Transkrypt

1 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI VSELs OBECNY STAN BADAÑ TOM NR 1 (63 87) Rola komórek dendrytycznych w odpowiedzi transplantacyjnej* The role of dendritic cells in transplantation Maja Budziszewska1 Anna Korecka-Polak1 Gra yna Korczak-Kowalska12 1Zak³ad Immunologii Wydzia³ Biologii Uniwersytet Warszawski 2 Instytut Transplantologii Warszawski Uniwersytet Medyczny *Dofinansowanie z grantu MNiSzW nr N N Streszczenie: Komórki dendrytyczne (DC) s¹ najwa niejszymi komórkami prezentuj¹cymi antygen (APC) limfocytom T. Stopieñ dojrza³oœci komórki DC ma MA E KOMÓRKI MACIERZYSTE PRZYPOMINAJ CE kluczowe znaczenie dla rodzaju odpowiedzi limfocytów T. Niedojrza³a komórka DC indukuje KOMÓRKI stan tolerancji EMBRIONALNE podczas gdy dojrza³a IZOLOWANE komórka DC - Z pe³n¹ TKANEK odpowiedÿ immunologiczn¹. DOROS YCH Ma to ogromne OBECNY znaczenie w STAN transplantologii BADAÑ* a zw³aszcza w reakcjach odrzucania przeszczepu po transplantacjach narz¹du. Komórka DC dawcy prezentuje VERY antygen SMALL w sposób EMBRYONIC bezpoœredni LIKE natomiast STEM komórka CELLS DC (VSELS) biorcy drog¹ poœredni¹. Komórki ISOLATED DC FROM niedojrza³e ADULT lub o TISSUES w³aœciwoœciach AN UPDATE tolerogennych mog¹ wyd³u yæ prze ycie przeszczepu allogenicznego. Takie oddzia³ywanie na funkcjê komórek Izabella KLICH DC aby 1 Stanis³awa by³y one niewra liwe WALAT 2 Janina na sygna³y RATAJCZAK dojrzewania 1 Magda in KUCIA vivo lub 1 aktywowanie komórek DC Mariusz charakteryzuj¹cych Z. RATAJCZAK siê 12 trwa³ymi w³aœciwoœciami tolerogennymi mo e poprawiæ tolerancjê przeszczepu. W tym celu wykorzystuje siê hodowle 1 Instytut prowadzone Komórki Macierzystej w specyficznych Centrum warunkach Rakowe im. leczenie Jamesa farmakologiczne Grahama Browna oraz in ynieriê Uniwersytet genetyczn¹. Louisville USA oraz 2 Zak³ad Fizjologii Katedry Fizjopatologii S³owa kluczowe: Pomorskiej Komórka dendrytyczna Akademii Medycznej transplantacja Szczecin tolerancja przeszczepu. Summary: The most important antigen-presenting cells (APCs) are dendritic cells (DCs) Streszczenie: which Najnowsze present badania antigen wskazuj¹ to T cells. e pluripotencjalne The state komórki of maturation macierzyste of DCs (PKM) is wystêpuj¹ crucial for w tkankach induction doros³ych of a T-cell organizmów. lymphocyte Nale ¹ do response. nich m.in. The wyizolowane immature ze DCs szpiku induce kostnego tolerance i innych the narz¹dów mature tzw. DCs ma³e - embrionalno-podobne immunity. This is komórki important macierzyste in transplantology VSELs (ang. Very especially Small Embryonic- in graft Like Stem cells). Cech¹ charakterystyczn¹ komórek VSELs jest ekspresja markerów typowych dla pluripotencjalnych komórek epiblastu które to we wczesnych etapach embriogenezy podczas gastrulacji rejection after organ transplantation. Donor DCs act via the direct while recipient DCs uczestnicz¹ via the w formowaniu indirect listków pathways zarodkowych of allorecognition. i daj¹ pocz¹tek ró nym Immature liniom DCs komórkowym. or DCs Uwa amy e komórki properties VSELs deponowane may prolong stopniowo allograft w rozwijaj¹cych survival. siê Manipulating tkankach odgrywaj¹ DCs wa n¹ function rolê w with tolerogenic to utrzymywaniu be insensitive puli tkankowo to maturation specyficznych signals komórek or activate macierzystych. DCs with Stanowi¹ tolerogenic one pierwotne properties Ÿród³o are wszystkich the promising komórek rozwijaj¹cego means of improving siê organizmu allograft podczas tolerance. ontogenezy There prze ywaj¹ are three w dojrza³ych approaches tkankach i tym samym pozostaj¹ Ÿród³em ukierunkowanych tkankowo komórek macierzystych. W odpowiedzi na achieve uszkodzenie these tkanek aims: i narz¹dów specific (np. cell w zawale culture miêœnia conditions sercowego pharmacological udarze mózgu) VSELs treatment mog¹ byæ to and mobilizowane genetic i engineering. kr¹ yæ we krwi obwodowej. Ponadto jak wykazano modyfikacja metylacji niektórych genów Keywords: wykazuj¹cych Dendritic piêtno genomowe cell transplantation chroni VSELs przed graft niekontrolowan¹ tolerance graft proliferacj¹ rejection. i tworzeniem potworniaków. Wstêp Zaburzenie tego procesu w sytuacjach patologicznych mo e prowadziæ do udzia³u VSELs w rozwoju niektórych typów nowotworów (np. potworniaków guzów germinalnych miêsaków wieku dzieciêcego). 1. Charakterystyka komórek dendrytycznych S³owa kluczowe: Komórki VSELs dendrytyczne Oct-4 komórki s¹ profesjonalnymi pluripotencjalne regeneracja komórkami plastycznoœæ. prezentuj¹cymi antygen Summary: (APC) obecnymi Accumulating w evidence centralnych demonstrates (grasica that i szpik) adult tissues i we contain wtórnych a population (wêz³y of limfatyczne very primitive pluripotent kêpki Peyer'a stem cells i œledziona) and recently narz¹dach our group identified limfatycznych a population [2]. of very Posiadaj¹ small stem zdolnoœæ cells in murine do bone marrow and other adult organs that express several markers characteristic for epiblast/germ linederived cells. We named these rare cells very small embryonic/epiblast like stem cells (VSELs). We aktywacji zarówno naiwnych limfocytów T jak i limfocytów T pamiêci umiejêtnoœæ transportowania antygenu (Ag) z obwodowych tkanek do obszarów bogatych w limfocyty T we wtórnych narz¹dach limfatycznych oraz zdolnoœæ do krzy owej *Finansowane z grantu KBN (N N ). prezentacji antygenów [2122]. Komórki DC nie stanowi¹ jednorodnej subpopulacji leukocytów. Ich morfologia funkcja oraz immunofenotyp ró ni¹ siê w zale noœci od stopnia dojrza³oœci umiejscowienia w organizmie i rodzaju komórki prekursorowej z której siê wywodz¹ [27].

2 64 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK hypothesized that these cells which are deposited during early gastrulation in developing tissues/organs play an important role in the turnover of tissue-specific/committed stem cells. Based on this we envision that germ line is not only the origin but also a basis/skeleton for the stem cell compartment in adult life forms. We noticed that VSELs could be mobilized into peripheral blood and the number of these cells circulating in peripheral blood increases during stress and tissue/organ injuries (e.g. heart infarct stroke). Furthermore our data indicate that VSELs are protected from uncontrolled proliferation and teratoma formation by a unique pattern of methylation of selected somatic imprinted genes. Finally we envision that in pathological situations VSELs could be involved in development of some malignan-cies (e.g. teratomas germinal tumors pediatric sarcomas). Key words: VSELs Oct-4 pluripotent stem cells regeneration plasticity. WSTÊP Mianem komórki macierzystej (KM) okreœla siê komórkê maj¹c¹ zdolnoœæ do samoodnawiania oraz ró nicowania siê w komórki potomne. Przytoczona definicja jest jednak zbyt ogólna i ma³o precyzyjna. Zidentyfikowano bowiem wiele rodzajów komórek macierzystych ró ni¹cych siê potencja³em proliferacyjnym oraz zdolnoœci¹ do ró nicowania. Ta niejednorodnoœæ populacji KM powoduje e trudno je jednoznacznie opisaæ wspóln¹ definicj¹. Pula KM utrzymuj¹c w równowadze liczbê komórek somatycznych w organizmie jest odpowiedzialna za odnawianie puli komórek somatycznych a w konsekwencji za odm³adzanie i regeneracjê narz¹dów i tkanek. Szereg laboratoriów pracuje nad efektywnym pozyskiwaniem komórek macierzystych i opracowaniem warunków ich ekspansji w hodowlach in vitro. Rozwijane technologie przynosz¹ nadziejê na postêp w optymalizacji klinicznego wykorzystania KM w terapii. Komórki te staj¹ siê niejako kluczem do d³ugowiecznoœci i znajduj¹ coraz szersze zastosowanie w rozwijaj¹cej siê nowej dyscyplinie klinicznej jak¹ jest medycyna regeneracyjna. Podstawowym za³o eniem medycyny regeneracyjnej jest wykorzystanie KM w terapii uszkodzonych narz¹dów i tkanek. Transplantacje narz¹dów jak siê wydaje bêd¹ w przysz³oœci coraz czêœciej zastêpowane przeszczepami zawiesiny swoistych dla danego narz¹du komórek macierzystych maj¹cych za zadanie regeneracjê/ odbudowê uszkodzonych tkanek. Szczególne nadzieje na wykorzystanie terapeutyczne KM wi¹ ¹ siê z takimi schorzeniami jak: zawa³ miêœnia sercowego udar mózgu parkinsonizm cukrzyca dystrofie miêœniowe toksyczne uszkodzenia w¹troby i nerek. POTENCJALNE RÓD A KOMÓREK MACIERZYSTYCH DO REGENERACJI TKANKOWO-NARZ DOWEJ Ju od oko³o 40 lat wykorzystuje siê krwiotwórcze komórki macierzyste (KKM) szpiku kostnego w leczeniu szeregu chorób uk³adu krwiotwórczego. Coraz czêœciej stosuje siê równie komórki macierzyste naskórka w leczeniu oparzeñ pow³ok skórnych oraz w celu usprawnienia procesu gojenia troficznych owrzodzeñ tkanek miêkkich koñczyn. Zaawansowana jest te technologia pozyskiwania macierzystych

3 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 65 komórek mezenchymalnych dla leczenia ubytków kostnych. Pozyskiwanie komórek macierzystych krwiotwórczych naskórka jak i mezenchymalnych na potrzeby kliniczne jest dziœ stosunkowo ³atwe. Znacznie trudniej jest natomiast uzyskaæ od zdrowych dawców komórki macierzyste innych tkanek i narz¹dów w liczbie pozwalaj¹cej na ich potencjalne wykorzystanie terapeutyczne. To istotne ograniczenie dotyczy m.in. miêœni szkieletowych miêœnia sercowego w¹troby wysp endokrynnych trzustki oœrodkowego uk³adu nerwowego. W zwi¹zku z powy szym w ostatnich latach du e nadzieje wzbudzi³a teoria plastycznoœci krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) lub ich zdolnoœci do transró nicowania. Zgodnie z jej podstawowym za³o eniem KKM pozyskane np. ze szpiku kostnego mobilizowanej krwi obwodowej lub krwi pêpowinowej sk¹d stosunkowo ³atwo je wyizolowaæ mia³yby byæ zdolne do odró nicowania siê w komórki macierzyste swoiste dla innych narz¹dów np. miêœnia sercowego oœrodkowego uk³adu nerwowego lub w¹troby. Analiza badañ przeprowadzonych w ró nych oœrodkach nasuwa jednak obawy e postulowana przez niektórych badaczy plastycznoœæ KKM w rzeczywistoœci by³a prawdopodobnie wynikiem artefaktów doœwiadczalnych. KOMÓRKI NIEHEMATOPOETYCZNE SZPIKU KOSTNEGO LEKCJA WYP YWAJ CA ZE ZJAWISKA PLASTYCZNOŒCI KRWIOTWÓRCZYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH (KKM) Jak powy ej wspomniano du e nadzieje pok³adano w potencjalnym wykorzystaniu w medycynie regeneracyjnej KKM izolowanych ze szpiku kostnego mobilizowanej krwi obwodowej oraz krwi pêpowinowej. Oczekiwania te opiera³y siê na wspomnianym powy ej zjawisku plastycznoœci przypisywanym tym komórkom i zdolnoœci do transró nicowania w komórki ró nych linii niehematopoetycznych. Teoriê plastycznoœci KKM wspiera³y wyniki niektórych pozytywnych badañ nad wykorzystaniem tych komórek w zwierzêcych modelach zawa³u miêœnia sercowego [40 79] udaru mózgu [ ] mechanicznego uszkodzenia rdzenia krêgowego [47] oraz toksycznego uszkodzenia w¹troby [58]. Pomimo obiecuj¹cych wyników przytoczo-nych powy ej badañ rola KKM w regeneracji uszkodzonych narz¹dów nadal jednak nie jest jednoznacznie okreœlona a jej ocena budzi kontrowersje [15 108]. Seria nowych badañ z zastosowaniem fenotypowo zdefiniowanych i oczyszczonych subpopulacji KKM przynios³a bowiem negatywne wyniki w modelach regeneracji miêœnia sercowego [6 76] oraz mózgu [11]. Te nieoczekiwane obserwacje podwa y³y koncepcjê plastycznoœci komórek macierzystych uk³adu krwiotwórczego [15 35]. Wspomniane niezgodnoœci i rozbie noœci w wynikach opublikowanych badañ mog¹ byæ konsekwencj¹ zastosowania przez laboratoria ró nych doœwiadczalnych modeli uszkodzenia tkanek jak równie trudnoœci w wykrywaniu w organizmie biorcy komórek pochodz¹cych od dawcy czyli w ocenie tzw. chimeryzmu komórkowego. W tabeli 1 zestawiono alternatywne wyjaœnienia postulowanego zjawiska plastycznoœci KKM.

4 66 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK Po pierwsze wykazanie plastycznoœci KKM mo e wymagaæ zastosowania odpowiednich modeli uszkodzenia tkanek prowadz¹cych do indukcji w mikroœrodowisku czynników sprzyjaj¹cych potencjalnemu wyst¹pieniu tego zjawiska. Hipotetycznie tego typu sprzyjaj¹ce warunki mog³yby dotyczyæ zmian epigenetycznych w KKM stymuluj¹cych je do ró nicowania siê w kierunku komórek linii innych ni hematopoetyczna [13 75]. Po drugie na podstawie opublikowanych doniesieñ plastycznoœæ KKM mo e byæ wyjaœniona fenomenem fuzji komórkowej [ ]. Wed³ug tej teorii przeszczepione KKM mog³yby ulegaæ fuzji z komórkami uszkodzonych narz¹dów. Komórki buduj¹ce dany narz¹d stawa³yby siê heterokarionami wykazuj¹cymi ekspresjê markerów komórek zarówno przeszczepu jak i tkanek gospodarza. Warto nadmieniæ jednak e zarówno fuzja komórkowa jak i zmiany epigenetyczne zachodz¹ce w komórkach po przeszczepie nale ¹ do bardzo rzadko wystêpuj¹cych przypadkowych zjawisk i nie mog¹ w pe³ni t³umaczyæ opublikowanych pozytywnych wyników badañ wskazuj¹cych na transró nicowanie KKM. Co wiêcej niektóre opublikowane ostatnio wyniki badañ wydaj¹ siê wykluczaæ zjawisko fuzji jako g³ówny proces prowadz¹cy do tzw. chimeryzmu komórkowego obserwowanego po przeszczepie KKM [ ]. Kolejnym mo liwym wyt³umaczeniem pozytywnych efektów terapeutycznych uzyskanych w próbach regeneracji tkanek i narz¹dów po zastosowaniu przeszczepu komórek szpiku kostnego mo e byæ ich wp³yw parakrynny na komórki uszkodzonego organu. Macierzyste komórki hematopoetyczne s¹ bowiem Ÿród³em wielu czynników wzrostowych oraz cytokin które wydzielone przez przeszczepione komórki in situ w miejscu uszkodzenia mog¹ promowaæ procesy regeneracyjne oraz waskularyzacjê uszkodzonych tkanek [87]. Ostatnie doniesienia wskazuj¹ tak e na mo liwoœæ modyfikacji fenotypu komórek w nastêpstwie przeniesienia miêdzy s¹siaduj¹cymi komórkami receptorów komórkowych bia³ek cytoplazmatycznych oraz mrna za pomoc¹ mikrofragmentów komórkowych (ang. microvesicles). Mikrofragmenty komórkowe s¹ kulistymi strukturami w których czêœæ cytoplazmy jest otoczona b³on¹ komórkow¹ [ ]. Z³uszczanie mikrofragmentów z powierzchni b³ony komórkowej opisane zosta³o jako zjawisko fizjologiczne towarzysz¹ce wzrostowi komórek; potwierdzono je tak e w stanach aktywacji komórek w takich procesach jak np. niedotlenienie tkanek czy ich uszkodzenie [ ]. W zwi¹zku z tym wspomniane przeniesienie receptorów powierzchniowych bia³ek oraz informacji genetycznej pod postaci¹ mrna pomiêdzy wszczepionymi KKM szpiku kostnego a komórkami gospodarza mog³oby przejœciowo prowadziæ do zmiany fenotypu komórek uszkodzonego organu. Wci¹ pozostaje niewyjaœnione czy mikrofragmenty komórkowe mog¹ tak e przenosiæ niektóre markery reporterowe stosowane do wykrywania chimeryzmu takie jak np. bia³ko wykazuj¹ce zielon¹ fluorescencjê GFP (ang. Green Fluorescence Protein) czy b-galaktozydazê. Najwa niejsze wydaje siê jednak e w trakcie badañ maj¹cych na celu wyjaœnienie plastycznoœci komórek macierzystych oraz udzia³u pierwotnych komórek szpikowych w regeneracji uszkodzonych narz¹dów (tab. 1) nie wziêto pod uwagê mo liwoœci e populacja komórek macierzystych obecnych w szpiku kostnym nie

5 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 67 TABELA 1. Alternatywne wyjaœnienia zjawiska transró nicowania lub "plastycznoœci" krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) TABLE 1. Alternative explanations of the phenomenon of trans-dedifferentiation of "plasticity" of hematopoietic stem cells (HSCs) Zmiany epigenetyczne Czynniki œrodowiskowe uszkadzaj¹ce tkanki/organy mog¹ indukowa æ zmiany epigenetyczne w genach reguluj¹cych pluripotencjê KKM (powoduj¹c zmiany w metylacji DNA acetylacjê histonów). Konieczne jest zgromadzenie dalszych dowodów by potwierdziæ powszechnoœæ tego zjawiska Fuzja komórkowa Bardzo rzadko wystêpuj¹ce zjawisko w którym przeszczepion e KKM ulegaj¹ fuzji z komórkami uszkodzonej tkanki tworz¹c heterokariony. Powsta³e heterokariony wykazuj¹ ekspresjê markerów KKM przeszczepu uszkodzonych komórek tkanek gospodarza (pseudochimeryzm) Stymulacja parakrynna KKM stanowi¹ Ÿród³o ró nych czynników wzrostowych i angiopoetycznych mog¹cych promowaæ regeneracjê tkanek/organów Przeniesienie bia³ek przez Niektóre doniesienia o "plastycznoœci" komórek macierzystych mog¹ mikrofragmenty byæ wyjaœnione za pomoc¹ zjawiska czasowej zmiany fenotypu b³onowe komórkowego bêd¹cego wynikiem przeniesienia receptorów cytoplazmatycznych bia³ek oraz mrna miêdzy KKM a uszkodzon¹ komórk¹ za pomoc¹ mikrofragmentów b³onowych Obecnoœæ Oprócz KKM szpik kostny zawiera tak e populacje innych komórek heterogenicznej macierzystych. Regeneracja uszkodzonych tkanek mo e zostaæ populacji komórek wyjaœniona obecnoœci¹ komórek progenitorowych dla œródb³onka macierzystych w szpiku naczyñ które stymuluj¹ neowaskularyzacjê jak równie obecnoœci¹ kostnym innych komórek macierzystych w tym komórek pluripotencjalnych (np.vsels). Mo e to t³umaczyæ brak efektu "plastycznoœci" przy zastosowaniu dok³adnie oczyszczonej populacji KKM jest jednorodna [53]. Uwa amy e nieuwzglêdnienie mo liwej heterogennoœci KM oraz brak odpowiednich kontroli w prowadzonych badaniach nad regeneracj¹ tkanek niehematopoetycznych z zastosowaniem przeszczepianych komórek szpiku kostnego oraz krwi pêpowinowej by³o Ÿród³em wielu nieœcis³oœci i doprowadzi³o do niew³aœciwych interpretacji obserwowanych zjawisk. Zgodnie z powy szym uwa amy e najlepszym wyjaœnieniem postulowanej plastycznoœci KKM jest obecnoœæ w szpiku kostnym mobilizowanej krwi obwodowej oraz krwi pêpowinowej heterogenicznej populacji komórek macierzystych. Obecne w puli przeszczepionych KKM inne komórki macierzyste bra³yby wiêc udzia³ w regeneracji uszkodzonych tkanek gospodarza co mo e t³umaczyæ obserwowane zjawiska opisywane jako plastycznoœæ czy zdolnoœæ do transró nicowania KKM [53]. Wystêpowanie niehematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym wyjaœnia wiêc lepiej ni transró nicowanie KKM pozytywne wyniki badañ nad plastycznoœci¹ KKM uzyskane przez badaczy którzy stosowali komórki szpikowe w regeneracji uszkodzonych narz¹dów [ ]. Co wiêcej w przypadkach kiedy stosowano wyselekcjonowane oczyszczone pule KKM komórki macierzyste niehematopoetyczne prawdopodobnie by³y eliminowane na etapie izolacji komórek do przeszczepu; przeszczepiane komórki nie ró nicowa³y siê wówczas w komórki innych tkanek i tym samym nie obserwowano zjawiska plastycznoœci [108].

6 68 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK Podsumowuj¹c na obecnym etapie badañ zjawisko transró nicowania KKM w komórki linii niehematopoetycznych oraz ich udzia³ w regeneracji uszkodzonych tkanek nadal pozostaj¹ w¹tpliwe i bardzo s³abo udokumentowane. Najbardziej prawdopodobnym wyt³umaczeniem pozytywnych wyników badañ nad plastycznoœci¹ jest wystêpowanie w szpiku kostnym ró norodnych populacji komórek macierzystych w tym i pluripotencjalnych komórek macierzystych. Zagadnienie to zostanie omówione poni ej. DOWODY NA RÓ NORODNOŒÆ KOMÓREK MACIERZYSTYCH SZPIKU KOSTNEGO OBECNOŒÆ NIEHEMATOPOETYCZNYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH Obecnoœæ niehematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym potwierdzaj¹ wyniki obserwacji œwiadcz¹ce o udziale komórek szpiku kostnego w regeneracji narz¹dów i tkanek [ ]. W tabeli 2 zestawiono charakterystyczne cechy fenotypowe ró nych rodzajów niehematopoetycznych komórek macierzystych które zidentyfikowano w szpiku kostnym. Nie mo na wykluczyæ e ró ni badacze stosuj¹c ró ne strategie izolacji opisywali w rzeczywistoœci zbli one populacje komórek macierzystych nadaj¹c im ró ne nazwy. Poni ej krótko opisano charakterystykê tych populacji oraz wystêpuj¹ce pomiêdzy nimi podobieñstwa. Komórki progenitorowe œródb³onka naczyñ EPC (ang. Endothelial Progenitor Cells). Podano e szpik kostny zarówno myszy jak i cz³owieka zawiera m.in. prekursory œródb³onka [4 5]. Co wiêcej zaobserwowano i wspomniane rezyduj¹ce EPC mog¹ byæ uwolnione ze szpiku do krwiobiegu i braæ udzia³ w procesach waskularyzacji towarzysz¹cych naprawie uszkodzonych organów [ ]. Okreœlenie stopnia udzia³u EPC pochodz¹cych ze szpiku w waskularyzacji narz¹dów wci¹ jednak wymaga dalszych badañ. Mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne MSC (ang. Mesenchymal Stem Cells; Multipotent Mesenchymal Stromal Cells). MSC stanowi¹ populacjê fibroblastów szpiku kostnego bêd¹cych podstawowymi komórkami zapewniaj¹cymi odpowiednie mikroœrodowisko dla wzrostu i ró nicowania KKM [ ]. Ponadto zdolne s¹ one do ró nicowania w komórki tkanek mezenchymalnych takich jak: tkanka ³¹czna w³aœciwa t³uszczowa kostna chrzêstna oraz wiêzade³ i œciêgien [10 84]. Nie mo na wykluczyæ jednak e izolowane populacje MSC zawieraj¹ równie inne niehematopoetyczne komórki macierzyste. Taka mo liwoœæ powinna byæ brana pod uwagê przy interpretacji wyników wskazuj¹cych na transró nicowanie MSC w komórki pochodz¹ce z innych ni mezoderma listków zarodkowych (np. w pochodz¹ce z ektodermy komórki nerwowe). W zwi¹zku z licznymi rozbie noœciami towarzystwo International Society for Cellular Therapy zaproponowa³o niedawno unikanie sformu³owania komórki macierzyste (stem cells) w odniesieniu do MSC proponuj¹c ich alternatywn¹ nazwê multipotencjalne mezenchymalne komórki stromalne [36].

7 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 69 TABELA 2. Fenotypowe cechy niehematopoetycznych komórek macierzystych zidentyfikowanych i wyizolowanych ze szpiku kostnego TABLE 2. Nonhematopoietic stem cells identified in the bone marrow Komórki macierzyste Fenotyp Komórki progenitorowe œródb³onka ( EPC E ndothelial Progenitor Cells) + + Ludzkie - CD133 CD34 c-kit (CD117) VE-kadheryna VEGFR2 CD146 vwf + CD M ysie - Sca-1 c-kit (CD117) Lin VEGFR2 VE-kadheryna Tie2 CD vwf CD31 Komórki macierzyste mezenchymalne ( MSC M esenchymal Stem Cells) * Kryteria wg International Society for + + Cellular Therapy: CD105 CD73 CD90 CD45 - CD CD14 CD11b CD79a - - CD19 HLA-DR + + low low Multipotencjalne dojrza³e komórki progenitorowe S SEA-1 CD13 Flk- 1 Thy-1 CD34 ( MAPC M ultipotent Adult Progenitor Cells) * CD CD45 CD117(c-kit) MHC I - MHC II Komórki MIAMI ( MIAMI Marrow Isolated Adult Multilineage I nducible Cells) * CD CD63 CD81 CD122 CD164 c-met BMPR1B NTRK3 CD34 CD36 CD45 - ) - D117 (c-kit - HLA-DR Bardzo ma³e komórki macierzyste podobne do komórek embrionalnych CXCR AC133 CD34 SSEA-1 (mysz) SSEA ( cz³owiek) AP c-met LIF-R ( VSELs Very Small Embryonic Like Stem CD Lin MHC I - HLA-DR CD90 c ells) CD CD105 * (fenotyp komórek po ekspansji/ fenotyp komórek adherentnych w hodowli) Skróty: AP - p³odowy typ alkalicznej fosfatazy; BMPR1 - receptor typu 1B dla BMP (ang. Bone Morphogenetic Protein) ; LIF-R - receptor dla LIF (ang. Leukemia Inhibitory Factor) ; NTRK3 receptor typu 3 dla eurotropowej kinazy tyrozynowej; vw - czynnik von Willebranda Multipotencjalne komórki progenitorowe MAPC (ang. Multipotent Adult Progenitor Cells). Komórki MAPC wyizolowane zosta³y jako frakcja adherentnych komórek jednoj¹drowych szpiku kostnego o fenotypie CD45 - GPA-A - oraz morfologii zbli onej do MSC [42]. MAPC pozostaj¹ jak dot¹d jedyn¹ populacj¹ szpikowych komórek macierzystych która po wstrzykniêciu do rozwijaj¹cej siê blastocysty mo e uczestniczyæ w tworzeniu komórek wszystkich trzech listków zarodkowych. Komplementacja rozwoju blastocysty przez te komórki ma wskazywaæ na ich pluripotencjalnoœæ [42]. Powy sza obserwacja wymaga jednak potwierdzenia przez inne niezale ne laboratoria. Komórki MIAMI (ang. Marrow-Isolated Adult Multilineage Inducible cells). Populacja komórek MIAMI zosta³a wyizolowana z frakcji komórek jednoj¹drowych ludzkiego szpiku kostnego w hodowlach ze zmniejszon¹ zawartoœci¹ tlenu na pod³o ach zawieraj¹cych fibronektynê [16]. Komórki MIAMI izolowano ze szpiku kostnego osób w ró nym wieku od 3. do 72. roku ycia. Linie komórkowe wyprowadzone z MIAMI wykazywa³y in vitro ekspresjê licznych markerów komórek nale ¹cych do trzech listków zarodkowych co wskazywaæ mo e na ich pluripotencjê. Jednak e udzia³ tych komórek w komplementacji rozwijaj¹cej siê blastocysty nie by³

8 70 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK dotychczas badany podobnie jak i potencjalny zwi¹zek miêdzy MIAMI oraz wspomnianymi powy ej komórkami MAPC. Jest wysoce prawdopodobne e stanowi¹ one populacje podobnych komórek izolowanych za pomoc¹ ró nych strategii badawczych. SZPIK KOSTNY JAKO RÓD O PLURIPOTENCJALNYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH IDENTYFIKACJA BARDZO MA YCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH PRZYPOMINAJ CYCH KOMÓRKI EMBRIONALNE VSELs Kilka lat temu zespó³ nasz zaproponowa³ alternatywne wyjaœnienie zjawiska plastycznoœci KKM. Za³o yliœmy jak powy ej wspomniano e szpik kostny jest Ÿród³em heterogenicznych populacji komórek macierzystych i obok KKM zawiera tak e pluripotencjalne komórki macierzyste (PKM) maj¹ce zdolnoœæ ró nicowania siê w rozmaite tkanki [53 90]. Komórki o takich w³aœciwoœciach uda³o siê nam ostatnio zidentyfikowaæ i wyizolowaæ ze szpiku kostnego [53 90]. Strategiê izolacji wspomnianej populacji bardzo ma³ych Sca-1 + CD45 - lin - komórek z mysiego szpiku kostnego z zastosowaniem FACS (ang. Fluorescence Activated Cell Sorter) zobrazowano na rycinie 1. Badania na poziomie mrna wykaza³y obecnoœæ w tych komórkach silnej ekspresji wczesnych tkankowo specyficznych genów reguluj¹cych procesy ró nicowania w kierunku linii niehematopoetycznych przy jednoczesnej ekspresji szeregu embrionalnych czynników transkrypcyjnych takich jak: Oct-4 Nanog i Rex-1 [52]. Pomocne w wyizolowaniu powy szych komórek by³y wyniki wstêpnych badañ sugeruj¹ce e komórki te: 1) bêd¹ wykazywa³y ekspresjê receptora CXCR4 (komórki mysie i ludzkie) oraz antygenów CD133 (komórki mysie i ludzkie) i Sca-1 (komórki mysie); 2) bêd¹ niehematopoetyczne a wiêc CD45 oraz 3) bêd¹ bardzo ma³e (3 4 mm œrednicy u myszy i 4 6 mm œrednicy u cz³owieka). Komórki te jak wspomniano wykazuj¹ ekspresjê szeregu markerów komórek pluripotencjalnych w tym SSEA-4 Oct-4 Rex-1 i Rif-1 na poziomie zarówno mrna jak i bia³ka. Jednoczeœnie s¹ negatywne pod wzglêdem obecnoœci antygenów zgodnoœci tkankowej MHC-I i MHC-II (HLA-DR) oraz bia³ek specyficznych dla linii mezenchymalnej takich jak: CD90 CD105 i CD29 [51]. Co wa niejsze komórki te izolowane z mysiego szpiku kostnego w badaniach z zastosowaniem elektronowego mikroskopu transmisyjnego maj¹ cechy charakterystyczne dla komórek embrionalnych takie jak: obecnoœæ du ego j¹dra komórkowego otoczonego w¹skim r¹bkiem cytoplazmy oraz wystêpowanie luÿnej chromatyny (euchromatyny) w j¹drze komórkowym. Co najwa niejsze pomimo bardzo ma³ych wymiarów komórki te zawieraj¹ prawid³ow¹ diploidaln¹ liczbê chromosomów a tak e liczne mitochondria. Odznaczaj¹ siê równie wysok¹ aktywnoœci¹ telomerazy. Wykorzystuj¹c powy sze kryteria komórki te okreœliliœmy mianem bardzo ma³ych komórek macierzystych podobnych do komórek embrionalnych VSELs (ang. Very Small Embryonic-Like stem cells)

9 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 71 RYCINA 1. Izolacja komórek VSELs ze szpiku kostnego doros³ych myszy za pomoc¹ FACS. Na rycinie zobrazowano strategiê izolacji VSELs za pomoc¹ sortowania FACS (ang. Fluorescence Activated Cell Sorting). Komórki szpiku kostnego izolowano z koœci udowych i piszczelowych koñczyn tylnych 4 8 tygodniowych myszy szczepu C57BL/6. Erytrocyty eliminowano za pomoc¹ lizy a pe³n¹ populacjê komórek szpiku kostnego barwiono stosuj¹c przeciwcia³a monoklonalne przeciwko mysim antygenom CD45 i Sca-1 oraz markerom specyficznym dla linii hematopoetycznych. Stosowano przeciwcia³a bezpoœrednio skoniugowane z fluorochromami (BD Pharmingen USA). PANEL A obrazuje rozmieszczenie komórek w zale noœci od parametrów FSC (ang. Forward Scatter) i SSC (ang. Side Scatter) komórek zale nych odpowiednio od wielkoœci oraz ziarnistoœci tych komórek. Region R1 zawiera komórki ma³e (2 8 µm) o morfologii limfocytarnej. Komórki z tego regionu przedstawiono na PANELU B w zale noœci od ich ekspresji markerów liniowych oraz Sca-1. Komórki o fenotypie Lin - Sca-1 + analizowano dalej pod wzglêdem ekspresji antygenu CD45 (Panel C). VSELs sortowano jako komórki o fenotypie CD45 - Lin - Sca-1 + (region R3) natomiast KKM jako CD45 + Lin - Sca-1 + (region R4). Wartoœæ procentowa jest to sama z odsetkow¹ œredni¹ zawartoœci¹ ka dej z populacji wœród wszystkich komórek jednoj¹drowych szpiku kostnego myszy FIGURE 1. Strategy to isolate very small embryonic like cells (VSELs) in the bone marrow derived from adult mice based on FACS sorting. The strategy to isolate very small embryonic like cells (VSELs) based on fluorescence-activated cell sorting (FACS) is showed. VSELs were sorted from bone marrow-mononuclear cells (BMMNCs) derived from 1 to 2-month-old mice of C57BL/6 strain. Erythrocytes were removed by a hypotonic solution (Lysing Buffer BD Biosciences San Jose USA). To label BMMNC the immunostaining for murine CD45 Sca-1 and lineage markers with specific antibodies conjugated with the fluorochromes (BD Pharmingen USA) was performed. PANEL A: Cell distribution based on FSC (Forward Scatter) and SSC (Side Scatter) parameters that describe their size and granularity respectively. Region 1 (R1) contains small cells with a size between 2 and 8 mm and lymphocytic morphology. Cells from R1 region are shown in PANEL B according to their lineage markers and Sca-1 expression. Sca- 1+Lin + cells were analyzed furthermore based on CD45 antigen expression (PANEL C). VSELs were sorted as population of CD45 Lin Sca-1 + cells (Region R3) and hematopoietic stem cells (HSCs) were sorted as population CD45 + Lin Sca-1 + cells (Region R4). Percent values are equall to mean quantity of each cell population among the all BMMNCs in the murine bone marrow

10 72 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK [52]. Ostatnio stosuj¹c cytometriê przep³ywow¹ uda³o siê nam zidentyfikowaæ podobne Sca-1 + lin - CD45 - komórki w tkankach wiêkszoœci mysich organów m.in. w nerkach p³ucach sercu oraz j¹drach. Komórki VSELs wyizolowano tak e z siatkówki oka wykazuj¹c jednoczeœnie e maj¹ one podobnie jak komórki szpikowe charakter komórek pluripotencjalnych [64]. Zaobserwowaliœmy e wielkoœæ VSELs mo e byæ ró na w zale noœci od narz¹du z którego s¹ izolowane. Komórki spe³niaj¹ce kryteria fenotypowe przyjête dla populacji mysich VSELs zidentyfikowaliœmy ostatnio w ludzkiej krwi pêpowinowej [51] co wskazuje na to i mog¹ wystêpowaæ tak e w tkankach cz³owieka. Wyniki dotychczasowych badañ przeprowadzonych w naszym laboratorium wskazuj¹ tym samym e w wiêkszoœci tkanek doros³ych osobników obecna jest populacja PKM maj¹cych szereg cech komórek pierwotnej ektodermy czyli epiblastu. Jak wiadomo w prawid³owym rozwoju embrionalnym epiblast daje pocz¹tek KM specyficznym tkankowo i narz¹dowo. PKM obecne w epiblaœcie podlegaj¹ ró nicowaniu najpierw do multipotencjalnych a nastêpnie tkankowo specyficznych komórek macierzystych które bior¹ udzia³ najpierw w tworzeniu a nastêpnie w regeneracji i odm³adzaniu narz¹dów [70 92]. Uwa amy e niektóre z tych pierwotnych komórek mog¹ unikn¹æ specyfikacji w kierunku bardziej zró nicowanych KM oraz zachowuj¹c swój pluripotencjalny charakter przetrwaæ u doros³ych osobników pomiêdzy zró nicowanymi tkankowo specyficznymi KM jako populacja komórek VSELs (ryc. 2). Podsumowuj¹c pochodz¹ce z epiblastu VSELs zostaj¹ zdeponowane pocz¹tkowo w powstaj¹cych podczas gastrulacji listkach zarodkowych we wczesnych etapach embriogenezy a nastêpnie w rozwijaj¹cych siê narz¹dach (ryc. 3) gdzie prze ywaj¹ do czasu osi¹gniêcia dojrza³oœci organizmu [91]. Cech¹ charakterystyczn¹ tych komórek jest ekspresja genów typowych dla pluripotencjalnych komórek epiblastu takich jak: SSEA-4 Oct-4 i Nanog. Hipotezê t¹ potwierdzaj¹ publikowane ostatnio dane wskazuj¹ce na obecnoœæ komórek macierzystych maj¹cych markery komórek epiblastu (np. Oct-4 SSEA) nie tylko w szpiku kostnym [ ] ale równie w tkankach wielu organów niehematopoetycznych takich jak: naskórek [27] nab³onek oskrzeli [62] miêsieñ sercowy [71] trzustka [17 49] j¹dra [29 44] miazga zêbowa [46] siatkówka [48] a tak e w p³ynie owodniowym [19]. Komórki te odpowiadaj¹ populacji Oct-4 + VSELs. Mog¹ siê one nieznacznie ró niæ morfologi¹ i wielkoœci¹ w zale noœci od typu tkanki z której s¹ izolowane [55 91]. Jak wspominano powy ej komórki podobne do VSELs zidentyfikowanych uprzednio w mysim szpiku uda³o siê nam ostatnio wyizolowaæ z ludzkiej krwi pêpowinowej [51] (tab. 3). Zgromadziliœmy te dowody e podobna populacja rezyduje w ludzkim szpiku szczególnie u ludzi w m³odym wieku. Uwa amy e VSELs mog¹ staæ siê alternatywnym Ÿród³em komórek macierzystych wykorzystywanych w celach terapeutycznych. Warto nadmieniæ e komórki te z powodzeniem zosta³y ju zastosowane w regeneracji miêœnia sercowego w eksperymentalnym modelu zawa³u u myszy [18].

11 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 73 RYCINA 2. Potencjalny udzia³ komórek VSELs w regeneracji tkanek. PANEL A: Liczba VSELs w dojrza³ych tkankach mo e ulegaæ zmianie w wyniku ich eliminowania wraz ze zwiêkszaniem liczby tkankowo specyficznych komórek macierzystych wytwarzanych podczas embriogenezy/gastrulacji. PANEL B: Alternatywnie wzglêdem panelu A mo liwe jest prze ycie komórek VSELs wœród tkankowo specyficznych komórek macierzystych; VSELs mog¹ stanowiæ dodatkowe ich Ÿród³o FIGURE 2. Potential VSELs activity in tissue regeneration. PANEL A: The VSELs number in adult tissues can be modified due to their elimination by pararel increasment of the quantity of tissue-committed stem and progenitor cells produced in embriogenesis and gastrulation phases of organism development. PANEL B: Contrary to Panel A: possible survival of VSELs among tissue-committed stem and progenitor cells; VSELs seem to be the addition source of tissue-committed stem and progenitor cells

12 74 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK RYCINA 3. Hipoteza obecnoœci embrionalnych komórek macierzystych epiblastu w dojrza³ych tkankach. Obecnoœæ VSELs w w¹trobie p³odowej szpiku kostnym i innych tkankach mo na wyjaœniæ hipotez¹ zasiedlania tych organów w wyniku migracji VSELs z epiblastu pod wp³ywem gradientu stê eñ SDF-1. W¹troba p³odowa jest najwa niejszym organem w szlaku migracyjnym tych komórek FIGURE 3. Hypothetical epiblast-derived stem cells (EPSC) existence in adult tissues. Finding of VSELs in fetal liver bone marrow and other tissues can be interpreted according to the hypothesis of VSELs migration from epiblast to those organs under the SDF-1 gradient. Fetal liver is the most important organ at the migratory pathways of VSELs in a developing organism PIÊTNO GENOMOWE (IMPRINTING GENOMOWY) JAKO MECHANIZM REGULUJ CY POTENCJA PROLIFERACYJNY VSELs Z ewolucyjnego punktu widzenia komórki linii zarodkowej okreœlane s¹ mianem nieœmiertelnych [ ]. Pochodz¹ce z linii komórek zarodkowych pierwotne komórki p³ciowe PGC (ang. Primordial Germ Cells) ewoluuj¹ w plemniki i komórki jajowe które tworz¹ w procesie zap³odnienia zygotê najwczeœniejsz¹ komórkê linii zarodkowej. Podczas rozwoju embrionalnego potencja³ linii zarodkowej jest zachowany w blastomerach moruli i w komórkach wêz³a zarodkowego blastocysty. W stadium blastocysty czêœæ komórek które otaczaj¹ blastulê ró nicuje siê w kierunku komórek trofoblastu daj¹c pocz¹tek ³o ysku. Po implantacji blastocysty w macicy komórki pluripotencjalne zlokalizowane s¹ w epiblaœcie czyli pierwotnej ektodermie [ ].

13 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 75 TABELA 3. Porównanie cech morfologicznych i fenotypowych mysich i ludzkich komórek VSELs TABLE 3. Morphologic and phenotypic comparison of murine and human VSELs ród³o komórek VSELs szpiku mysiego VSELs ludzkiej krwi pêpowinowej Wielkoœæ 3 5 mm 4 7 mm J ¹dro du e zawiera euchromatynê podwójna liczba chromosomów du e zawiera euchromatynê podwójna liczba chromosomów Cytoplazma w¹ski r¹bek cytoplazmy bogaty w mitochondria w¹ski r¹bek cytoplazmy bogaty w mitochondria Markery powierzchniowe Sca CXCR4 CD45 lin - - MHC-I HLA-DR - CD CD105 CD C D133 CXCR4 CD45 lin MHC-I HLA-DR CD CD105 CD29 Markery zarodkowych komórek macierzystych SSEA-1 Oct-4 Nanog Rex-1 du a aktywnoœæ telomerazy SSEA-4 Oct-4 Nanog Rex-1 du a aktywnoœæ telomerazy Ró nicowanie i n vitro + + U dzia³ w rozwoju zarodka N ie* (nieodpowiednie ) * Chronione przez zniesienie somatycznego imprintingu genów U myszy w 7. dni po zap³odnieniu dpc. (ang. days post-conception) czêœæ PKM epiblastu okreœlana jako PGC migruje do listw p³ciowych gdzie ró nicuje siê w oogonia b¹dÿ spermatogonia z których powstaj¹ oocyty b¹dÿ plemniki [69 70]. Krótko po specyfikacji PGC pozosta³e PKM epiblastu zaczynaj¹ ró nicowaæ siê w multi/unipotencjalne komórki z których rozwijaj¹ siê ró ne tkanki i narz¹dy [91]. Zak³adamy e w przebiegu ró nicowania wywodz¹ce siê z epiblastu PKM nie s¹ ca³kowicie eliminowane z rozwijaj¹cego siê organizmu. Prawdopodobnie czêœæ tych komórek prze ywa pomiêdzy tkankowo specyficznymi komórkami macierzystymi jako populacja VSELs [91]. Jak wiadomo jednym z podstawowych problemów medycyny regeneracyjnej jest opracowanie efektywnej ekspansji PKM. PKM poddaj¹ siê ekspansji tylko wtedy kiedy maj¹ prawid³owy imprinting genomowy (piêtno genomowe). Piêtno genomowe jest bowiem jednym z mechanizmów które kontroluj¹ ekspansjê i proliferacjê PKM w doros³ym organizmie i najlepiej zosta³o poznane w³aœnie w populacji PGC. Jak wykazano PGC wyizolowane z rozwijaj¹cych siê p³odów po 11. dniu rozwoju embrionalnego: 1) szybko gin¹ w hodowlach in vitro 2) j¹dra komórkowe tych komórek nie bior¹ udzia³u w tworzeniu klonu podczas transferu j¹drowego do enukleowanej komórki jajowej 3) nie tworz¹ potworniaków po wstrzykniêciu zwierzêtom doœwiadczalnym i 4) nie komplementuj¹ rozwoju zarodka po iniekcji do rozwijaj¹cej siê blastocysty [ ]. Tak wiêc ta najwa niejsza populacja KM odpowiedzialna za przenoszenie informacji genetycznej z pokolenia na pokolenie nie wykazuje tych wszystkich cech które tradycyjnie przypisuje siê PKM. Za stan ten odpowiedzialne jest usuniêcie piêtna genomowego (ang. somatic imprint) na wa nych rozwojowo genach [ ]. Piêtno genomowe polega na ró nym stopniu metylacji niektórych genów w komórkach jajowych i plemnikach [59 67]. Gen jest metylowany (naznaczany) na

14 76 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK allelu pochodz¹cym tylko od jednego z rodziców. Do tej pory poznano np. u myszy oko³o 80 takich genów które s¹ naznaczane g³ównie w komórkach rozrodczych eñskich. Tylko kilka genów jest naznaczanych w gametach mêskich (np. Igf2-H19 Rasgrf1 Meg3) [ ]. Podczas zap³odnienia pary odpowiednich genów wykazuj¹cych piêtno wystêpuj¹ w odpowiedniej proporcji w zygocie i piêtno to utrzymuje siê nastêpnie podczas rozwoju we wszystkich komórkach linii somatycznej. Odmienna sytuacja wystêpuje w PGC. Usuniêcie (demetylacja) jednostek regulatorowych genów wykazuj¹cych imprinting nastêpuje podczas migracji PGC do listw p³ciowych [59 67]. Usuniêcie piêtna genomowego w PGC ma powodowaæ e komórki te jeœli zmieni¹ kierunek migracji podczas ich wêdrówki do listew p³ciowych i osiedl¹ siê w innych narz¹dach nie bêd¹ ulega³y proliferacji i tworzy³y potworniaków. Jest to równie wa ny mechanizm maj¹cy za zadanie kontrolowanie proliferacji tych komórek i zapobiega zjawisku dzieworództwa (partenogenezy). Piêtno genomowe zostanie ponownie odbudowane w komórkach gamet w j¹drach i jajnikach po pierwszym podziale mejotycznym gdy liczba DNA zostanie zredukowana do po³owy tak aby diploidalna zygota powstaj¹ca w wyniku zap³odnienia mia³a prawid³owy wzrost metylacji genów pochodz¹cych od samca i samicy. Jeœli jednak PGC w których dosz³o ju do usuniêcia piêtna genomowego umieszczone zostan¹ w hodowli na warstwie mysich fibroblastów p³odowych w obecnoœci wyselekcjonowanych czynników wzrostu np. czynnika hamuj¹cego bia³aczkê LIF (ang. Leukemia Inhibitory Factor) zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów bfgf (ang. basic Fibroblast Growth Factor) i liganda receptora c-kit mog¹ one ulec zmianom epigenetycznym i odzyskaæ prawid³owy wzór somatyczny piêtnowanych genów [25 93]. Powstaj¹ wtedy unieœmiertelnione embrionalne komórki p³ciowe EGC (ang. Embryonic Germ Cells) [68 118] maj¹ce w³aœciwoœci PKM. EGC w przeciwieñstwie do PGC: 1) ró nicuj¹ siê w hodowlach in vitro w komórki pochodz¹ce potencjalnie z trzech listków zarodkowych 2) j¹dra komórkowe tych komórek bior¹ udzia³ w tworzeniu klonu podczas transferu j¹drowego do enukleowanej komórki jajowej 3) daj¹ pocz¹tek potworniakom po wstrzykniêciu zwierzêtom doœwiadczalnym oraz 4) komplementuj¹ rozwój zarodka po iniekcji do rozwijaj¹cej siê blastocysty. Ta zmiana w³aœciwoœci biologicznych PGC po transformacji w EGC wi¹ e siê jak wspominano powy ej z odtworzeniem prawid³owego piêtna genomowego. Tak wiêc proces ten ma charakter odwracalny i w niektórych warunkach mo e zostaæ odtworzony. Ostatnio wykazaliœmy e podobne zjawisko jakie opisano dla PGC zachodzi tak e w VSELs i kontroluje proliferacjê tych komórek. Stwierdziliœmy bowiem e usuniêcie imprintingu genomowego na niektórych genach (Igf2-H19 Rasgrf1) VSELs jest odpowiedzialne za to e komórki te w dojrza³ych tkankach pozostaj¹ w stanie uœpienia. Chroni to organizm przed powstawaniem potworniaków [55 91]. Niemniej jednak podobnie jak w przypadku PGC proces ten w sprzyjaj¹cych warunkach epigenetycznych jest odwracalny. Dlatego te pracujemy nad strategi¹ prowadz¹c¹ do przywrócenia w³aœciwego somatycznego imprintingu w VSELs. Uwa amy e VSELs po przywróceniu prawid³owego piêtna genomowego mog³yby potencjalnie staæ siê alternatyw¹ dla komórek embrionalnych pozyskiwanych z

15 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 77 p³odów czy te tzw. indukowanych PKM otrzymywanych w wyniku transformacji komórek somatycznych [ ]. RÓ NICOWANIE MYSICH VSELs IN VITRO Zidentyfikowane i opisane przez nasz¹ grupê VSELs stanowi¹ bardzo ma³¹ liczebnie populacjê komórek obecnych w szpiku kostnym doros³ych osobników (1 komórka VSELs na ok komórek jednoj¹drowych mysiego szpiku) [52]. Z obserwacji naszych wynika tak e e szpik kostny m³odych myszy zawiera wiêcej komórek o fenotypie VSELs a liczba tych komórek maleje z wiekiem osobnika [52]. Maj¹c na uwadze potencjalne wykorzystanie tych komórek do celów terapeutycznych niezbêdnym wydaje siê szybkie opracowanie skutecznej metody ich ekspansji ex vivo. Prowadzimy wiêc intensywne badania nad opracowaniem sk³adu skutecznego koktajlu ró nych czynników wzrostowych stymuluj¹cych proliferacjê VSELs. Nasze dotychczasowe obserwacje wskazuj¹ e VSELs wymagaj¹ do proliferacji nie tylko œrodowiska hodowlanego o odpowiednim sk³adzie ale równie sygna³ów kostymuluj¹cych w hodowlach z innymi komórkami (np. mysimi fibroblastami podœcieliska szpiku kostnego). W takich warunkach hodowlanych VSELs dziel¹ siê oraz ró nicuj¹ w komórki nale ¹ce potencjalnie do trzech listków zarodkowych tj. kardiomiocyty (mezoderma) ró ne rodzaje komórek nerwowych (ektoderma) oraz komórki trzustki syntetyzuj¹ce insulinê (endoderma) [52]. W hodowlach na komórkach linii stromalnej OP-9 VSELs ró nicuj¹ siê w kierunku komórek hematopoetycznych. Stwierdziliœmy równie e w hodowli z mysimi komórkami linii mioblastycznej C2C12 oko³o 5 10% VSELs tworzy sfery przypominaj¹ce kule zarodkowe. Komórki znajduj¹ce siê w takich sferach wykazuj¹ aktywnoœæ p³odowej formy fosfatazy alkalicznej [52] oraz wykazuj¹ cechy komórek niedojrza³ych zawieraj¹ du e j¹dro komórkowe wype³nione euchromatyn¹. Ponadto jeœli zostan¹ wyizolowane i umieszczone w odpowiednim medium ró nicuj¹cym przekszta³caj¹ siê w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych. Obecnie nasza grupa prowadzi tak e intensywne badania potencja³u regeneracyjnego komórek pochodz¹cych ze wspomnianych sfer w ró nych zwierzêcych modelach uszkodzenia tkanek in vivo. SZPIK KOSTNY JAKO RÓD O KR CYCH NIEHEMATOPOETYCZNYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH W warunkach fizjologicznych niewielka liczba KKM stanowi pulê kr¹ ¹c¹ we krwi obwodowej powstaj¹c¹ w wyniku samoodnawiania siê komórek macierzystych w niszach szpikowych i utrzymuj¹c¹ równowagê puli komórek macierzystych w innych oddalonych niszach szpiku kostnego. Uwa amy e kr¹ ¹ce komórki macierzyste mog¹ konkurowaæ o nisze specyficzne dla ró nych tkanek i narz¹dów. Zjawisko to mo e t³umaczyæ fakt wystêpowania heterogenicznych populacji komórek

16 78 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK macierzystych w ró nych organach np. obecnoœæ KKM w miêœniach szkieletowych. Liczba uwolnionych do krwiobiegu KKM zwiêksza siê po podaniu chemotaktycznych czynników mobilizuj¹cych takich jak np. czynnik wzrostowy kolonii granulocytów G-CSF (ang. Granulocyte-Colony Stimulating Factor) [82] czy te antagonista receptora CXCR4 bicyklam AMD3100 [21]. KKM ulegaj¹ równie mobilizacji w sytuacjach stresowych dla organizmu np. w hipoksji czy te po uszkodzeniu narz¹dów [ ]. Potwierdzono e równie niehematopoetyczne komórki macierzyste szpiku kostnego mog¹ pokonywaæ barierê szpikow¹ i kr¹ yæ we krwi m.in. podczas mobilizacji farmakologicznej (G-CSF AMD3100) lub stresu zwi¹zanego z uszkodzeniem tkanek czy organów (np. zawa³ miêœnia sercowego udar mózgu toksyczne uszkodzenie w¹troby) [90 99]. Dlatego zjawisko mobilizacji komórek macierzystych ze szpiku kostnego do krwi obwodowej powinno byæ postrzegane jako proces uwalniania nie tylko KKM ale równie komórek macierzystych niehematopoetycznych. Co wiêcej mobilizacja œrodkami farmakologicznymi w po³¹czeniu z leukoferez¹ mo e znaleÿæ zastosowanie kliniczne do pozyskiwania obok szpikowych KKM tak e i pierwotnych komórek niehematopoetycznych. W tabeli 4 wymieniono niektóre sytuacje kliniczne prowadz¹ce do zwiêkszenia liczby komórek macierzystych kr¹ ¹cych we krwi obwodowej. Zjawisko to obserwowano w przypadkach uszkodzenia miêœni szkieletowych [ ] oraz miêœnia sercowego [50 111] w udarze mózgu [56] skomplikowanych z³amaniach koœci [28] uszkodzeniach w¹troby i nerek [105] niedokrwieniu koñczyn [43] a tak e po transplantacjach w¹troby i p³uc [60] oraz operacjach na otwartym sercu [73]. Wspomniane kr¹ ¹ce komórki szpikowe opisano jako komórki prekursorowe œródb³onka komórki satelitowe miêœni szkieletowych [57] komórki progenitorowe dla miêœnia sercowego [111] komórek nerwowych i koœci [28 56] a tak e jako MSC oraz tzw. fibrocyty [8 83] które prawdopodobnie stanowi¹ funkcjonalnie zmienion¹ subpopulacjê MSC. Dane te wskazuj¹ e podczas uszkodzenia tkanek i narz¹dów niehematopoetyczne komórki macierzyste mobilizowane s¹ ze szpiku kostnego oraz prawdopodobnie z innych niszy tkankowych do krwi obwodowej gdzie kr¹ ¹ jako potencjalne Ÿród³o komórek macierzystych wspomagaj¹cych regeneracjê. Kr¹ eniem ich zawiaduj¹ uwalniane z uszkodzonych tkanek chemoatraktanty takie jak: SDF-1 (Stromal Derived Factor-1) VEGF HGF/SF LIF oraz bfgf [ ]. Stwierdzono równie e czynnik transkrypcyjny HIF-1 (Hypoxia Regulated/ Inducible transcription Factor-1) zwi¹zany z niedotlenieniem tkanek ma bardzo znacz¹cy udzia³ w regulacji ekspresji tych ligandów [34 95]. Promotory genów dla SDF-1 VEGF oraz HGF/SF zawieraj¹ bowiem funkcjonalne miejsca wi¹zania HIF-1 [ ]. W ten sposób hipoksja mo e indukowaæ ekspresjê wymienionych czynników odpowiedzialnych za uwalnianie komórek macierzystych ze szpiku w tym VSELs i ich ukierunkowan¹ migracjê do uszkodzonych tkanek i narz¹dów (ryc. 4).

17 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 79 TABELA 4. Dowody na kr¹ enie niehematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kostnego w ró nych stanach klinicznych TABLE 4. Proofs for the bone marrow-derived nonhematopoietic stem cells circulation at different pathological states of human organism Uszkodzenie Mysz komórki macierzyste ze szpiku kostnego zosta³y opisane jako komórki miêœni zasilaj¹ce pulê komórek satelitowych po przeszczepie do napromienionych szkieletowych miêœni podobnie szpikowe KM uczestniczy³y w regeneracji miêœni szkieletowych uszkodzonych w nastêpstwie intensywnych æwiczeñ fizycznych + Zawa³ miêœnia Cz³owiek zwiêkszenie liczby kr¹ ¹cych we krwi komórek CD34 CXCR4 + sercowego c-met + opisano po ostrym zawale miêœnia sercowego. Kr¹ ¹ce komórki by³ y wzbogacone w mrna dla Gata-4 Mef-2C i Nkx2.5/Csx Mysz Zwiêkszenie zawartoœci mrna dla markerów linii kadiomiocytów: Gata-4 Mef-2C i Nkx.25/Csx w ca³ej populacji komórek jednoj¹drowych krwi obwodowej po eksperymentalnie spowodowanym zawale serca U dar mózgu Mysz Zwiêkszenie zawartoœci mrna dla markerów linii neuronalnych : GFAP Nestyny i biii-tubuliny w ca³ej populacji komórek jednoj¹drowych krwi obwodowej po eksperymentalnie spowodowanym udarze mózgu Liczne z³amania Cz³owiek Zwiêkszenie zawartoœci mrna dla markerów tkanki kostnej koœci (osteokalcyny alkalicznej fosfatazy kolagenu typu I) w komórkach jedno- j¹drowych krwi obwodowej u pacjentów ze skomplikowanymi z³amaniami koœci Uszkodzenie Mysz Zwiêkszenie efektywnego zasiedlania uszkodzonej (przez ekspozycjê + + w¹troby na CCl ) w¹troby myszy NOD/SCID przez ludzkie komórki CD34 C XCR Uszkodzenie M ysz Zwiêkszenie we krwi liczby kr¹ ¹cych komórek CD34 C XCR4 oraz nerek lin - + S ca-1 podczas ostrej niewydolnoœci nerek + + Przeszczep p³uc Cz³owiek Zwiêkszenie liczby kr¹ ¹cych komórek CXCR4 c ytokeratyna-5 we krwi + + Operacje na Cz³owiek Zwiêkszenie liczby kr¹ ¹cych komórek CD34 C XCR4 we krwi otwartym sercu + Przeszczep C z³owiek Zwiêkszenie liczby kr¹ ¹cych komórek CD34 we krwi oraz w¹troby zawartoœci mrna dla GATA-4 cytokeratyny 19 i a-fetoproteiny w ca³ej populacji komórek jednoj¹drowych krwi obwodowej Niedotlenienie Mysz Obecnoœæ szpikowych komórek Sca F LK-1 T ie- 2 C D34 koñczyn kr¹ ¹cych we krwi oraz ich udzia³ w neowaskularyzacji ROLA PROGENITOROWYCH/MACIERZYSTYCH KOMÓREK SZPIKU KOSTNEGO W PROCESACH PATOLOGICZNYCH Gromadzone s¹ dowody doœwiadczalne e uwalniane i kr¹ ¹ce we krwi obwodowej KM mog¹ odgrywaæ niekorzystn¹ rolê w szeregu procesów patologicznych [96]. Stwierdzono e jeœli komórki szpikowe zostan¹ zmobilizowane w niew³aœciwym czasie lub zasiedl¹ niew³aœciw¹ niszê tkankow¹ (np. obszar tkanki objêty przewlek³ym procesem zapalnym) mog¹ zamiast wspomagaæ regeneracjê prowadziæ do rozwoju zmian patologicznych [94] np. zw³óknienia p³uc pterygii ga³ki ocznej czy te neuropatii towarzysz¹cej cukrzycy [ ]. Potwierdzono równie e KM pochodz¹ce ze szpiku kostnego mog¹ braæ udzia³ w rozwoju niektórych guzów litych. Wskazuj¹ na to wyniki badañ dotycz¹cych raka o³¹dka

18 80 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK RYCINA 4. Koncepcja kr¹ enia niehematopoetycznych komórek macierzystych we krwi obwodowej. PANEL A Komórki macierzyste mog¹ kr¹ yæ we krwi obwodowej. W warunkach normalnych kr¹ y niewielka ich liczba (g³ównie krwiotwórcze komórki macierzyste) ale zasobnoœæ tej puli KM zwiêksza siê (w wyniku mobilizacji) podczas uszkodzeñ tkankowych i w stanach stresu (np. zawa³ miêœnia sercowego udar mózgu uszkodzenia w¹troby zapalenia jelit). Mobilizowane KM s¹ przyci¹gane do uszkodzonych tkanek przez czynniki chemotaktyczne m.in. czynnik wzrostowy pochodzenia stromalnego-1 SDF-1 czynnik wzrostowy hepatocytów HGF (ang. Hepatocyte Growth Factor) czy te czynnik wzrostowy komórek œródb³onka VEGF (ang. Vascular Endothelial Growth Factor). Do takiej puli komórek macierzystych ulegaj¹cych mobilizacji i kr¹ ¹cych we krwi podczas uszkodzeñ tkankowych nale ¹ równie zidentyfikowane ostatnio pluripotencjalne komórki macierzyste jakimi s¹ VSELs. PANEL B Potencjalny udzia³ komórek VSELs w regeneracji miêœnia sercowego Podczas zawa³u miêœnia sercowego ekspresja SDF-1 ulega zwiêkszeniu w uszkodzonej tkance a tak e nastêpuje gromadzenie siê fragmentów rozk³adu sk³adowej C3 dope³niacza (C3a i desarg C3a). Fragmenty dope³niacza wzmacniaj¹/moduluj¹ odpowiedÿ komórek macierzystych CXCR4 + na gradient stê eñ SDF-1 co powoduje wiêksz¹ ich efektywnoœæ i skutecznoœæ w regeneracji uszkodzonej tkanki przez tworzenie super gradientu (tak jak w przypadku uszkodzenia miêœnia sercowego panel B). Poza SDF-1 inne chemoatraktanty równie odgrywaj¹ wa n¹ rolê w tym procesie ( HGF/SF LIF VEGF) FIGURE 4. Concept of the nonhematopoietic stem cells circulation in the peripheral blood. PANEL A Stem cells can circulate in peripheral blood.at the normal conditions in human organism a low number of stem cells circulate in the peripheral blood (mostly hematopoietic stem cells). However the quantity of stem cells increases due to the mobilization mechanisms in situations such as tissue damage and biological stress processes (acute myocardial infarction cerebral stroke liver parenchyma injury intestine inflammation etc ). Mobilized stem cells are attracted to the injured tissues due to the concentration gradient of chemotactic agents like SDF-1(Stromal Derived Factor-1) HGF (Hepatocyte Growth Factor) and VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Among stem cell populations mobilized under tissue injury conditions the pluripotent stem cells (such as VSELs) were found. PANEL B Potential VSELs activity in the myocardial muscle regeneration process. SDF-1 concentration is increased during the acute myocardial infarction. Moreover activated complement cascade elements (C3a and desarg C3a) appear in the heart damaged tissue. These elements modulate and upregulate the response of CXCR4 + stem cells to an increased concentration of SDF-1 what results in a stronger regenerative effect in that tissue by the super gradient creation (like in case of the heart hypoxia and damage panel B). Other chemoattractants play important role in this process as well (HGF/SF LIF VEGF)

19 VSELs OBECNY STAN BADAÑ 81 rozwijaj¹cego siê w nastêpstwie przewlek³ego stanu zapalnego b³ony œluzowej o³¹dka ze wspó³istniej¹cym zaka eniem o etiologii Helicobacter pylori [38]. W zmienionej œluzówce o³¹dka zaobserwowano zwiêkszon¹ ekspresjê SDF-1 (ang. Stromal Derived Factor-1) co wskazywaæ mo e na potencjalny udzia³ tego chemoatraktanta w mobilizowaniu CXCR4 + KM ze szpiku kostnego (np. VSELs?). Komórki takie po osiedleniu siê w œluzówce o³¹dka transformowa³y w komórki inicjuj¹ce rozwój gruczolakoraka [61]. Podobne zjawisko jako mog¹ce wyjaœniaæ patogenezê rozrostu nowotworowego wskazano równie w niektórych przypadkach raka jelita grubego. Ponadto z licznych obserwacji wynika e komórki EPC oraz MSC ze szpiku kostnego mog¹ byæ zaanga owane w rozwój nowotworów dostarczaj¹c progenitorów komórek naczyñ krwionoœnych i podœcieliska [24 106]. Na potencjalny udzia³ komórek macierzystych szpiku kostnego w rozwoju guzów litych mo e wskazywaæ fakt e komórki szpikowe eksponowane in vitro na rakotwórcze dzia³anie 3-metylocholantrenu mog¹ transformowaæ w komórki inicjuj¹ce rozrost wielu typów nowotworów [63]. Powy sze dane dostarczaj¹ wiêc dowodów na to e komórki macierzyste szpiku kostnego mog¹ byæ Ÿród³em wielu niehematopoetycznych rozrostów nowotworowych a sam szpik jest organem ukrywaj¹cym komórki macierzyste potencjalnie podatne na transformacje nowotworowe. W tym kontekœcie dalszych badañ wymaga równie okreœlenie potencjalnego udzia³u komórek VSELs w tych niekorzystnych zjawiskach. PERSPEKTYWY BADAÑ NAD KOMÓRKAMI VSELs Na podstawie analizy wyników badañ w³asnych jak równie zwiêkszaj¹cej siê liczby publikowanych doniesieñ potwierdzaj¹cych obecnoœæ ró nych populacji pierwotnych komórek w szpiku kostnym (m.in. pluripotencjalnych VSELs) uwa amy e pozytywne wyniki wczeœniejszych badañ sugeruj¹ce plastycznoœæ KKM szpiku kostnego powinny byæ poddane weryfikacji. Nale y odpowiedzieæ na pytanie czy VSELs mog¹ w organizmie doros³ego osobnika uczestniczyæ w odnowie innych liniowo zdeterminowanych komórek macierzystych w³¹czaj¹c w to np. obecne w szpiku kostnym KKM. Stosuj¹c odpowiednie badawcze modele uszkodzeñ narz¹dów u zwierz¹t poszukujemy odpowiedzi na pytanie czy VSELs mog¹ znaleÿæ praktyczne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. Jak wskazaliœmy wczeœniej VSELs zosta³y ju z powodzeniem zastosowane w eksperymentalnym modelu zawa³u miêœnia sercowego u myszy [18] ale podstawowym potencjalnym ograniczeniem ich wykorzystania w celach terapeutycznych jest stosunkowo ma³a liczebnoœæ populacji VSELs w szpiku kostnym. Ponadto jak udokumentowaliœmy liczba tych komórek maleje z wiekiem [52]. Istnieje równie mo liwoœæ e po uszkodzeniu tkanek VSELs zmobilizowane ze szpiku jeœli nawet docieraj¹ bez przeszkód do zmienionego patologicznie narz¹du skutecznie uczestnicz¹ w regeneracji jedynie niewielkich uszkodzeñ. Pojawia siê tym

20 82 I. KLICH S. WALAT J. RATAJCZAK M. KUCIA M. Z. RATAJCZAK samym uzasadniona obawa e efektywna regeneracja wiêkszego i bardziej rozleg³ego uszkodzenia tkankowego (np. zawa³u miêœnia sercowego czy te udaru mózgu) mo e przekraczaæ zdolnoœci regeneracyjne tej stosunkowo ma³oliczebnej populacji komórek. Dlatego wa ne bêdzie opracowanie protoko³ów i procedur zapewniaj¹cych skuteczn¹ ekspansjê tych komórek ex vivo. Po drugie migracja i przemieszczenie VSELs do tkanek objêtych uszkodzeniem zale y od sygna³ów chemotaktycznych które mog¹ byæ niewystarczaj¹co silne i skuteczne. Czynniki chemotaktyczne nara one s¹ bowiem na dzia³anie enzymów proteolitycznych wydzielanych zarówno przez leukocyty krwi obwodowej jak i makrofagi tkankowe in situ w miejscach uszkodzenia. Przyk³adowo metaloproteinazy trawi¹ce bia³ka macierzy zewn¹trzkomórkowej wydzielane przez komórki towarzysz¹ce procesom zapalnym powoduj¹ m.in. lokaln¹ degradacjê czynnika chemotaktycznego pochodzenia stromalnego-1 co w efekcie upoœledza migracjê komórek macierzystych do miejsc uszkodzenia. W takiej sytuacji zmobilizowane VSELs mog¹ potencjalnie kr¹ yæ we krwi obwodowej jako bezdomna populacja a nastêpnie wracaæ do szpiku kostnego lub zasiedlaæ inne organy. Po trzecie aby VSELs mog³y w pe³ni wykazaæ swój potencja³ regeneracyjny ich czynnoœæ musi byæ w pe³ni zaktywowana. Badania nasze wskazuj¹ e VSELs rezyduj¹ce w szpiku kostnym w wyniku zmian metylacji genów wykazuj¹cych piêtno genomowe pozostaj¹ w stadium uœpienia. Jak do tej pory nie uda³o siê nam jeszcze zidentyfikowaæ kombinacji czynników wzrostowych ani te. moleku³ adhezyjnych pozwalaj¹cych na efektywne namna anie VSELs in vitro bez udzia³u innych komórek (np. C2C12 OP-9 fibroblastów szpikowych). PODSUMOWANIE Wyniki badañ uzyskane w naszym laboratorium wskazuj¹ e VSELs mog¹ stanowiæ populacjê komórek alternatywn¹ dla zarodkowych komórek macierzystych. W czasie kiedy trwa etyczno-religijna debata nad pozyskiwaniem i zastosowaniem komórek embrionalnych w praktyce klinicznej istnieje uzasadniona potrzeba oceny przydatnoœci VSELs jako alternatywnego Ÿród³a PKM w medycynie regeneracyjnej. Musimy wiêc jak najszybciej znaleÿæ odpowiedÿ na pytanie czy VSELs izolowane z tkanek doros³ych organizmów mog¹ spe³niæ te oczekiwania i byæ efektywnie zastosowane w klinice. Nadchodz¹ce lata przynios¹ odpowiedÿ na to pytanie. PIŒMIENNICTWO [1] ALIOTTA JM SANCHEZ-GUIJO FM DOONER GJ et al. Alteration of marrow cell gene expression protein production and engraftment into lung by lung-derived microvesicles: a novel mechanism for phenotype modulation. Stem Cells 2000; 25(9): [2] ALVAREZ-DOLADO M PARDAL R GARCIA-VERDUGO JM et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 2003; 425(6961):