Rozpuszczalność, wysalanie i denaturacja białek

Transkrypt

1 Ćwiczenie 4 Rozpuszczalność, wysalanie i denaturacja białek Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych Kwas octowy C Kwas azotowy (V) C Kwas solny C Kwas trichlorooctowy C, N Kwas 5-sulfosalicylowy 2 hydrat C Kwas pikrynowy F, T Kwas fosfowolframowy hydrat C Wodorotlenek sodu C nadsiarczan amonu O, Xn Etanol 96% F Miedzi (II) siarczan kryst. 5 hydrat Xn, N Ołowiu (II) octan 3 hydrat T, N Rtęci (II) chlorek T+, N śelaza chlorek bezwodny Xn I. Rozpuszczalność i wysalanie białek Niektóre białka dobrze rozpuszczają się w wodzie, inne natomiast rozpuszczają się dopiero w rozcieńczonych roztworach soli. Stąd dzieli się je na białka hydrofilowe, o duŝym oraz hydrofobowe, o małym powinowactwie do wody. O rozpuszczalności białek decyduje przede wszystkim ich powinowactwo do wody tj. zdolność do hydratacji. Woda wiązana jest przez białko poprzez atomy tlenu i azotu wiązania peptydowego (wiązanie koordynacyjne) oraz grupy hydrofilowe łańcuchów bocznych aminokwasów poprzez wiązania wodorowe lub siłami oddziaływań typu dipol-dipol (oddziaływania van der Waalsa). W konsekwencji cząsteczki białek hydrofilowych otoczone są płaszczem wodnym (woda hydratacyjna), który stanowi znaczącą i nieodłączną część cząsteczki białka (30-40%) i ma istotny wpływ na jej właściwości strukturalne (czyli na wymiary i kształt cząsteczki białka) oraz funkcjonalne (dostępność róŝnych ugrupowań powierzchniowych, osłabianie reaktywności maskowanych przez nią grup). Białka hydrofilowe mogą czasem wiązać drobiny wody równieŝ wewnątrz własnej cząsteczki na skutek obecności tam reszt aminokwasów polarnych, czemu towarzyszy zwiększanie objętości cząsteczek białka określane mianem pęcznienia. Na rozpuszczalność białek wpływa teŝ ph roztworu i obecność w nim soli. Rozpuszczalność białka w roztworze o ph zbliŝonym do jego punktu izoelektrycznego (pi) jest niewielka. Czynniki zwiększające rozpuszczalność białka utrudniają jego wytrącanie, a związki obniŝające rozpuszczalność powodują wytrącenie osadu białka po osiągnięciu pi. Białka hydrofobowe są rozpuszczalne tylko w roztworach elektrolitów na skutek selektywnej adsorpcji z roztworu jonów jednego rodzaju, co powoduje, Ŝe białka te posiadają ten sam ładunek elektryczny a przez to utrzymują się w roztworze. Rozpuszczalność białek hydrofilowych wynika natomiast z wytwarzania warstwy hydratacyjnej i jednakowego ładunku cząsteczek samego białek, którego źródłem jest dysocjacja kwasowych i zasadowych grup obecnych w cząsteczkach tych białek. 1. Rozpuszczalność globulin w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli Globuliny są białkami nierozpuszczalnymi w wodzie z powodu silnego momentu dipolowego (tworzenie agregatów). Kationy oraz aniony soli nieorganicznych dzięki zobojętnianiu dodatnich i ujemnych ładunków dipola 1

2 białkowego (zjonizowanych grup) odpowiedzialnych za przyciąganie pomiędzy cząsteczkami białka, zapobiegają agregacji cząsteczek białek. Powinowactwo jonów do tych zjonizowanych grup jest bowiem większe od powinowactwa dwubiegunowych cząsteczek wody. Albuminy dzięki temu, Ŝe ich momenty dipolowy jest mniejszy od momentu dipolowego globulin oraz właściwemu sobie duŝo większemu powinowactwu do wody, są dobrze rozpuszczalne w wodzie. A. Zmieszać 0,5 ml surowicy z 12,5 ml wody i odstawić na kilka minut. Pojawia się zmętnienie roztworu od wytrąconych globulin, które znika po dodaniu kilku kropli nasyconego roztworu NaCl. B. Jeden gram mączki grochowej ekstrahować 25 ml 0,9% roztworu NaCl. Osad odwirować, a porcję supernatantu (1 ml) rozcieńczać stopniowo wodą obserwując zwiększanie się zmętnienia z powodu wytrącania się globulin. Po dodaniu kilku kropli nasyconego roztworu NaCl osad ponownie się rozpuści. 2. Wpływ ph na rozpuszczalność białek Rozpuszczalność kaŝdej substancji jest wynikiem równowaŝenia wewnętrznych sił przyciągania cząsteczek ciała rozpuszczanego i przyciągania pomiędzy cząsteczkami rozpuszczalnika a cząsteczkami ciała rozpuszczanego. W punkcie izoelektrycznym przyciąganie pomiędzy cząsteczkami białka jest największe, gdyŝ nie posiadają one ładunku elektrycznego, a więc białko w pi jest najsłabiej rozpuszczalne, gdyŝ cząsteczki białka zbijają się w agregaty łatwo wypadające z roztworu. W ph róŝnym od pi białka są obdarzone ładunkiem, co zmniejsza wzajemne przyciąganie jego cząsteczek, a w efekcie zwiększa rozpuszczalność. Do 0,25 ml surowicy dodać 0,5 ml wody i wprowadzać kroplami roztwór 10 M HCl tak długo jak narasta zmętnienie roztworu (ok ml). Dodawać następnie kroplami roztwór nasyconego NaOH aŝ do ponownego rozpuszczenia osadu. 3. Wytrącanie albumin i globulin etanolem W roztworach o ph bliskim wartości 5, globuliny wytrącają się przy stęŝeniu etanolu równym 15%, a albuminy przy stęŝeniu równym 40%. Przy innych wartościach ph konieczne jest stosowanie wyŝszych stęŝeń etanolu. Etanol powoduje odwodnienie białka i jego wypadanie z roztworu, ale jeśli czynnik ten działa krótko i w niskich temperaturach to moŝna je ponownie rozpuścić. Białka wytrącane w niskich temperaturach etanolem (-5 C do -15 C) nie ulegają denaturacji, co wykorzystuje się do otrzymywania frakcji białek surowicy metodą Cohna. A. 0,5 ml surowicy 2-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl oziębić do 0 C. Następnie dodać 0,5 ml 95% etanolu. Występuje zmętnienie, które znika po natychmiastowym rozcieńczeniu wodą. B. Do 0,5 ml 5-krotnie rozcieńczonej surowicy 0,9% roztworem NaCl dodać 1 ml 95% etanolu. Wytrąca się osad rozpuszczalny w wodzie. 4. Wysalanie białek silnymi elektrolitami Sole obojętne w sposób charakterystyczny wpływają na rozpuszczalność białek. Przy mniejszych stęŝeniach zwiększają rozpuszczalność białek, a przy większych stęŝeniach powodują wypadanie białek w postaci nierozpuszczalnych osadów. Spowodowane jest to odciąganiem cząsteczek wody od cząsteczek białka przez jony soli z powodu konkurowania z białkami o cząsteczki wody, co w konsekwencji zmniejsza rozpuszczalność białka, a przy duŝych stęŝeniach soli powoduje wypadanie białek z roztworu, czyli tak zwane wysalanie białek. Wysalanie białek jest procesem odwracalnym, gdyŝ dodanie czystego rozpuszczalnika lub obniŝenie stęŝenia soli przez dializę powoduje ponowne rozpuszczenie białek. RóŜne białka wymagają do wysolenia róŝnych stęŝeń soli i własność ta jest wykorzystywana do rozdzielania mieszanin białkowych. Najbardziej skutecznym związkiem wysalającym białka jest nadsiarczan amonu [(NH 4) 2SO 4] ze względu na duŝą własną rozpuszczalność tej soli, 2

3 przez co moŝna uzyskać roztwory o duŝej sile jonowej. Białka wytrącane siarczanem amonu, sodu lub magnezu nie ulegają denaturacji, więc po obniŝeniu stęŝenia soli (np. przez dializę) otrzymuje się roztwór białka o pełnej aktywności biologicznej Oddzielanie albumin od globulin Osocze jest mieszaniną białek o róŝnej masie cząsteczkowej i róŝnym stopniu uwodnienia. Poszczególne frakcje osocza moŝna łatwo oddzielać wykorzystując ich róŝną rozpuszczalność w stęŝonych roztworach soli. Najłatwiej, juŝ przy 25% nasyceniu roztworu (NH 4) 2SO 4 wysala się fibrynogen. Globuliny tracą wodę hydratacyjną przy 50% nasyceniu roztworu (NH 4) 2SO 4 lub w nasyconych roztworach MgSO 4 i Na 2SO 4. Albuminy wysalają