Morfologiczne i kliniczne aspekty choroby Danona

Transkrypt

1 Chorzy trudni nietypowi/case report Morfologiczne i kliniczne aspekty choroby Danona Morphological and clinical aspects of Danon disease Anna Fidziańska 1, Ewa Walczak 2, Michał Walski 3, Edyta Wiśniewska 4, Teresa Wagner 2, Marek Kuch 4 1 Zespół Nerwowo-Mięśniowy, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa 2 Zakład Anatomii Patologicznej, Instytut Reumatologii, Warszawa 3 Zakład Ultrastruktury Komórki, MRC, PAN, Warszawa 4 Klinika Kardiologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Szpital Bródnowski, Warszawa Abstract Background: Danon disease, an X-linked hypertrophic cardiomyopathy, is caused by primary deficiency of lysosome-associated membrane protein (LAMP-2). The pathological hallmark of the disease is the appearance of intracytoplasmic vacuoles containing autophagic material and the absence of LAMP-2 activity in the muscle. Aim: To define the LAMP-2 protein deficiency we investigated cardiac and skeletal muscle of a 19-year-old man with hypertrophic cardiomyopathy without clinically apparent skeletal myopathy or mental impairment, whose mother died suddenly at 46 years of age. Methods: Clinical, morphological, immunohistochemical and ultrastructural analysis was performed. Paraffin sections of cardiac muscle were stained using routine histochemical methods. Frozen sections of skeletal muscle were stained using histochemical methods as well as using monoclonal antisera against N-terminal of dystrophin and antisera against LAMP-2. Ultrastructural examination of both cardiac and skeletal muscle specimens were performed. Results: Cardiac and skeletal muscle revealed an excessive accumulation of early and late autophagic vacuoles containing various cytoplasmic debris. In immunohistochemical analysis the vacuolar membrane seen in skeletal muscle was decorated with antibody against dystrophin and such vacuoles were negative for LAMP-2. Conclusion: Ultrastructural and immunohistochemical analysis of skeletal muscle (less invasive than myocardial biopsy) may be used in diagnosis of Danon disease. Early diagnosis of Danon disease is important for timely cardiac transplantation, the only effective therapeutic option. Key words: autophagic vacuoles, LAMP-2 deficiency, Danon disease Kardiol Pol 2008; 66: Wstęp Choroba Danona jest rzadką, sprzężoną z płcią chorobą dotyczącą głównie mięśnia serca i mięśni szkieletowych [1, 2]. Objawy ze strony serca zwykle zaczynają się w wieku młodzieńczym, chorzy umierają z powodu niewydolności mięśnia sercowego w 3. dekadzie życia [3 5]. W przeciwieństwie do zajęcia mięśnia serca, miopatia ma zwykle przebieg łagodny. U ok. 70% chorych występuje niedorozwój umysłowy [4, 5]. Objawy kardiologiczne u nosicielek choroby zwykle rozwijają się w 4. lub 5. dekadzie życia i wówczas nie obserwuje się miopatii ani upośledzenia umysłowego [4]. Choroba Danona jest następstwem niedoboru białka LAMP-2 kodowanego w chromosomie Xq24 [6, 7]. Białko LAMP-2 jest wysoce glukozowanym lizosomalnym białkiem błonowym, które bierze udział zarówno w fuzji autofagosomów z innymi błonami, jak też w dojrzewaniu wakuoli autofagalnych [8]. Morfologiczną cechą diagnostyczną choroby jest obecność wewnątrzcytoplazmatyczych wodniczek zawierających materiał autofagalny i glikogen w kardiomiocytach oraz komórkach mięśni szkieletowych [1, 2]. W celu dokładniejszego przybliżenia cech kliniczno- -patologicznych choroby Danona przedstawiamy przypa- Adres do korespondencji: prof. dr hab. Anna Fidziańska, Zespół Nerwowo-Mięśniowy, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, ul. Pawińskiego 5, Warszawa, tel.: , ewit@cmdik.pan.pl Praca wpłynęła: Zaakceptowana do druku:

