Zastosowanie kwasów i estrów 1-aminoalkanofosfonowych do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia choroby nowotworowej

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 31/662 ( ) A61K 31/13 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Zastosowanie kwasów i estrów 1-aminoalkanofosfonowych do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia choroby nowotworowej (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 23/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/12 (72) Twórca(y) wynalazku: MARCIN DRĄG, Świdnica, PL ANNA MARCINKOWSKA, Radwanice, PL JÓZEF OLEKSYSZYN, Siechnice, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Halina Winohradnik PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kwasów i estrów 1-aminoalkanofosfonowych do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia choroby nowotworowej, w charakterze czynnika indukującego apoptozę komórek rakowych. Choroby nowotworowe a szczególnie nowotworowe guzy lite są ciągle wiodącą przyczyną śmierci na świecie. Konwencjonalne metody leczenia chorób nowotworowych obejmują metody chirurgiczne, podawanie pacjentowi związków chemoterapeutycznych i ostatnio wprowadzone metody immunologiczne, które polegają na podawaniu przeciwciał lub ich fragmentów połączonych z molekułami leku np. radioizotopami. Wszystkie te metody dają jednak niepełne powodzenie w leczeniu. Metody chirurgiczne są stosowane z powodzeniem, jeśli nowotwór jest wykryty we wczesnym stadium rozwoju, a na pewno przed etapem przerzutowania do innych organów organizmu. Chemoterapia ma również ograniczony zasięg stosowania, ponieważ leki chemoterapeutyczne są nieselektywne i są toksyczne dla większości zdrowych komórek organizmu. Co gorsze, wiele komórek nowotworowych staje się odporna na stosowane leki chemoterapeutyczne i terapia staje się nieskuteczna. Dla przykładu u pacjentów z nowotworem, leczonych cis-platyną często pojawiają się komórki nowotworowe odporne na cis-platynę. Nowe, oparte na metodach immunologicznych terapie stwarzają szereg problemów, jak na przykład kłopoty z efektywnym dostarczeniem immunokompleksu do miejsca nowotworowego i poważne problemy z odpowiedzią układu odpornościowego i co za tym idzie neutralizacją kompleksu. W organizmie ludzkim, każdej doby powstaje nowych komórek. Taka sama ilość musi umrzeć. W kodzie genetycznym każdej z takich komórek jest zaprogramowana umiejętność do popełnienia samobójstwa. Proces taki nazywany jest apoptozą, inaczej zaprogramowaną śmiercią komórki. Komórki nowotworowe na wskutek mutacji genetycznych (carcinogenesis) utraciły zdolność do apoptozy. Dlatego rosną bez ograniczeń prowadząc do śmierci organizmu. Z japońskiego opisu patentowego, zgłoszonego w trybie międzynarodowym nr PCT/JP98/04118, znane jest monoklonalne przeciwciało specyficznie rozpoznające ludzką proteinę związaną z integryną oraz antygeny, które wywołują apoptozę jądrzastych komórek krwi posiadających proteinę związaną z integryną. Większość leków przeciwnowotworowych w różny sposób i z różną skutecznością indukuje apoptozę komórek rakowych i tym samym eliminuje je z organizmu. Mechanizmy tych procesów w większości przypadków są słabo poznane albo wręcz nieznane. Z polskiego zgłoszenia patentowego PL znany jest sposób indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych, w którym inicjatorem indukcji apoptozy jest lektyna, otrzymywana z Chelidonium maius, którą dodaje się do komórek nowotworowych linii CHO lub R2C w ilości od 5 do 30 μg/ml hodowli komórek nowotworowych zawierających 1 milion tych komórek, zawieszonych korzystnie w płynie infuzyjnym. W zgłoszeniu PCT/US99/00637, do leczniczej indukcji apoptozy aktywowanych komórek w miejscu stanu zapalnego, stosuje się chimerowe kwasy nukleinowe. Każdy związek zdolny do indukowania apoptozy jest potencjalnym i cennym lekiem przeciwnowotworowym. Kwasy 1-aminoalkanofosfonowe i ich pochodne są związkami znanymi w literaturze naukowej i patentowej. Znane, biologiczne własności kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich pochodnych dotyczą głównie ich aktywności antybakteryjnej (Hassall F.C. i inni w Actual Chim. Ther., 1985, 12, , Allen J.G. i inni w Nature, 1978, 272, 56-58). Brak jest w literaturze naukowej i patentowej jakichkolwiek wzmianek o ich zdolnościach do indukcji apoptozy komórek rakowych. Zastosowanie według wynalazku, polega na tym, że do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia chorób nowotworowych lub zapobiegającego chorobom nowotworowym, w charakterze czynnika aktywnego, wywołującego apoptozę komórek rakowych, stosuje się kwasy i estry 1-aminoalkanofosfonowe o wzorze ogólnym 1, w którym W oznacza wodór albo leucynę, n wynosi 1 lub 2 lub 3, R oznacza podstawnik łańcucha bocznego metioniny, leucyny lub podstawnik fenyloetylowy, cykloheksyloetylowy lub n-nonanowy, a X 1 i X 2 jest taki sam lub różny i oznacza H lub fenylowy pierścień. Kwasy i estry 1-aminoalkanofosfonowe o wzorze ogólnym 1, będące przedmiotem wynalazku, jako czynniki aktywne w lekach zawierających farmaceutycznie dopuszczalne podłoże, mogą być używane w leczeniu białaczki oraz raka płuc. Zdolność do indukcji apoptozy czyni związki będące przedmiotem wynalazku szczególnie przydatnymi w lekach przeznaczonych do leczenia guzów litych i zaawansowanych form raka, które nie mogą być leczone na drodze konwencjonalnych metod. W leczeniu chorób nowotworowych, czynnik aktywny w postaci kwasów i estrów 1-aminoalkilofosfonowych według wynalazku, może być podawany pacjentowi poprzez każdą farmaceutycznie

