MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SKANINGOWA w BIOLOGII

Transkrypt

1 Pracownia Mikroskopii Laboratory of Scanning Elektronowej Skaningowej Electron Microscopy Uniwersytet Śląski University of Silesia Wydział Biologii i Ochrony Faculty of Biology and Środowiska Environmental Protection ul. Jagiellońska 28 tel: (+48 32) Katowice jagna.karcz@us.edu.pl MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SKANINGOWA w BIOLOGII Jagna Karcz Katowice, 2009

2 I. Etapy przygotowania preparatów do badań w SEM UTRWALANIE GA (aldehyd glutarowy) PŁUKANIE - bufory fosforanowe OSMOWANIE - czterotlenek osmu ODWADNIANIE - szereg alkoholowy, acetonowy SUSZENIE W PUNKCIE KRYTYCZNYM (CPD) NAPYLANIE OBSERWACJA W SEM i ANALIZA OBRAZU 2

3 II. Przygotowanie materiału do obserwacji w SEM Mikroskopia elektronowa skaningowa w sposób istotny przyczynia się do lepszego poznania olbrzymiego bogactwa struktur komórkowych związanych przede wszystkim z powierzchnią komórki, jak również z jej zróżnicowanymi połączeniami z innymi komórkami, a także ze strukturami wewnątrzkomórkowymi. Stało się to możliwe, z jednej strony dzięki stale doskonalonej optyce elektronowej skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) oraz opracowaniu szeregu specyficznych metod przygotowania komórek, tkanek i narządów do badań w SEM. Metody przygotowania preparatu do obserwacji w mikroskopie skaningowym są zróżnicowane, zależne przede wszystkim od stopnia uwodnienia badanego obiektu. Obiekty twarde takie jak, zarodniki roślin, ziarna pyłku, nasiona, pokrywy chitynowe skorupiaków, aparaty gębowe owadów nie wymagają specyficznych metod przygotowania, gdyż nie zmieniają swojej naturalnej struktury i mogą być nawet bez napylania badane w SEM. Natomiast tkanki roślinne i zwierzęce o dużej zawartości wody wymagają odpowiednich metod przygotowania do badań w SEM tj. utrwalania, odwadniania i suszenia w celu uniknięcia artefaktów związanych z deformacją próbki w próżni mikroskopowej. 1. Utrwalanie i osmowanie W skaningowej mikroskopii elektronowej najczęściej stosowanymi utrwalaczami są: aldehyd glutarowy (GA) 1.5-3% r-r w 0.1 M buforze fosforanowym lub kakodylowym o ph= 7.2; czas utrwalania od 2-4h (max h) w temp. pokojowej lub w 4 C. Glutaraldehyd bardzo dobrze stabilizuje struktury białkowe, nie utrwala jednak lipidów. FAA (formaldehyd + kwas octowy lodowaty + alkohol etylowy 70%, 5:5:90); czas utrwalania co najmniej 24 h w temp. pokojowej czterotlenek osmu OsO 4, 1-2% r-r w buforze fosforanowym lub kakodylowym; czas utrwalania od 2-4h w 4 o C lub w temp. pokojowej pod dygestorium w ciemności. Utrwalacz ten dodatkowo utwardza tkanki. 2. Płukanie i odwadnianie Płukanie w buforze fosforanowym ma na celu usunięcie utrwalacza z tkanek. Proces odwadniania przeprowadza się we wzrastających stężeniach alkoholu etylowego lub acetonu (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%), a następnie w alkoholu absolutnym lub acetonie od min. 3. Suszenie w punkcie krytycznym (metoda CPD) Metoda CPD opiera się na wykorzystaniu zjawiska polegającego na tym, że w tzw. punkcie krytycznym dwutlenek węgla przechodzi ze stanu płynnego w gazowy, a procesowi temu nie towarzyszą siły zniekształcające. Uzyskuje się w ten sposób mniej artefaktów na powierzchni badanych próbek. 4. Napylanie Próbki pokrywa się złotem technicznym w napylarce prożniowej. Warstwa napylająca redukuje niekorzystny efekt związany ze skondensowaną wiązką elektronów w komorze mikroskopu oraz poprawia jakość uzyskanych obrazów. Czas napylania ustala się doświadczalnie. 3

4 III. Standardowa metoda SEM dla tkanek biologicznych Budowę obiektów roślinnych i zwierzęcych można obserwować w SEM po zastosowaniu odpowiednich metod przygotowawczych. W mikroskopie skaningowym możliwa jest obserwacja następujących rodzajów próbek: powierzchnie, przekroje poprzeczne, przekroje podłużne, wycinki tkanek lub narządów pochodzące z obiektów utrwalonych chemicznie, skrawanych ręcznie lub mikrotomowo. 1. Utrwalanie - 3% aldehyd glutarowy (utrwalacz redukcyjny) w 0.1 M buforze fosforanowym o ph=7.2 w temp. pokojowej lub w 0-4 o C (4-24h) 2. Płukanie w 0.1 M buforze fosforanowym o ph=7.2 (3 x 10min.) 3. Dotrwalanie w 1-2% czterotlenku osmu (utrwalacz utleniający) w 0.1 M buforze fosforanowym o ph=7.2 (2-4h w temp. pok. w ciemności pod dygestorium): (1%OsO 4 ) - fiolka 0.25g OsO 4 w 25 ml 0.1 M buforu fosforanowego (12.5 ml 0.2 M r-ru fosforanowego ml wody dest.) lub 2% r-r czterotlenku osmu (fiolka 0.25g OsO 4 w 12.5 ml buforu 0.1 M (6.25 ml 0.2M r-ru fosforanowego ml wody dest.) 4. Płukanie w 0.1 M buforze fosforanowym o ph=7.2 (3 x 10 min.) 5. Odwadnianie w wodnym szeregu alkoholowym 50%, 60%, 70% (w alkoholu 70% można przerwać procedurę), 80%, 90%, 96%, 100% (5-15 min.); 2x100% alkohol absol. lub aceton (15-30 min.) 6. Suszenie w punkcie krytycznym CPD 7. Naklejanie próbek na stolik aluminiowy 8. Napylanie metalem szlachetnym 9. Obserwacja w SEM i analiza obrazu Metoda przygotowania 0.1 M buforu fosforanowego: I. Roztwór fosforanowy 0.2 M: R-r A: Na 2 HPO 4 12 H 2 O g/500ml lub Na 2 HPO 4 2H 2 O g/500ml R-r B: NaH 2 PO 4 2 H 2 O g/500ml lub NaH 2 PO 4 H 2 O g/500ml II. Bufor fosforanowy 0.1 M o ph 7.2: 36 ml r-ru A i 14 ml r-ru B (roztwór fosforanowy 0.2 M) i uzupełnić wodą destylowaną do 100 ml, a następnie sprawdzić na pehametrze czy otrzymano bufor fosforanowy 0.1 M o ph 7.2. III. 3% aldehyd glutarowy: 50 ml 0.2 M roztworu fosforanowego + 12 ml 25% aldehydu glutarowego + 38ml wody destylowanej Powyższa procedura jest wprawdzie uniwersalna, ale pewne odstępstwa są dopuszczalne w zależności od badanego materiału. 4

5 IV. Analiza obrazu SEM Epiderma organów nadziemnych u roślin i naskórek u zwierząt stanowią powierzchniową, zwartą warstwę bezpośrednio kontaktującą się ze środowiskiem zewnętrznym. Istnieją jednak dość duże różnice rozwojowe, strukturalne i funkcjonalne pomiędzy tymi warstwami. W obu przypadkach podstawowym jej elementem są właściwe komórki epidermalne, o różnie wykształconej i ornamentowanej zewnętrznej ścianie peryklinalnej i antyklinalnej. Komórki te pokryte są ciągłą kutykulą, która jest najbardziej charakterystyczną cechą fenotypu epidermalnego. Kryteria analizy obrazu SEM (Fot. 1, 2): 1.Wzór komórkowy powierzchni lub układ komórkowy (cellular pattern) - jest to specyficzna dla danego obiektu (gatunku) orientacja przestrzenna komórek epidermalnych wraz z różnorodnymi strukturami zewnętrznymi (włoski, emergencje) 2. Pierwotna skulptura (primary sculpture): kształt komórek epidermalnych. Zarys komórek najczęściej wieloboczny, izodiametryczny lub prozenchymatyczny, wydłużony w jednym kierunku Zarys zewnętrznych ścian peryklinalnych - zarys tych ścian determinują makroskopowo widoczne nierówności powierzchni. Komórki mogą być w zarysie płaskie, zapadnięte lub wypukłe. W obrębie komórek wypukłych mogą występować formy pośrednie: stożkowate, kopulaste, brodawkopodobne. Zarys ścian antyklinalnych - widoczne w SEM jako granice komórkowe, w zarysie proste, nieregularnie powyginane (S-, U-, Omega - i V-kształtne) Ukształtowanie granic antyklinalnych - granice komórkowe mogą być podwyższone, zapadnięte 3. Wtórna skulptura (secondary sculpture) delikatna kutykularna mikroornamentacja zewnętrznych ścian komórkowych (powierzchnia kutykuli) Kutykularna ornamentacja zewnętrznych ścian peryklinalnych i antyklinalnych - powierzchnia nienaruszonych ścian komórkowych może być gładka, prążkowana, siatkowana, drobnobrodawkowana Kutykularna ornamentacja na wewnętrznej stronie zewnętrznych lub wewnętrznych ścian peryklinalnych i antyklinalnych, określana jako wtórne zgrubienia ścian (secondary wall thickenings) - wzór kutykularny może być siatkowaty, spiralny, prążkowany. To nie jest typowa cecha powierzchni, ale jest często widoczna po zapadnięciu i deformacji zewnętrznych ścian komórkowych. 4.Trzeciorzędowa skulptura (tertiary sculpture) epikutykularna sekrecja Powierzchnia kutykuli komórek epidermalnych roślin zazwyczaj jest pokryta nalotem woskowym. Pod względem chemicznym woski są silnie hydrofobowymi polimerami, stanowiącymi ważną barierę mechaniczno-fizjologiczną pomiędzy rośliną a środowiskiem. Wzór epikutykularnego wosku na powierzchni zewnętrznych ścian komórkowych epidermy może być granularny, pałeczkowaty, tabularny lub inny. 5

6 Przykłady dokumentacji fotograficznej (mikrofotografie SEM) z mikroskopu elektronowego skaningowego (A-F Tesla BS 340) A B C D E F Fot. 1. Mikrostruktura powierzchni epidermy roślin. Mikrofotografie SEM (J. Karcz). A) Oenothera parviflora, wzór komórkowy łupiny nasiennej. Wielokątne komórki epidermy testy z prostymi ścianami antyklinalnymi i drobnobrodawkowaną wtórną skulpturą ścian peryklinalnych. B) Oenothera depressa, komórki epidermy testy z zapadniętymi ścianami antklinalnymi i wyraźnie broawkowaną ornamentacją zewnętrznych ścian peryklinalnych. C) Reynoutria bohemica, epiderma dolnej strony liścia ze szparką. D) Reynoutria japonica, epiderma górnej strony liścia. E) Brassica oleracea, powierzchnia kutykuli epidermy owocu z woskiem epikutykularnym. F) Brassica campestris, struktury woskopodobne na powierzchni epidermy liścia. Skala: A-B, 10 µm; C-D, 20 µm; E-F, 5 µm. 6

7 Przykłady dokumentacji fotograficznej (mikrofotografie SEM) z mikroskopu elektronowego skaningowego (A, B- Hitachi S3400), (C-F Tesla BS 340) A B C D E F Fot. 2. Mikrofotografie SEM (J. Karcz). A) Mucronothrus nosalis, roztocze. B) Chrysolina pardalina, fragment jelita. C) Arabidopsis thaliana, stadia rozwojowe trichomów. D) Arabidopsis thaliana, liść siewki z dojrzałym włoskiem mechanicznym. E) Chenopodium berlandieri, owoc z pozostałością okwiatu. F) Zea mays, walec osiowy strefy włośnikowej korzenia siewki. Skala: C- 20 µm; D- 50 µm; E- 500 µm; F- 100 µm. 7

8 Literatura: Barthlott W Microstructural features of seed surface. Systematics Association 25: Bozolla J.J., Russell L.D. 1999: Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. Jones and Bartlett Publishers, Boston. Briarty L.G. 1976: A method for preparing living plant cell walls for scanning electron microscopy. J. Microsc. 94: Dykstra M.J., Reuss L.E. 2003: Biological Electron Microscopy: Troubleshooting. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. Theory, Techniques, and Falk RH Scanning electron microscopy. Preparation of plant tissues for SEM. SEM Inc., AMF O Hare (Chicago), IL 60666, USA. Goldstein J., Newbury D.T., Joy D., Lyman C., Echlin P., Lifshin E., Sawyer L., Michael J. 2003: Scanning electron microcsopy and X-ray microanalysis. Kluwer Academic/PlenumPublishers, New York. Hayet MA Principles and techniques of scanning electron microscopy. Van Nostrand Reinhold Company Regional Offices, New York. Karcz J Skaningowy mikroskop elektronowy w badaniach karpologicznych. Wiadomości Botaniczne 40(3/4): Kittel C Wstęp do fizyki ciała stałego, PWN Warszawa. Watkins CD, Sadun A, Marenka S Nowoczesne metody przetwarzania obrazu, WNT Warszawa. Strony internetowe: