Izolacja genomowego DNA z plam krwawych metodą absorpcji-elucji

Transkrypt

1 Magdalena Dębska Jacek Drabik Izolacja genomowego DNA z plam krwawych metodą absorpcji-elucji Wstęp i cel Izolacja kwasu dezoksyrybonukleinowego ze œladów biologicznych zabezpieczonych na miejscu zdarzenia jest jednym z wa niejszych etapów badañ w genetycznych badaniach kryminalistycznych. Otrzymanie pe³nego profilu genetycznego sprawcy uzale nione jest miêdzy innymi od uzyskania odpowiedniego stê enia DNA w roztworze wolnym od inhibitorów reakcji ³añcuchowej polimeryzacji (PCR). Wybór odpowiedniej metody ekstrakcji DNA stanowi klucz do uzyskania prawid³owych wyników badañ. Dostêpnych jest wiele komercyjnych zestawów dedykowanych do wyodrêbniania ludzkiego DNA z ró nego rodzaju materia³u, z jakim mo na siê spotkaæ w badaniach medyczno-s¹dowych. W numerze 264/2009 Problemów Kryminalistyki przedstawione zosta³y wyniki doœwiadczeñ maj¹cych Liza Przeniesienie lizatu pipet¹ Adsorpcja P³ukanie Elucja Izolat Ryc. 1. Schemat izolacji DNA metod¹ separacji na membranie silikonowej z przenoszeniem lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety Fig. 1. Scheme of DNA isolation using separation on silica membrane with transferring lysate onto the column by pipette Ÿród³o (ryc. 1 9b): autorzy na celu porównanie efektywnoœci ró nych metod izolacji genomowego DNA ze œladów biologicznych [1]. W artykule omówiono skutecznoœæ czterech nowych zestawów przeznaczonych do izolacji DNA ze œladów biologicznych. Dwa z nich opiera³y siê na technologii separacji magnetycznej, dwa pozosta³e by³y to zestawy kolumienkowe wykorzystuj¹ce technologiê separacji kwasu dezoksyrybonukleinowego na membranie silikonowej. W przypadku metod kolumienkowych jednym z etapów ekstrakcji jest oddzielenie lizatu od pod³o a, na którym znajdowa³ siê zabezpieczony œlad biologiczny, a nastêpnie jego transfer na membranê silikonow¹ wi¹- ¹c¹ DNA. Od sposobu przeprowadzenia tego etapu zale y w du ej mierze wydajnoœæ ca³ego procesu izolacji. Odzyskanie jak najwiêkszej objêtoœci lizatu ma bowiem bezpoœredni wp³yw na stê enie DNA w uzyskanym ekstrakcie. W praktyce laboratoryjnej lizat najczêœciej odci¹ga siê z probówki i przenosi na kolumnê silikonow¹ za pomoc¹ pipety (ryc. 1 3). Mo e to jednak powodowaæ pozostawanie cennego materia³u genetycznego na pod³o u. Dzieje siê tak szczególnie w przypadku pod³o y ch³onnych, np. tkanin, papieru. Istnieje jednak alternatywna metoda, w której lizat wraz z pod³o em umieszcza siê w specjalnym filtrze, a nastêpnie odwirowuje. Pod³o e zostaje zatrzymane na siateczce o odpowiedniej strukturze, natomiast ca³y roztwór przechodzi do dolnej czêœci probówki. Tak oddzielony lizat przenosi siê w ca³oœci na kolumnê silikonow¹. Schemat procedury oczyszczania lizatu z u yciem filtra przedstawia rycina 4. Na stê enie DNA w uzyskanym ekstrakcie wp³ywa równie iloœæ RNA obecnego w lizacie. Z³o e krzemionkowe wchodz¹ce w sk³ad kolumn stosowanych w izolacji metod¹ absorpcji-elucji przy³¹cza zarówno kwas rybonukleinowy, jak równie kwas dezoksyrybonukleinowy. Dodanie do buforu lizuj¹cego odpowiedniego odczynnika, tzw. noœnika RNA, zwiêksza efektywnoœæ PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ)

2 Ryc. 2a c. Przenoszenie lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety Fig. 2a c. Transferring lysate onto the column by pipette wi¹zania DNA do membrany silikonowej na kolumnie [2]. W przypadku izolacji DNA ze œladów kryminalistycznych, a tak e próbek zawieraj¹cych ma³e iloœci DNA zestawem QIAamp DNA Micro zaleca siê stosowanie noœnika RNA. Substancja ta, wed³ug producenta zestawu, stabilizuje DNA w próbkach o bardzo niskim stê eniu kwasów nukleinowych (ryc. 5 7). Ryc. 3a b. Przenoszenie lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety (QIAamp DNA Micro) Fig. 3a b. Transferring lysate onto the column by pipette (QIAamp DNA Micro) 18 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ) 2009

3 Liza Rozdzia³ na filtrze Adsorpcja P³ukanie Elucja Lizolat Ryc. 4. Schemat izolacji DNA metod¹ separacji na membranie silikonowej z u yciem filtra do oddzielenia lizatu od pod³o a Fig. 4. Scheme of DNA isolation using separation based on silica membrane with lysate separation by means of filter unit Ryc. 5a. Lizat wraz z pod³o em na filtrze NucleoSpin Fig. 5a. Lysate with solid sample material on NucleoSpin filter unit Ryc. 5b. Pod³o e w filtrze NucleoSpin po odwirowaniu Fig. 5b. Solid sample material on NucleoSpin filter unit after centrifugation Celem przeprowadzonych badañ by³o sprawdzenie, w jaki sposób zastosowanie etapu oddzielania pod³o a od lizatu za pomoc¹ filtrów wp³ywa na efektywnoœæ izolacji DNA w zastosowanej metodzie. Testowano równie wp³yw obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym na wydajnoœæ procesu ekstrakcji. Otrzymane wyniki zosta³y porównane pod k¹tem wydajnoœci metody (porównanie uzyskanych stê eñ DNA) oraz jakoœci uzyskanego DNA (porównanie uzyskanych profili genetycznych). Zwrócono równie uwagê na ryzyko wyst¹pienia kontaminacji na etapie oddzielania lizatu na filtrach. Materia³ i metody Materia³em do badañ by³y jak uprzednio [1] próbki krwi pobrane od oœmiu osób i umieszczone w probówkach z heparyn¹ jako œrodkiem antykoagulacyjnym. Krew nanoszono na pod³o e ch³onne (ja³owe p³ótno) oraz na pod³o e ch³onne zawieraj¹ce inhibitor PCR PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ)

4 Ryc. 6. Pod³o e na filtrze QIAshredder po zwirowaniu (QIAamp DNA Micro) Fig. 6. Solid sample material on QIAshredder filter unit after centrifugation (QIAamp DNA Micro) Ryc. 7. Noœnik RNA (QIAamp DNA Micro) Fig. 7. Carrier RNA (QIAamp DNA Micro) (materia³ jeansowy) o wymiarach oko³o 5 x 5 mm, a nastêpnie przechowywano przez okres 4 miesiêcy w wyja³owionych, suchych, otwartych probówkach w temperaturze pokojowej. Wszystkie próbki poddano ekstrakcji DNA metod¹ absorpcji-elucji z wykorzystaniem dwóch ró nych zestawów odczynników: 1. Izolacjê DNA z u yciem zestawu Nucleo- Spin Tissue XS (ryc. 8a b) wykonano w dwóch wariantach: a) zastosowanie etapu oddzielania lizatu na filtrach NucleoSpin, b) przenoszenie lizatu na kolumnê silikonow¹ za pomoc¹ pipety bez u ycia filtrów. Dla ka dego wariantu wykonano osiem powtórzeñ dla nastêpuj¹cych przypadków: 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Degradacja 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, degradowanej 30 min w temp. 150 o C. Inhibicja 1 μl krwi naniesionej na materia³ jeansowy zawieraj¹cy barwnik indygo. Kontrola negatywna ja³owe p³ótno bez naniesionej krwi. Izolowane DNA zawieszano zgodnie z zaleceniami producenta w objêtoœci 20 μl. 2. Izolacjê DNA z u yciem zestawu QIAamp DNA Micro wykonano w trzech wariantach: a) zastosowanie etapu oddzielania lizatu na filtrach QIAshredder (ryc. 9a b); bufor lizuj¹cy z dodatkiem noœnika RNA, b) przenoszenie lizatu na kolumnê silikonow¹ za pomoc¹ pipety bez u ycia filtrów; bufor lizuj¹cy bez dodatku noœnika RNA, c) przenoszenie lizatu na kolumnê silikonow¹ za pomoc¹ pipety bez u ycia filtrów; bufor lizuj¹cy z dodatkiem noœnika RNA. Dla ka dego wariantu ekstrakcjê wykonano dla nastêpuj¹cych przypadków: 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno (8 powtórzeñ). 