(73) Uprawniony z patentu: (74)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) IntCl7: A61L 15/44 (54)Biodegradowalne implanty/opatrunki z gąbki kolagenowej i antybiotyku stosowane, zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi i sposób otrzymywania biodegradowalnych implantów/opatrunków (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/96 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/00 (73) Uprawniony z patentu: Grzybowski Jacek, Warszawa, PL Antos Małgorzata, Warszawa, PL Trafny Elżbieta Anna, Warszawa, PL Zawistowska-Marciniak Irena, Warszawa, PL (72) Twórcy wynalazku: Jacek Grzybowski, Warszawa, PL Małgorzata Antos, Warszawa, PL Elżbieta Anna Trafny, Warszawa, PL (74) Irena Zawistowska-Marciniak, Warszawa, PL Pełnomocnik: Łazewska Sławomira, Sławomira Łazewska & Son PATENT AGENCY PL B1 (57) 1. Biodegradowalne implanty/opatrunki z gąbki kolagenowej i antybiotyku, stosowane zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi, znamienne tym, że zawierają gąbkę kolagenową o grubości do 20 mm i porach do 0,4 mm oraz wodną zawiesinę antybiotyku polipeptydowego, chinolinowego albo tetracyklinowego zamkniętego w liposomach w ilości do 6 mg antybiotyku na 1 cm2 gąbki. 7. Biodegradowalne implanty/opatrunki z gąbki kolagenowej i antybiotyku, stosowane zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi, znamienne tym, że złożone są z co najmniej dwu sprasowanych warstw gąbki kolagenowej o grubości do 20 mm i porach do 0,4 mm, pomiędzy warstwami gąbki zawarta jest warstwa o grubości do 1,5 mm kremu proliposomowego zawierającego antybiotyk polipeptydowy, chinolinowy albo tetracyklinowy trwały w środowisku wodnym w ilości do 6 mg antybiotyku na 1 cm2gąbki. 9. Sposób otrzymywania biodegradowalnych implantów/opatrunków, stosowanych zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi, z gąbki kolagenowej i antybiotyku, znamienny tym, że gąbkę kolagenową o grubości od 3 do 10 mm i porach do 0,4 mm pokrywa się cienką warstwą o grubości do 1,5 mm kremu proliposomowego zawierającego antybiotyk polipeptydowy, chinolinowy albo tetracyklinowy trwały w środowisku wodnym w ilości co najwyżej 6 mg antybiotyku na 1 cm2 gąbki, po czym pokrywa się drugą warstwą gąbki, ewentualnie nakłada następnie warstwy kremu z antybiotykiem przykrywając każdorazowo warstwą gąbki, całość sprasowuje się przez okres 4 do 24 godzin w temperaturze 0-30 C.

2 Biodegradowalne implanty/opatrunki z gąbki kolagenowej i antybiotyku stosowane, zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi i sposób otrzymywania biodegradowalnych implantów/opatrunków Zastrzeżenia patentowe 1. Biodegradowalne implanty/opatrunki z gąbki kolagenowej i antybiotyku, stosowane zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi, znamienne tym, że zawierają gąbkę kolagenową o grubości do 20 mm i porach do 0,4 mm oraz wodną zawiesinę antybiotyku polipeptydowego, chinolinowego albo tetracyklinowego zamkniętego w liposomach w ilości do 6 mg antybiotyku na 1 cm2 gąbki. 2. Biodegradowalne implanty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako antybiotyk zamknięty w liposomach zawierają polimyksynę. 3. Biodegradowalne implanty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako antybiotyk zamknięty w liposomach zawierają kolistynę. 4. Biodegradowalne implanty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako antybiotyk zamknięty w liposomach zawierają cyprofloksacynę. 5. Biodegradowalne implanty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako antybiotyk zamknięty w liposomach zawierają doksycyklinę. 6. Biodegradowalne implanty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako antybiotyk zamknięty w liposomach zawierają bacytracynę. 7. Biodegradowalne implanty/opatrunki z gąbki kolagenowej i antybiotyku, stosowane zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi, znamienne tym, że złożone są z co najmniej dwu sprasowanych warstw gąbki kolagenowej o grubości do 20 mm i porach do 0,4 mm, pomiędzy warstwami gąbki zawarta jest warstwa o grubości do 1,5 mm kremu proliposomowego zawierającego antybiotyk polipeptydowy, chinolinowy albo tetracyklinowy trwały w środowisku wodnym w ilości do 6 mg antybiotyku na 1 cm2 gąbki. 8. Biodegradowalne implanty według zastrz. 7, znamienne tym, że stanowią sprasowaną wielowarstwową gąbkę kolagenową zawierającą pomiędzy warstwami krem z antybiotykiem. 9. Sposób otrzymywania biodegradowalnych implantów/opatrunków, stosowanych zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi, z gąbki kolagenowej i antybiotyku, znamienny tym, że gąbkę kolagenową o grubości od 3 do 10 mm i porach do 0,4 mm pokrywa się cienką warstwą o grubości do 1,5 mm kremu proliposomowego zawierającego antybiotyk polipeptydowy, chinolinowy albo tetracyklinowy trwały w środowisku wodnym w ilości co najwyżej 6 mg antybiotyku na 1 cm2 gąbki, po czym pokrywa się drugą warstwą gąbki, ewentualnie nakłada następnie warstwy kremu z antybiotykiem przykrywając każdorazowo warstwą gąbki, całość sprasowuje się przez okres 4 do 24 godzin w temperaturze 0-30 C. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że między poszczególne warstwy gąbki wprowadza się krem proliposomowy zawierający różne antybiotyki. * * * Przedmiotem wynalazku są biodegradowalne implanty z gąbki kolagenowej i antybiotyku stosowane zwłaszcza na wewnętrzne ogniska zakażeń drobnoustrojami patogennymi i sposób otrzymywania przedmiotowych implantów/opatrynków. Implanty z gąbki kolagenowej zawierające antybiotyki umożliwiają leczenie zakażeń wewnętrznych np. zakażeń szpiku kostnego. Implanty te charakteryzują się obojętnością chemiczną wykluczającą drażnienie chemiczne tkanek, zwłaszcza tkanek zranionych, jałowością mikrobiologiczną, brakiem immunogenności,

3 działaniem hemostatycznym biodegradacją w odpowiednim czasie, niebolesnością stosowania, odpowiednią trwałością. Znane są implanty z gąbki kolagenowej zawierającej gentamycynę wbudowaną w kolagen za pomocą wiązań chemicznych. Otrzymanie chemicznego połączenia kolagenu z antybiotykiem przy zachowaniu odpowiedniej aktywności antybiotyku wymaga żmudnych i długotrwałych operacji chemicznych. Bardzo pożądaną cechą implantu (wszczepu) jest możliwość łatwej zmiany antybiotyku. Gąbka kolagenowa zawierająca wbudowaną gentamycynę nie posiada takiej cechy. Nieoczekiwanie okazało się, że jako implanty lub opatrunki można stosować gąbki kolagenowe nasycone liposomalną postacią antybiotyku (antybiotyk zamknięty w liposomie) lub gąbki kolagenowe zawierające wewnątrz warstwę w pełni biodegradowalnego, tak zwanego kremu proliposomowego. Zależnie od potrzeby można otrzymać implanty zawierające różne antybiotyki. Warunkiem koniecznym jaki należy spełnić jest otrzymanie liposomalnych postaci antybiotyków o odpowiednio dużej trwałości i jednocześnie dużej aktywności w stosunku do bakterii zakażających tkanki. Liposomy są kulistymi tworami, złożonymi z fosfolipidów i lipidów, otrzymywanymi w postaci jedno- lub wielobłonowych struktur o różnej wielkości od około 25 nm do 2500 nm. Liposomy otaczają przestrzeń wodną. Do liposomów można wprowadzać leki, przy czym trwałość liposomalnych postaci leków zależy w dużej mierze od natury chemicznej leków, a w szczególności od ich stopnia hydrofobowości. Leki hydrofilowe, jak np. antybiotyki aminoglikozydowe, są zamykane w przestrzeni wodnej wewnątrz liposomów, takie liposomy nie są zbyt trwałe i łatwo tracą lek przez wyciek. Związki hydrofobowe np. amfoterycyna B, lub posiadające regiony hydrofobowe jak np. białka wbudowują się w błony liposomowe, tworząc trwałe struktury (pod względem możliwości wycieku leku). Substancje o właściwościach pośrednich, jeśli chodzi o stopień hydrofilowości mogą prawdopodobnie ulegać adhezji do błon, co zwiększa trwałość liposomów. Nieoczekiwanie stwierdzono, że antybiotyki polipeptydowe, chinolonowe i z grupy tetracyklin można zamknąć z dużą wydajnością w liposomach i następnie wprowadzić do gąbki kolagenowej co gwarantuje wysokie ich stężenie w implantach/opatrunkach kolagenowych. Przedmiotem wynalazku są biodegradowalne implanty/opatrunki zawierające gąbkę kolagenową o grubości poniżej 20 mm i porach poniżej 0,4 mm oraz zawiesinę wodną antybiotyku polipeptydowego, chinolinowego albo tetracyklinowego zamkniętą w liposomach. Korzystnie antybiotykiem zamkniętym w liposomach jest polimyksyna, kolistyna, cyprofloksacyna, doksycyklina. Wynalazek dotyczy również biodegradowalnych implantów/opatunków złożonych z co najmniej dwu sprasowanych warstw gąbki kolagenowej o grubości poniżej 20 mm i porach poniżej 0,4 mm pomiędzy którymi zawarta jest warstwa kremu proliposomowego o grubości poniżej 1,5 mm zawierającego antybiotyk polipeptydowy, chinolinowy albo tetracyklinowy trwały w środowisku wodnym, w ilości do 6 mg antybiotyku na 1 cm2 gąbki. W przypadku, gdy implanty/opatrunki zawierają sprasowaną, wielowarstwową gąbkę kolagenową, korzystnie gdy pomiędzy warstwami jest krem proliposomowy zawierający antybiotyk. Trwałość implantów/opatrunków z gąbek kolagenowych nasyconych liposomalną formą antybiotyku jest duża, co jest niezmiernie istotne przy ich przechowywaniu. Sposobem według wynalazku biodegradowalne implanty/opatrunki otrzymuje się przez wprowadzenie wodnej zawiesiny antybiotyku zamkniętego w liposomach do gąbki kolagenowej o grubości poniżej 20 mm i porach poniżej 0,4 mm. Na 1 cm2 gąbki wprowadza się do 6 mg antybiotyku, po czym implant/opatrunek zamyka się w hermetycznym opakowaniu. Ewentualnie przed zaniknięciem implant/opatrunek zawierający liposomy poddaje się liofilizacji. Alternatywnie, krem proliposomowy wprowadza się w cienkiej warstwie (0,5 do 1,0 mm) między dwie gąbki i sprasowuje. Liposomy zawierające antybiotyk lub krem proliposomowy (znany pod nazwą hydrated gel ) przygotowuje się jedną ze znanych metod (New R.R.C.; Liposomes. A practical approache. Oxford, 1990).

4 Sposób otrzymywania implantów/opatrunkowych według wynalazku o d z nacza się dużą prostotą i może być stosowany w przemyśle. Możliwe jest sporządzanie przedmiotowych implantów/opatrunków w postaci mikrobiologicznie jałowej, różnymi metodami (patrz niżej), w zależności od wydajności zamykania antybiotyku w liposomach (enkapsulacji) oraz od pożądanych własności otrzymanych preparatów. Gąbkę kolagenową nasyca się zawiesiną antybiotyku zamkniętego w liposomie, następnie po oddzieleniu niezwiązanego leku, poddaje się liofilizacji. Taki preparat można sterylizować radiacyjnie. Zastosowany na ranę uwalnia lek powoli, przy czym szybkość uwalniania zależy od warunków środowiska (wpływ tkanek, obecność bakterii, wysokość ciśnienia osmotycznego itp.). Przy wydajności zamykania antybiotyku w liposomach (enkapsulacji) 40 do 60% gąbkę kolagenową można nasycić zawiesinę antybiotyku zamkniętego w liposomach bez konieczności oddzielania niezamkniętego antybiotyku i przechowywać w odpowiednim hermetycznym opakowaniu np. w miseczce z tworzywa zamkniętej przez zgrzanie z aluminiową folią, albo przed zaniknięciem poddać liofilizacji. Między liposomami i wolnym antybiotykiem zostaje zachowany stan równowagi. W tym przypadku implant/opatrunek zawiera około 50% antybiotyku w postaci wolnej, który w ranie szybko penetruje do tkanek, zapewniając początkowe wysokie stężenie leku w miejscu zakażenia, przez krótki okres czasu. Pozostałe 50% antybiotyku uwalniane jest stopniowo z liposomów zapewniając bakteriostatyczne/bakteriobójcze stężenie leku przez okres kilku dni. Przy mniejszej wydajności enkapsulacji np. 15 do 20% zawiesinę liposomów należy zagęścić przez wirowanie i po oddzieleniu supematantu użyć liposomalny antybiotyk do nasycenia gąbki kolagenowej. Tak otrzymany implant/opatrunek można przechowywać w stanie wilgotnym lub po liofilizacji. Liposomalny antybiotyk można również wbudować w gąbkę kolagenową w trakcie procesu jej wytwarzania, mieszając go z zawiesiną kolagenu przed liofilizację będącą integralnym etapem technologicznym otrzymywania gąbek. Taki sposób jest korzystny dla procesu liofilizacji mniej stabilnych liposomów ponieważ kolagen chroni je przed uszkodzeniem w trakcie suszenia. W celu otrzymania liposomalnej formy antybiotyku odparowuje się w kolbce chloroformowy roztwór lipidów zawierający lecytynę ewentualnie z dodatkiem do 40% cholesterolu otrzymując film lipidowy. Na ten film lipidowy wlewa się roztwór wodny antybiotyku o stężeniu do 100 mg antybiotyku w 1 ml buforu. Następnie obraca się kolbką na wyparce i spontanicznie powstają liposomy zawierające wbudowane antybiotyki. Alternatywnie implant/opatrunek można przygotować jako preparat kilkuwarstwowy. W tym celu gąbkę kolagenową o grubości od 3 do 10 mm pokrywa się cienką warstwą (od 0,1 do 1,0 mm) kremu proliposomowego zawierającego antybiotyk, przykrywa się drugą gąbką i sprasowuje przez okres 4 do 24 godzin w temperaturze od 0 do 30 C. Można również przygotować implanty o większej liczbie warstw korzystnie pięciowarstwowe wprowadzając w różne warstwy różne antybiotyki. Gąbki stosowane do sporządzania implantów/opatrunków tym sposobem mogą również zawierać już wprowadzony wcześniej liposomalny antybiotyk (taka gąbka z liposomalnym antybiotykiem np. z polimyksyną lub kolistyną musi być zliofilizowana). W wilgotnym środowisku tkanek rany antybiotyk jest powoli uwalniany z warstwy kremu proliposomowego. Gdy ilość płynu w tkankach rany jest duża z kremu proliposomowego mogą tworzyć się spontanicznie liposomy zawierające antybiotyk. W takim przypadku część antybiotyku pozostaje w postaci wolnej, a część w postaci liposomalnej. Stosowanie implantów/opatrunków zawierających krem proliposomuwy jest korzystne w przypadku stosowania antybiotyków, które zamykają się w liposomach z małą wydajnością (np. bacytracyna), lub też tworzą mało trwałe liposomy. Wynalazek został zilustrowany poniższymi przykładami Przykład I Rozpuszcza się 100 mg lecytyny z żółtek jaj i 50 mg cholesterolu w 5 ml chloroformu. Roztwór odparowuje się w kolbie okrągłodennej przy 60 obrotach na minutę, w temperaturze 37 C

5 stosując strumień sterylnego azotu, przefiltrowanego przez filtr teflonowy o porach 0,22 m m, a następnie dosusza się przez 1 godzinę w próżni. Na otrzymany film lipidowy wlewa się 5 ml polimyksyny B o stężeniu 4 mg/ml. Następnie obraca się kolbkę przez 30 minut i pozostawia na dwie godziny w temperaturze 20 C. Otrzymaną zawiesinę liposomalnej polimyksyny B po oddzieleniu nie zamkniętego antybiotyku przez wirowanie, nasyca się gąbkę kolagenową o grubości 3 mm i porach 0,04 mm, liposomy wprowadza się w ilości zapewniającej stężenie antybiotyku 0,3 mg/cm2. Następnie otrzymany implant/opatrunek poddaje się procesowi liofilizacji i zamyka w hermetycznym opakowaniu. Przykład II Implant/opatrunek otrzymuje się w sposób opisany w przykładzie I, z tą różnicą, że do enkapsulacji stosuje się polimyksynę w stężeniu 3 mg/ml i z preparatu lipososomalnej polimyksyny nie usuwa się nie zamkniętego w mikrokapsułkach antybiotyku. Przykład III Implant/opatrunek otrzymuje się w sposób opisany w przykładzie I, z tą różnicą, że stosuje się 140 mg lecytyny i 10 mg cholesterolu w 5 ml chloroformu oraz roztwór kolistyny (zamiast polimyksyny) o stężeniu 4 mg/ml. Gąbkę kolagenową o grubości 5 mm i porach 0,1 mm nasyca się liposomalną kolistyną w ilości zapewniającej stężenie antybiotyku 2 mg na 1 cm2. Przykład IV Implant/opatrunek otrzymuje się w sposób opisany w przykładzie I, z tą różnicą, że stosuje się 100 mg lecytyny i 40 mg cholesterolu oraz 10 mg fosfatydyloetanoloaminy w 5 ml chloroformu oraz roztwór cyprofloksacyny (zamiast polimyksyny) o stężeniu 20 mg/ml. Gąbkę kolagenową o grubości 7 mm i porach 0,04 mm nasyca się liposomalną cyprofloksacyną w ilości zapewniającej stężenie antybiotyku 0,5 mg na 1 cm2 gąbki.. Przykład V Badania aktywności implantów/opatrunków in vitro. Aktywność przeciwbakteryjna in vitro implantów/opatrunków była testowana przy użyciu standardowej metody probówkowej jak przy badaniu wartości MIC (Minamal Inhibitory Concentration). Do badania użyto implantu zawierającego liposomalną polimyksynę B sporządzanego według przykładu I, z tym, że stężenie polimyksyny wynosiło 0,3 mg/cm2. Preparat kontrolny stanowi gąbka kolagenowa o tej samej grubości nasycona wolną polimyksyną B o tym samym stężeniu 0,3 mg/cm2 oraz gąbka koloagenowa nasycona płynem fizjologicznym, bez antybiotyku. Test przeprowadzono umieszczając w probówkach zawierających po 20 ml jałowego bulionu po 1,2,4 lub 8 kawałków implantu/opatrunku lub gąbki o powierzchni 1 cm2. Następnie do probówek dodawano inokulum żywych bakterii Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853); wartość MIC polimyksyny dla tego szczepu wynosiła 0,6 μg/ml. Po 24 godzinach inkubacji w 37 C oznaczono w probówkach liczbę żywych komórek bakteryjnych standartową metodą płytkową. Tabela 1 Liczba żywych komórek bakterii Pseudomonas aeruginosa hodowli bulionowej po dodaniu implantów kolajgenowych o powierzchni 1 cm2 zawierających liposomalną polimyksynę B o stężeniu 0,3 mg/cm2. Liczba gąbek dodanych do probówki Stężenie polimyksyny (mg/ml) Implant z liposomalną polimyksyną B > Gąbka z wolną polimyksyną Gąbka nasycona PBS Wzrost zlewy (bakterie niepoliczalne) Wniosek: Implant/opatrunek z gąbki kolagenowej zawierającej liposomalną polimyksynę B posiada aktywność bakteriobójczą w hodowli bulionowej.

6 Przykład VII Badania aktywności in vivo. Tabela 2. Redukcja liczby żywych komórek bakterii Pseudomonas aeruginosa (ATTC 27853) w doświadczalnie zakażonych ranach u myszy. Po wycięciu okienek skórnych u 40 myszy (po 5 myszy w grupie), między mięsie skórny i grzbietowy wstrzykiwano 107 żywych komórek bakteryjnych, po czym rany pokrywano opatrunkiem z gąbki kolagenowej zawierającej liposomalną postać polimyksyny B lub opatrunkiem z gąbki kolagenowej zawierającej liposomy puste, bez antybiotyku (placebo). Po pierwszym, drugim, trzecim i ósmym dniu zdejmowano opatrunki i pobierano biopsje z tkanek zakażonych, po czym oznaczano w nich liczbę żywych bakterii metodą płytkową. Jak widać z tabeli, w pierwszym i drugim dniu po zakażeniu liczba bakterii w grupie badanej była niższa o jeden rząd wielkości niż w kontroli (liposomy puste ); w ósmym dniu liczba bakterii w biopsji spod opatrunku placebo (w grupie kontrolnej) była wciąż wyższa niż 105 na 1 g tkanki, która to wartość jest uważana za graniczną dla zakażenia. W grupie z opatrunkami zawierającymi polimyksynę, liczba bakterii spadła poniżej 104 na gram Tabela 2 Liczba bakterii w zakażonej ranie, leczonej implantem/opatrunkiem z polimyksynąb. Dni po zakażeniu Gąbka z liposomalną formą polimyksyny B Gąbka z liposomami pustymi (placebo) 2,3*105 3,8*105 4,0*105 <104 3,5* 106 6,6* 106 1,9* 106 4,0*105 Wniosek: Implant/opatrunek kolagenowy z liposomalną formą polimyksyny B posiada aktywność bakteriobójczą in vivo o przedłużonym działaniu. Przykład VIII Krem proliposomowy sporządza się jak standardowe kremy, np. ucierając w moździerzu 4 g lecytyny z żółtek jaj i od 0,5 do 3 g cholesterolu z 4 do 8 ml roztworu (lub zawiesiny) antybiotyku o stężeniu do 250 mg/ml, zawierającym 0,1 do 5% aminokwasu - kwasu glutaminowego, argininy lub lizyny. Bardziej szczegółowo krem proliposomowy sporządza się z: 4 g lecytyny z żółtek jaj, 2 g cholesterolu i 6 ml roztworu doksycykliny zawierającej 1 % kwasu glutaminowego. Na gąbkę kolagenową o grubości 4 mm i porach 0,1 mm nanosi się warstwę kremu o grubości 0,4 mm i przykrywa drugą taką samą gąbką i sprasowuje przez okres 17 godzin w temperaturze 20 C. Implant zamyka się w hermetycznym opakowaniu. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.