Nietypowe materiały biologiczne pobierane w sposób nieinwazyjny w diagnostyce laboratoryjnej

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(3): Praca poglądowa Review Article Nietypowe materiały biologiczne pobierane w sposób nieinwazyjny w diagnostyce laboratoryjnej Noninvasively collected, atypical biological materials in medical laboratory diagnostics Paulina Kowalczyk 1, Aneta Manda 1, Barbara Kościelniak 1, Przemysław Tomasik 2, Krystyna Sztefko 2 1 Studenckie Koło Naukowe Biochemii Klinicznej przy Zakładzie Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykańskiego Instytutu Pediatrii, UJ Collegium Medicum, Kraków 2 Zakład Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykańskiego Instytutu Pediatrii, UJ Collegium Medicum, Kraków Streszczenie W procesie leczenia niezwykle ważną rolę odgrywa wczesna diagnostyka, która pozwala na natychmiastowe rozpoznanie choroby i zastosowanie odpowiedniej terapii. Istotnym czynnikiem wpływającym na sukces terapeutyczny jest sposób pozyskania próbek materiału do badań. Nieinwazyjne pobranie materiału do analizy ogranicza lęk pacjenta związany z tą procedurą, przez co zachęca go do prowadzenia częstszej samokontroli i przyczynia się do diagnozowania chorób na wczesnym etapie. Z tego powodu poszukuje się obecnie nowych metod i parametrów, wykorzystujących materiały biologiczne pobierane w sposób nieinwazyjny. Dynamiczny postęp techniki i nauk medycznych sprawił, że dostępne badania diagnostyczne obejmują coraz szersze ich spektrum. Ciekawą alternatywę dla stosowanych powszechnie w laboratoriach diagnostycznych moczu i kału stanowią takie matryce biologiczne, jak: ślina, włosy, paznokcie, powietrze wydychane, nasienie, pot, łzy czy wydzielina śluzowa górnych dróg oddechowych. Niniejsza praca skupia się na omówieniu zarówno dostępnych, jak i potencjalnych możliwości zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej nietypowych materiałów biologicznych pobieranych w sposób nieinwazyjny. Obecnie analizy z ich użyciem stanowią niewielką część wykonywanych rutynowo oznaczeń, ale prężny rozwój technik badawczo-pomiarowych oraz nieustanny wzrost wiedzy na temat tych materiałów pozwala sądzić, że w przyszłości staną się szeroko rozpowszechnione. Summary Early diagnosis plays an important role in the treatment process. It permits the instantaneous diagnosis of diseases and application of appropriate therapy. The way of obtaining samples for testing is an essential element affecting the therapeutic success. Non-invasive sampling of specimens for laboratory analysis reduces patient s anxiety associated with this procedure and encourages patients to monitor their health status using laboratory tests. Therefore, intensive researches for new methods and parameters in easily available specimens are performed. An interesting alternative to urine and feces, which has been commonly used in medical laboratories, are: saliva, hair, nails, exhaled air, semen, sweat, tears or mucus of the upper respiratory tract. The paper discusses both available and potential laboratory tests in non-invasively collected materials. Nowadays, the application of these analyses represents a minor part of the routine laboratory tests. However, continuous development of analytical methods and progress of knowledge of this materials allow to think that in the future they will be widely performed. Słowa kluczowe: włosy, ślina, pot, łzy, testy oddechowe Key words: hair, saliva, sweat, tears, breath tests Wstęp Współcześnie obserwuje się rozwój badań z wykorzystaniem materiałów pobieranych w sposób nieinwazyjny, bez specjalistycznego sprzętu czy nadzoru personelu medycznego, w warunkach domowych [1]. Zaletą takiego pobierania materiału jest zmniejszenie lęku pacjenta, co może się przyczynić do większej chęci monitorowania stanu swojego zdrowia, a tym samym do diagnozowania chorób na wczesnym etapie i poprawy demograficznych wskaźników stanu zdrowia [2]. Kał, mocz, oraz wymaz z dróg rodnych są powszechnie używane w rutynowej diagnostyce, dlatego też w tej publikacji nie będą szerzej omawiane. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie możliwości wykorzystania mniej popularnych materiałów biologicznych pobieranych w sposób nieinwazyjny jak ślina, włosy, paznokcie, powietrze wydycha- 255

2 ne, nasienie, pot, łzy, czy wydzielina górnych dróg oddechowych w diagnostyce laboratoryjnej oraz kierunków rozwoju tego typu diagnostyki w przyszłości. Ślina Ślina to lekko kwaśny (ph 6-7) płyn wydzielniczy, którego głównym składnikiem jest woda (99%). Ślina zebrana bez czynników stymulujących, takich jak pokarm, jest hipotoniczna, a po pobudzeniu wydzielania staje się izotoniczna w stosunku do osocza. W skład śliny wchodzą m.in. elektrolity (w tym Na, K, Mg, Ca, wodorowęglany, fosforany), białka w tym immunoglobuliny, mucyny, substancje grupowe krwi, enzymy, hormony i witaminy z grupy A, B, C i K [3]. Metody zbierania śliny można podzielić na bez stymulacji oraz z użyciem bodźców tj. parafiny czy gumy do żucia, aby zwiększyć szybkość jej wydzielania. W zależności od przeznaczenia materiału wykorzystuje się szklane lub plastikowe pojemniki, do których ślina może być drenowana, wypluwana czy odsysana. Istnieją również metody absorpcyjne z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów np. Salivette. W ich skład wchodzi chłonny bawełniany lub syntetyczny wkład, który pacjent żuje przez określony czas [4]. Oznaczenia wykonywane w ślinie mogą służyć do diagnozowania chorób infekcyjnych, chorób z autoagresji, nowotworowych, a także chorób endokrynologicznych i kardiologicznych. Ślina może być też wykorzystywana jako materiał w badaniach poziomu leków, czy stwierdzenia obecności narkotyków. Najczęściej oznaczanym hormonem w ślinie jest kortyzol. Na podstawie stężeń tego hormonu w ślinie można ocenić funkcję nadnerczy, prowadzić kontrolę suplementacji hydrokortyzonem, a także monitorować odpowiedź organizmu na stres czy ćwiczenia fizyczne. Zaletą oznaczenia kortyzolu w ślinie jest pobranie materiału do badań bez reakcji stresowej często towarzyszącej pobraniu krwi, która może być powodem podwyższenia stężenia kortyzolu. Do innych hormonów sterydowych oznaczanych w ślinie należą: Testosteron (m.in. diagnostyka hirsutyzmu u kobiet, diagnozowanie hipogonadyzmu i monitorowanie deficytu androgenów u mężczyzn). Progesteron (m.in. ocena indeksu owulacji, monitorowanie hormonalnej terapii zastępczej), 17-OH-progesteron (m.in. diagnozowanie wrodzonego przerostu nadnerczy, ocena funkcji łożyska). Estradiol, estron, estriol (m.in. ocena funkcji jajników w diagnostyce niepłodności, kontrola poziomu hormonów u pacjentek podczas HTZ, testy predykcyjne przedwczesnego porodu). Androstendion (m.in. w przypadku podejrzenia wirylizacji) aldosteron (m.in. diagnostyka hiperaldosteronizmu). DHEA i DHEA-S (m.in. w ocenie funkcji nadnerczy, rozpoznaniu guzów nadnerczy, określeniu przyczyny wirylizacji u kobiet lub wczesnego pokwitania u chłopców) [5]. Stężenie hormonów w ślinie odzwierciedla stężenie ich formy wolnej (nieskoniugowanej z białkami) we krwi. Wolne steroidy dostają się do śliny na drodze dyfuzji, a ich stężenie nie zależy od ilości wydzielanej śliny [6]. Wyjątek stanowi DHEA-S, który ze względu na swój ładunek nie może przenikać przez błony lipidowe, w związku z czym występuje w ślinie w śladowych ilościach [7]. Oprócz hormonów sterydowych do śliny na zasadzie dyfuzji mogą przenikać aminy cykliczne np. melatonina. Prowadzone są także badania nad oznaczeniami hormonów peptydowych, jednak złożony mechanizm transportu tych związków do śliny utrudnia ustalenie zależności między ich stężeniem we krwi i w ślinie. Do metod najczęściej stosowanych do oznaczania stężeń hormonów sterydowych możemy zaliczyć metody EIA i RIA, a także metody separacyjne: chromatografia cieczowa i gazowa. [8]. Również niektóre leki i używki, niezwiązane z białkami, są transportowane do śliny na drodze biernej dyfuzji. Transport ten zależy zarówno od właściwości danego związku np. rozpuszczalności w tłuszczach, wielkości cząsteczki, pka, jak i od ph czy wielkości przepływu śliny [9]. Obecnie można oznaczać w ślinie