się natomiast dopiero po całkowitym wysyceniu roztworu (NH 4) 2SO 4. Do 0,5 ml surowicy 2-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl dodać taką samą objętość nasyconego roztworu (NH 4) 2SO 4. Po zmieszaniu uzyskuje się pół-nasycenie roztworu siarczanu amonu. Wytrącający się kłaczkowaty osad globulin odwirować (1 min), a do klarownego supernatantu dodawać (NH 4) 2SO 4 in substantia, aŝ do nasycenia roztworu i zaobserwowania wytrącania albumin. II. Denaturacja białek Termin denaturacja białek oznacza naruszenie lub zniszczenie natywnej konformacji białka, co zawsze pociąga za sobą zmianę lub utratę jego biologicznych aktywności (np. enzymatycznych, hormonalnych, antygenowych), a nawet moŝe być przyczyną zmian jego właściwości fizykochemicznych (zmniejszenie rozpuszczalności, wzrost lepkości, utrata skręcalności światła spolaryzowanego). Denaturacja jest procesem samorzutnym, egzoergicznym, a przez to nieodwracalnym. Po denaturacji białka mają zwykle właściwości hydrofobowe, niezaleŝne od typu natywnego białka, hydrofilowego czy hydrofobowego. Białka zdenaturowane w ph róŝnym od pi (czyli w formie jonu) utrzymują się w roztworze, gdyŝ stabilizuje je ładunek elektryczny, a podczas denaturacji białka w pi natychmiast ulegają wytrąceniu z roztworu (koagulacji). Denaturację białek mogą powodować niektóre czynniki fizyczne takie jak: wysoka temperatura, ultradźwięki, promieniowanie X i ultrafioletowe, wstrząsanie wodnych roztworów białka w atmosferze powietrza, wysychanie. Czynnikami chemicznymi denaturującymi białka są: stęŝone kwasy i zasady nieorganiczne, kationy metali cięŝkich, niektóre kwasy organiczne, stosowanie rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą (etanol, aceton) w temperaturze pokojowej, chlorowodorek guanidyny, mocznik, detergenty (siarczan dodecylu sodu, Triton), fenol, chloroform. Czynniki denaturujące działają na wiązania stabilizujące strukturę przestrzenną białka (wiązania wodorowe, wiązania jonowe, oddziaływania hydrofobowe, wiązania dwusiarczkowe, wiązania koordynacyjne), a przez to powodują zniekształcenie lub zniszczenie struktury II-, III- czy IV-rzędowej, bez hydrolitycznej degradacji łańcucha polipeptydowego. 1. Denaturacja cieplna Ciepło powodując rozrywanie wiązań wodorowych w cząsteczkach, nieodwracalnie denaturuje białka. Dla róŝnych białek proces ich denaturacji cieplnej rozpoczyna się w róŝnych temperaturach (pomiędzy 40 C a 100 C), a tylko nieliczne białka wytrzymują krótkotrwałe gotowanie (np. Ŝelatyna, rybonukleaza). Większość białek globularnych wykazuje najmniejszą rozpuszczalność blisko punktu pi danego białka. Przy ph odpowiadającym pi cząsteczki, białka są elektrycznie obojętne, przez co wykazują tendencję do agregacji, co powoduje ich wypadanie z roztworu. Do 0,5 ml surowicy 5-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl dodać jedną kroplę 1% roztworu CH 3COOH i ogrzewać do wrzenia. Powstaje wówczas obfity osad białka zdenaturowanego przez ogrzewanie. Kwas octowy 3

4 sprowadza odczyn roztworu do ph około 5, tj. takiej wartości ph, w której większość białek jest nierozpuszczalna. Powstały biały kłaczkowaty osad po dodaniu NaCl lub MgSO 4 stanie się wyraźniejszy. Dlaczego? 2. Działanie rozpuszczalników organicznych Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton) stosowane przez dłuŝszy czas w większych stęŝeniach i w wyŝszej temperaturze (20 C 30 C) dezorganizując warstwę wodną otaczającą cząsteczki białka i osłabiając ich oddziaływania hydrofilowe, umoŝliwiają wzajemne łączenie się cząsteczek białka, a przez to powodują wytrącanie zdenaturowanych białek z roztworów. Do 0,5 ml surowicy rozcieńczonej 5-krotnie 0,9% roztworem NaCl dodać 1 ml 95% etanolu. Po godzinie zawartość probówki rozcieńczyć wodą. Strąt nie rozpuszcza się. Porównaj z ćwiczeniem Wytrącanie białek etanolem. 