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno (6 powtórzeñ). Inhibicja 1 μl krwi naniesionej na materia³ jeansowy zawieraj¹cy barwnik indygo (8 powtórzeñ). Kontrola negatywna ja³owe p³ótno bez naniesionej krwi (8 powtórzeñ). Izolowane DNA zawieszano zgodnie z zaleceniami producenta w objêtoœci 20 μl. Ekstrakcjê DNA przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producentów, stosuj¹c protoko³y dla œladów kryminalistycznych w postaci zaschniêtych plam krwawych [2, 3]. Wszystkie badania przeprowadzono 20 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ) 2009

5 Ryc. 8a. Zestaw filtrów NucleoSpin oraz kolumienek silikonowych Fig. 8a. NucleoSpin filter units and silica membrane columns Ryc. 9a. Zestaw filtrów QIAshredder oraz kolumienek silikonowych (QIAamp DNA Micro) Fig. 9a. QIAshredder filter units and silica membrane columns (QIAamp DNA Micro) Ryc. 8b. Kolumna z membran¹ silikonow¹ Fig. 8b. Silica membrane column w obecnoœci kontroli pozytywnej (DNA o znanym genotypie) oraz kontroli negatywnej (próba odczynnikowa), otrzymuj¹c prawid³owe dla nich wyniki. Oznaczenie stê enia DNA w uzyskanych izolatach wykonano metod¹ Real Time PCR za pomoc¹ aparatu ABI PRISM 7500 Sequence Detection System i oprogramowania 7500 System Detection Software v z zastosowaniem zestawu odczynników Quantifiler Human DNA Quantification Kit. Otrzymane ekstrakty DNA amplifikowano z u yciem zestawu odczynników AmpFlSTR SGM Plus i aparatu GeneAmp PCR System Produkty reakcji PCR poddawano elektroforezie w sekwenatorze ABI PRISM 3130 XL. Do analizy wyników u ywano oprogramowania Gene- Mapper ID v firmy Applied Biosystems. Wyniki uzyskane z oznaczenia iloœciowego stê eñ DNA po izolacji zestawem NucleoSpin Tissue XS opracowano przy u yciu testu t-studenta, natomiast zestawem QIAamp DNA Micro przy u yciu analizy wariancji testem Tukeya. Do obliczeñ statystycznych zastosowano wersjê demo oprogramowania Graph- Pad Prism v. 5 (zgodnie z obowi¹zuj¹c¹ licencj¹ producenta). Ryc. 9b. Kolumna z membran¹ silikonow¹ (QIAamp DNA Micro) Fig. 9b. Silica membrane column (QIAamp DNA Micro) Wyniki Testowane w doœwiadczeniu warianty oddzielania lizatu od pod³o a, a tak e wp³yw obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym na efektywnoœæ izolacji analizowano w nastêpuj¹cych aspektach: Wydajnoœæ metody (uzyskane stê enia DNA). Jakoœæ uzyskanego DNA (obraz profili genetycznych). Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji (obecnoœæ profili mieszanych). Analiza ilościowa uzyskanego DNA Izolacja DNA z użyciem zestawu NucleoSpin Tissue XS Zale noœæ stê enia DNA w otrzymanych izolatach od wariantu oddzielania lizatu od pod³o a dla metody NucleoSpin Tissue XS przedstawiaj¹ tabele 1 5. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ)

6 Tabela 1 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from linen using NucleoSpin Tissue XS method, depending on the lysate separation variant Tabela 2 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 2,5 μl of blood taken from linen using NucleoSpin Tissue XS method, depending on the lysate separation variant [ ] wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa Ÿród³o (tabele 1 9): opracowanie w³asne Wy sze œrednie stê enie DNA izolowanego z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na p³ótno uzyskano przy przenoszeniu lizatu na