Problemy Terapii Monitorowanej OPINION PAPER 2011, 22, nr 1/2, str

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Problemy Terapii Monitorowanej OPINION PAPER 2011, 22, nr 1/2, str ANETA ROGALSKA, EWA SZULA, AGNIESZKA MARCZAK* NOWE ZWIĄZKI STABILIZUJĄCE MIKROTUBULE (MSA) POZYSKIWANE Z ORGA- NIZMÓW MORSKICH PRZYSZŁOŚĆ CHEMIOTERAPII Novel agents stabilizing microtubule (MSA) from marine organisms the future of chemotherapy Katedra Termobiologii, Instytut Biofizyki, Uniwersytet Łódzki Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Zofia Jóźwiak STRESZCZENIE Naturalne związki stabilizujące mikrotubule (MSA, ang. Microtubule-Stabilizing Agents), pozyskiwane z gąbek morskich oraz korali, wydają się być jedną z bardziej obiecujących grup chemioterapeutyków uŝywanych w terapii przeciwnowotworowej. Oddziałują one na cytoszkielet, zaburzając jego strukturę oraz funkcje. Ich głównym mechanizmem działania jest stabilizacja mikrotubul poprzez wiązanie się do podjednostek tubuliny, co prowadzi do hamowania cyklu mitotycznego i śmierci komórki. MSA mogą równieŝ zaburzać proces angiogenezy poprzez tworzenie sieci nowych połączeń krwionośnych guza, uczestniczyć w przekazywaniu sygnałów w komórce oraz dysregulować aktywność kinaz. Artykuł opisuje mechanizm działania i funkcje mikrotubul oraz przedstawia najwaŝniejsze klasy związków stabilizujących mikrotubule, uwzględniając ich budowę chemiczną, oddziaływanie na tubulinę oraz najnowsze badania potwierdzające ich aktywność przeciwnowotworową. SŁOWA KLUCZOWE: leki przeciwnowotworowe, chemioterapia, związki stabilizujące mikrotubule SUMMARY Natural compounds called MSA (ang. Microtubule-Stabilizing Agents), derived from marine sponges and corals, appear to be one of the most promising groups of chemotherapeutic agents used in cancer therapy. They affect the cytoskeleton, disrupting its structure and functions. Their main mechanism of action is to stabilize microtubules by binding to tubulin subunits which inhibits the mitotic cycle and causes cell death. They may also interfere with the process of angiogenesis, disturbing the action of creating new tumor vessels connections. They can also participate in cell s signals transduction and deregulate kinase activity. The article describes the mechanism of action and functions of microtubules, and presents the most important members of microtubule stabilizing compounds, including their chemical structure, effects on tubulin as well as the latest research on them. KEY WORDS: anticancer drugs, chemotherapy, microtubule stabilizing agents WSTĘP Mimo znacznego postępu medycyny, nowotwory są nadal główną przyczyną zgonów na świecie. Szukanie nowych opcji w leczeniu tej choroby jest priorytetem dla firm farmaceutycznych i niezaleŝnych organizacji badawczych. Wiele uwagi poświęca się obecnie związkom pochodzenia naturalnego. Projektowanie de novo i synteza bioaktywnych cząsteczek, nawet przy uŝyciu skomplikowanego modelowania komputerowego nie zastąpi milionów lat ewolucji i doboru naturalnego. Obok roślin lądowych oraz bakterii, z których bardzo często pozyskuje się związki przeciwnowotworowe, bogatym i wciąŝ niepoznanym źródłem leków są oceany. Pokrywają one większą część powierzchni Ziemi, a ewolucja ich mieszkańców trwała setki milionów lat. Spośród wielu róŝnych rodzajów organizmów morskich wykorzystywanych jako źródło leków, najbogatsze okazały się korale oraz gąbki, głównie ze względu na pokrywające ich powierzchnie organizmy symbiotyczne [1, 2].

2 64 A. Rogalska i wsp. Niniejszy artykuł przedstawia najnowsze związki pozyskiwane z organizmów morskich, których celem działania jest cytoszkielet, odgrywający waŝną rolę w wielu procesach komórkowych m.in. w podziałach komórkowych, transporcie wewnątrzkomórkowym, czy ruchu komórek. Cytoszkielet zbudowany jest z mikrotubul, mikrofilamentów oraz filamentów pośrednich. Mikrotubule wydają się być najbardziej podatnymi na uszkodzenia i oddziaływania biologiczne strukturami, przez co celem wielu leków przeciwnowotworowych są właśnie te struktury [3, 4]. MIKROTUBULE BUDOWA I FUNKCJE Mikrotubule są cylindrami zbudowanymi z 13 podłuŝnie ułoŝonych protofilamentów, z których kaŝdy składa się z heterodimerów α- i β-tubuliny. Czasteczki tubuliny α- i β- są podobnymi do siebie białkami globularnymi o masie około 50 kda kaŝda. Kodowane są przez odrębne geny i połączone ze sobą wiązaniem niekowalencyjnym. Dimery tubuliny podczas polimeryzacji równieŝ łączone są tymi wiązaniami. KaŜdy protofilament posiada swoją strukturalną biegunowość, która wynika z naprzemiennego ułoŝenia α- i β-tubuliny, gdzie na jednym końcu obecna jest α-tubulina (tzw. koniec minus), a na drugim β-tubulina (tzw. koniec plus) (Ryc. 1A) [5]. Koniec minus zakotwiczony jest w centrum organizacji mikrotubul (MTOC, ang. Microtubule-Organizing-Center), którym jest centrosom zawierający dwie centriole. Odpowiedzialny jest on za kontrolę liczby i orientacji mikrotubul w cytoplazmie w komórkach eukaryota. Z MTOC współpracują białka związane z mikrotubulami (MAPs, ang. Microtubule- Associated Proteins), które stanowią element łączący mikrotubule w centrum organizacji. Mikrotubule cechuje dynamiczna niestabilność, polegająca na ich gwałtownym skracaniu się bądź wydłuŝaniu. Mogą one takŝe całkowicie się rozpaść lub zacząć formować od nowa. Właściwość ta związana jest ze zdolnością tubuliny do przyłączania i hydrolizy cząsteczki guanozynotrifosforanu (GTP, ang. Guanosine-5 -Triphosphate). Miejsce odpowiedzialne za hydrolizę GTP, tzw. miejsce E (ang. Exchangeable site) znajduje się w podjednostce β tubuliny. KaŜdy dimer tubuliny w stanie wolnym jest związany z cząsteczką GTP i w tej postaci dołączany jest do końca plus mikrotubuli. Gdy w pobliŝu końca plus obecna jest duŝa liczba cząsteczek GTP-tubuliny, dochodzi do powstania tzw. czapeczki (ang. GTPcap). Tworzą ją kolejno dołączane kompleksy heterodimeru tubuliny z GTP, w których na skutek duŝego tempa przyłączania nowych cząsteczek tubuliny nie dochodzi do hydrolizy GTP. Takie GTPprotofilamenty są bardzo stabilne, co skutkuje wydłuŝaniem się mikrotubuli. W sytuacji, gdy dochodzi do hydrolizy GTP z wytworzeniem cząsteczki GDP (GDP, ang. Guanosine-5 -Diphosphate) obserwujemy skracanie się mikrotubuli, jako, Ŝe protofilamenty zbudowane z heterodimerów GDP są niestabilne i łatwo odłączają się od mikrotubuli [6]. Mikrotubule zapewniają wewnątrzkomórkowy transport, nadają komórce kształt, polarność, biorą udział w przekazywaniu sygnałów komórkowych, a takŝe zapewniają prawidłowy rozdział chromosomów podczas podziału komórkowego [7]. ZWIĄZKI STABILIZUJĄCE MIKROTUBULE (MSA) MECHANIZM DZIAŁANIA Związki oddziałujące z mikrotubulami (MBD, ang. Microtubule-Binding Drugs) dzielą się na dwie grupy. Pierwszą stanowią specyfiki, które hamują tworzenie dimerów heterotubuliny w polimery mikrotubul i zwane są związkami destabilizującymi mikrotubule (MDA, ang. Microtubule-Destablilizing Agents). Druga grupa to leki hamujące depolimeryzację mikrotubul w podjednostki α i β-tubuliny, czego skutkiem jest stabilizacja wrzeciona kariokinetycznego. To tak zwane związki stabilizujące mikrotubule (MSA, ang Microtubule-Stabilizing Agents). (Ryc. 1B). Niezwykle obiecującą grupą związków są zwłaszcza leki stabilizujące mikrotubule, które mogą być skuteczne w terapii zarówno białaczek, jak i guzów litych [8]. NaleŜą do nich między innymi stosowane juŝ od wielu lat w leczeniu nowotworów taksany (paklitaksel, docetaksel), oraz nowsza ich generacja epotilony, znacznie bardziej skuteczne od taksanów, zwłaszcza u chorych wykazujących oporność wielolekową (MDR, ang. Multiple Drug Resistance) [9].

3 Nowe związki stabilizujące mikrotubule 65 Ryc. 1. Procesy polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul (A) oraz podział związków oddziałujących z mikrotubulami (B) Fig. 1. Process of polimerization and depolimerization of microtubules (A) and division of Microtubule-Binding Agents Działanie MSA polega na wstrzymywaniu depolimeryzacji mikrotubul w dimeryczne podjednostki tubuliny, co skutkuje zahamowaniem mitozy poprzez stabilizację wrzeciona podziałowego. Prowadzi to do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G2/M i w efekcie śmierci komórki na drodze apoptozy. WiąŜą się one preferencyjnie do N-końca β-tubuliny, a takŝe do aminokwasów w pozycji [10]. Związki te mogą mieć równieŝ drugorzędowe miejsca wiązania do mikrotubul lub nawet do innych białek występujących w komórce, przez co wytwarzany jest kompleks, który moŝe oddziaływać na róŝne procesy komórkowe i podtrzymywać synergizm niektórych kombinacji leków [11]. Badania przedkliniczne i kliniczne dowiodły, Ŝe substancje wiąŝące mikrotubule ingerują takŝe w proces angiogenezy przyczyniając się pośrednio do śmierci komórek nowotworowych. Proces neowaskularyzacji polega na tworzeniu połączeń kapilarnych i sieci naczyń krwionośnych komórek nowotworowych z otoczeniem. Przebiega on w kilku etapach, zaczynając od proteolitycznej degradacji błony podstawnej otaczających komórek, migracji komórek śródbłonka z istniejących juŝ naczyń do macierzy zewnątrzkomórkowej, namnaŝanie tych komórek w nowym miejscu, kończąc na organizacji i morfogenezie nowych struktur przypominających naczynia włosowate [12]. In vitro, MBDs wykazują zdolność do blokowania angiogenezy, w tym migracji i adhezji komórek śródbłonka. Podobne działanie wykazują in vivo, gdzie indukują powaŝne zmiany w morfologii nowo tworzonych włosowatych naczyń krwionośnych guza. Dochodzi do zwiększenia przepuszczalności tych naczyń, a w konsekwencji moŝe powodować blisko całkowite zatrzymanie się angiogenezy. Dokładny mechanizm tej aktywności jest jednak nadal badany [13]. Mikrotubule uczestniczą takŝe w przekazywaniu sygnałów w komórce, więc związki wiąŝące się z mikrotubulami mogą przyczyniać się do hamowania przekaźnictwa w komórkach i w konsekwencji do ich śmierci. Przykładem moŝe być wpływ MSA na transkrypcję naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF, ang. Vascular Endothelial Growth Factor). Regulatorem aktywacji transkrypcji VEGF jest czynnik transkrypcyjny, HIF-1 (ang. Hypoxia-Inducible Factor 1), który występuje w postaci heterodimeru złoŝonego z podjednostki HIF-1α i HIF-1β. W obrębie promotora genu VEGF, łączy się on z innym czynnikiem, zwanym HRE (ang. Hypoxia Responce Element) [14]. Serynowo-treoninowa kinaza Akt, nazywana takŝe kinazą białkową B (PKB, ang. Protein Kinase B), moŝe pośrednio wpływać na

4 66 A. Rogalska i wsp. ekspresję podjednostki HIF-1α (aktywowanej w warunkach hipoksji przez MSA) lub prowadzić do zmniejszania jej poziomu poprzez blokowanie importu tego peptydu do jądra [8]. Dysregulacja aktywności kinaz jest częstą przyczyną chorób nowotworowych. Biorą one udział w międzykomórkowym przekazywaniu sygnałów oraz w regulacji procesów związanych ze wzrostem, przeŝyciem czy proliferacją komórek. Jedną z kinaz istotnych w procesie angiogenezy jest cytoplazmatyczna kinaza ogniskowo-adhezyjna FAK (ang. Focal Adhesion Kinase), którą zlokalizowano w komórkach wytwarzających połączenia z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM, ang. Extracellular Matrix) lub z innymi komórkami. Nadrzędną funkcją FAK jest przekazywanie sygnału pochodzącego z receptorów integrynowych, biorących udział w adhezji, do wewnątrzkomórkowej kaskady białek [15]. Okazało się, Ŝe MSA blokują aktywację integryny poprzez zahamowanie jej szlaku sygnałowego FAK-paksylina- Akt. CHARAKTERYSTYKA NOWYCH ZWIĄZKÓW STABILIZUJĄCYCH MIKROTUBULE W tabeli 1 przedstawiono przykłady najnowszych związków stabilizujących mikrotubule, wykazujących aktywność przeciwnowotworową, pozyskiwanych z organizmów morskich. Tabela 1. Leki wiąŝące się do tubuliny [wg 16] Table 1. Microtubule binding agents [based on 16] Pochodzenie Lek Gatunek Gąbki morskie Diskodermolidy Diktiostatyna Halichondryny Laulimalidy Myklamidy Peloruzyd Zampanolidy Fascinospongia rimosa Korale Eleuterobiny Sarcodictyny Discoderma dissolute Spongia (marine sponge) Halichondria okadai Hyattella sp. and Fasciospongia rimosa (marine sponges) Mycale sp. Mycale hentscheli (marine sponge) Eleutherobia sp. (soft coral) Sarcodictyon roseum (soft coral) DISKODERMOLIDY Ryc. 2. Ogólna budowa chemiczna diskodermolidów [wg 4]. Fig. 2. Chemical structure of discodermolides [based on 4]. Diskodermolidy (ang. Discodermolides) to grupa związków wyizolowana z ekstraktu gąbek karaibskich Discodermia dissoluta, o aktywności immunosupresyjnej i stabilizującej mikrotubule (Ryc. 2). Cząsteczka leku nie posiada wprawdzie struktury pierścieni zamkniętych, mimo to wiąŝe się w tym samym miejscu podjednostki β-tubuliny, bądź znacząco nachodzi na to miejsce, co inne MSA. Pofałdowanie łańcucha tubuliny pasuje do układów pierścieniowych rdzenia, a grupy funkcyjne lub pierścienie

5 Nowe związki stabilizujące mikrotubule 67 laktonowe przy C19 naśladują łańcuchy boczne [17]. Diskodermolidy występują w postaci dwóch enancjomerów, róŝniących się połoŝeniem grup hydroksylowych. Obie struktury hamują proliferację komórek, jednak mechanizmy ich działania są odmienne. Enancjomer +, będący naturalnym produktem pozyskiwanym z gąbek powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G2/M, podczas gdy jego syntetyczny odpowiednik enancjomer - blokuje cykl w fazie S. Wszelkie zmiany w składzie chemicznym związku powodują znaczące zmiany równieŝ w jego właściwościach. Acetylacja w pozycji C17 pierścienia powoduje istotny wzrost cytotoksyczności leku [17]. Związki te wykazują istotnie większą aktywność przeciwnowotworową niŝ paklitaksel (PTX, ang. Paclitaxel) w komórkach z MDR, ale z drugiej strony jest ona mniejsza od efektów działania epotilonów. W komórkach gruczolakoraka płuc A549-T12 (ang. Human Lung Carcinoma Cell Line) indukują zmiany w ekspresji jednej z izoform β-tubuliny w przeciwieństwie do epotilonów czy eleuterobinów [7]. Dodatkowo, diskodermolidy inicjują montaŝ mikrotubul bez udziału GTP i białek MAPs, co powoduje powstanie agregatów mikrotubul. Miejsca wiązania na protofilamentach są konkurencyjne dla PTX. Po podaniu leku, zachodzi natychmiastowe tworzenie się skupisk tubuliny krótszych niŝ po działaniu paklitakselu, co dowiedziono za pomocą spektroskopii elektronowej. Agregaty te preferencyjnie lokują się w obszarach obwodowych komórki [17]. Badania Gunasekera i wsp. (2001) dowodzą antyproliferacyjnej aktywności wielu acetylowanych pochodnych diskodermolidów na mysie komórki białaczki P388. Najefektywniejszą okazała się być pochodna z dwoma acetylowanymi grupami hydroksylowymi przy C3 i C7 cząsteczki leku, powodując 47-krotny wzrost aktywności, przy IC nm [18]. Diskodermolidy zostały początkowo odrzucone w pierwszej fazie badań klinicznych ze względu na wysoką toksyczność dla płuc, jednak dostępne technologie pozwalające zmodyfikować skład chemiczny bądź strukturę cząsteczki, mogą być skuteczne w pokonaniu tej bariery [19]. DIKTIOSTATYNA Bliskim krewnym diskodermolidów jest diktiostatyna (ang. Dictyostatin), która równieŝ została pozyskana z gąbek Spongin sp. Cząsteczka tego leku zbudowana jest z 26-węglowego łańcucha w tym 22 atomy tworzą pierścień laktamowy z grupą karboksylową przy C1 (Ryc. 3) [20]. Mechanizmy działania tego związku jest bardzo podobny do taksolu: łączy się z zewnętrzną stroną β-tubuliny. W przeciwieństwie jednak do taksanów jest słabym substratem dla transportera ABCB1 (ang. ATP-Binding Cassette sub-family B member 1) i moŝe być stosowana u pacjentów opornych na paklitaksel [4]. Ryc. 3. Wzór strukturalny cząsteczki diktiostatyny [wg 4]. Fig. 3. Chemical formula of dictiostatin [based on 4]. Naukowcy, modyfikując strukturę chemiczną cząsteczki leku, badali właściwości cytotoksyczne nowych pochodnych. Wykazano, Ŝe w aktywności antyproliferacyjnej uzyskiwanych związków największe znaczenie miały podstawniki przy C4 i C5 [4]. Zsyntetyzowano takŝe 16-desmethyl-25,26- dihydrodictyostatins, która działała jak białka związane z mikrotubulami, ale nie wykazywała aktywno-

6 68 A. Rogalska i wsp. ści w komórkach opornych na paklitaksel. Vollmer i wsp., 2011 [21] dokonywali takŝe modyfikacji w pozycjach C25-C26. Uzyskano w ten sposób między innymi analogi: 25,26-dihydrodiktiostatynę oraz 6-epi-25,26-dihydrodiktiostatynę. Obie pochodne powodowały zatrzymanie cyklu komórkowego, hamowały wzrost komórek opornych na paklitaksel i epotilon B (EpoB, ang. Epothilone B), działały synergistycznie z paklitakselem w linii raka piersi MDA-MB-231 (ang. Breast Cancer Cell Line) oraz wykazywały charakter antyangiogenny w przypadku transgenicznej larwy Danio pręgowanego (słodkowodna ryba z rodziny karpiowatych) [21]. HALICHONDRYNY Po raz pierwszy grupa tych związków, w tym halichondryna B (ang. Halichondrins), została wyizolowana z japońskiej gąbki Halichondira okadai. W późniejszym czasie otrzymano kolejne naturalne produkty z gąbek takich jak: Lissodendoryx sp., Phakellia carteri, Axinella sp. Halichondryna B ma budowę duŝego, polieterowego makrolitu (Ryc. 4A). Zatrzymuje ona cykl komórkowy w fazie G2/M, co skłoniło naukowców do jego syntezy w warunkach laboratoryjnych. Pierwsze udane próby odbyły się w 1990 roku. W toku zmian grup funkcyjnych oraz zmian konformacyjnych halichondryny B, stworzono związek o potencjalnie leczniczych właściwościach E7389 (eribulinę) (ang. Eribulin) (Ryc. 4B) [22]. A. Halichondryna B B. E7389 (Eribulina) Ryc. 4. Budowa chemiczna halichondryny B (A) i jej syntetycznej pochodnej - E7389 (B) [wg 22]. Fig. 4. Chemical structure of halichondrin B (A) and its derivative E7389 (B) [based on 22].

7 Nowe związki stabilizujące mikrotubule 69 Prowadzono badania kliniczne obejmujące 71 kobiet z rakiem piersi, którym wdroŝono intensywne leczenie E7389. Efekty leczenia zaobserwowano u 65 kobiet natomiast u 10 poprawa trwała zaledwie od 4 do 11 miesięcy. U niektórych zaobserwowano odpowiedź na działanie leku dopiero po roku. Obiecującym faktem jest teŝ zmniejszenie efektów ubocznych chemioterapii z zastosowaniem E7389 ze strony układu Ŝołądkowo-jelitowego oraz nerwowego tj. uczucia mrowienia w palcach dłoni i stóp w porównaniu do Halichondryny B [23]. Kolejne badania dowiodły, Ŝe eliburina hamuje polimeryzację mikrotubul poprzez tworzenie się agregatów tubuliny, przez co zaburza działanie wrzeciona kariokinetycznego. Ma takŝe ma specyficzny sposób oddziaływania z tubuliną, a mianowicie powoduje alkilowanie i sieciowanie tubuliny. Dokładny mechanizm działania tego związku nie został jeszcze poznany. Analog ten był aktywny w komórkach raka piersi linii MCF-7 (ang. Breast Cancer Cell Line). Powodował niestabilność mikrotubul w interfazie, inicjował apoptozę. Tworzył takŝe skupiska tubuliny, ale w odróŝnieniu od Epotilonu B czy diskodermolidów, nie powodował skracania mikrotubul. UwaŜa się, iŝ skupiska utworzone zostały z połączenia leku z tubuliną na jej końcach oraz z połączeń cząsteczek samego leku [24]. Eksperymenty dotyczące wpływu halichondryny na angiogenezę ujawniły, Ŝe związek ten hamuje aktywność śródbłonkowego czynnika wzrostu od 25 do 50-krotnie intensywniej aniŝeli E7389 [25]. Prowadzono równieŝ badania nad E7389 dotyczące zmiany polarności błony komórkowej na linii chłoniaka U937 (ang. Human Leukemic Monocyte Lymphoma Cell Line). Jednym z wczesnych stadiów apoptozy jest utrata polarności błony, spowodowana translokacją cząsteczek fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej monowarstwy lipidowej. Utrata integralności błony komórkowej jest wynikiem dalszych stadiów apoptozy bądź nekrozy. Badania prowadzone przy uŝyciu między innymi aneksyny V pozwoliły zaobserwować w komórkach chłoniaka po dodaniu E7389 wczesne oraz późne fazy apoptozy w wyniku aktywacji kaspazy 3 i 9 [26]. LAULIMALIDY Do tej klasy zalicza się laulimalid (ang. Laumalide) oraz izolaulimalid (ang. Isolaumalide), które zostały pozyskane z ekstraktu lipofilowego pochodzącego z gąbek morskich Cacospongia mycofijiensis, Ŝyjących w Oceanie Spokojnym (Ryc. 5). WiąŜą się one do α-tubuliny [27]. Działanie ich podobne jest do działania paklitakselu, epotilonów oraz diskodermolidów. Przejawiają aktywność w komórkach z nadekspresją glikoproteiny-p, czego się nie obserwuje w przypadku taksanów [17]. Przeprowadzone eksperymenty potwierdzają, iŝ oba związki są duŝo bardziej aktywne niŝ pakliatksel w komórkach raka Ryc. 5. Budowa laulimalidu [wg 17]. Fig. 5. Structure of laulimalide [based on 17]. jajnika SKVLB-1 (ang. Drug-Resistant Human Ovarian Carcinoma Cell Line), z MDR [28]. Są takŝe cytotoksyczne w komórkach nowotworowych opornych na działanie PTX oraz epotilonów [10]. W komórkach linii A-10 mięśni gładkich aorty szczura (ang. Rat Aortic Smooth Muscle Cell Line) laulimalid w stęŝeniu 2 µm powoduje tworzenie się pęczków mikrotubul w cytoplazmie, natomiast stęŝenie 20 µm inicjuje tworzenie się skupisk mikrotubul z krótkimi protofilamentami, które preferencyjnie układają się

8 70 A. Rogalska i wsp. przy peryferycznych regionach komórki i powstają niezaleŝnie od MTOC. Laulimalid w komórkach raka piersi MDA-MB-435 (ang. Breast Cancer Cell Line) po 9 godzinach inkubacji powodował zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G2/M. Nietypowe struktury mikrotubul zaobserwowano takŝe w komórkach raka jajnika linii SK-OV3 (ang. Ovarian Carcinoma Cell Line) oraz A-10 po inkubacji z laulimalidem i izolaulimalidem. Kształt skupisk był okrągły, przypominały one zwoje i pojawiały się w centrum komórki. Związki te mają zdolność do pobudzenia szlaku apoptotycznego z udziałem kaspazy 3, co prowadzi do aktywacji białek p17 i p12 [28]. Apoptoza jest teŝ wywoływana przez inicjację fosforylacji białka Bcl-2 (ang. B-cell lymphoma 2) przez ten lek [29]. Innym działaniem laulimalidu na komórki nowotworowych jest zaburzenie przekaźnictwa wewnątrzkomórkowego na szlaku regulowanym przez białko Hsp90, dotyczącego migracji i adhezji komórek. Zaobserwowano utratę interakcji Hsp90 (ang. Heat Shock Protein 90) z kinazą FAK i VEGFR-2 (ang. Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) [30]. Ich biologiczna aktywność polega równieŝ na blokadzie fosforylacji paksyliny, która bierze udział w działaniu kinaz białkowych odpowiedzialnych są za przekazywanie sygnałów z receptorów integrynowych do wewnątrzkomórkowych białek [13]. MYKLAMIDY Myklamid A (ang. Myclamide A) wyizolowano z gąbki Mycale sp. w okolicach Nowej Zelandii w 1988 roku. Pochodną - myklamid C ze Stylinos sp. Myklamid A jest inhibitorem translacji i proliferacji komórek (IC nm) [3]. Myklamid B z trzema oksymetylowymi grupami zamiast dwóch ma silniejsze działanie cytotoksyczne w przeciwieństwie do myklamidu D z jedną oksymetylową grupą, która jednocześnie przyczynia się do wzrostu polarności analogu i utrudnia przenikanie leku do komórki [31] (Ryc. 6). Syntetyczny analog myklamidów: 18-O-methyl mycalamide B miał słabsze działanie niŝ myklamid A i hamował wbudowywanie [125I]-uridyny i [3H]-leucyny do RNA i białek badanych linii komórkowych. Ryc. 6. Struktura chemiczna myklamidów [wg 3]. Fig. 6. Chemical structure of myclamides [based on 3]. Badania wykazały, Ŝe myklamid A i B zwiększały przeŝywalność myszy z chłoniakiem P388 (ang. Murine Leukemia Cell Line) [32]. Pomimo pozytywnych wyników dalszych badań in vivo nie podjęto.

9 Nowe związki stabilizujące mikrotubule 71 PELORUZYD Peloruzyd A (ang. Peloruside A) to związek pochodzący z ekstraktu gąbek Mycale hentscheli. Tak jak inne MSAs, charakteryzuje się strukturą pierścieniową, makrolaktamową, z układami łańcuchów bocznych i podstawników (Ryc. 7). Drugą pochodną z tej grupy jest peloruzyd B (ang. Peloruside B), który przejawia takie same właściwości cytotoksyczne jak peloruzyd A. Jednak wyjściowym związkiem uŝywanym w badaniach jest enancjomer (+) peloruzydu A [33]. Ryc. 7. Enencjomer (+) peloruzydu A budowa chemiczna [wg 33]. Fig. 7. Enantiomer (+) of peloruside A chemical formula [based on 33]. Wykazano, iŝ jego mechanizm działania polega na oddziaływaniu cząsteczek tego leku z tubuliną w tym samym miejscu co laulimalidy, bądź w miejscu tuŝ obok tego rejonu, ale na niego zachodzącym [11]. Udowodniono równieŝ, Ŝe uŝycie tego związku powoduje blok w fazie G2/M cyklu komórkowego. Jest on aktywny w kulturach makrofagów pochodzących ze szpiku (ang. Bone Marrow-Derived Macrophage) (BMMR) opornych na działanie PTX. W dodatku komórki poddawane działaniu peloruzydu wchodziły na drogę apoptozy [34]. Podobne badania prowadzono na linii białaczkowej HL-60 (ang. Human Promyelocytic Leukemia Cell Line), gdzie indukowanie apoptozy miało miejsce na drodze interakcji z czynnikiem transkrypcyjnym c-myc i białkiem p53 [11]. Był on 10-ktotnie słabszym inhibitorem proliferacji chłoniaka P388 niŝ poprzednio wykryte pochodne z Mycale hentscheli tj. myklamid A i pateamina (IC 50 =18 nm) [31]. Inne badania potwierdzają, Ŝe IC 50 peloruzydu A jest rzędu 6-18 nm w linii komórkowej raka płuc: H441 (ang. Human Lung Adenocarcinoma Epithelial Cell Line), komórek neuroblastomy SH-SY5Y (ang. Human Neuroblastoma Cell Line) i komórek chłoniaka P388 [35]. Peloruzyd A podobnie jak inne MSA hamuje dynamiczność mikrotubul w stęŝeniu bliskim blokowaniu progresji komórek na drodze cyklu komórkowego, ale niŝszym niŝ stęŝenie potrzebne in vitro do montaŝu tubuliny. Ponadto znacząco redukuje on wzrost i skracanie mikrotubul w interfazie komórek, poprzez co hamuje całkowitą dynamiczności mikrotubul [36]. Związek ten jest lepiej rozpuszczalny niŝ paklitaksel i skuteczny w komórkach z opornością wielolekową. Ponadto prowadzone są równieŝ badania nad zastosowaniem peloruzydu A w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych jak Alzheimer czy stwardnienie rozsiane (autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia w modelu mysim). Pierwsza faza badań klinicznych w leczeniu raka została przerwana ze względu na brak stałych dostaw gąbek. Kultury gąbek zostały zniszczone przez ślimaki. Niemniej jednak udało się juŝ zsyntetyzować peloruzyd A i B, C i D [33, 37] co pozwoli na wznowienie badań klinicznych. ZAMPANOLIDY Zampanolid (ang. Zampanolide) to związek wyizolowany po raz pierwszy z gąbki Fasciospongia rimosa znalezionej na Okinawie. Po raz pierwszy opisany był w 1996 roku przez Tanaka i Higawa w Japonii [38] (Ryc. 8). W roku 2009 roku znaleziono go takŝe w gąbce Cacospongi mycofijirnsis, z której wyizolowano juŝ takie związki jak: laulimalid i izolaulimalid naleŝące do MSAs, latrunkulinę

10 72 A. Rogalska i wsp. Ryc. 8. Zampanolid Fig. 8. Zampanolide A, która destabilizuje aktynę, dendrolazynę, która posiada właściwości feromonu, a takŝe mykotiazol o nieznanym mechanizmie działania. Jest to 20-członowy makrolid o słabych właściwościach hamujących wzrost komórek. Blokuje on cykl komórkowy w fazie G2/M. Stabilizuje wiązania mikrotubul w interfazie i indukuje powstawanie mikrojąder w czasie podziału mitotycznego. Komórki traktowane zampanolidem zwiększają swoją objętość 2,7 raza. Nadekspresja glikoproteiny p (P-gp, ang. P- glycoprotein) w komórkach nie wpływa na skuteczność jego działania, co pozwala przypuszczać, Ŝe będzie bardzo skuteczny w komórkach opornych na działanie dostępnych leków, takich jak np. taksany [39]. Badania potwierdziły, Ŝe komórki raka jajnika oporne na paklitaksel wykazują 100% wraŝliwości na zampanolid [40]. ELEUTEROBINY Eleuterobiny (ang. Eleutherobines) wyizolowane zostały ze zwierząt morskich Eleutherobia species - miękkich korali, Ŝyjących w Oceanie Indyjskim (Ryc. 9). Te glikozylowane diterpeny są cytotoksyczne dla komórek i hamują cykl i podziały komórkowe [41]. Jak wszystkie związki z tej grupy stabili- Ryc. 9. Struktura chemiczna eleuterobiny A [wg 42]. Fig. 9. Chemical structure of eleutherbine A [based on 42]. zują mikrotubule [17]. Znane są dwa analogi tych związków eleuterobina A i B. Są substratami dla glikoproteiny-p, poprzez co są mało toksyczne w komórkach wraŝliwych na paklitaksel [7]. Inne badania z kolei donoszą, Ŝe mechanizm działania tego związku w komórkach opornych na taksany polega na tworzeniu mutacji w podjednostkach β-tubuliny. Jego aktywność badano na ludzkiej linii komórek raka okręŝnicy HCT116 (ang. Colon Cancer Cell Line), gdzie wykazano, Ŝe cytotoksyczność jest podobna do paklitakselu. Tę samą sublinię komórek z MDR, ze 100-krotnie większą opornością, wykorzystano do

11 Nowe związki stabilizujące mikrotubule 73 zbadania działania tego leku na komórki z nadekspresją P-gp. W badaniach tych eleuterobina była o 50% skuteczniejsza niŝ PTX [41]. Przeprowadzono teŝ doświadczenie, polegające na inkubacji komórek HCT116 z róŝnymi stęŝeniami eleuterobiny. Okazało się, Ŝe po 4h w stęŝeniu IC 50 = 25 nm, komórki znajdowały się w stadium bloku mitotycznego, podczas gdy niŝsze stęŝenia leku tj. 3 nm i 10 nm powodowały powstanie mikrojąder. Przy stęŝeniach stosunkowo wysokich, bo 1µM i 5 µm, obecne były pęczki mikrotubul. Stwierdzono takŝe, Ŝe eleuterobin ma nieco mniejsze powinowactwo do mikrotubul, które są związane z białkami MAPs [10]. SARKODIKTYNY Sarkodiktyny (ang. Sarcodictyins) pod względem chemicznym, mają bardzo zbliŝoną budowę do eleuterobinów (Ryc. 10). Posiadają pierścieniowy trzon, który ma jeden bądź dwa łańcuchy boczne. Łańcuchy te, posiadające od 2 do 4 atomów węgla, warunkują połączenie całej cząsteczki z pierścieniem aromatycznym. Taka budowa wydaje się być znacząca w oddziaływaniu MSA z podjednostkami β- tubuliny. Sarkodiktyny zostały wyizolowane równieŝ ze zwierząt morskich Sarcodictyon roseum i wyróŝniamy w tej grupie dwa związki: sarkodiktynę A oraz B [17]. Ryc. 10. Wzór strukturalny sarkodiktyny A [wg 17]. Fig. 10. Chemical formula of sarcodictine A [based on 17]. Oddziałują one z mikrotubulami stabilizując je, jednak nie przejawiają aktywności w komórkach z nadekspresją P-gp, a ich działanie antyproliferacyjne jest najniŝsze ze wszystkich poznanych dotąd MSA [7]. SYNERGIZM ZWIĄZKÓW STABILIZUJĄCYCH MIKROTUBULE Związki stabilizujące mikrotubule (MSAs) dzielą się na dwie grupy w zaleŝności od ich miejsca wiązania na mikrotubulach. Do pierwszej grupy naleŝy paklitaksel i jego biomimetyki (m.in. docetaksel, epotilony, diskodermolidy, diktiostatyna). Leki te wiąŝą się do jednego z dwóch miejsc na wewnętrznej stronie podjednostki β-tubuliny lub w tzw. porze mikrotubuli (zewnętrzna strona, między podjednostka α i β heterodimerów). Do drugiej grupy związków stabilizujących mikrotubule naleŝą laulimalidy czy peloruzyd, których miejsce wiązania się tubuliny nie było długo określone. Dopiero w 2008 roku Huzil i wsp. [43] zaproponowali mechanizm wyjaśniający działanie peloruzydu A i określili dokładnie miejsce jego przyłączenia do tubuliny. Z ich badań wynikało, Ŝe pochodne taksanów wchodzą w reakcję z regionem βh7, który leŝy naprzeciwko pętli T5 w niezmiennym regionie łączącym nukleotydy, podczas gdy peloruzyd A łączy się z pętlą H9-S8 równieŝ leŝącą naprzeciwko pętli T5 [43] (Ryc. 11). Z kolei Nguyen i wsp. (2010) [44], radioaktywnie wyznakowali peloruzyd A, aby jeszcze dokładniej wyznaczyć miejsce przyłączenia się analogu do tubuliny za pomocą wiązań wodorowych. Ich badania potwierdziły, Ŝe peloruzyd A i laulimalid wiąŝą się do tego samego miejsca na β-tubulinie i potwierdziły silniejsze cytotoksyczne działanie laulimalidu [44].

12 74 A. Rogalska i wsp. Ryc. 11. Miejsca wiązania peloruzydu A oraz taksolu w podjednostce β tubuliny [44, zmodyfikowany]. Fig. 11. Locations of binding peloruside A and taxol into β subunit of tubulin [based on 44, modified]. Podjęto próby określenia skuteczność połączonego działania dwóch związków oddziałujących z mikrotubulami. Wysunięto hipotezę, Ŝe synergistyczne działanie będą wykazywały te związki, które mają róŝne miejsca wiązania na tubulinie. Z kolei leki, które konkurują o miejsce na protofilamencie, nie mogą być skuteczne [11]. Wyniki badań potwierdziły postawioną tezę. Zaobserwowano brak synergizmu między peloruzydem A a diskodermolidem w komórkach linii raka jajnika 1A9 (ang. Human Ovarian Tumor Cell Line). Natomiast po potraktowaniu tej samej linii komórkowej paklitakselem oraz diskodermolidem współdziałanie leków zostało zauwaŝone. Ciekawym spostrzeŝeniem było to, iŝ brak było synergizmu w przypadku uŝycia tej samej linii komórkowej oraz paklitakselu i peloruzydu A [45, 46]. PODSUMOWANIE Ostatnie lata przyniosły odkrycie znacznej liczby nowych związków stabilizujących mikrotubule, wiele ich analogów zsyntetyzowano równieŝ w warunkach laboratoryjnych. Obecnie zaś naleŝy większy nacisk połoŝyć na poznanie mechanizmów ich działania. Naturalne związki stabilizujące mikrotubule (MSA, ang. Microtubule-Stabilizing Agents), pozyskiwane z gąbek morskich oraz korali, wydają się być jedną z bardziej obiecujących grup chemioterapeutyków uŝywanych w terapii przeciwnowotworowej. PIŚMIENNICTWO 1. Napolitano JG, Daranas AH, Norte M, Fernández JJ: Marine Macrolides, A promising source of antitumor compounds. anticancer agents. Med. Chem. 2009, 9: Blunt JW, Copp BR, Hu WP, Munro MHG, Northcote PT, Prinsep MR: Marine natural products. Nat. Prod. Rep. 2009, 26: Miller JH, Singh AJ, Northcote PT: Microtubule-stabilizing drugs from Marine sponges: focus on Peloruside A and Zampanolide. Mar. Drugs. 2010, 8: Paterson I, Naylor GJ, Gardner NM, Guzman E, Wright AE: Total synthesis and biological evaluation of a series of macrocyclic hybrids and analogues of the antimitotic natural products Dictyostatin, Discodermolide and Taxol. Chem. Asian J. 2011, 6: Fojo T, Menefee M: Mechanisms Of Multidrug Resistance: The potential role of microtubule-stabilizing agents. Ann. Oncol. 2007, 18: Perez EA: Microtubule inhibitors: differentiating tubulin-inhibiting agents based on mechanisms of action, clinical activity and resistance. Mol. Cancer Ther. 2009, 8:

13 Nowe związki stabilizujące mikrotubule Altmann KH: Microtubule-stabilizing agents: a growing class of important anticancer drugs. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001,5: Bley CR, Orlowski K, Furmanova P, McSheehy PMJ, Pruschy M: Regulation of VEGF-expression by patupilone and ionizing radiation in lung adenocarcinoma cells. Lung Cancer. 2011, Rogalska A, Marczak A, Szwed M, Gajek A, Jóźwiak Z: Epotilony-nadzieja dla pacjentów niewraŝliwych na leczenie taksanami. Współczesna Onkologia. 2010, 14: Kingston DGI: Tubulin-interactive natural products as anticancer agents. J. Nat. Prod. 2009, 72: Wilmes A, O Sullivan D, Chan A, Chandrahasen C, Paterson I, Northcote PT i wsp.: Synergistic interactions between Peloruside A and other microtubule-stabilizing and destabilizing agents in cultured human ovarian carcinoma cells and murine T Cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 2010, 10: Jin SW, Patterson C: The Opening Act: Vasculogenesis and the origins of circulation. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009, 29: Schwartz EL: Antivascular actions of microtubule-binding drugs. Clin. Cancer Res. 2009, 15: Krześlak A: Kinaza Akt: Kluczowy regulator metabolizmu i progresji nowotworów. Postepy Hig. Med. Dosw. 2010, 64: Totoń E, Rybczyńska M: Charakterystyka białka FAK i jego rola w procesie nowotworzenia. Postepy Hig. Med. Dosw. 2007, 61: Stanton RA, Gernert KM, Nettles JH, Aneja R: Drugs that target dynamic microtubules: a new molecular perspective. Med. Res. Rev. 2011, 31: He L, Orr GA, Horwitz SB: Novel molecules that interact with microtubules and have functional activity similar to Taxol. Drug Discov Today. 2001, 6: Gunasekera SP, Longley RE, Isbrucker RA: Acetylated analogues of the microtubule-stabilizing agent Discodermolide: preparation and biological activity. J. Nat. Prod. 2001, 64: Risinger AL, Jackson EM, Polin EA, Helms GL, LeBoeuf DA, Joe PA i wsp.: The Taccalonolides: Microtubule stabilizers that circumvent clinically relevant Taxane resistance mechanisms. Cancer Res. 2008, 68: Shin Y, Fournier JH, Brückner A, Madiraju C, Balachandran R, Raccor BS i wsp.: Synthesis and biological evaluation of ( )-dictyostatin and stereoisomers. Tetrahedron. 2007, 27: Vollmer LL, Jiménez M, Camarco DP, Zhu W, Daghestani HN, Balachandran R I wsp.: A simplified synthesis of novel Dictyostatin analogues with in vitro activity against Epothilone B resistant cells and antiangiogenic activity in zebrafish embryos. Mol. Cancer Ther. 2011, 10: Simmons TL, Andrianasolo E, McPhail K, Flatt P, Gerwick WH: Marine natural products as anticancer drugs. Mol. Cancer Ther. 2005, 4: O Hanlon LH: Scientists are searching the seas for cancer drugs. J. Natl. Cancer Inst. 2006, 98: Jordan MA, Kamath K, Manna T, Okouneva T, Miller HP, Davis C i wsp.: The primary antimitotic mechanism of action of the synthetic Halichondrin E7389 is suppression of microtubule growth. Mol. Cancer Ther. 2005, 4: Dabydeen DA, Burnett JC, Bai R, Verdier-Pinard P, Hickford SJH, Pettit GR i wsp.: Comparison of the activities of the truncated Halichondrin B Analog NSC (E7389) with those of the parent compound and a proposed binding site on tubulin. Mol. Pharmacol. 2006, 70: Kuznetsov G, Towle MJ, Cheng H, Kawamura T, TenDyke K, Liu D i wsp.: Induction of morphological and biochemical apoptosis following prolonged mitotic blockage by Halichondrin B macrocyclic ketone analog E7389. Cancer Res. 2004, 64: Liu J, Towle MJ, Cheng H, Saxton P, Reardon C, Wu J i wsp.: In vitro and in vivo anticancer activities of synthetic (-)- laulimalide, a marine natural product microtubule stabilizing agent. Anticancer Res. 2007, 27: Mooberry SL, Tien G, Hernandez AH, Plubrukarn A, Davidson BS: Laulimalide and isolaulimalide, new Paclitaxel-like microtubule-stabilizing agents. Cancer Res. 1999, 59: Mooberry SL, Randall-Hlubek DA, Leal RM, Hegde SG, Hubbard RD, Zhang L i wsp.: Microtubule-stabilizing agents based on designed Laulimalide analogues. PNAS. 2004, 101: Lu H, Murtagh J, Schwartz EL: The microtubule binding drug Laulimalide inhibits vascular-endothelial growth factorinduced human endothelial cell migration and is synergistic when combined with Docetaxel (Taxotere). Mol. Pharmacol. 2006, 69: West LM; Northcote PT, Hood KA, Miller JH, Page MJ: Mycalamide D, a new cytotoxic amide from The New Zealand marine sponge Mycale species. J. Nat. Prod. 2000, 63: Burres, NS, Clement JJ: Antitumor activity and mechanism of action of the novel Marine natural products Mycalamide-A and -B and onnamide. Cancer Res. 1989, 49: Williams DR, Nag PP, Zorn N: Strategies For The synthesis of the novel antitumor agent Peloruside A. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2008, 11: Crume KP, Miller JH, La Flamme AC: Peloruside A, an antimitotic agent, specifically decreases tumor necrosis factor-a production by lipopolysaccharide-stimulated murine macrophages. Exp. Biol. Med. 2007, 232: Hoye TR, Jeon J, Kopel LC, Ryba TD, Tennakoon MA, Wang Y: Total synthesis of Peloruside A through kinetic lactonization and relay ring-closing metathesis cyclization reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2010, 49:

14 76 A. Rogalska i wsp. 36. Chan A, Andreae P, Northcote PT, Miller JH: Peloruside A inhibits microtubule dynamics in a breast cancer cell line MCF7. Invest. New Drugs. 2010, 29: Singh AJ, Xu CX, Xu, X, West LM, Wilmes A, Chan A i wsp.: Peloruside B, a potent antitumor macrolide from The New Zealand marine sponge Mycale hentscheli: isolation, structure, total synthesis and bioactivity. J. Org. Chem. 2010, 75: Tanaka J, Higa T: Zampanolide, A new cytotoxic macrolide from a marine sponge. Tetrahedron Lett. 1996, 37: Field JJ, Singh AJ, Kanakkanthara A, Halafihi T, Northcote PT, Miller JH: Microtubule-stabilizing activity of Zampanolide, a potent macrolide isolated from the tongan marine sponge Cacospongia mycofijiensis. J. Med. Chem. 2009, 52: Parekh H, Wiesen K, Simpkins H: Acquisition of Taxol resistance via P-glycoprotein- and non-p-glycoprotein-mediated mechanisms in human ovarian carcinoma cells. Biochem. Pharmacol. 1997, 53: Long BH, Carboni JM, Wasserman AJ, Cornell LA, Casazza AM, Jensen PR i wsp.: Polymerization, is similar to Paclitaxel (Taxol) Eleutherobin, a novel cytotoxic agent that induces tubulin. Cancer Res. 1998, 58: Nicolaou KC, Chen JS, Dalby SM: From nature to the laboratory and into the clinic. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17: Huzil JT, Chik JK, Slysz GW, Freedman H, Tuszynski J, Taylor RE i wsp.: A unique mode of microtubule stabilization induced by Peloruside A. J. Mol. Biol. 2008, 378: Nguyen TL, Xu X, Gussio R, Ghosh AK, Hamel E: The assembly-inducing Laulimalide/Peloruside A binding site on tubulin: molecular modeling and biochemical studies with [³H] Peloruside A. J. Chem. Inf. Model. 2010, 50: Giannakakou P, Fojo T: Discodermolide: just another microtubule-stabilizing agent? No! A lesson in synergy. Clin. Cancer Res. 2000, 6: Canales A, Rodríguez-Salarichs J, Trigili C, Nieto L, Coderch C, Andreu JM i wsp.: Insights into the interaction of Discodermolide and Docetaxel with tubulin. mapping the binding sites of microtubule-stabilizing agents by using an integrated NMR and computational approach. ACS Chem Biol. 2011, 6: Autor do korespondencji: Agnieszka Marczak Katedra Termobiologii, Uniwersytet Łódzki aszwar@biol.uni.lodz.pl tel fax