3 PL B1 3 akceptowalną drogę np. doustnie lub dożylnie, podskórnie lub topikalnie. Dawki są uzależnione od stanu pacjenta, rodzaju związku a także od towarzyszącej terapii innymi lekami. Efektywną dawką terapeutyczną jest dawka wystarczająca do indukcji apoptozy komórek rakowych, która oscyluje w granicach od 0.01 mg/kg do 200 mg/kg masy ciała pacjenta, a preferowana dawka wynosi od 1 mg do 100 mg dla pacjenta w trzech dawkach dziennie. Kompozycje zawierające kwasy i estry 1-aminoalkilofosfonowe o wzorze 1 w farmaceutycznie dopuszczalnym podłożu, mają postać tabletek, kapsuł, syropu, suspensji, proszku, granulek, emulsji, mikrosfer, nanosfer, lilidowych pęcherzyków, polimerycznych pęcherzyków i roztworu, zwłaszcza do zastrzyków. Zdolność kwasów i estrów 1-aminoalkilofosfonowych o wzorze 1 do wywoływania apoptozy komórek rakowych przetestowano na komórkach nowotworowych ludzkich z linii limfoblastycznej (Limphoma) chłoniaka T komórkowego - Jurkat rosnących w toni medium i epitelialnej raka płuc (Lung carcinoma) - A549 przylegających w hodowli do podłoża, zdeponowanych w pracowni hodowli komórkowych Zakładu Biochemii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu. Poszczególne linie w literaturze są scharakteryzowane następująco: Linia komórkowa typu JURKAT: Typ komórki - ludzka T komórka leukemiczna DSMZ numer ACC 282. Pochodzenie: krew 14 letniego chłopca z ostrą leukemią limfoblastyczną (ALL) z pierwszym nawrotem w roku 1976; często ten typ komórek jest nazywany "JM" (JURKAT i JM pochodzą od tego samego pacjenta i są klonami siostrzanymi), czasami JM może być subklonem o rozbieżnych cechach. Literatura. Schneider et al., Int. J. Cancer 19: (1977) Deponent komórek: Dr. Jun Minowada, Fujisaki Cell Center, Okayama, Japan. Dane o typie komórek Morfologicznie okrągłe komórki rosnące pojedynczo lub w gromadach w Medium 90% RPMI % FBS + 2 mm L-glutamine. Subkulturowe optymalne tempo podziału wynosi 1:2 do 1:3 w ciągu każdych 2-3 dni; zawartość po rozmrożeniu około 1 x 10 6 komórek/ml; utrzymuje się na poziomie x 10 6 komórek/ml. Inkubacja przy 37 C w atmosferze 5% CO 2. Czas duplikacji (podwojenia ilości) godzin. Maksymalna gęstość przy zbiorze 1.5 x 10 6 komórek/ml. Przechowywanie w zamrożeniu w 70% medium, 20% FBS, 10% DMSO przy ilości 5 x 10 6 komórek/ampułkę. Ludzka linia komórkowa typu A549, Kaukaska, rak płuc, ECACC Pochodzenie komórek - 58 letni mężczyzna z Kaukazu. Komórki mogą syntezować lecytynę używając cytydynową ditosfocholinową ścieżkę metaboliczną. Czasami komórki mogą zawierać ciała inkluzyjne, jednakże nie posiadające żadnych ludzkich patogenów. Morfologia: Epiteliczny, ludzki, kaukaski rak płuc Deponent: ATCC, USA Szczególne właściwości i zawartość: Lecytyna, Duże stężenia nienasyconych kwasów tłuszczowych (ECACC, Salisbury, Wiltshire) Subkulturowe optymalne tempo podziału wynosi 1:3 do 1:6 przy posiewie w ilości 2-4x10,000 komórek/cm 2 używając 0,25% trypsyny lub trypsyny/edta; 5% CO 2 ; 37 C. Kariotyp: Hypotryploidalny Medium hodowlane: Dla linii Jurkat używano medium RPMI-1640 (R8758) firmy Sigma z dodatkiem 10% FBS (Fetal Bovine Serum) firmy Cambrax., dla linii A549 stosowano medium MEM (Minimum Essential Medium Eagle M2279) firmy Sigma z suplementacją 0,292 g/l L-glutaminą i 10% FBS firmy Cambrax. Warunki hodowli: Hodowle komórkowe prowadzono w temp. 37 C w atmosferze 5% CO 2. W celu odklejenia komórek linii A549 od podłoża stosowano trypsynizację używając 0,25% Trypsin-EDTA solution (T4049) firmy Sigma. Poniższe przykłady mają na celu lepsze objaśnienie wynalazku, ale w żadnej mierze nie ograniczają jego zakresu. P r z y k ł a d I Aktywność czynnika aktywnego w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-3- -fenylo-propionofosfonowego przetestowano w hodowlach komórek Jurkat in vitro. Przygotowano hodowle komórkowe linii Jurkat tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni, w objętości 0,9 ml, w dołkach (obraz w mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawiono do zrównoważenia w medium. Po 24 godzinach obraz w polu widzenia mikroskopu był taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe, równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne (liczebność nie ogranicza proliferacji).