2 Morfologiczne i kliniczne aspekty choroby Danona 303 dek 19-letniego mężczyzny z kardiomiopatią przerostową bez klinicznych cech miopatii i upośledzenia umysłowego; matka chłopca zmarła nagle w wieku 46 lat z powodu kardiomiopatii rozstrzeniowej. Opis przypadku Mężczyzna 19-letni został przyjęty na oddział kardiologiczny z powodu męczliwości i postępującej duszności wysiłkowej. W ostatnim tygodniu przed hospitalizacją odczuwał dyskomfort w jamie brzusznej z uczuciem pełności. Chory wykazywał prawidłowy rozwój ruchowy i był zdrowy w okresie dzieciństwa. Z nauką w szkole radził sobie dobrze i aktywnie uprawiał sporty. Jego matka zmarła w wieku 46 lat z powodu kardiomiopatii rozstrzeniowej. Badanie przedmiotowe ujawniło znaczne pulsowanie w okolicy koniuszka serca, szmer skurczowy nad lewą połową klatki piersiowej i hepatomegalię. Badania radiologiczne i tomografia komputerowa (CT) klatki piersiowej wykazały powiększenie sylwetki serca, znaczny zastój w żyłach płucnych i wysięk opłucnowy. EKG ujawniło blok lewej odnogi pęczka Hisa z krańcowo wydłużonym czasem trwania QRS (220 ms) i obecnością kryteriów przerostu lewej komory (LV). Echokardiografia przezklatkowa wykazała poszerzenie obu przedsionków, przerost LV i prawej komory (RV), globalną dysfunkcję skurczową i rozkurczową. Echokardiografia metodą Dopplera ujawniła cechy nadciśnienia płucnego. Końcowy rozkurczowy wymiar LV wynosił 69 mm, a skurczowy 56 mm. Wymiar RV 30 mm, lewego przedsionka 48 mm, frakcja wyrzutowa LV 33%, grubość tylnej ściany 24 mm i grubość przegrody międzykomorowej (IVS) 25 mm. Badanie neurologiczne ujawniło prawidłową siłę mięśniową i zachowane odruchy. Aktywność kinazy kreatynowej (CK) była podwyższona (520 U/1), podobnie jak niektóre enzymy wątrobowe (ALAT 898 U/l, AST 315 U/l, LHD 918/l); poziom sercowej troponiny I wyniósł 1,37 ng/l. Materiał badany i metodyka Metodą biopsji endomiokardialnej pobrano materiał z koniuszkowej części przegrody RV. Wycinek do badań rutynowych w mikroskopie świetlnym zatopiono w parafinie. Drugi wycinek do badania ultrastrukturalnego utrwalono w buforowanym glutaraldehydzie. Pobrano także biopsję z mięśnia prostego uda do analizy immunohistochemicznej i mikroskopowo-elektronowej. Seryjne krojone skrawki mrożone barwiono z użyciem monoklonalnych przeciwciał przeciw dystrofinie (Novocastra) i białku LAMP-2 (Stressgen). Do badań w mikroskopie elektronowym wycinki zarówno mięśnia serca, jak i mięśnia szkieletowego utrwalono w glutaraldehydzie buforowanym kakodylanem sodu 1% czterotlenkiem osmu w tym samym buforze. Skrawki odwadniano i zatopiono w Spurr-resin. Cienkie skrawki barwione octanem uranylu i cytrynianem ołowiu badano w mikroskopie elektronowym JEM 1200X/II. Wyniki Badania histologiczne wykazały obecność przerośniętych kardiomiocytów z powiększonymi i nieregularnymi jądrami. Uderzającą cechą morfologiczną skrawków parafinowych była obecność mikrowakuoli w kardiomiocytach; wakuole były optycznie puste lub zawierały wtręty kwasochłonne (Rycina 1.). Nie stwierdzono włóknienia, zmian zapalnych ani zmian w budowie kardiomiocytów. Badanie ultrastrukturalne ujawniło obecność licznych wakuoli autofagalnych zawierających heterogenny nieprawidłowy materiał, często z obecnością cząsteczek glikogenu (Rycina 2.). Małe skupiska glikogenu były widoczne w sarkoplazmie tych samych kardiomiocytów. Niektóre wodniczki zawierały różnego rodzaju resztki cytoplazmatyczne i materiał elektronowo gęsty (Rycina 3.). Wakuole autofagalne morfologicznie heterogenne o wielkości 0,2 3,5 µm zlokalizowane były w przestrzeni międzywłókienkowej i w przestrzeni okołojądrowej. Wiele z tych struktur przypominało wczesne wakuole autofagalne (AVi) zawierające morfologicznie niezmienione organelle sarkoplazmatyczne (Rycina 4.) i późne wakuole autofagalne (AVd) zawierające częściowo zdegradowany materiał sarkoplazmatyczny (Rycina 5.). Obecne były tak- Rycina 1. Mięsień serca z licznymi wakuolami (H+E 448) Rycina 2. Mięsień serca. Gigantyczna obłoniona wakuola zawierająca cząstki glikogenu, lizosomy i struktury mielinowe ( )

3 304 Anna Fidziańska et al. Rycina 3. Mięsień serca. Wakuole zawierające resztki sarkoplazmatyczne ( ) Rycina 5. Mięsień serca. Autofagalna wakuola typu AVd zawierająca częściowo zdegradowany materiał i strukturę mielinową ( ) Rycina 4. Mięsień serca. Otoczona podwójną błoną autofagalną wakuola typu AVi ( ) Rycina 6. Mięsień serca. Olbrzymia wakuola typu hybryd ( ) że organelle-hybrydy zawierające AVd zlokalizowane w obrębie jednej wodniczki (Rycina 6.). W mięśniu czworogłowym uda 25 30% włókien mięśniowych charaktryzowało się obecnością wodniczek lub zasadochłonnych skupisk (Rycina 7.). Błona wodniczek wykazywała wzmożoną aktywność w barwieniu przeciwciałami przeciwko dystrofinie (Rycina 8.) i brak aktywności przeciwciał LAMP-2 (Rycina 9.). Analiza ultrastrukturalna ujawniła obecność licznych wakuoli autofagalnych zawierających różne resztki cytoplazmatyczne i materiał elektronowo gęsty (Rycina 10.). Dyskusja Przedstawiamy 19-letniego mężczyznę z wywiadem rodzinnym i objawami kardiologicznymi typowymi dla kardiomiopatii przerostowej. Początki objawów wystąpiły między 18. a 19. rokiem życia. Chory nie wykazywał cech upośledzenia umysłowego ani wyraźnych zmian neurologicznych czy mięśniowych. W komórkach mięśnia serca i mięśnia szkieletowego stwierdzono charakterystyczne zmiany wakuolarne zawierające materiał autofagalny i glikogen. Wywiad rodzinny, płeć, wczesny początek objawów, znaczny przerost LV i RV, globalna dysfunkcja skurczowa, ciężka dysfunkcja rozkurczowa, charakterystyczne gromadzenie wakuoli autofagalnych w komórkach mięśnia serca i mięśni szkieletowych i brak aktywności LAMP-2 potwierdzają rozpoznanie u naszego pacjenta choroby Danona. Białko LAMP-2 jest głównym składnikiem błony lizosomalmej i produktem genu zmapowanego na chromosomie Xq24 [6]. Białko LAMP-2 jest odpowiedzialne zarówno za fuzję endofagosomów z innymi endosomalnymi wakuolami, jak i za proces dojrzewania wakuoli autofagalnych [8, 9]. Autofagocytoza zużytych struktur komórkowych z ich usuwaniem odgrywa istotna rolę w odnawianiu komórek mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych [10]. Rola autofagocytozy jako mechanizmu naprawy jest szczególnie ważna dla długo żyjących komórek postmitotycznych, które charakteryzują się bar-

4 Morfologiczne i kliniczne aspekty choroby Danona 305 A A B B Rycina 7. Mięsień czworogłowy uda. A. Nieregularna wąska wakuola i zasadochłonne ziarniste skupisko (H+E 448). B. Plaka barwiąca się PAS- -pozytywnie ( 448) Rycina 9. Mięsień czworogłowy uda. Analiza immunohistochemiczna A. Mięsień kontrolny. We włóknach mięśniowych widoczne drobne granulki LAMP-2 pozytywne. B. Mięsień czworogłowy pacjenta. Całkowity brak aktywności LAMP-2 ( 1050) Rycina 8. Mięsień czworogłowy uda. Analiza immunohistochemiczna. Dystrofinopozytywna wakuola wewnątrzkomórkowa. Aktywnie barwiąca się błona komórki mięśniowej ( 1050) Rycina 10. Mięsień czworogłowy uda. Ogromna autofagalna wakuola z licznymi błoniastymi strukturami ( )