3. Działanie stęŝonego HNO3. Odczyn Hellera Na pół ml stęŝonego HNO 3 ostroŝnie nawarstwić 0,5 ml surowicy 5-krotnie rozcieńczonej 0,9% NaCl, tak aby płyny się nie mieszały. Na granicy zetknięcia roztworów powstaje biały pierścień zdenaturowanego i wytrąconego białka. Pierścień ten jest nierozpuszczalny w nadmiarze kwasu. 4. Działanie NaOH StęŜone zasady nieorganiczne powodują denaturację białka, ale większość z nich pozostaje w stanie rozpuszczonym w środowisku zasadowym. Zdenaturowane białko ulega wytrąceniu po zobojętnieniu roztworu. A. Do 0,5 ml surowicy dodać 0,25 ml 2 M roztworu NaOH. Po wymieszaniu dodawać kroplami 5% roztwór CH 3COOH aŝ do momentu wytworzenia delikatnego osadu. B. Do 1 ml surowicy dodać parę kropli 2 M roztworu NaOH, wymieszać i następnie dodawać kroplami rozcieńczony CH 3COOH aŝ do momentu utworzenia kłaczkowatego osadu. 5. Działanie kationów metali cięŝkich na białka Białka w ph wyŝszym od punktu izoelektrycznego posiadają ładunek ujemny, więc mogą reagować z kationami. Białczany, czyli sole metali cięŝkich (Fe +2, Fe +3, Hg +2, Pb +2 ) z białkami mają małe wartości stałych dysocjacji, przez co są trudno rozpuszczalne i wypadają z roztworu w formie nierozpuszczalnych kompleksów. Z tego powodu jony metali cięŝkich np. rtęci, ołowiu, miedzi są wykorzystywane do wytrącania białek z roztworu. Przygotować trzy probówki z 0,5 ml surowicy 5-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl. Dodawać do nich kroplami za kaŝdym razem wstrząsając: do pierwszej 1% roztwór CuSO 4, do drugiej 1% roztwór (CH 3COO) 2Pb, a do trzeciej 5% roztwór HgCl 2. Do czwartej probówki dodać 0,5 ml surowicy 2-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl i kilka kropli 1% roztworu FeCl 3. Obserwować wytrącanie białka. 6. Wytrącanie białek anionami W roztworach poniŝej punktu izoelektrycznego grupy aminowe białka ulegają protonowaniu, więc białka obdarzone są ładunkiem dodatnim. Niektóre kwasy organiczne np. kwas trichlorooctowy (CCl 3COOH), sulfosalicylowy, pikrynowy i fosfowolframowy, tworzą z nimi nierozpuszczalne połączenia. Białka w obecności 4

5 powyŝszych związków ulegają denaturacji i kwasy te wykorzystuje się do odbiałczania roztworów. Odbiałczanie roztworów jest konieczne przy oznaczaniu w nich stęŝenia niektórych niskocząsteczkowych związków (np. mleczanu czy pirogronianu w surowicy krwi), gdyŝ pozwala uniknąć reakcji jakie mogłyby dawać białka z odczynnikami stosowanymi do ilościowego oznaczania określonego związku. Przygotować cztery probówki zawierające po 0,5 ml surowicy 10-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl. Do pierwszej dodać 0,5 ml 10% roztworu kwasu trichlorooctowego, do drugiej kilka kropli 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego, do trzeciej 3 krople 5% roztworu CH 3COOH i µl kwasu pikrynowego, a do czwartej 0,5 ml 5% roztworu kwasu fosfowolframowego. Obserwować wytrącanie białka. Odczynniki surowica bydlęca, mączka grochowa nasycony roztwór NaCl, 0,9% roztwór NaCl, NaCl in substantia, nasycony roztwór NaOH, 2 M roztwór NaOH, nasycony roztwór (NH 4) 2SO 4,, (NH 4) 2SO 4 in substantia, 1% roztwór CuSO 4, 1% roztwór (CH 3COO) 2Pb, 5% roztwór HgCl 2, 1% roztwór FeCl 3, 95% etanol stęŝ HNO 3, 10 M roztwór HCl, 1% roztwór CH 3COOH, 5% roztwór CH 3COOH, 10% roztwór kwasu trichlorooctowego, 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego, 5% roztwór kwasu fosfowolframowego, kwas pikrynowy 5