farmaceutyki z wielu grup, m.in. leki przeciwastmatyczne (np. teofilina), anty-arytmiczne i przeciwnadciśnieniowe (np. digoksyna, metoprolol), przeciwpadaczkowe (np. karbamazepina), antybiotyki (np. gentamycyna), przeciwbólowe (paracetamol), psychotropowe (sole litu) [10]. W ślinie można wykrywać: tetrahydrokanabinoidy (THC), kokainę, opiaty, amfetaminę, metamfetaminę, fencyklidynę, benzodiazepiny, barbiturany, metadon, kotyninę (metabolit nikotyny) bądź alkohol [11]. Alkohol wykrywany jest w ślinie już po 20 min od spożycia do 12h po spożyciu, natomiast THC od kilku minut po użyciu do 24h [12]. W ślinie można wykrywać przeciwciała, kwasy nukleinowe lub antygeny bakterii, wirusów czy pasożytów. Najczęściej wykrywane są przeciwciała m.in przeciwko HBV, HAV, wirusowi odry, świnki, różyczki, EBV, parwowirusowi B19, HHV-6, HPV, lamblii. Badania takie mogą odgrywać dużą rolę w nadzorowaniu i kontroli chorób zakaźnych, stanowić testy przesiewowe w celu potwierdzenia skuteczności szczepionek lub konieczności podania dawek przypominających [13]. Test OraQuick ADVANCE wykrywający przeciwciała HIV1/2 został zaaprobowany przez FDA (Federalna Komisja Leków i Żywności, USA) jako test przesiewowy w warunkach domowych. Wynik dodatni musi jednak zostać zweryfikowany przez badanie potwierdzające. Również w przypadku wirusowego zapalenia wątroby typu C można wykrywać obecność przeciwciał za pomocą komercyjnie dostępnych testów przesiewowych, jednak nie zostały one zatwierdzone przez FDA [14]. Podobnie wykrywanie w ślinie swoistych przeciwciał IgG anty-h.pylori [15] lub DNA bakteryjnego z zastosowaniem PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) może być badaniem przesiewowym u osób z długotrwale występującymi zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi [16]. Prowadzone są badania nad oznaczaniem antygenów i kwasów nukleinowych wirusów w ślinie, jednak ze względu na zmiany składu śliny oraz małą stabilność tych analitów występuje duży odsetek wyników fałszywie ujemnych. Jedną z dostępnych komercyjnie metod jest wykrywanie wirusa HPV w ślinie (OraRisk HPV Test) [17]. Ślina może stanowić przydatny materiał w diagnostyce chorób o podłożu autoimmunologicznym m.in. zespole Sjögrena i celiakii [18]. W ślinie występują charakterystyczne dla zespołu Sjögrena przeciwciała anty-ro i anty-la jak również autoprzeciwciała anty-ttg typowe dla celiakii [19]. Dodatkowo oznaczanie ceruloplazminy w ślinie może być przydatne do różnicowania stadiów nasilenia celiakii [20]. 256

3 Diagn Lab 2014; 50(3): W licznych badaniach stwierdzono obecność markerów nowotworowych w ślinie między innymi: przeciwciała przeciw białku p53, antygeny CA125, CA19-9, CA-15.3 czy CEA. W przypadku raka piersi w ślinie można wykrywać także rozpuszczalny fragment c- -erb-2 (HER2), który może być stosowany do diagnozowania i jako marker prognostyczny u chorych na raka piersi. [21]. Inne badania wykazały, że w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej (OSCC) wzrasta poziom scd44 oraz markerów guza CYFRA21-1, TPA, CA125, których stężenie odpowiada ich stężeniu w surowicy. Wykazano również podwyższony poziom transferryny w ślinie pacjentów z OSCC, silnie skorelowany z wielkością i stadium zaawansowania guza. Natomiast do monitorowania przebiegu choroby przydatne są oznaczenia IL-8 i TNF-α. [22] Udało się także powiązać 4 występujące w ślinie biomarkery mrna (KRAS, MBD3L2, ACRV1 i DPM) z rakiem trzustki, pozwalają one odróżnić chorych od osób zdrowych i z przewlekłym zapaleniem trzustki [23]. Wykazano obecność CRP w ślinie, co może zostać wykorzystane do nieinwazyjnej oceny ryzyka chorób układu krążenia (CVD) [24]. Połączenie EKG z oznaczeniem w ślinie CRP i MPO znacznie poprawiło wykrywalność zawału mięśnia sercowego. W ślinie można oznaczyć również NT-proBNP [25], CK-MB [26], czy hs-ctnt [27], zastosowanie w przyszłości tych markerów do diagnozowania chorób serca znacznie ułatwiłoby procedurę pobierania materiału oraz obniżyłoby koszty badań. Włosy Włos pod względem histologicznym jest zrogowaciałą formą naskórka. W jego budowie