy membranami kapilarnymi. Temperatura roztworu w bioreaktorach z reguły nie przekracza 313 K, co pozwala efektywnie odparowywać z brzeczki metabolity o temperaturze wrzenia zdecydowanie niższej od temperatury wrzenia wody (373 K). Glicerol i powstające podczas jego fermentacji metabolity, jak 1,3 propanodiol czy kwasy karboksylowe, posiadają temperaturę wrzenia znacznie wyższą, z reguły powyżej 400 K. Teoretycznie wyklucza to praktyczne zastosowanie MD do ich wydzielania z roztworów wodnych, zwłaszcza w niskiej temperaturze brzeczki. Niespodziewanie okazało się, że pomimo małej lotności metabolitów w fermentującym roztworze glicerolu zastosowanie procesu MD znacząco wpłynęło na zwiększenie efektywności pracy bioreaktora. Sposób fermentacji glicerolu w bioreaktorze z wykorzystaniem bakterii z jednoczesnym usuwaniem produktów charakteryzuje się tym, że fermentację prowadzi się w bioreaktorze membranowym równocześnie z procesem destylacji membranowej, w którym powstające podczas fermentacji lotne produkty częściowo usuwa się z fermentującego roztworu. Usuwanie lotnych metabolitów przez membrany w procesie destylacji membranowej sprawia, iż bakterie rozwijają się intensywniej (wyższe wartości CFU/ml), co sprzyja konwersji gliceryny do innych produktów. Kapilarne porowate membrany zanurza się w bioreaktorze bezpośrednio w fermentującym roztworze glicerolu w pozycji horyzontalnej, korzystnie umieszcza się je przynajmniej w 1/3 wysokości bioreaktora powyżej jego dna. Ciecz

3 PL B1 3 podawaną do wnętrza kapilar schładza się tak, aby jej temperatura wynosiła przynajmniej 8 stopni mniej niż temperatura fermentującego roztworu. Stosunek objętości brzeczki do powierzchni membran wynosi przynajmniej 0,22 m 3 /m 2. Stosuje się membrany wykonane z materiału hydrofobowego, korzystnie z polipropylenu. Po zakończeniu procesu fermentacji i usunięciu brzeczki zebrany destylat wykorzystuje się do płukania wnętrza bioreaktora i powierzchni membran. Po kilkakrotnym płukaniu najpierw destylatem, a później wodą stosowaną do procesu fermentacji, membrany nie wykazują spadku wydajności. Zastosowanie destylacji membranowej w procesie fermentacji glicerolu umożliwia prowadzenie procesu metodą dolewową półciągłą, gdyż zdecydowanie wydłuża pracę bioreaktora. W procesie tym wraz z truciznami odbieramy, w postaci destylatu, część objętości bioreaktora, co umożliwia nam dolewanie nowych partii glicerolu. W procesie destylacji membranowej, oprócz pary wodnej z brzeczki, wydzielane były także istotne ilości kwasu octowego i propionowego. Pozwoliło to ograniczyć spadek wartości ph brzeczki w bioreaktorze i zmniejszyć stężenie szkodliwych metabolitów, co pozytywnie wpłynęło na rozwój bakterii. W klasycznych bioreaktorach spadkowi wartości ph zapobiega się dodając do brzeczki roztwór NaOH. W efekcie powstają sole, co wywołuje niekorzystny wzrost ciśnienia osmotycznego, pogarsza warunki bytowe bakterii i w rezultacie powoduje skrócenie czasu eksploatacji bioreaktora. Sposób według wynalazku objaśniono w przykładach wykonania. P r z y k ł a d 1 Do fermentacji glicerolu zastosowano