Ćwiczenie L10 Lipidy. 1. Właściwości lipidów. Wymagania:

Transkrypt

1 Ćwiczenie L10 Lipidy Wymagania: 1. Charakterystyka lipidów jako związków nierozpuszczalnych w wodzie. 2. Budowa lipidów. 3. Reakcje charakterystyczne dla lipidów i ich składników. 4. Znaczenie steroidów w diagnostyce medycznej. 5. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. LIPIDY to heterogenna grupa związków organicznych wyodrębniona ze względu na brak rozpuszczalności w wodzie, a rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych. Są one składnikami pokarmu i pełnią wiele funkcji metabolicznych. Podzielono je na 3 grupy: proste, do których naleŝ tłuszcze właściwe i woski, złoŝone, do których naleŝą fosfolipidy, glikolipidy i inne, prekursory i pochodne lipidów. 1. Właściwości lipidów Celem ćwiczenia jest wykazanie róŝnych właściwości fizykochemicznych lipidów Rozpuszczalność tłuszczowców Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie, natomiast rozpuszczają się w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych. Postępowanie: Przygotować 4 długie szklane probówki i pipety pasteurowskie ; postępować wg schematu Odczynniki (ml) woda etanol chloroform aceton Olej roślinny 4 krople 4 krople 4 krople 4 krople Zapisać wynik obserwacji Zamieszać na mieszadle pionowym vortex

2 1.2 Tworzenie emulsji tłuszczu w obecności emulgatorów Emulsja tłuszczu to układ koloidalny, w którym ośrodek rozpraszający i substancja rozproszona są nierozpuszczającymi się wzajemnie cieczami, tworząca się w przypadku silnego wytrząsania z wodą i rozbicia tłuszczu na drobne kropelki. Emulsja jest układem termodynamicznie nietrwałym, gdyŝ tłuszcz po chwili wypływa ponownie na powierzchnię wody, dlatego w celu jej utrwalenia stosuje się dodatki emulgatorów. Emulgator to substancja zmniejszająca napięcie powierzchniowe na granicy faz tj. siłę, która przeciwstawia się zwiększeniu powierzchni granicznej między wodą i tłuszczem. Powstała w ten sposób emulsja tłuszczu i wody charakteryzuje się wysoką stabilnością. Do emulgatorów moŝna zaliczyć m.in. lecytynę (fosfatydylocholinę), detergenty (sole estrów kwasu siarkowego i wyŝszych alkoholi), mydła (sole sodowe lub potasowe kwasów tłuszczowych), kwasy Ŝółciowe. Utworzenie emulsji tłuszczu w przewodzie pokarmowym ma istotne znaczenie dla procesów trawiennych. Sole kwasów Ŝółciowych zwiększają stopień rozproszenia lipidów w treści pokarmowej w jelicie, przez co zwiększa się powierzchnia styku i zwiększa się dostępność lipazy trzustkowej dla trawionych lipidów. Kwasy Ŝółciowe są końcowymi produktami przemiany cholesterolu. Wykazują one zdolność obniŝania napięcia powierzchniowego roztworów, a dzięki temu emulgowania tłuszczów, co ułatwia ich trawienie w przewodzie pokarmowym. Dzięki tym własnościom umoŝliwiają prawidłowe wchłanianie tłuszczów oraz witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Postępowanie: Przygotować 3 długie szklane probówki i pipety pasteurowskie ; postępować wg schematu Odczynniki (ml) olej H 2 O 5,5 5 5 Zawartość probówek wymieszać sól kwasu Ŝółciowego - 0,5 - detergent - - 0,5 Zawartość probówek wytrząsnąć Porównać trwałość emulsji w trzech probówkach. Zanotować wynik obserwacji.

3 1.3. Zmydlanie tłuszczów, badanie właściwości mydeł Reakcja zmydlania, czyli hydrolizy tłuszczów zarówno prostych, jak i fosfolipidów zachodzi w środowisku zasadowym. Produktami reakcji, poza alkoholem, są mydła, czyli sole kwasów tłuszczowych. Zmydlanie tłuszczów (hydroliza zasadowa): Jako sole słabych kwasów oraz mocnych zasad wykazują odczyn zasadowy. Pod wpływem mocnych kwasów nieorganicznych (np. H 2 SO 4 ) z mydeł powstają nierozpuszczalne w wodzie kwasy tłuszczowe. Mydła charakteryzują się róŝną rozpuszczalnością w wodzie w zaleŝności od kationu metalu jaki wchodzi w jego skład. Mydła sodowe i potasowe dobrze rozpuszczają się w wodzie, natomiast mydła wapniowe i magnezowe są trudno rozpuszczalne w wodzie. Mydła rozpuszczalne w wodzie są substancjami powierzchniowo czynnymi. Micele koloidowe mydła utrzymują się w wodzie dzięki otaczającemu je płaszczowi wodnemu. Dodanie elektrolitu o większym powinowactwie do wody np. NaCl powoduje odwodnienie miceli i zobojętnienie ładunków elektrycznych na powierzchni przez co cząsteczki koloidu są pozbawiane otoczki wodnej i wypadają z roztworu. W przebiegu ostrego zapalenia trzustki dochodzi do martwicy Balsera martwicy tkanki tłuszczowej spowodowanej powstawaniem nierozpuszczalnych mydeł wapniowych tworzących charakterystyczne ogniska w jamie brzusznej. Postępowanie Przygotować suchą długą probówkę szklaną, łopatkę metalową i pipetę pasteurowską ; postępować wg schematu Smalec a) Otrzymywanie mydła potasowego 10% KOH w metanolu 1 Pół łopatki Wstawić probówkę do wrzącej łaźni na 5 minut (okulary ochronne!), a następnie ochłodzić pod wodą. Otrzymane mydło rozpuścić w 10 ml wody destylowanej 3 ml

4 b) Badanie właściwości mydeł Postępowanie Przygotować 3 suche probówki szklane i pipety pasteurowskie ; postępować wg schematu Odczynniki (ml) 1 Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego 2 Wysalanie mydła 3 Wydzielanie wolnych kwasów tłuszczowych Roztwór mydła ,5 ml % roztwór CaCl 2 Stały NaCl + 3 ml wody destylowanej - do wytrącenia osadu - 1 M H 2 SO ,5 ml 1) Probówkę nr 3 wstawić do gorącej łaźni wodnej, ogrzewać do rozpuszczenia osadu Zanotować wyniki obserwacji 1.4. Wykrywanie glicerolu 2) Probówkę schłodzić pod strumieniem zimnej wody kranowej 3) Zlać roztwór znad osadu 4) Do osadu dodać 2 ml wody Tłuszcze właściwe (triacyloglicerole) naleŝą do estrów, które składają się z: alkoholu trihydroksylowego glicerolu oraz jednokarboksylowych kwasów tłuszczowych. Glicerol, podobnie jak inne alkohole wielowodorotlenowe mające grupy hydroksylowe przy sąsiednich atomach węgla, reaguje z wodorotlenkiem miedzi(ii), tworząc charakterystyczny szafirowy kompleks miedzi(ii).

5 Postepowanie: Przygotować dwie probówki i pipety pasteurowskie ; postępować wg schematu Zanotować wynik obserwacji. Odczynniki (ml) 1 2 7% CuSO % NaOH 1 1 Zamieszać i zanotować wynik obserwacji glicerol 1 - woda - 1 Zamieszać 1.5. Wykazanie obecności nienasyconych wiązań w kwasach tłuszczowych Redukcja manganianu(vii) potasu Wiązania podwójne w nienasyconych kwasach tłuszczowych łatwo ulegają utlenieniu pod wpływem utleniaczy, np. KMnO 4. Dochodzi do rozerwania łańcucha węglowego w miejscu podwójnych wiązań z jednoczesnym utlenieniem do grup karbonylowych. Analizując produkty rozpadu moŝna byłoby określić połoŝenie wiązań podwójnych w cząsteczce kwasu tłuszczowego. Podczas reakcji z KMnO 4 zachodzi utlenienie kwasu nienasyconego oraz redukcja utleniacza. Postepowanie: Przygotować dwie probówki i pipety pasteurowskie ; postępować wg schematu Odczynniki (ml) 1 2 woda 0,5 - olej roślinny - 0,5 1 M Na 2 CO ,01 M KMnO 4 2 krople 2 krople Zamieszać

6 Zanotować wynik obserwacji Porównanie tłuszczów spoŝywczych pod względem zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych. Niezbędnym elementem diety człowieka są nienasycone kwasy tłuszczowe. NaleŜą do nich kwas linolowy, linolenowy i arachidonowy. Do występujących w nienasyconych kwasach tłuszczowych podwójnych wiązań między atomami węgla mogą przyłączać się fluorowce. W wyniku reakcji jodu z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, odczynnik Hübla (alkoholowy roztwór I 2 w HgCl 2 ) odbarwia się. Postępowanie: Przygotować 4 probówki i pipety pasteurowskie ; postępować wg schematu Tłuszcze spoŝywcze w chloroformie olej 2ml smalec 2 ml margaryna 2 ml masło 2 ml Odczynnik Hübla 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml Zamieszać i zanotować obserwację w czasie do 60 sekund 2. Witaminy lipidowe Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach A,D,E,K naleŝą do lipidów i są pochodnymi izoprenoidowymi Wykrywanie tokoferoli Witamina E tokoferole Tokoferole, w tym witamina E, to grupa pokrewnych związków występujących w olejach roślinnych róŝniących się między sobą liczbą i połoŝeniem grup metylowych. Właściwości redukcyjne nadaje im grupa hydroksylowa w pozycji 6 w pierścieniu 6- chromanolu. Metody oznaczania tokoferolu są oparte na wykorzystaniu tych właściwości w reakcjach chemicznych. W reakcji Emmerie-Engla tokoferol reaguje w środowisku etanolu z

7 α,α -bipirydyną i w obecności jonów Ŝelaza(III) powstaje sól o intensywnie czerwonej barwie. Fe 3+ + tokoferol sól o intensywnie czerwonej barwie Postępowanie: Przygotować dwie krótkie probówki i pipety pasteurowskie ; postępować wg schematu Odczynniki (ml) Witamina E 4 krople - - Olej roślinny - 4 kropli - Etanol 0,5 0,5 0,5 0,2% FeCl 3 w etanolu 0,25 0,25 0,25 0,5% α,α -bipirydyna w etanolu 0,5 0,5 0,5 Woda destylowana krople Pozostawić w temperaturze pokojowej przez 5 minut Zanotować wynik obserwacji. 3. Steroidy 3.1. Cholesterol Cholesterol występuje we wszystkich tkankach ludzkiego organizmu, jednak w szczególnie duŝych ilościach w ośrodkowym układzie nerwowym, wątrobie i skórze. Jest on składnikiem błon komórkowych i wewnątrzkomórkowych oraz prekursorem hormonów steroidowych i kwasów Ŝółciowych. Nie jest substratem energetycznym. Całkowita ilość cholesterolu w organizmie jest stała dzięki równowadze dynamicznej między wchłanianiem w jelicie (cholesterol egzogenny), syntezą zachodzącą we wszystkich tkankach (cholesterol endogenny) i wydalaniem z Ŝółcią. Większość cholesterolu ustrojowego nie jest zestryfikowana (tzw. cholesterol wolny), tylko w osoczu i nadnerczach przewaŝa (ponad 60%) cholesterol w postaci estrów z kwasami tłuszczowymi (cholesterol zestryfikowany). Cholesterol w osoczu krwi transportowany jest przez lipoproteiny (większość około 60% przez LDL, 30% przez HDL i pozostałe 10% przez VLDL). StęŜenie cholesterolu w osoczu krwi zaleŝy od wieku, czynników genetycznych, sposobu odŝywiania, czynności wątroby i nerek, a takŝe od wysiłku fizycznego. Do podwyŝszenia stęŝenia cholesterolu we krwi dochodzi w hipercholesterolemii rodzinnej, w okresie przed menstruacyjnym, ciąŝy, schorzeniach wątroby i nerek, a takŝe przy niedoczynności tarczycy.

8 ObniŜenie stęŝenia cholesterolu występuje w hipobeta- i abetalipoproteinemii, nadczynności tarczycy, w przypadku cięŝkiego uszkodzenia wątroby oraz w stanach wyniszczenia organizmu (np. końcowe stadia chorób nowotworowych). Celem ćwiczenia jest oznaczenie stęŝenia cholesterolu i jego pochodnej Oznaczanie stęŝenia cholesterolu całkowitego w surowicy krwi metodą enzymatyczną Zasada metody Zestaw (CHOL-PAP) jest przeznaczony do oznaczania stęŝenia cholesterolu całkowitego (wolnego i zestryfikowanego) w surowicy metodą enzymatyczną. W skład zestawu wchodzi odczynnik roboczy zawierający enzymy w buforze fosforanowym o ph 6,6: esterazę cholesterolową, oksydazę cholesterolową i peroksydazę oraz 4-aminoantypirynę, fenol i stabilizatory. Substraty Enzym Produkty 1. estry cholesterolu cholesterol esteraza cholesterolu H 2 O kwasy tłuszczowe 2. cholesterol 4-cholesten-3-on oksydaza cholesterolu O 2 H 2 O H 2 O 2 H 2 O 2 4-(p-benzochinonomonoimino)-fenazon 4-aminoantypiryna peroksydaza Fenol Chinonoimina o czerwonym zabarwieniu NatęŜenie zabarwienia chinonoiminy jest proporcjonalne do stęŝenia cholesterolu całkowitego w surowicy. Postępowanie: Przygotować trzy probówki i pipety półautomatyczne; postępować według schematu Probówki Odczynniki (ml) P W O Surowica 0,01 (10 µl) - - Wzorzec - 0,01 (10 µl) - Odczynnik roboczy Wymieszać i inkubować w temp. 37 o C 10 min. Zmierzyć ekstynkcję próby badanej i wzorcowej wobec próby ślepej przy długości fali λ = 500 nm (Marcel).

9 Oblicz stęŝenie cholesterolu całkowitego w próbie badanej według wzoru: Ekstynkcja próby badanej c = x 200 (mg/dl) Ekstynkcja próby wzorcowej Wzorzec roztwór cholesterolu o stęŝeniu 5,17 mmol/l (200 mg/dl). Dla celów diagnostycznych stęŝenie cholesterolu wyraŝa się w mmol/l i w mg/dl (mg%). Oblicz stęŝenie cholesterolu całkowitego w mmol/l i dokonaj analizy wyniku na podstawie poniŝszego zestawienia: Wykrywanie cholesterolu metodą Salkowskiego Cholesterol, zawierający wiązanie podwójne, pod wpływem stęŝonego kwasu siarkowego, ulega odwodnieniu prowadząc do powstania związku o sprzęŝonych wiązaniach podwójnych kwasu disulfonowego bicholestadienu o barwie czerwonej. Probówki Odczynniki (ml) 1 2 chloroform - 1 2% roztwór cholesterolu w chloroformie 1 ml - Zawartość probówek wymieszać Trzymając ukośnie probówkę dodawać kroplami stęŝony roztwór H 2 SO 4 ( nie mieszać) 0,5 0,5 Zapisać obserwacje.

10 3.2. Hormony steroidowe Oznaczanie stęŝenia 17-ketosteroidów w moczu dobowym pozwala na przybliŝoną ocenę czynności nadnerczy i gonad. Wydalane z moczem 17 -ketosteroidy są końcowymi produktami przemiany steroidów androgennych i niektórych kortykosteroidów. Ich stęŝenie u męŝczyzn jest wskaźnikiem wydzielania androgenów przez nadnercza i gonady. U kobiet 17- ketosteroidy zawarte w moczu są pochodzenia nadnerczowego, natomiast u męŝczyzn 2/3 jest pochodzenia nadnerczowego, a 1/3 gonadowego. Ilość wydalanych z moczem 17- ketosteroidów jest zaleŝna od wieku i płci. U męŝczyzn wynosi ona w moczu dobowym mg, natomiast u kobiet 5-13 mg Oznaczanie stęŝenia 17-ketosteroidów metodą Zimmermana-Reinchardta Reakcja Zimmermana-Reinchardta charakterystyczna jest dla 17-ketosteroidów, które mają grupę ketonową w pozycji C-17 i sąsiadującą z nią (w pozycji C-16) grupę metylenową. W środowisku zasadowym (KOH) m-dinitrobenzen tworzy z 17-ketosteroidem związek kompleksowy o barwie czerwono-fioletowej. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stęŝenia 17-ketosteroidów w badanej próbie. Postepowanie: Do dwóch suchych probówek oznaczonych P (próba badana) i O (próba ślepa) dodać kolejno: Probówki Odczynniki (cm 3 ) P O Roztwór DHA (dehydroizoandrosteron) w etanolu 0,2 - Etanol - 0,2 m-dwunitrobenzen w etanolu 0,2 0,2 5 M KOH w etanolu 0,2 0,2 Wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej 30 min. w ciemności Etanol 2 2 Wyznaczyć stęŝenie DHA na podstawie pomiaru absorbancji próby badanej wobec próby ślepej przy długości fali 520 nm (spektrofotometr Marcel).