WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT P CHERZYKOWY

Transkrypt

1 WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT P CHERZYKOWY Dr Łukasz Baranowski Wydział Rolnictwa i Biologii Katedra Botaniki Warszawa,

2 SYSTEMY BŁON WEWN TRZNYCH Błony kom. wyst pują we wszystkich układach biologicznych zdolnych do samodzielnego życia. Tworzą mniejsze systemy (organelle błonowe). Komunikacja: wymiana sygnałów, transport p cherzykowy i niezwiązany z p cherzykami. TRANSPORT Wewnątrzkomórkowy Mi dzykomórkowy (plasmodesmy)

3 EUCARYOTA Szlak sekrecyjny Szlak endocytotyczny Organelle: ER, aparat Golgiego, endosomy, wakuole. Transport pomi dzy tymi organellami wymaga mechanizmów sortujących, transportujących oraz rozpoznających błon docelową. Transport wydzielniczy: p cherzyki transportowane są z ER, pow. cis, środkową, trans AG, aż do wakuoli lub błony docelowej (transport anterogradowy). Transport retrogradowy utrzymuje lokalizacj białek ER i AG oraz białek z rodziny SNARE.

4 RETIKULUM ENDOPLAZMATYCZNE Pierwsze organellum szlaku wydzielniczego. Najbardziej plastyczne (system spłaszczonych cystern, rozgał zionych rurek i p cherzyków otoczonych błoną). Wi cej białek i fosfolipidów, mniej steroli. Dużo kwasów nienasyconych (płynność). Wn trze: liczne enzymy (synteza, modyfikacja, sekrecja). Funkcje: u roślin: synteza, modyfikacja, sortowanie białek, glikoprotein i lipidów, regulacja zawartości wapnia w cytozolu oraz tworzenie struktur błoniastych (ciała ER).

5

6 DOMENY ER I ICH FUNKCJE: Gładkie enzymy biosyntezy glicerolipidów, terpenów, fenylopropanoidów, flawonoidów i wosków. Szorstkie synteza nowych białek i transport do innych typów ER, AG, wakuoli i błony komórkowej. Tranzytowe formowanie p cherzyków transportujących. Cztery typy domen ER związane są z jądrem komórkowym: domena receptorowa lamin, porów jądrowych, ER bramkowe i domena nukleacji mikrotubul. Domena receptorowa lamin jest miejscem organizacji lamin jądrowych i przyczepu chromosomów interfazowych. ER bramkowe bierze udział w regulacji wymiany białek mi dzy błoną ER a otoczką jądrową.

7 Domeny: nukleacji mikrotubul, formowania ciał olejowych, białkowych, plasmodesm czy wakuoli są charakterystyczne dla roślin wyższych a ich obecność i forma jest zależna od konkretnych funkcji komórki i procesów w niej zachodzących. Domeny wiążące wakuol, mitochondria i filamenty aktynowe oraz kotwiczenia błony komórkowej, formujące wakuol i recyklingujące lipidy. POCHODNE ER Struktury KDEL (np. u fasoli) Rycynosomy (Ricinus communis) procesy hydrolityczne P cherzyki PAC (Ricinus communis, Cucurbita maxima) Transport prekursorów białek zapasowych (np. albuminy 2S, globuliny 11S) z ER do wakuoli magazynującej omijając aparat Golgiego.

8 APARAT GOLGIEGO Roślinny aparat Golgiego składa si z diktiosomu, czyli polarnego stosu dyskowatych cystern otoczonych pojedynczą błoną wraz z towarzyszącymi im p cherzykami.

9 Liczba cystern budująca pojedynczy diktiosom waha si od 5 do 7 w komórkach czapeczki korzenia do 30 w komórce klejnotki. Liczba diktiosomów w komórce jest zmienna. W zależności od typu komórki, czynników fizjologicznych, etapu różnicowania i pełnionych funkcji, komórki mogą zawierać od jednego diktiosomu u zawłotni do kilkuset w komórkach czapeczki korzenia kukurydzy, a nawet kilku tysi cy w komórkach włosków łupiny nasiennej bawełny.

10 W obr bie diktiosomu wyróżnia si trzy domeny/obszary/strefy: cis, środkową i trans. Strefa cis nazywana jest strefą formowania lub wejścia, a strefa środkowa i trans dojrzewania lub wyjścia. Polarność diktiosomów wyraża si także różną średnicą cystern, jak i nierównomiernym rozmieszczeniem p cherzyków. Typy p cherzyków: 1. Okryte białkami opłaszczającymi typu I (COPI) (strefa cis). 2. Kolczaste okryte klatryną (strefa trans). 3. Gładkopowierzchniowe produkujące śluz. 4. G ste (DV) o średnicy do 300 nm charakterystyczne dla komórek bielma rącznika pospolitego oraz liścieni dyni olbrzymiej i wielu roślin z rodziny Fabaceae.

11 TRANS GOLGI NETWORK Z diktiosomami związane są nie tylko p cherzyki, ale i TGN (PGN). TGN kompleks dynamicznych przedziałów błonowych zlokalizowanych po stronie trans AG. Cz ść autorów twierdzi, że TGN jest cz ścią diktiosomu, podczas gdy inni uważają, że jest ono organellum autonomicznym.

12 TRANS GOLGI NETWORK W niektórych komórkach TGN zbudowana jest z szerokich cystern i wyst puj w pewnej odległości od AG. W innych przypadkach TGN jest ledwo widoczna i połączona z biegunem trans AG. Funkcje: TGN uczestniczy w transporcie makromolekuł nowosyntetyzowanych przez AG, jak również jest zaangażowana w endocytoz.

13 FUNKCJE APARATU GOLGIEGO: Modyfikacja łańcuchów oligosacharydowych glikoprotein i proteoglikanów. Biosynteza składników błony komórkowej (lipidów i glikolipidów) oraz ściany komórkowej (hemiceluloz, pektyn i śluzów). AG formuje, wydziela i przyjmuje liczne p cherzyki przez co bierze udział również w przepływie błon w komórce (szlaki sekrecyjne i endocytotyczne).

14 WAKUOLA Typowa wakuola jest najwi kszym organellum klasycznej komórki roślinnej. Otoczona jest pojedynczą błoną tonoplastem. Funkcje: 1. Gromadzi białka zapasowe i produkty przemiany materii. 2. Bierze udział w procesach litycznych i programowanej śmierci komórki. 3. Reguluje: obj tość komórki, turgor, ph, koncentracj jonów nieorganicznych w cytozolu. 4. Uczestniczy w transdukcji sygnałów. 5. W jednej komórce roślinnej mogą znajdować si wakuole pełniące różne funkcje np. gromadzące białka zapasowe (PSV) i biorące udział w procesach litycznych (LV) odpowiednik zwierz cych lizosomów.

15 TONOPLASTOWE BIAŁKA INTźGRALNź (TIP) Białka TIP należą do bardzo licznej grupy białek regulujących transport wody (akwaporyny). Masa ok. 27 kda a ich cząsteczka składa si z sześciu transmembranowych domen, połączonych krótkimi p tlami, i dwóch hydrofilowych końców (C i N) zakotwiczonych w cytoplazmie.

16 TONOPLASTOWE BIAŁKA INTźGRALNź (TIP) W tonoplaście wakuol magazynujących znajdują si izoformy α-tip i δ-tip, natomiast tonoplast wakuol litycznych zawiera izoform γ-tip. Analizy immunocytochemiczne komórek stożka wzrostu korzenia j czmienia potwierdziły wyst powanie dwóch funkcjonalnie oddzielnych typów wakuol. Wakuole magazynujące oprócz odpowiedniej dla siebie izoformy TIP zawierały także j czmienne lektyny, a lityczne aleurain (j czmienną proteinaz cysteinową).