kolumnê Nucleo- Spin za pomoc¹ pipety. W przypadku zastosowania tego sposobu istnieje du a rozbie noœæ pomiêdzy wynikami cz¹stkowymi, co potwierdza otrzymana wysoka wartoœæ odchylenia standardowego. Przy zastosowaniu filtrów do oddzielania lizatu od pod³o a w próbce nr 3 zanotowano wy sze stê enie DNA, znacznie odbiegaj¹ce od innych wyników (1,98 ng/μl). Pomimo wyeliminowania tej wartoœci z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa, nie stwierdzono statystycznie istotnej ró nicy pomiêdzy otrzymanymi œrednimi stê eniami DNA po izolacji z zastosowaniem filtrów i przy przenoszeniu lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety. Przy izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, podobnie jak w przypadku 1 μl krwi, wy sze œrednie stê enie DNA w ekstraktach uzyskano przy zastosowaniu wariantu z przenoszeniem lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety. Stosuj¹c filtry do oddzielania lizatu od pod³o a, otrzymano du ¹ rozbie noœæ wyników cz¹stkowych. Odchylenie standardowe przewy szy³o wartoœæ œredni¹ obliczon¹ na podstawie wyników z pomiarów. W tym przypadku równie nie stwierdzono statystycznie istotnej ró nicy Tabela 3 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 5 μl of blood taken from linen using NucleoSpin Tissue XS method, depending on the lysate separation variant Œrednie stê enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró ni¹ siê statystycznie: ab przy p 0,05 [p poziom istotnoœci] [ ] wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa 22 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ) 2009

7 Tabela 4 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin Tissue XS z materia³u zdegradowanego stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1μl of degraded blood taken from linen using NucleoSpin Tissue XS method, depending on the lysate separation variant Tabela 5 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na jeans z barwnikiem indygo (pod³o e z inhibitorem reakcji PCR) Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from jeans (PCR inhibitor) using NucleoSpin Tissue XS method, depending on the lysate separation variant Œrednie stê enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró ni¹ siê miêdzy sob¹ statystycznie: ab przy p 0,05 [p poziom istotnoœci] [ ] wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa pomiêdzy œrednimi stê eniami DNA uzyskanymi po izolacji przy zastosowaniu obu wariantów oddzielania lizatu od pod³o a. W przypadku ekstrakcji DNA z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono statystycznie istotnie wy sze œrednie stê enie DNA w izolatach uzyskanych po przeniesieniu lizatu na kolumny silikonowe za pomoc¹ pipety (p 0,05). W przypadku próbki nr 3 zmierzona wartoœæ stê enia DNA znacznie przewy sza³a inne wyniki otrzymane tym sposobem (10,87 ng/μl). Wynik ten wyeliminowano z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa. Podobna sytuacja mia³a miejsce w przypadku próbki nr 2 w opcji z zastosowaniem filtra. W przypadku izolacji DNA z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno i degradowanej w eksperymentalnie dobranych warunkach termicznych, zastosowanie filtrów do oddzielania lizatu od pod³o a skutkowa³o obni eniem œredniego stê enia DNA w uzyskiwanych izolatach w stosunku do ekstraktów otrzymanych po zastosowaniu wariantu przenoszenia lizatu za pomoc¹ pipety. Wynik ten zosta³ potwierdzony statystycznie (p 0,05). Przy izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o e zawieraj¹ce inhibitor reakcji ³añcuchowej polimeryzacji, wy sze œrednie stê enie DNA w ekstraktach uzyskano, stosuj¹c filtry do oddzielania lizatu od pod³o a. Jednak pomimo wyeliminowania z obliczeñ wartoœci odbiegaj¹cej od pozosta³ych wyników (próbka nr 3 w opcji z zastosowaniem filtra), nie stwierdzono statystycznie istotnej ró nicy pomiêdzy otrzymanymi wynikami. Izolacja DNA z użyciem zestawu QIAamp DNA Micro W tabelach 6 8 przedstawiono stê enia DNA w izolatach uzyskanych metod¹ QIAamp DNA Micro z zastosowaniem ró nych wariantów oddzielania lizatu od pod³o a oraz w zale noœci od obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym. Przy izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono ni sze stê enie DNA w wariancie oddzielania lizatu od pod³o a z zastosowaniem filtrów QIAshredder. W opcji przenoszenia lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety obecnoœæ noœnika RNA lub jego brak w buforze lizuj¹cym nie odgrywa wiêkszej roli. W obydwu przypadkach uzyskano podobne wartoœci œrednich stê eñ DNA w izolatach. Wyniki nie by³y istotne statystycznie. Izolacja DNA z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno wykaza³a wy sze œrednie stê enie DNA w izolatach otrzymanych przy przeno- PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ)

8 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ QIAamp DNA Micro z dodatkiem noœnika RNA oraz bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from linen using QIAamp DNA Micro method with or without carrier RNA present in lysis buffer, depending on the lysate separation variant Tabela 6 [ ] wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa Tabela 7 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ QIAamp DNA Micro z dodatkiem noœnika RNA oraz bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 5 μl of blood taken from linen using QIAamp DNA Micro method with or without carrier RNA present in lysis buffer, depending on the lysate separation variant Œrednie stê enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró ni¹ siê miêdzy sob¹ statystycznie: AB przy p 0,01 [p poziom istotnoœci] [ ] wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa 24 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ) 2009

9 Tabela 8 Stê enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o a przy izolacji DNA metod¹ QIAamp DNA Micro z dodatkiem noœnika RNA oraz bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na jeans z barwnikiem indygo (pod³o e z inhibitorem reakcji PCR) Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from jeans (PCR inhibitor) using QIAamp DNA Micro method with or without carrier RNA present in lysis buffer, depending on the lysate separation variant [ ] wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa szeniu lizatu na kolumny silikonowe za pomoc¹ pipety. Wynik ten by³ statystycznie istotny (p 0,01). Po ekstrakcji z dodatkiem i bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego w obydwóch przypadkach uzyskano podobne œrednie stê enia DNA. W opcji z zastosowaniem filtrów QIAshredder izolacjê wykonano w oœmiu powtórzeniach, natomiast przy przenoszeniu lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety w szeœciu. Z obliczeñ statystycznych wyeliminowano za pomoc¹ testu Grubbsa wartoœci uzyskane dla próbek nr 2, które znacz¹co odbiega³y od innych uzyskanych wyników w wariantach przenoszenia lizatu na kolumny silikonowe za pomoc¹ pipety. Z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o e zawieraj¹ce inhibitor PCR przy zastosowaniu do oddzielenia lizatu od pod³o a filtrów QIAshredder nie uda³o siê wyizolowaæ DNA w ogóle. Tylko w jednym przypadku uzyskano stê enie DNA w badanym izolacie (0,01 ng/μl), jednak wynik ten, jako odbiegaj¹cy od pozosta³ych, wyeliminowano z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa. Œrednie ze stê- eñ DNA w izolatach otrzymanych po izolacji z przenoszeniem lizatu na kolumny za pomoc¹ pipety by³y jednakowe (0,01 ng/μl) dla procedur z zastosowaniem i bez zastosowania noœnika RNA w buforze lizuj¹cym. W adnym z badanych przypadków nie stwierdzono statystycznie istotnej ró nicy pomiêdzy otrzymanymi wynikami. Analiza jakościowa uzyskanego DNA Charakterystykê jakoœci profili genetycznych uzyskanych z badanych próbek przedstawiono w tabeli 9. Izoluj¹c DNA zestawem NucleoSpin Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 1, 2,5 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno oraz w próbie kontrolnej, uzyskano pe³ne profile genetyczne we wszystkich badanych przypadkach bez wzglêdu na sposób oddzielania lizatu od pod- ³o a. Przy zastosowaniu filtrów NucleoSpin do izolacji DNA z materia³u zdegradowanego uzyskano szeœæ profili czêœciowych, w których wypadniêciu uleg³y tylko allele w loci o wysokiej masie cz¹steczkowej: D2S1338 i D18S51, w dwóch przypadkach dodatkowo D16S539 i D21S11 i w jednym przypadku locus FGA. Dla pod³o- a z inhibitorem otrzymano jeden pe³ny profil genetyczny, jeden czêœciowy (wypad³y allele z uk³adów D21S11, D18S51 oraz FGA), a w przypadku pozosta- ³ych szeœciu próbek wynik genotypowania by³ negatywny. W wariancie z przenoszeniem lizatu na kolumny ze z³o em krzemionkowym za pomoc¹ pipety dla materia³u poddawanego degradacji termicznej uzyskano pe³ne profile genetyczne w siedmiu badanych przypadkach oraz jeden profil czêœciowy, gdzie wypadniêciu uleg³y wysokocz¹steczkowe loci D21S11, D18S51 oraz FGA. Izolacja DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o e z inhibitorem PCR skutkowa³a otrzymaniem trzech pe³nych profili genetycznych PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ)

10 Analiza uzyskanych profili genetycznych w zale noœci od zastosowanego wariantu izolacji * zbadano 6 próbek Analysis of the genetic profiles depending on the extraction s method variant * six samples were examinated Tabela 9 Zastosowane w tabeli oznaczenia: FP pe³ny profil (full profile) PP czêœciowy profil (partial profile) NEG. brak profilu oraz dwóch profili czêœciowych, w których wypadniêciu uleg³y nastêpuj¹ce uk³ady: D2S1338, D18S51 oraz FGA w jednej próbce, a tak e D3S1358, D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51, TH01 oraz FGA w drugiej próbce. W pozosta³ych trzech przypadkach nie uda³o siê uzyskaæ profili genetycznych. Przy ekstrakcji DNA zestawem QIAamp DNA Micro, oddzielaj¹c lizat od pod³o a za pomoc¹ pipety i bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego, uzyskano pe³ne profile genetyczne we wszystkich powtórzeniach dla 1 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Podobny wynik otrzymano dla wariantu z dodaniem noœnika RNA do buforu lizuj¹cego szeœæ pe³nych profili genetycznych (na szeœæ badanych) dla 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno i siedem profili genetycznych dla 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Tu jednak dla jednej próbki wynik genotypowania by³ negatywny. Przy zastosowaniu filtrów QIAshredder do izolacji DNA z 1 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno uzyskano czêœciowe profile genetyczne, w których wypad³y uk³ady: D18S51 w jednej próbce oraz D3S1358, vwa, D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51, D19S433, TH01 i FGA w kolejnych. Wraz ze wzrostem iloœci materia³u wyjœciowego uzyskiwano wiêcej pe³nych profili genetycznych cztery dla 1 μl, piêæ dla 2,5 μl oraz szeœæ dla 5 μl. Dla prób stanowi¹cych 1 μl krwi naniesionej na jeans w ogóle nie uzyskano wyników genotypowania. Przenosz¹c lizat na kolumny za pomoc¹ pipety, otrzymano jeden pe³ny i cztery czêœciowe profile genetyczne w wariancie bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego. We wszystkich przypadkach wypadniêciu uleg³y allele z loci D21S11, D18S51 oraz FGA, a dodatkowo TH01 w trzech próbkach, D3S1358 i D19S433 w dwóch i vwa, D16S539 oraz D2S1338 w jednej. Po dodaniu noœnika RNA do buforu lizuj¹cego otrzymano trzy pe³ne i dwa czêœciowe profile genetyczne z wygaszeniem sygna³u w uk³adach D16S539, D2S1338, D18S51 i FGA. Podobnie jak uprzednio, dla trzech próbek nie uzyskano wyników genotypowania. W próbie kontrolnej dla izolacji z zastosowaniem filtrów QIAshredder uzyskano piêæ pe³nych profili genetycznych oraz trzy czêœciowe, w których wypadniêciu uleg³y allele w uk³adach D16S539, D2S1338, D18S51 i FGA. W adnym z analizowanych przypadków nie stwierdzono wyst¹pienia profilu mieszanego, co œwiadczy o braku kontaminacji próbek. Podsumowanie Wiêksz¹ efektywnoœæ izolacji genomowego DNA z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno przy u yciu zestawu NucleoSpin Tissue XS obserwowano w przypadku oddzielania lizatu od pod- 26 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ) 2009

11 ³o a i jego przenoszenia na kolumny silikonowe za pomoc¹ pipety. Analogiczne rezultaty uzyskano w przypadku materia³u zdegradowanego. Podobnie wy sze œrednie stê enia DNA przy zastosowaniu tego sposobu uzyskano w przypadku izolacji z materia³u 1 oraz 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, jednak e wyniki te nie zosta³y potwierdzone statystycznie. Uzyskanie mniejszego stê enia DNA przy zastosowaniu filtrów NucleoSpin mog³o wynikaæ z faktu zatrzymywania siê czêœci kwasów nukleinowych na membranie filtra. Oddzielanie lizatu od pod³o a za pomoc¹ filtrów Nucleo- Spin powoduje obni enie stê enia DNA w otrzymywanych izolatach. Jedynie w przypadku analizy wyników uzyskanych po izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o e z inhibitorem PCR uzyskano wy sze œrednie stê enie DNA przy zastosowaniu filtrów NucleoSpin, ale wynik ten nie by³ statystycznie istotny. Sposób oddzielania lizatu z próbek stanowi¹cych 1, 2,5 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno oraz w przypadku próby kontrolnej nie mia³ wp³ywu na jakoœæ genotypowania. Dla próbek poddanych degradacji oraz próbek na pod³o u z inhibitorem PCR przy oddzielaniu lizatu od pod³o a za pomoc¹ pipety odsetek pe³nych profili genetycznych by³ wiêkszy ni przy zastosowaniu filtrów. W metodzie QIAamp DNA Micro równie wy sze stê enia DNA w izolatach uzyskiwano dla wariantu oddzielania lizatu od pod³o a za pomoc¹ pipety. Analogicznie, jak w poprzedniej metodzie, ró nice by³y istotne statystycznie dla 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Z zastosowaniem filtrów QIAshredder wydajnoœæ procesu ekstrakcji znacz¹co spada³a. To samo dotyczy³o materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o e z inhibitorem PCR. Mia³o to swoje odzwierciedlenie w jakoœci uzyskiwanych profili genetycznych. W opcji z zastosowaniem filtrów QIAshredder do oddzielenia lizatu od pod³o a jakoœæ genotypowania w rozpatrywanych