4 4 PL B1 Preparaty, w postaci roztworów o stężeniach wyjściowych - 10 mm, rozcieńczono używając medium hodowlanego dla linii Jurkat do stężenia 0,5 mm i przefiltrowano przez filtry bakteriologiczne. Dodano odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 50 μm i 250 μm. Efekty zarejestrowano po 48 godzinach i stwierdzono, że indukcja apoptozy, przy stężeniu 50 μm, wynosi 32,7% hamowania wzrostu komórek nowotworowych, a przy stężeniu 250 μm - 82,7% hamowania. P r z y k ł a d II Aktywność czynnika aktywnego w postaci kwasu 1-amino-3-fenylo-propionofosfonowego przetestowano sposobem opisanym w przykładzie I w hodowlach komórek Jurkat in vitro. Efekty zarejestrowano po 48 godzinach i stwierdzono, że indukcja apoptozy, przy stężeniu 50 μm, wynosi 83,2% hamowania wzrostu komórek nowotworowych, a przy stężeniu 250 μm - 79,2% hamowania. P r z y k ł a d III Aktywność czynnika aktywnego w postaci kwasu 1-amino-3-cykloheksylo-propionofosfonowego przetestowano sposobem opisanym w przykładzie I w hodowlach komórek Jurkat in vitro. Efekty zarejestrowano po 48 godzinach i stwierdzono, że indukcja apoptozy, przy stężeniu 50 μm, wynosi 56,6% hamowania wzrostu komórek nowotworowych, a przy stężeniu 250 μm - 88,7% hamowania. P r z y k ł a d IV Aktywność czynnika aktywnego w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu 1-(aminoleucylo)amino-3-metylo-butylofosfonowego przetestowano sposobem opisanym w przykładzie I w hodowlach komórek Jurkat in vitro. Efekty zarejestrowano po 48 godzinach i stwierdzono, że indukcja apoptozy, przy stężeniu 50 μm, wynosi 58,2% hamowania wzrostu komórek nowotworowych, a przy stężeniu 250 μm - 75,2% hamowania. P r z y k ł a d V Aktywność czynnika aktywnego w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino- -dekanofosfonowego przetestowano sposobem opisanym w przykładzie I w hodowlach komórek Jurkat in vitro. Efekty zarejestrowano po 48 godzinach i stwierdzono, że indukcja apoptozy, przy stężeniu 50 μm, wynosi 52,4% hamowania wzrostu komórek nowotworowych, a przy stężeniu 250 μm - 74,5% hamowania. P r z y k ł a d VI Test cytotoksyczności wykonano w obecności kwasu 1-amino-3-fenylo-propionofosfonowego, przy stężeniach 31,25 μm, 62,5 μm, 125 μm, 186 μm, 250 μm. Przygotowano gęste hodowle komórek linii Jurkat. Roztwory wyjściowe o stężeniu wyjściowym - 10 mm rozcieńczono używając mediów hodowlanych odpowiednio dla linii Jurkat do stężenia 0,5 mm. Przefiltrowano przez filtry bakteriologiczne i dodano do hodowli komórkowych uzyskując stężenia efektywne w hodowlach odpowiednio 31,25 μm, 62,5 μm, 125 μm, 186 μm i 250 μm. Hodowle kontynuowano przez 72 godziny. Komórki zebrano ilościowo i testem z MTT oznaczono przeżywalność. Do obliczeń, za 100% przyjęto