17 ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE

18 ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE

19 INNź BIAŁKA TONOPLASTU W korzeniu palowym rzodkwi, białka TIP stanowią od 30 do 50% wszystkich białek tonoplastowych. Inne znaczniki molekularne wakuol (pirofosfataza, V-ATPaza) to tylko 10% białek. V- PPiaza i V-ATPaza należą do pomp protonowych i zapewniają tonoplastowi odpowiedni gradient ph i potencjał błonowy. Cząsteczka V-ATPazy (700 kda) zbudowana jest z 14 różnych podjednostek białkowych złożonych w cz ść transmembranową i katalityczny region cytozolowy. Białko to może uczestniczyć w szlaku sekrecyjnym w komórkach eukariotycznych.

20 ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE

21 ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE

22 KOMUNIKACJA POMI ŹZY SYSTźMAMI BŁON WźWN TRZNYCH Wi kszość nowo zsyntetyzowanych wielkocząsteczkowych związków chemicznych musi być przetransportowana z miejsca ich produkcji do miejsca ich funkcjonowania. Transport ten odbywa si także dzi ki p cherzykom transportującym. P cherzyki transportujące to niewielkie struktury otoczone pojedynczą błoną. Transport p cherzykowy pomi dzy systemami błon wewn trznych wymaga mechanizmów sortujących ładunek, transportujących oraz rozpoznających błon docelową. Wyróżnia si wydzielnicze (szlak wczesny i pó ny) i endocytotyczne drogi transportu.

23 WCZESNY SZLAK WYDZIELNICZY Oragnelle zaangażowane we wczesny szlak wydzielniczy (ang. early secretory pathway) to źr i AG. Transportowane makrocząsteczki są syntetyzowane i/lub modyfikowane w ER i diktiosomach. Przykładami modyfikacji posttranslacyjnych zachodzących w źr są np. pierwotna glikolizacja białek, czy formowanie wiązań disiarczkowych. W AG znajdują si liczne glikotransferazy i glikozydazy uczestniczące w wydłużaniu, skracaniu, przyłączaniu lub odłączaniu łańcuchów glikozylowych. W AG mogą także zachodzić modyfikacje proteolityczne niektórych białek. Po obróbce chemicznej związki wielkocząsteczkowe pakowane są do odpowiednich p cherzyków i transportowane do kolejnych przedziałów błonowych w obr bie komórki lub przez fuzj z błoną komórkową wydzielają swoją zawartość do ściany komórkowej (egzocytoza).

24 TRANSPORT Z ER DO AG Transport - p cherzyki okryte białkami opłaszczającymi COPII. Komponentami tych białek są Sar1p i kompleksy białkowe Sec13/ Sar1p (24 kźa) należy do małych białek wiążących GTP. 2. Kompleks Sec13 (700 kźa) składa si z białek Sec13p i Sec31p zawierających liczne motywy WD (Trp-Asp). 3. Sec23 (400 kźa) to kompleks białek Sec23p i Sec24.

25 TRANSPORT Z ER DO AG Transport z źr do AG w komórkach eukariotycznych zapewniany jest też przez białka SNARź [(ang. soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF) attachment protein receptors, SNAP receptors)]. Każdy typ p cherzyka transportującego ma na swojej powierzchni znacznik molekularny. Marker ten musi być rozpoznany przez odpowiednie receptory błony docelowej. Rozpoznanie i fuzja p cherzyka z błoną odbywa si przy udziale białek SNARź. SNARź to dwie odr bne rodziny integralnych białek błonowych. v-snare to białka wyst pujące w błonach p cherzyków transportujących, a bardziej stabilne t-snarź znajdują si w cytozolowych cz ściach błon organelli docelowych.

26 TRANSPORT W OBR BIź AG I Z AG ŹO źr Charakterystyczną cechą p cherzyków transportujących jest opłaszczanie białkami COPI. Komponentami tych białek jest ARF1 i kompleks białkowy zwany z koatomerem.

27 TRANSPORT W OBR BIź AG I Z AG ŹO źr ARF1 to białko wiążące GTP o masie około 20 kda, które zostało odkryte w cytozolu w postaci monomerycznej formy związanej z GŹP. Forma ta podlega N-mirystylacji (N-MYR) pozwalającej na jej kotwiczenie w błonie bez udziału koatomerów. W porównaniu do innych ARF-ów, wiązanie ARF1 wymaga czynnika wymiany nukleotydów guaninowych (GTP/GDP exchange factor, GEF). GEF-y mogą być wrażliwe na działanie brefeldyny A (BFA), która może zakłócać transport białek przez AG. U Arabidopsis osiem czynników ARF-GźF zaklasyfikowano do dwóch rodzin: klasy GNOM/Geal1/2p/GBF i klasy BIG/sec7p.

28 BREFELDYNA A (BFA) Brefeldyna A to makrocykliczny hydrofobowy lakton pochodzenia grzybowego. W komórkach roślinnych BFA jest inhibitorem szlaku sekrecyjnego (sekrecji konstytutywnej) i tworzenia si p cherzyków nieklatrynowych (COPI). Bierze także udział w modyfikacjach szlaków syntezy lipidów i O- i N-glikanów oraz kształtu, lokalizacji i funkcjonowania wszystkich organelli zaangażowanych w ścieżki egzocytotyczne i endocytotyczne.

29 BREFELDYNA A (BFA) Traktowanie roślin BFA prowadzi do wielu zmian, nie tylko na poziomie molekularnym, ale i ultrastrukturalnym. Wysokie st żenie BFA powoduje przede wszystkim, rearanżacj struktur AG. Stosy cystern diktiosomu ulegają deformacjom bąd zanikają) lub przeciwnie, powstają rozbudowane kompleksy diktiosomów w wyniku łączenia si cystern dwu różnych stosów. Mogą powstawać także struktury hybrydowe, np. źr-diktiosom, co prowadzi do redystrybucji białek z AG do ER. Mimo tych wszystkich zmian wiele cystern pozostaje metabolicznie aktywne o czym świadczy ich zdolność do formowania i odłączania p cherzyków. Strukturami powstającymi na skutek działania BFA są także tzw. przedziały indukowane BFA (ang. BFA-induced compartments). Powstają one najprawdopodobniej przez horyzontalny podział diktiosomów.

30 PÓ NY SZLAK WYDZIELNICZY Pierwszym organellum pó nego szlaku wydzielniczego w komórkach zwierz cych i roślinnych jest TGN. Białka transportowane są przez p cherzyki z TGN do wakuol (magazynujących i litycznych) lub błony komórkowej. W przeciwieństwie do ładunku dostarczanego do wakuol, ten przeznaczony dla błony komórkowej nie posiada specyficznej sygnatury kierującej. Wszystkie poznane białka wakuolarne mają wakuolarny sygnał sortujący (ang. vacuolar sorting signal, VSS).

31 TRANSPORT Z TGN DO PVC W komórkach drożdży, zwierząt i roślin od TGN odpączkowują p cherzyki okryte klatryną (ang. clathrincoated vesicles, CCV. P cherzyki te są odpowiedzialne, przede wszystkim, za transport lizosomalnych kwaśnych hydrolaz pochodzących z AG. Ich okrywa składa si z klatrynowego triskelionu, kompleksu adaptorowego i receptora transbłonowego.

32 TRANSPORT Z TGN DO PVC Triskeliony to heksamery zbudowane z trzech łańcuchów polipeptydowych ci żkich (ang. clathrin heavy-chain, CHC) i trzech lekkich (ang. clathrin light-chain, CLC) ułożonych w struktur trójnożną.

33 TRANSPORT Z TGN DO PVC W komórkach ssaków każda noga ma długość 45 nm i składa si z trzech morfologicznie różnych regionów: kolana wrażliwego na proteazy, domeny proksymalnej o długości 17 nm i 25 nm domeny dystalnej. Triskeliony drożdży i roślin zbudowane są z takich samych regionów, ale ich nogi są dłuższe (61 nm). U wszystkich eukariotów białka CHC kodowane są przez pojedynczy gen.