bakterie Lactobacillus casei. Bioreaktor membranowy składał się z termostatowanej w łaźni wodnej szklanej kolby kulistej o pojemności 0,002 m 3, szczelnie zamkniętej korkiem gumowym, wewnątrz której umieszczono moduł membranowy do destylacji membranowej (MD) w wersji zanurzeniowej (bez obudowy zewnętrznej). Moduł wykonano z kapilarnych membran polipropylenowych Accurel PP S6/2 (Membrana GmBH, Niemcy). Średnica kapilar d w /d z = 1,8/2,6 mm, średni rozmiar porów 0,22 m, porowatość 73%. W module zamontowano dwie kapilary, o długości 0,5 m każda, co odpowiadało powierzchni zewnętrznej modułu F zew = 0,00817 m 2. Membrany ułożono w bioreaktorze w pozycji horyzontalnej i umieszczono w 1/3 wysokości bioreaktora ponad jego dnem. Wlot i wylot modułu połączono poprzez korek zamykający kolbę z zewnętrznym obiegiem chłodzącym, w którym ciecz tłoczono pompą perystaltyczną. W chwili startowej obieg ten wypełniony był znaną ilością wody destylowanej (0,2-0,3 kg). Średnia temperatura w obiegu chłodzącym wynosiła 295 K, a natężenie przepływu recyrkulowanej cieczy wynosiło 0,15 kg/min. Temper a- tura fermentacji 308 K. Z wyznaczonego przyrostu masy cieczy w obiegu chłodzącym obliczano strumień destylatu wydzielanego z brzeczki przez jednostkę powierzchni membran w jednostce czasu trwania procesu MD, a z bilansu masowego strumienie jednostkowe poszczególnych ozn a- czonych składników. Do analizy składu roztworów zastosowano chromatograf cieczowy HPLC: Hitachi Elite La- Chrom, z detektorem UV-Vis L Użyto kolumnę: Rezex ROA Organic Acid 300 x 7,8 (Phenomenex) i roztwór kwasu siarkowego jako eluent. Wartość ph mierzono pehametrem ELMETRON TP1. Zmiany ilości komórek mierzono metodą gęstości optycznej przy ekstynkcji 560 nm i 600 nm (spektrofotometr Carl-Zeiss Jena 11, Niemcy). Objętość startowa brzeczki w bioreaktorze wynosiła 0,0018 m 3, co odpowiada stosunkowi objętości cieczy do powierzchni membran 0,22 m 3 /m 2. Roztwór do fermentacji (brzeczkę) przygotowano ze sterylnej wody demineralizowanej, do której dodano: pepton (10 kg/m 3 ); glicerol (10 kg/m 3 ) oraz ekstrakt drożdżowy (5 kg/m 3 ). Brzeczkę zaszczepiono dodając 0,00018 m 3 inakulatu, uzyskanego po 48 h hodowli bakterii na podłożu RMS (50 kg/m 3 ). Dla porównania przygotowano także drugą hodowlę (kolba Erlenmeyera 500 ml) o takim samym składzie jak brzeczka w bioreaktorze, którą jako referencyjną umieszczono w cieplarce (Nüve EN055). Temperatura brzeczki w bioreaktorze i hodowli referencyjnej była podobna. W obydwu hodowlach co 24 h pobierano próby do analizy (25 ml) i dodawano do brzeczek nową porcję glicerolu (10 kg/m 3 ) rozpuszczonego w takiej ilości sterylnej wody demineralizowanej, aby utrzymać stały poziom cieczy w danej hodowli. Wyniki pomiarów analitycznych przedstawiono w tabelach 1 i 2. Wartości dla destylatu obliczono jako ilość kwasu octowego wydzielaną z brzeczki przez 1 m 2 membran podczas 24 godzin trwania procesu MD. Tabela 1 przedstawia wyniki badań uzyskane dla hodowli referencyjnej. Tabela 2 przedstawia wyniki badań uzyskane dla hodowli w bioreaktorze z destylacją membranową.

4 4 PL B1 T a b e l a 1 Dzień ph 4,7 4,5 4,5 4,3 4,1 3,4 560 nm 0,598 0,694 0,737 0,687 0,605 0, nm 0,531 0,617 0,669 0,622 0,540 0,331 Kwas octowy [kg/m 3 ] - 1,64-1,1 1,38 1,79 Kwas mlekowy [kg/m 3 ] - 1,82-1,6 1,54 1,24 T a b e l a 2 Dzień ph 4,4 4,5 4,9 4,9 4,6 4,5 560 nm 0,664 0,748 0,827 0,755 0,780 0, nm 0,564 0,679 0,755 0,684 0,717 0,697 Kwas octowy [kg/m 3 ] - 0,92 1,16 0,97 1,4 1,2 Kwas mlekowy [kg/m 3 ] - 1,68 2,0 1,7 1,76 1,5 Destylat [kg kwasu octowego/m 2 dobę] - 2,6 2,45 1,95 1,2 1,3 W badanym destylacie oprócz kwasu octowego stwierdzono także obecność niewielkich ilości kwasu mrówkowego i propionowego (poniżej 0,02 kg/m 3 ). Ponadto, jego intensywny zapach wskazywał, że do destylatu przechodziły znaczne ilości odorów powstających w fermentującej brzeczce. Obecności tych związków nie wykryto w prowadzonej analizie chromatograficznej IC (detektor konduktometryczny), co wskazuje na ich niejonowy charakter. Uzyskane wartości stężenia biomasy (pomiary przy 560 i 600 nm) były wyższe w przypadku bioreaktora połączonego z MD, co potwierdza korzystny wpływ wydzielania produktów ubocznych na rozwój bakterii. P r z y k ł a d 2 Do fermentacji zastosowano bakterie Leuconostoc mesenteroides. Do badań użyto aparaturę i metodykę opisaną w przykładzie 1 - z tą różnicą, że temperaturę wody chłodzącej podwyższono do 300 K. Dodatkowo zbadano zmiany ilości komórek bakterii stosując standardową metodę posiewów na sterylnej zestalonej pożywce RMS, dla rozcieńczeń w zakresie Kolonie liczono po 24 h inkubacji w temperaturze 313 K za pomocą licznika koloni POL-EKO LKB2002. Liczbę bakterii przeliczono na standardową wartość podawaną w liczbie jednostek bakterii formujących kolonię z 1 ml dozowanego do posiewu roztworu - CFU/ml (ang. Colony Forming Units). Wyniki pomiarów analitycznych przedstawiono w tabelach 3 i 4 W tabeli podano wartość logarytmu dziesiętnego z wyznaczonej liczby komórek. Tabela 3 przedstawia wyniki badań uzyskane dla hodowli referencyjnej. Tabela 4 przedstawia wyniki badań uzyskane dla hodowli w bioreaktorze z destylacją membranową. T a b e l a 3 Dzień Log 10 z CFU/ml 10,44 11,34 10,97 6,60 6,95 5,45 5,60 4,01 Kwas mlekowy [kg/m 3 ] 1,18 3,44 6,15 5,80 Kwas octowy [kg/m 3 ] 0,22 1,11 0,84 0,89 Kwas propionowy [kg/m 3 ] 0,526 3,72 3,43 4,24

5 PL B1 5 T a b e l a 4 Dzień Log 10 z CFU/ml 9,16 10,66 8,60 8,56 8,69 9,33 7,94 8,22 Kwas mlekowy [kg/m 3 ] 0,3 3,5 3,5 4,3 8,2 6,3 6,8 Kwas octowy [kg/m 3 ] 1,55 1,56 0,83 1,26 1,39 1,15 0,85 Kwas propionowy [kg/m 3 ] 5,9 6,1 8,8 8,3 6,2 7,8 W przypadku bioreaktora połączonego z MD uzyskano wyższe stężenie bakterii oraz kwasów karboksylowych w brzeczce. Usuwanie lotnych metabolitów przez membrany w procesie MD sprawiło, iż bakterie rozwijały się intensywniej (wyższe wartości CFU/ml), co sprzyjało konwersji gliceryny do innych produktów. P r z y k ł a d 3 Przeprowadzono trzy następujące po sobie pięciodniowe fermentacje glicerolu stosując po kolei bakterie Lactobacillus casei, Lactococcus lactis oraz Leuconostoc mesenteroides. Zastosowano aparaturę i metodykę opisaną w przykładzie 1. Po zakończeniu