5 306 Anna Fidziańska et al. dzo niskim (jeśli w ogóle) wskaźnikiem regeneracji [8, 9]. Uszkodzone struktury komórkowe gromadzą się stopniowo w komórkach długo żyjących, co wskazuje, że mechanizm autofagocytozy nie jest wystarczający. Duże ilości zdegradowanego materiału z kwaśnymi enzymami mogą interferować z funkcją lizosomów, powodując słabą odnowę długo żyjących białek, uszkodzenie organelli, zmniejszenie funkcji adaptacyjnej i śmierć komórki. Obserwowane u chorego masywna akumulacja wodniczek autofagalnych w kardiomiocytach, ich obecność w mięśniu szkieletowym i brak aktywności białek LAMP-2 pozwalają postawić rozpoznanie choroby Danona. Choroba ta jest związana z płcią [1, 2, 4, 11]. Pacjenci z chorobą Danona mają zwykle typową triadę objawów: kardiopatię, miopatię i upośledzenie umysłowe [3 5, 11], jednakże opisywano przypadki atypowe bez osłabienia mięśni czy upośledzenia umysłowego, a także z polineuropatią aksonalną i bezobjawowym podwyższeniem aktywności CK [12, 13]. Nosicielki choroby Danona zwykle mają izolowaną kardiomiopatię [3 5], jednakże w dużej populacji nosicielek opisano także cechy miopatii [4, 5]. Podsumowując, przedstawione wyniki wskazują, iż poszukiwanie deficytu białka LAMP-2 powinno być prowadzone u chorych z kardiomiopatią przerostową, zwłaszcza gdy towarzyszą jej cechy miopatii lub tylko wysoka aktywność CK [13]. Diagnostyczna biopsja mięśnia szkieletowego (mniej inwazyjna i bardziej dostępna niż biopsja endomiokardialna) powinna być rozważana pod kątem ewentualnego rozpoznania choroby Danona [5]. Nie ma swoistego leczenia dla tej choroby, w grę wchodzi jedynie przeszczep serca jako najbardziej skuteczne leczenie tej śmiertelnej kardiomiopatii [3, 11]. Jeden z pacjentów leczony z powodzeniem przeszczepem serca jest obserwowany od ponad 5 lat [11], co wskazuje, że choroba Danona jest potencjalnie uleczalna poprzez transplantację serca. Wnioski Wczesne rozpoznanie choroby Danona jest bardzo ważne dla wykonania w odpowiednim czasie przeszczepu serca jedynego efektywnego sposobu leczenia. Piśmiennictwo 1. Danon MJ, Oh SJ, DiMauro S, et al. Lysosomal glycogen storage disease with normal acid maltase. Neurology 1981; 31: Charron P, Villard E, Sébillon P, et al. Danon s disease as a cause of hypertrophic cardiomyopathy: a systematic survey. Heart 2004; 90: Sugie K, Koori T, Yamamoto A, et al. Characterization of Danon disease in a male patient and his affected mother. Neuromuscul Disord 2003; 13: Sugie K, Yamamoto A, Murayama K, et al. Clinicopathological features of genetically confirmed Danon disease. Neurology 2002; 58: Fanin M, Nascimbeni AC, Fulizio L, at al. Generalized lysosome-associated membrane protein-2 defect explains multisystem clinical involvement and allows leukocyte diagnostic screening in Danon disease. Am J Pathol 2006; 168: Nishino I, Fu J, Tanji K, et al. Primary LAMP-2 deficiency causes X-linked vacuolar cardiomyopathy and myopathy (Danon disease). Nature 2000; 406: Fukuda M. Lysosomal membrane glycoproteins. Structure, biosynthesis, and intracellular trafficking. J Biol Chem 1991; 266: Eskelinen EL, Illert AL, Tanaka Y, et al. Role of LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Mol Biol Cell 2002; 13: Eskelinen EL. Maturation of autophagic vacuoles in Mammalian cells. Autophagy 2005; 1: Klionsky DJ, Emr SD. Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation. Science 2000; 290: Echazni-Laguna A, Morh M, Epailly E, et al. Novel Lamp-2 gene mutation and successful treatment with heart transplantation in a large family with Danon disease. Muscle Nerve 2006; 33: Laforèt P, Charron P, Maisonobe T, et al. Charcot-Marie-Tooth features and maculopathy in a patient with Danon disease. Neurology 2004; 63: Musumeci O, Rodolico C, Nishino I, et al. Asymptomatic hyperckemia in a case of Danon disease due to a missense mutation in Lamp-2 gene. Neuromuscul Disord 2005; 15: