Biochemia: Ćw. - Lipidy

Transkrypt

1 LIPIDY Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych: amoniak - C, N, azotan srebra - C, N, bezwodnik kwasu octowego C, bromek jodu C, chlorek baru T, chlorek wapnia Xi, chloroform Xn, etanol 96% F, kwas octowy lodowaty C, kwas siarkowy C, siarczan miedzi (II) Xn, N, węglan sodu X, woda bromowa C, N, Tn, wodorosiarczan potasu C, wodorotlenek potasu C, wodorotlenek sodu C 1. WYKRYWANIE GLICEROLU 1.1. PRÓBA AKROLEINOWA Produktami reakcji hydrolizy tłuszczów właściwych (kwasowej, zasadowej lub enzymatycznej z udziałem lipaz) są: glicerol i odpowiednie kwasy tłuszczowe. Glicerol (propanotriol, nazwa zwyczajowa gliceryna) ulega odwodnieniu w wysokiej temperaturze w obecności czynników odciągających wodę (np. KHSO4). W wyniku tej reakcji powstaje nienasycony aldehyd kwasu akrylowego zwany akroleiną, zgodnie z równaniem: glicerol akroleina Pary akroleiny redukują jony Ag + do Ag 0, dlatego umieszczona w nich bibuła nasączona roztworem wodorotlenku diamoniakalnosrebrowego [Ag(NH3)2]OH przybiera kolor brunatny do czarnego, w zależności od stężenia akroleiny. Wykonanie: Przygotować 1 krótką szklaną probówkę (suchą!) zawierającą ok. 0.2 g krystalicznego KHS04 a następnie dodać do niej 5 kropli glicerolu (ok. 250 ul). U wylotu probówki zawiesić zagięty pasek bibuły nasączony świeżo przygotowanym amoniakalnym roztworem AgNO3 (*). Probówkę ogrzewać w łaźni wodnej. Wydzielają się dymy akroleiny o drażniącym zapachu (nie badamy próbek węchem!). Obserwujemy ciemnienie bibuły wskutek redukujących właściwości akroleiny. (*) amoniakalny roztwór AgNO3 (odczynnik Tollensa): do jednej probówki pobierz 100 ul 10% wodnego roztworu AgNO3, do drugiej probówki dodaj 75 ul H2O i 50 ul stężonego (25%) roztworu amoniaku. Po wymieszaniu, dodawaj cały czas mieszając 100 ul uzyskanego 10% roztworu NH3 do roztworu AgNO3. Cały roztwór wykorzystaj do nasączenia paska bibuły (przechowywanie grozi powstaniem wybuchowego srebra piorunującego ) REAKCJA Z WODOROTLENKIEM MIEDZI Glicerol będąc alkoholem trihydroksylowym tworzy z Cu(OH)2 połączenia kompleksowe o intensywnym niebieskim zabarwieniu. Wykonanie: Przygotować krótką probówkę szklaną. Do 0.5 ml nasyconego roztworu CuSO4 dodać kroplami 2M roztwór NaOH, aż do wytrącenia się niebieskiego osadu Cu(OH)2. Po dodaniu kilku kropli glicerolu osad rozpuszcza się, a roztwór przyjmuje intensywną niebieską barwę. 1

2 2.1. ROZPUSZCZALNOŚĆ TŁUSZCZÓW Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie. Ulegają emulgacji przy zmniejszonym napięciu powierzchniowym przez detergent. W etanolu tłuszcze rozpuszczają się słabo. Bardzo dobrze rozpuszczają się w chloroformie. Wykonanie: Przygotować cztery probówki szklane. Do każdej z nich dodać 3 krople oleju roślinnego. Następnie do pierwszej wlać 0.5 ml wody destylowanej, do drugiej 0.5 ml detergentu rozcieńczonego 4-krotnie wodą destylowaną, do trzeciej 0.5 ml 96% etanolu a do czwartej 0.5 ml chloroformu. Zawartość probówek wymieszać dokładnie na wortexie. Obserwować rozpuszczalność tłuszczu ROZPUSZCZALNOŚĆ BARWNIKÓW W TŁUSZCZACH Sudan III to czerwony barwnik disazowy rozpuszczalny w benzenie, acetonie i etanolu Długi, niepolarny łańcuch węglowodorowy wchodzący w skład tego barwnika, sprawia, że związek ten dobrze rozpuszcza się w tłuszczach. Sudan III Wykonanie: Przygotować jedną krótką probówkę. Dodać 2 ml wody destylowanej i odrobinę (!) barwnika Sudan III barwnik nie rozpuszcza się w wodzie. Następnie dodać 0.5 ml oleju i zamieszać zawartość probówki barwnik rozpuszcza się w oleju. 3. ZMYDLANIE TŁUSZCZÓW Hydroliza zasadowa (np. z udziałem wodorotlenku sodu lub potasu) prowadzi do powstania gliceryny oraz soli kwasów organicznych, czyli mydeł, dlatego nazywana jest zmydlaniem tłuszczu. Reakcja ta wykorzystywana jest przy produkcji mydła. Z mydła można odzyskać wolne kwasy tłuszczowe dodając roztworu stężonego kwasu OTRZYMYWANIE MYDŁA Wykonanie: W porcelanowej parownicy rozgrzać na kuchence elektrycznej ok. 1 g smalcu. Do gorącego smalcu dodać 1.6 ml 30% NaOH, a następnie 1 ml etanolu. Mieszając tłuczkiem, ogrzewać do utworzenia się jednolitej masy mydła. Dodając stopniowo gorącą wodę (ok. 150 ml), przelać roztwór mydła do zlewki o objętości 250 ml i kontynuować ogrzewanie, ciągle mieszając bagietką, aż do całkowitego rozpuszczenia się mydła OTRZYMYWANIE MYDŁA NIEROZPUSZCZALNEGO Wykonanie: Przygotować trzy krótkie probówki. Do każdej z nich dodać po 2 ml roztworu mydła a następnie do pierwszej 0.5 ml 1% roztworu CaCl2, od drugiej 0.5 ml 1% roztworu BaCl2. Trzecią pozostawić jako próbę kontrolną do porównania. W probówce z chlorkami: wapnia i baru wytrąca się osad nierozpuszczalnych mydeł wapniowych i barowych WYSALANIE MYDŁA Wykonanie: Do probówki z 2,5 ml roztworu mydła wprowadzać porcjami NaCl in substantia, aż do wysycenia roztworu. Wytrąca się kłaczkowaty osad mydła, który rozpuszcza się po dodaniu wody w nadmiarze. 2

3 3.4. WYTRĄCANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Wykonanie: Do probówki z 1 ml roztworu mydła dodawać porcjami 1M kwas siarkowy aż do momentu, gdy wytrąci się biały osad kwasów tłuszczowych (roztwór powinien mieć odczyn kwaśny). Osad nie rozpuszcza się po dodaniu wody w nadmiarze TWORZENIE TRWAŁEJ EMULSJI TŁUSZCZU W OBECNOŚCI MYDŁA Wykonanie: Przygotować dwie krótkie probówki. Do pierwszej probówki dodać 4 ml wody destylowanej, 0.5 ml oleju oraz odrobinę Sudanu III a do drugiej 4 ml roztworu mydła, 0.5 ml oleju oraz odrobinę Sudanu III. Zawartość probówek silnie wstrząsnąć. W probówce z mydłem wytwarza się trwała emulsja. Porównać wyniki uzyskane w doświadczeniach 2.1 (rozpuszczalność tłuszczu w roztworze detergentu), 2.2 oraz 3.5. Wyciągnąć wnioski. 4. ROZRÓŻNIANIE MIEDZY NASYCONYMI I NIENASYCONYMI KWASAMI TŁUSZCZOWYMI 4.1. REAKCJA ADDYCJI BROMU Tłuszcze roślinne i zwierzęce różnią się rodzajem kwasów tłuszczowych, którymi zestryfikowany jest glicerol. Tłuszcze roślinne są związkami nienasyconymi, a więc estrami gliceryny i nienasyconych kwasów karboksylowych, natomiast tłuszcze zwierzęce to związki nasycone estry gliceryny i nasyconych kwasów karboksylowych. Aby odróżnić tłuszcz roślinny od zwierzęcego można użyć wody bromowej (nasycony, wodny roztwór bromu o intensywnie żółtej barwie). Reakcja przyłączania chlorowców pozwala na wykrycie obecności nienasyconych wiązań oraz jest podstawą ich ilościowego oznaczania (oznaczanie liczby jodowej). Tłuszcze roślinne zawierające wiązania podwójne przyłączając brom powodują odbarwienie wody bromowej. Wykonanie: Przygotować 3 krótkie i 3 długie szklane probówki. Nad palnikiem roztopić niewielką ilość masła zwierzęcego w pierwszej krótkiej szklanej probówce. Do drugiej krótkiej probówki dodać 0.2 ml stopionego masła a do trzeciej 0.2 ml oleju roślinnego. Do drugiej i trzeciej probówki dodać po 0.5 ml etanolu. Rozmieszać dokładnie zawartość obu probówek. Do trzech długich probówek odmierzyć po 0.5 ml wody bromowej pod dygestorium (!). Do pierwszej dodać 0.5 ml etanolu (próba kontrolna), do