przypadkach by³a znacznie ni sza ni przy oddzielaniu lizatu od pod³o a za pomoc¹ pipety. Nie zaobserwowano znacz¹cego wp³ywu obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym ani na iloœæ, ani na jakoœæ otrzymanych wyników. BIBLIOGRAFIA 1. Dêbska M., Drabik J.: Porównanie efektywnoœci ró - nych metod izolacji genomowego DNA ze œladów biologicznych, Problemy Kryminalistyki 2009, 264, Qiagen QIAamp DNA Micro Handbook, Germany 2003, Macherey Nagel User Manual, NucleoSpin Tissue XS Genomic DNA from Tissue, Germany 2007, Streszczenie Celem przeprowadzonych badañ by³o sprawdzenie, w jaki sposób zastosowanie etapu oddzielania pod³o a od lizatu za pomoc¹ filtrów wp³ywa na efektywnoœæ izolacji DNA przy zastosowaniu metody absorpcji-elucji zestawami NucleoSpin Tissue XS oraz QIAamp DNA Micro. Testowano równie wp³yw obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym na wydajnoœæ procesu ekstrakcji. Materia³ do badañ stanowi³a wysuszona krew na ja³owym pod³o u oraz na pod³o u zawieraj¹cym inhibitor PCR, a tak e materia³ zdegradowany. Wiêksz¹ efektywnoœæ izolacji genomowego DNA otrzymano w przypadku pominiêcia etapu oczyszczania pod³o a na filtrach zarówno w metodzie NucleoSpin Tissue XS jak te QIAamp DNA Micro. Ró nice statystycznie istotne stwierdzono w przypadku izolacji DNA z 5 μl krwi na ja³owym pod³o u. Zastosowanie filtrów w metodzie NucleoSpin Tissue XS w przypadku izolacji z 1, 2,5 oraz 5 μl krwi na ja³owym p³ótnie oraz w próbie kontrolnej nie mia- ³o wp³ywu na jakoœæ genotypowania. Natomiast dla próbek zdegradowanych oraz zawieraj¹cych inhibitor PCR zanotowano wiêksz¹ iloœæ pe³nych profili przy oddzielaniu lizatu od pod³o a za pomoc¹ pipety. W przypadku metody QIAamp DNA Micro zastosowanie filtrów wp³ywa³o na uzyskanie mniejszej iloœci pe³nych profili genetycznych w rozpatrywanych przypadkach. Nie zaobserwowano znacz¹cego wp³ywu obecnoœci noœnika RNA ani na uzyskiwane stê enia DNA, ani na jakoœæ otrzymywanych profili genetycznych. S³owa kluczowe: izolacja DNA, noœnik RNA, œlady biologiczne, kryminalistyczne badania DNA, metoda absorpcji- -elucji. Summary The purpose of the research was to compare two methods of separation of the lysate from the solid sample material by the use of filter units and by pipette using different protocols for silica membrane based kits: NucleoSpin Tissue XS and QIAamp DNA Micro. The influence of carrier RNA addition to the lysis buffer on efficiency of DNA extraction was also tested. The material for the research consisted of dried blood spots on sterile linen as well as on jeans containing PCR inhibitor and also degraded DNA. As far as quantity aspect is concerned better results in both methods were obtained with no use of filter units. Statistical significance was observed in case of DNA extraction from 5 μl of blood on sterile linen. On the other hand the use of filter units had no influence on quality of DNA profiles in case of DNA extraction from 1, 2,5 and 5 μl of blood on sterile linen or from control samples. Better genotyping quality was obtained for degraded DNA and samples on jeans when the lysate was separated by pipette. The use of filter units in QIAamp DNA Micro kit caused a decrease in genotyping quality. There was no significant influence on concentration of DNA or on genotyping quality when carrier RNA was added to the lysis buffer. Keywords: DNA extraction, carrier RNA, forensic biology, absorption-elution method. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 266 (paÿdziernik grudzieñ)