34 TRANSPORT DO PVC Pierwszym etapem transportu do przedziału przedwakuolarnego (ang. prevacuolar compartment, PVC) jest utworzenie p cherzyka i załadowanie go odpowiednim ładunkiem. W literaturze PVC nazywane jest także ciałem wielop cherzykowym (ang. multivesicular body, MVB) lub endosomem pó nym. Proces powstawania p cherzyka okrytego klatryną (CCV).

35 TRANSPORT Z TGN DO WAKUOL Niektóre białka transportowane są do wakuol przez p cherzyki zależne od AP-3 (ang. AP-3-dependent vesicles). Kompleks AP3 został zlokalizowany w komórkach ssaków i drożdży i nie jest powiązany z klatryną, ale tylko z białkami SNARź. W tym mechanizmie transportującym odkryto wakuolarne białko t-snare (Vam3p). W komórkach roślinnych mogą wyst pować dwa, funkcjonalnie różne, typy wakuol. Białka przeznaczone do wakuol litycznych np. hydrolazy posiadają swoisty sekwencyjnie, wakuolarny sygnał sortujący (ang. sequence specific VSS, ssvss) np. motyw czteroaminokwasowy NPIR (Asn-Pro-Ile-Arg) dwóch niespokrewnionych białek: aleurainy i sporaminy.

36 TRANSPORT Z TGN DO WAKUOL Białka zapasowe transportowane są do PSV przede wszystkim przez DV, co zaobserwowano w liścieniach grochu i dyni. DV pączkują z aparatów Golgiego, a nast pnie są uwalniane dalej przez TGN. DV opłaszczone są białkami lecz nie poznano struktury i właściwości molekularnych. DV zawierają globuliny 11S (legumina) i 7S (wicylina), dojrzałe dodatkowo glikoproteiny, natomiast nie stwierdzono obecności w nich albuminy 2S i BP-80. Brak BP-80 wskazuje na inny mechanizm sortowania białek. W tym przypadku może być on oparty na p cherzykach.

37 TRANSPORT Z TGN DO BŁONY KOMÓRKOWEJ Transport z TGN do błony komórkowej ma duże znaczenie w komórkach roślinnych. Wiąże si to z dostarczaniem prekursorów (hemiceluloz i pektyn) ściany komórkowej. Diktiosomy mogą syntetyzować glikoproteiny i polisacharydy, które muszą być przetransportowane do ściany komórkowej. Cząsteczki te pakowane są w różne p cherzyki, lecz wszystkie typy p cherzyków związane są z białkami SNARE.

38 ENDOCYTOZA I ENDOSOMY Endocytoza i endosomy w roślinach uczestniczą m. in. w różnicowaniu zarodka i epidermy, grawitropizmie, ruchu komórek przyszparkowych, przebudowie ściany komórkowej, regulacji transportu auksyn i odpowiedzi na atak patogenów. Pierwszym etapem endocytozy jest wgł bienie błony komórkowej, czyli tzw. dołek okryty klatryną, z którego tworzy si p cherzyk okryty klatryną. P cherzyki odpączkowują, łączą si ze sobą i tworzą endosom wczesny, u roślin nazywany też cz ściowo okrytym retikulum (ang. partially coated reticulum, PCR). Kolejne struktury tego szlaku to endosom pó ny i wakuole lityczne.

39 WORTMANINA Wortmanina specyficznie blokuje aktywność kinazy-3fosfatydylinozytolu (ang. phosphatidylinositol-3-kinase, PI3kinase), która bierze udział w syntezie fosforanu-3fosfatydylinozytolu (ang. phosphatidylinositol-3-phosphate, PI3P). Związek ten obecny jest w endosomach późnych komórek drożdży i ssaków. W roślinach PI3P zlokalizowano w endosomach ARA7/RabFb2. Traktowanie wortmaniną komórek kallusowych tytoniu (Nicotiana tabacum) BY-2 i korzeni Arabidopsis thaliana potwierdziło wyst powanie zniekształconych MVB.

40 DZI KUJ ZA UWAG!!! AŻ STRACH SI BAĆ EGZAMINU