Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

Transkrypt

1 Politechnika Śląska Wydział Chemiczny Katedra Chemii rganicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C pracował: mgr inż Tadeusz Gorewoda Gliwice

2 1 Wstęp; Już od prawie wieku drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae) są obecne w syntezie organicznej Przez ten czas stały się one jednymi z najbardziej popularnych biokatalizatorów komórkowych, stosowanych w różnych typach reakcji Jednym z szerszych zastosowań tych organizmów są reakcje redukcji pośród tych reakcji można wymienić: redukcje -ketoestrów, diketonów i ketokwasów; redukcje -hydroksyaldehydów i -hydroksyketonów do -dioli; redukcję związków zawierających wiązanie C=C; redukcję aromatycznych i nienasyconych ketonów; redukcję związków nitrowych 1 Wyżej wymienione reakcje mogą zachodzić dzięki obecności w komórkach drożdży enzymów z grupy reduktaz Podczas ćwiczenia zostaną przeprowadzone reakcje: a) Redukcji -ketoestru do -hydroksyestru; b) Redukcji wiązania podwójnego węgiel węgiel; 11 Redukcja -ketoestru do -hydroksyestru Spośród reakcji redukcji przebiegających z udziałem drożdży piekarskich najszerzej opisywaną grupą są redukcje -ketoestrów do -hydroksyestrów Badania genomu S cerevisiae wykazały 49 sekwencji kodujących białka zdolne do aktywności redukcyjnej Wykazano różnice pomiędzy działaniem poszczególnych enzymów, ich aktywnością stereoselektywnością Używając do reakcji wydzielone enzymy uzyskiwano doskonałe selektywności (>90% ee, >90% de) Użycie całych komórek drożdżowych dało w niektórych 1 Servi S; Synthesis 1990,

3 przypadkach nieco gorsze rezultaty 2 Wiąże się to z faktem działania całej gamy enzymów Dodatkowo taka metoda charakteryzuje się większą objętością mieszaniny reakcyjnej i większym balastem, niż użycie pojedyńczych enzymów Jednakże za użyciem całych komórek drożdżowych przemawia istotny fakt, iż opisywane reakcje zachodzą z udziałem koezymu jakim jest NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) Aby koenzym ten mógł się regenerować, wymagane jest dostarczenie drożdżom węglowodanów (np glukozy) R R 1 H NADP + R 2 R 3 H H węglowodan reduktaza R R 1 NADPH R 2 R 3 Największą zaletą redukcji ketoestrów z użyciem drożdży jest selektywność reakcji W przypadku -niepodstawionych ketoestrów stwierdzono, iż wielkość podstawnika przy węglu C3 oraz podstawnika przy grupie estrowej wywiera istotny wpływ na enancjoselektywność reakcji Wybierając odpowiednie podstawniki można więc uzyskać produkt o pożądanej konfiguracji z wysokim nadmiarem enancjomerycznym Poniżej przedstawiono kilka przykładów: H R 1 R 2 R 1 R 2 R 1 R 2 produkt wydajność (%) ee(%) CH 2 Cl n-c 8 H 17 (3R) CH 2 Cl CH 2 CH 3 (3S) - do 90 Bu-t CH 2 CH 3 (3R) Ph CH 2 CH 3 (3S) Redukcja -podstawionych ketoestrów wiąże się dodatkowo z diastereoselektywnością (powstają dwa centra chiralne) Także w tym wypadku udało się uzyskać wysokie nadmiary enancjomeryczne i diastereomeryczne dzięki użyciu różnych podstawników w pozycjach 2, 3 oraz przy grupie estrowej 2 Kaluzna I, Matsuda T, Sewell A K, Stewart J D; J Am Chem Soc 2004, 126,

4 H R 1 R 3 R 2 R 1 R 3 R 2 R 1 R 2 R 3 wydajność (%) ee(%) de(%)/konformer CH 3 CH 3 CH 2 CH syn CH 3 CH 2 CH=CH 2 CH 2 CH anti CH 3 CH 3 n-c 8 H syn CH2CH3 H CH 2 CH 3 72 >90 80 anti Redukcja ketonów do alkoholi w klasycznej preparatyce organicznej może odbywać się na kilka sposobów Główne z nich to: a) Reakcje z wodorkami metali Najczęściej używanymi związkami są LiAlH 4 (glinowodorek litu) oraz NaBH 4 (borowodorek sodu) Reakcja z użyciem LiAlH 4 jest dość ogólna - poza grupą karbonylową redukowane są także inne grupy obecne w substracie np N 2, CN, CR itd Borowodorek sodu jest bardziej selektywny i nie redukuje grup takich jak N 2 czy halogenowych Dodatkową jego zaletą jest możliwość stosowania go w roztworach wodnych Wodorki metali nie uwadarniają podwójnych ani potrójnych wiązań węgiel węgiel (za wyjątkiem wiązań C=C sprzężonych z grupą CR) b) Redukcja z zastosowaniem wodoru gazowego i katalizatora (platyna, ruten, pallad, nikiel itp) To rozwiązanie obciążone jest najmniejszą selektywnością w tych warunkach zredukowane zostają także wiązania wielokrotne c) Reakcja z etanolanem sodu w alkoholu etylowym Stosowana zanim odkryto LiAlH 4, częściej stosowana do redukcji estrów niż ketonów d) Reakcja z diborowodorem B 2 H 6 pisane układy przez lata zyskały wiele modyfikacji Ich najczęstszym celem było uzyskanie chemoslektywności reakcji Uzyskuje się ją dzieki stosowaniu różnych warunków reakcji: kombinacji metal- jon wodorkowy, różnym katalizatorom i rozpuszczalnikom 3 Jednakże stosowane wodorki metali, jak i katalizatory metaliczne są drogim i nie raz niewygodnym w pracy surowcem Także praca z wodorem niesie za sobą nibezpieczeństwo Z tego względu drożdże piekarnicze w ostatnich latach nabierają znaczenia na tym polu syntezy Ich atrybutami są niska cena, niskie temperatury reakcji (30-40 o C), zastosowanie wody jako rozpuszczalnika, aspekt ekologiczny Daje to podstawy do zastosowania S cerevisiae na poziomie przemysłowym Jednym z zastosowań drożdży jest chemo, regio i wysoce stereospecyficzna redukcja triketonu do trimegestonu leku podawanego w terapii chorób pomenopauzalnych 4 3 March J; Chemia rganiczna 1975 WNT Warszawa 4 Crocq V, Masson Ch, Winter J,Richard Ch, Lemaitre G, Lenay J, Vivat M, Buendia J, Prat D;rganic Process Research & Development 1997, 1,

5 Scerevisiae (S) H sacharoza, EtH, H 2 trimegeston Ćwiczenie: Eksperyment obejmuje redukcję 2-metyloacetylooctanu etylu prowadzącą do mieszaniny (2R,2S) i (2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu w stosunku izomerów 3:1 5 CH 3 Scerevisiae Et 30 stc, 48 h, 65%, > 95% ee H + Et CH 3 H CH 3 Et czynniki: 2-metyloacetooctanu etylu 0,5 g (3,85 mmol) drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 30 g* sacharoza 7,5 g woda destylowana 100 ml Celite Etanol ctan etylu MgS 4 3 : 1 pis ćwiczenia: Umieścić drożdże, sacharozę oraz wodę w kolbie stożkowej (500ml), a następnie zatkać wylot kolby watą i umieścić w cieplarce (30-37 o C) na około 20 minut w celu zapoczątkowania fermentacji Co 3 minuty energicznie wymieszać zawartość kolby 2-Metyloacetooctan etylu rozpuścić w 1ml etanolu i dodać jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami Pozostawić w cieplarce w temp 30 0 C przez 48h ** Zakładając odpowiedni stopień przereagowania, reakcję należy przerywać wyciągając kolbę z cieplarki i dodając 2 łyżki celitu (dokładnie wymieszać) Tak przygotowaną mieszaninę pozostawić na ok 15 min od czasu do czasu mieszając Nastepnie odsącza się zawiesinę drożdży na lejku Büchnera poprzez 3 mm złoże celitu (jeżeli w przesączu są wyraźnie widoczne pozostałości drożdży operację należy powtórzyć) Doprowadzić odczyn przesączu do ph = 7 przy użyciu 2 molowego roztworu NaH Tak powstały żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml) W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, należy mieszaninę wysolić NaCl lub/oraz odwirować Zlane ekstrakty organiczne suszy się bezwodnym siarczanem magnezu, przesącza na lejku z sączkiem karbowanym, 5 Fràter G, Müller U, Günter W, Roberts SM(ed); Preparative Biotransformations Whole Cells and Isolated enzymes in rganic Synthesis, 1992, 2:11, Wiley, London 5

6 a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej pozostałości produktu (produkt należy zważyć) Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC W tym celu należy pobrać próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńczć ją w octanie etylu (C~ 25 mg/ml) Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy - -eter dietylowy 3:1 Jako wzorzec nałożyć roztwór substratu Płytki obserwuje się pod lampą UV Jeżeli Mieszanina nie zawiera wzorca, tylko produkt obliczyć wydajność teoretyczną i praktyczną reakcji Literaturowa wydajność wynosi 70% mieszaniny (2R,3S)- i (2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu Surowy produkt można oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej Jako wypełnienie kolumny należy stosowac żel silikonowy, a jako eluent układ eter naftowy-eter dietylowy (3:1) 12 Redukcja podwójnego wiązania węgiel- węgiel Redukcja wiązań typu C=C z użyciem drożdży jest istotną metodą syntezy chiralnych wielofunkcyjnych syntonów Po raz pierwszy drożdże do tego celu uzyto już w latach 30 zeszłego stulecia Istotny wpływ w takim uwodornieniu ma otoczenie wiązania C=C istotny wpływ ma sąsiedztwo grupy karbonylowej lub wiązania podwójnego z deficytem elektronów bez których to reakcja nie zachodzi Badania przeprowadzone w latach 70 dowiodły stereoselektywności redukcji z użyciem S cerevisiae, w których ogólną zasadą była transstereospecyficzna addycja wodoru oraz wprowadzenie wodoru pro-(r) w centrum karbonylowym Chemoselektywność enzymów drożdżowych została niejednokrotnie potwierdzona Poniżej przytoczono kilka przykładów 6 7 : Scerevisiae (R) eter naftowy Me(CH 2 ) 4 (CH 2 ) 7 C 2 Me Scerevisiae 76% Me(CH 2 ) 4 (CH 2 ) 7 C 2 Me R R 74% H Scerevisiae N 2 H 3 C N 2 H CH 3 R=H, Cl, Br, N 2 50% 89-98% ee 6 Fuganti C, Griselli S,Servi S, Hőgberg, Roberts SM (ed); Preparative Biotransformations Whole Cells and Isolated enzymes in rganic Synthesis, 1992, 2:71, Wiley, London 7 Dumanski PG, Florey P, Knetting M, Smallridge AJ; JMolecCatal B: Enzymatic 2001, 11,

7 Redukcję wiązań C=C można rónież osiągnąć poprzez redukcję katalizowaną np metalami grup przejściowych lub ich tlenkami (Ni Raneya, Pt 2, Pd, itd) z użyciem gazowego wodoru Istnieją także metody stosujące np układy cynk i kwas, sód w etanolu, hydrazynę lub lit i aminę alifatyczną Zwykle można przeprowadzić tymi metodami selektywną redukcję wiązań C=C (bez naruszenia innych obecnych w substratach grup (np CH, CH, CN, itp) jednakże wymaga to zastosowania warunków i substratów redukujących charakterystycznych dla danego związku 3 Ćwiczenie: Celem ćwiczenia jest redukcja -metylo- -(2-furylo)akroleiny Jako produkt otrzymuje się nasycony alkohol Mechanizm tej reakcji jest trójetapowy : redukcja utlenianie redukcja Wyjściowy aldehyd pozostaje w równowadze z pochodną alkoholu allilowego, przy czym równowaga jest przesunięta w stronę alkoholu Jednakże już małe (równowagowe) ilości -metylo- -(2-furylo)akroleiny ulegają powolnej trans-addycji wodoru w poprzek wiązania podwójnego, do nasyconego aldehydu Nasycony aldehyd jest wówczas szybko redukowany do nasyconego alkoholu [H + ] CH [x] szybko H powoli poprzez utlenianie in situ do nienasyconego aldehydu CH szybko H 72%, > 98% ee dczynniki: -metylo- -(2-furylo)akroleina 0,45 g, (0003 mola) drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 12 g* glukoza 40 g woda destylowana 80 ml Celite Etanol ctan etylu MgS 4 bezw nasycony r-r węglanu sodu 2M kwas solny pis ćwiczenia: Umieścić drożdże, glukozę oraz wodę w kolbie stożkowej (500ml), a następnie zatkać wylot kolby watą i umieścić w cieplarce (30-37 o C) na około 45 minut w celu zapoczątkowania fermentacji Co 5 minut energicznie wymieszać zawartość kolby 7

8 ph fermentującej mieszaniny powinno być następnie podniesione z 4 do ok 55 poprzez dodanie nasyconego r-ru węglanu sodu (ok3-4 ml) Do tak przygotowanej mieszaniny należy dodać roztwór wyjściowego aldehydu w etanolu (2ml) i delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej perację należy wykonywać pod wyciągiem Co godzin należy sprawdzać ph mieszaniny Ewentualnie w celu obniżenia ph do wartości ok 5 posłużyć się roztworem kwasu solnego Po ok 48 h, zakładając wysoki stopień przereagowania, należy przerwać reakcję dodając dwie łyżki celitu ** Mieszaninę pozostawić na ok 30 min od czasu do czasu mieszając Następnie odsączyć zawiesinę na lejku ze Büchnera poprzez 3 mm złoże celitu (jeżeli w przesączu są wyraźnie widoczne pozostałości drożdży operację należy powtórzyć) Klarowny, brązowawy filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4 x 70 ml) Zlane ekstrakty octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu a następnie przesącza na lejku z sączkiem karbowanym Przesącz odparowuje się na wyparce rotacyjnej (T = 30 o C), do uzyskania żółtego oleistego produktu Skład mieszaniny należy skontrolować metodą TLC Próbkę przygotować wg procedury z poprzedniej syntezy Jako układ rozwijający stosuje się chlorek metylenu Płytki obserwu się pod lampą UV przy długości fali 254 nm Ponieważ aldehyd szybko przechodzi w nienasycony alkohol, na płytce przy R f ~038 mogą być widoczne 2 plamy w kształcie ósemki (nasycony i nienasycony alkohol) Świadczy to o niecałkowitym przereagowaniu substratu Jeżeli obecna jest tylko 1 plamka przy R f =034 pochodząca od produktu, można uznać całkowite przereagowanie Wówczas należy obliczyć wydajność teoretyczną oraz praktyczną (S)-3-(2-Furylo)-2-etylo-1-propanol uzyskuje się z literaturową wydajnością 49% Produkt można oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej, używając jako eluenta chlorku metylenu *Jeżeli używane są drożdże piekarnicze z pożywką doliczyć ok 50% masy **Na tym etapie mieszaninę reakcyjną można zamrozić i przerabiać po kilku dniach 8