absorpcję prób kontrolnych gdzie, taka sama ilość komórek jak w próbach badanych, nie była poddawana działaniu wybranych czynników. Dane eksperymentalne przedstawiono na wykresie - Fig. 1, który obrazuje wpływ badanego związku przy określonych stężeniach na komórki Jurkat i jest charakterystyką przeżywalności komórek mierzonej w procentach w zależności od stężenia związku. Wartości na osi rzędnych ustalano poprzez zmianę absorbancji przy długości fali λ=595nm. P r z y k ł a d VII Test cytotoksyczności wykonano w obecności kwasu 1-amino-3-cykloheksylo-propionofosfonowego, metodą opisaną w przykładzie VI przy tych samych stężeniach dla komórek linii Jurkat. Dane eksperymentalne przedstawiono na Fig. 2. P r z y k ł a d VIII Test cytotoksyczności wykonano w obecności chlorowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylotio-propionofosfonowego, metodą opisaną w przykładzie VI przy tych samych stężeniach dla komórek linii Jurkat. Dane eksperymentalne przedstawiono na Fig. 3. P r z y k ł a d IX Test cytotoksyczności wykonano w obecności kwasu 1-amino-3-fenylo-propionofosfonowego, metodą opisaną w przykładzie VI przy tych samych stężeniach dla komórek monowarstwowych linii A549. Dane eksperymentalne przedstawiono na Fig. 4 P r z y k ł a d X Test cytotoksyczności wykonano w obecności kwasu 1-amino-3-cykloheksylo-propionofosfonowego, metodą opisaną w przykładzie VI przy tych samych stężeniach dla komórek monowarstwowych linii A549. Dane eksperymentalne przedstawiono na Fig. 5.

5 PL B1 5 P r z y k ł a d XI Test cytotoksyczności wykonano w obecności chlorowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylotio-propionofosfonowego, metodą opisaną w przykładzie VI przy tych samych stężeniach dla komórek monowarstwowych linii A549. Dane eksperymentalne przedstawiono na Fig. 6. Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie kwasów i estrów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym W oznacza wodór albo leucynę, n wynosi 1 lub 2 lub 3, R oznacza podstawnik łańcucha bocznego metioniny, leucyny lub podstawnik fenyloetylowy, cykloheksyloetylowy lub n-nonanowy, a X 1 i X 2 jest taki sam lub różny i oznacza H lub fenylowy pierścień do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia chorób nowotworowych lub zapobiegającego chorobom nowotworowym, w charakterze czynnika aktywnego, wywołującego apoptozę komórek rakowych. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że ilość kwasów i estrów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w leku, wystarczająca do apoptozy komórek rakowych, mieści się w przedziale od 0.01 mg do 200 mg na kilogram masy ciała pacjenta.

6 6 PL B1 Rysunki

7 PL B1 7

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)