drugiej 0.5 ml masła zwierzęcego w etanolu a do trzeciej 0.5 ml oleju roślinnego w etanolu. Wymieszać zawartość probówek. Obserwować zmianę barwy roztworów REAKCJA Z MANGANIANEM (VII) POTASU Wykonanie: Przygotować 1 krótką szklaną probówkę. Dodać 0.2 ml oleju a następnie 1 ml 1% roztworu Na2CO3. Lekko ogrzać i wstrząsając, dodawać stopniowo świeżo przygotowany roztwór KMnO4* (ok. 1 ml). Roztwór manganianu (VII) potasu początkowo odbarwia się a następnie zaczyna wydzielać się brunatny osad MnO2. Jeżeli osad jest słabo widoczny, roztwór przenieść do probówki wirowniczej o obj. 2 ml i zwirować. * kryształek KMnO4 rozpuścić w niewielkiej objętości wody destylowanej, zamieszać 5. ANALIZA JAKOŚCIOWA CHOLESTEROLU Cholesterol to nienasycony jednowodorotlenowy alkohol zaliczany do endogennych steroli zwierzęcych. Wchodząc w skład błon organizmów eukariotycznych modulując ich płynność. Jest również prekursorem hormonów steroidowych. 3

4 5.1. PRÓBA SALKOWSKIEGO Stężony kwas siarkowy powoduje odłączenie od cholesterolu cząsteczki wody, w wyniku czego powstaje kwas disulfonowy bicholestadienu barwiący warstwę chloroformową na kolor malinowy. Wykonanie: Przygotować trzy krótkie szklane probówki suche (!). Do pierwszej dodać 0.5 ml 0.2% chloroformowego roztworu cholesterolu, do drugiej 1 ml stopionego masła w chloroformie (0.3 ml masła ml chloroformu) a do trzeciej 1 ml stopionego smalcu w chloroformie (0.3 ml smalcu ml chloroformu). Wszystkie roztwory podwarstwić kilkoma kroplami stęż. H2SO4. Warstwa chloroformowa barwi się na kolor malinowy, natomiast dolna warstwa wykazuje zieloną fluorescencję. Jeśli zmiana koloru nie zajdzie od razu po dodaniu H2SO4, probówkę odstawić na kilkanaście minut PRÓBA LIEBERMANA I BURCHARDA W obecności kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu octowego z cholesterolu powstaje kwas monosulfonowy bicholestadienu barwiący roztwór na kolor zielony. Wykonanie: Przygotować 2 krótkie probówki szklane suche (!). Do jednej dodać 0.5 ml 0.2% chloroformowego roztworu cholesterolu a do drugiej 1 ml masła rozpuszczonego w chloroformie (0.3 ml masła ml chloroformu). Do obu probówek dodać 0.5 ml bezwodnika kwasu octowego a następnie ostrożnie po ściankach obu probówek po 2 krople stęż. H2SO4. Pojawia się zielone zabarwienie. 6. ANALIZA JAKOŚCIOWA LECYTYNY Lecytyna (fosfatydylocholina) należy do glicerofosfolipidów. Reszta fosforanowa zestryfikowana jest choliną. Oprócz glicerolu w jej skład wchodzą także kwasy tłuszczowe. Dzięki obecności fosfocholiny o charakterze hydrofilnym lecytyna tworzy w wodzie dość trwałe emulsje WYKRYWANIE CHOLINY lecytyna Cholina jest czwartorzędowym kationem amoniowym. W środowisku silnie zasadowym zostaje w wyniku hydrolizy uwolniona z lecytyny i rozpada się do trimetyloaminy i glikolu etylenowego. Lotną trimetyloaminę można zidentyfikować na podstawie charakterystycznego zapachu solanki śledziowej oraz odczynu zasadowego. Wykonanie: Przygotować probówkę zawierającą 0.1 ml etanolowego roztworu lecytyny. Dodać 2,5 ml 30% roztworu NaOH starając się, aby wewnętrzne ścianki probówki u wylotu pozostały suche. Ogrzewać ok. 5 min. we wrzącej łaźni wodnej. Do wylotu probówki zbliżyć zwilżony wcześniej wodą papierek uniwersalny (nie badamy próbki węchem!). Obserwować zmianę barwy papierka i zmianę konsystencji roztworu (powstaje mydło sodowe) WYTRĄCANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Wykonanie: Do 1 ml roztworu mydła uzyskanego z lecytyny w ćwiczeniu 6.1 dodawać stężony kwas octowy aż do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny i pojawi się delikatny osad kwasów tłuszczowych. 4

5 7. WSKAŹNIKI WŁAŚCIWOŚCI TŁUSZCZÓW Do chemicznych wskaźników właściwości tłuszczów zaliczamy: 1. liczbę kwasową (liczba Kottstorfera) ilość mg KOH zużytego do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych w 1g tłuszczu, 2. liczbę zmydlania ilość mg KOH potrzebna do zmydlenia 1g tłuszczu, 3. liczbę jodową ilość gram wolnego I2 przyłączonego do 100g tłuszczu, 7.1. OZNACZANIE LICZBY KWASOWEJ TŁUSZCZÓW Triacyloglicerole stanowiące główny składnik masła zwierzęcego, roślinnego oraz olejów roślinnych mają odczyn obojętny. W wyniku jełczenia następuje częściowa hydroliza tłuszczu. Wolne kwasy tłuszczowe nadają tłuszczom odczyn kwaśny. Określenie zawartości wolnych kwasów tłuszczowych daje odpowiedź, czy tłuszcz jest świeży, czy zjełczały. Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych mierzy się wyznaczając wartość liczby kwasowej; w tym celu próbkę tłuszczu miareczkuje się mianowanym roztworem KOH. Wykonanie: Do dwóch kolb stożkowych dodać po 3 g masła świeżego i nieświeżego i roztopić tłuszcze. W tym celu kolby zawierające masło lekko podgrzać nad palnikiem i energicznie zamieszać. Następnie dodać po 15 ml etanolu (UWAGA: łatwopalny!) i dokładnie wymieszać. Do trzeciej kolby (próba ślepa) dodać tylko etanol. Do wszystkich roztworów dodać po 200µl 1% etanolowego roztworu fenoloftaleiny. Szybko miareczkować za pomocą 0.01 M KOH w obecności fenoloftaleiny do słabo różowego zabarwienia. Opracowanie wyników: liczbę kwasową (LK) dla masła policzyć wg wzoru: gdzie: LK = (a b)/c a objętość 0.1 M KOH zużyta na miareczkowanie próby badanej [ml] b objętość 0.1 M KOH zużyta na miareczkowanie elanolu [ml] (próba ślepa) c ilość tłuszczu [g] 7.2. OZNACZANIE LICZBY JODOWEJ TŁUSZCZÓW Tłuszcze o dużej zawartości estrów nienasyconych kwasów tłuszczowych (oleje roślinne) cechują się dużą wartością liczby jodowej, natomiast tłuszcze zawierające niewiele wiązań podwójnych (masło zwierzęce, smalec) mają małą liczbę jodową. Wykonanie: Przygotować trzy kolby stożkowe o pojemności 100 ml z doszlifowanym korkiem. Na folii aluminiowej odważyć dokładnie 0.1 g oleju i 0.2 g masła zwierzęcego a następnie przenieść olej i masło do kolb, zwilżając uprzednio korek roztworem KI. Następnie do każdej z kolb dodać 5 ml chloroformu przepłukując folie, na których został zważony tłuszcz (kolba trzecia będzie zawierała wyłącznie chloroform próba kontrolna). Dokładnie rozpuścić tłuszcz. Dodać 7.5 ml odczynnika Hanusa. Kolbę starannie zamknąć korkiem i po wymieszaniu pozostawić w ciemności na 30 min. Po upływie tego czasu dodać 7.5 ml 10% roztworu KI (zmywając nim szyjkę kolby i korek) oraz 25 ml wody destylowanej. W wyniku reakcji IBr i KI uwalnia się I2. Powstały jod odmiareczkować za pomocą 0.1 M roztworu Na2S2O3 do słabo różowego zabarwienia. Następnie dodać kilka kropli 1% wskaźnika skrobiowego i skończyć miareczkowanie. Opracowanie wyników: liczbę jodową (LJ) policzyć wg wzoru: gdzie: LJ = (a b)/c a objętość 0.1 M Na2S2O3 zużyta na miareczkowanie próby kontrolnej [ml] b objętość 0.1 M Na2S2O3 zużyta na miareczkowanie próby badanej [ml] c ilość tłuszczu [g] Spodziewane wartości liczby jodowej: masło zwierzęce: olej słonecznikowy: Zalecana literatura: "Biochemia J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, PWN, W-wa 2005; rozdział "Lipidy i błony biologiczne", str (lub odpowiedni rozdział we wcześniejszych lub późniejszych wydaniach). 5