każdej fermentacji usuwano przefermentowana brzeczkę. Następnie bioreaktor oraz powierzchnię zewnętrzną umieszczonych w nim membran płukano dwukrotnie porcjami zebranego w procesie MD destylatu. Po tym płukaniu bioreaktor przemyto wodą zdemineralizowaną, po czym prowadzono kolejną fermentację. Zmiany wydajności procesu MD podczas fermentacji glicerolu z okresowym płukaniem powierzchni membran przedstawiono w tabeli 5. T a b e l a 5 Wydajność [dm 3 /m 2 24 h] Dzień Lactobacillus casei 19,31 15,65 14,07 11,85 11,12 Lactococcus lactis 19,44 16,1 12,83 15,6 13,51 Leuconostoc mesenteroides 20,12 16,86 17,81 15,47 10,28 Uzyskane wyniki wskazują, że powstający na powierzchni membran biofilm miał pewien wpływ na spadek wydajności modułu membranowego, co ograniczono przez cykliczne płukanie modułu (wzrost wydajności w 1 dniu pomiarów). P r z y k ł a d 4 Do fermentacji zastosowano bakterie Leuconostoc mesenteroides. Zastosowano warunki procesu jak opisano w przykładzie 1, z tą różnicą, że nowe porcje glicerolu dozowano co drugi dzień procesu w ilości 5 kg/m 3. Proces fermentacji prowadzono w sposób ciągły przez 23 dni. Uzyskane wyniki długoterminowej fermentacji ciągłej połączonej z MD przedstawiono w tabeli 6. T a b e l a 6 Dzień Strumień [dm 3 /m 2 24 h] Destylat kwas octowy [g/m 3 ] Destylat kwas propionowy [g/m 3 ] 17,2 16,3 15,4 14,6 14,7 14,9 15,9 14,7 15,2 14,2 13,6 14,1 14,2 13, , log CFU/ml 8,9 9,1 9,7 10,6 8,6 8,5 9,3 8,2 8,8 9,8 8,5 7,8 8,2 8,2 Intensywny nieprzyjemny zapach otrzymywanego destylatu wskazywał na odbieranie także odorów z brzeczki. Brzeczka po zakończeniu badań miała przyjemny miodowy zapach. Dodawanie nowych porcji glicerolu zintensyfikowało burzliwość fermentacji, co w efekcie ograniczyło stopień zanieczyszczenia membran i związany z tym spadek wydajności modułu.

6 6 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób fermentacji glicerolu w bioreaktorze z wykorzystaniem bakterii z jednoczesnym usuwaniem produktów, znamienny tym, że fermentację prowadzi się w bioreaktorze membranowym równocześnie z procesem destylacji membranowej, w którym powstające podczas fermentacji lotne produkty częściowo usuwa się z fermentującego roztworu, przy czym kapilarne porowate hydrofobowe membrany zanurza się w pozycji horyzontalnej, bezpośrednio w fermentującym roztworze glicerolu, zaś ciecz podawaną do wnętrza kapilar schładza się tak, aby jej temperatura wynosiła przynajmniej 8 stopni mniej niż temperatura fermentującego roztworu. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kapilarne porowate membrany umieszcza się przynajmniej w 1/3 wysokości bioreaktora powyżej jego dna. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek objętość brzeczki do powierzchni membran wynosi przynajmniej 0,22 m 3 /m Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że membrany kapilarne wykonane są z polipropylenu. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po zakończeniu procesu i usunięciu brzeczki zebrany destylat wykorzystuje się do płukania wnętrza bioreaktora i powierzchni membran. Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)