wyróżnia się: korzeń leżący w mieszku włosowym oraz wystającą ponad powierzchnię skóry łodygę. Bezbarwna osłonka zewnętrzna zbudowana jest z uformowanej w łuski bezpostaciowej keratyny. Warstwy wewnętrzne to kora i rdzeń. Kora zbudowana jest z zawierających barwnik melaninę keratynocytów i odpowiada za właściwości mechaniczne. Centralną część włosa stanowi rdzeń będący pustą przestrzenią z nielicznymi, rozproszonymi komórkami [28]. Miesięczny przyrost włosa wynosi średnio 1cm i zależy od takich czynników jak: przynależność rasowa. odżywianie czy stan zdrowia. Włosy wyróżniają się spośród innych materiałów wysoką trwałością i odpornością na działanie czynników zewnętrznych, co znalazło powszechne zastosowanie w badaniach retrospektywnych i kryminalistycznych na temat stanu odżywienia pacjenta lub narażenia na toksyny oraz określenia czasu ekspozycji. Istnieją trzy drogi inkorporacji egzogennych związków chemicznych do włosów. Pierwsza to aktywna lub bierna dyfuzja z krwi odżywiającej skórę (najbardziej istotna), druga to dyfuzja z potu i innych płynów obmywających włosy, z kolei trzecia to dyfuzja cząsteczek z powietrza. W przypadku dyfuzji z krwi przyjmuje się, że obecność substancji w 1 centymetrze długości włosa odpowiada okresowi około miesięcznej ekspozycji na daną substancję [29]. Po ucięciu przy skórze włosy należy oczyścić przy użyciu detergentów i rozpuszczalników organicznych, np. metanolu. Oznaczane substancje są ekstrahowane z rozdrobnionych lub pociętych fragmentów włosów [30]. Oznaczenie ksenobiotyków jest możliwe dzięki zastosowaniu wysokoczułych i selektywnych metod analitycznych takich jak spektrometria masowa w połączeniu z chromatografią cieczową (LC/MS) czy też z chromatografią gazową (GC/ MS) [31]. W badaniach kryminalistycznych profilu genetycznego opartego na analizie jądrowego DNA, istotne jest, aby włos był młody i wyrwany wraz z cebulką otoczoną łącznotkankową pochewką. Istnieje również możliwość analizy mitochondrialnego DNA w sytuacji gdy dostępne są tylko fragmenty włosów [32]. Oznaczenia wykonywane we włosach odgrywają istotną rolę zarówno w ocenie uzależnienia od narkotyków, w kontroli leczenia różnych form uzależnień, jak również w monitorowaniu terapii lekowej. Oznaczane są takie związki jak kokaina, heroina, amfetamina, czy też inne opioidy, a także mefedron, kannabinoidy i inne środki psychoaktywne oraz leki [33]. Włosy mają szczególną wartość przy wykrywaniu kwasu gamma-hydroksymasłowego (GHB) składnika pigułki gwałtu. We krwi można wykryć go w czasie do 8h, w moczu do 12h, podczas gdy we włosach można potwierdzić spożycie tego związku w terminie do kilku miesięcy [34]. Możliwa jest analiza zawartości nikotyny czy glukuronidu etylu (produkt metabolizmu alkoholu etylowego) w łodydze włosa [35]. Za pomocą tego typu oznaczeń możliwe jest monitorowanie korzystania z używek, a także kontrola abstynencji [36]. Analiza składu włosów jest przydatna do wykrywania środków dopingujących. Możliwe jest oznaczenie w łodydze włosów steroidów anabolicznych zarówno endogennego tj. DHEA, testosteron jak również egzogennego pochodzenia nandrolon, stanozolol, mesterolon [37]. Dodatkowo oznaczać można także beta-2 adrenomimetyki [38]. Ujemny wynik badania moczu, a dodatni wynik analizy włosów świadczy o stosowaniu danego środka w przeszłości. Zastosowanie wysokoczułych metod pomiarowych umożliwia oznaczanie jakościowe i ilościowe poszczególnych pierwiastków, w tym mikro i makroelementów a także toksycznych metali ciężkich takich jak kadm, ołów, rtęć czy arsen [39]. Badania te mogą być pomocne w ocenie długoterminowych niedoborów w diecie, a w badaniach sanitarno-epidemiologicznych do oceny jakości środowiska życia i wykrywania terenów nadmiernie zanieczyszczonych [40]. Należy jednak podkreślić, iż niektórzy autorzy nie stwierdzili korelacji między podażą pierwiastków, a ich stężeniem we włosach, tłumacząc to wpływem czynników środowiskowych, czy też zabiegami pielęgnacyjnymi na włosach [41]. Stosunkowo nową metodą jest pomiar zawartości kortyzolu w łodydze włosów. Analiza ta pozwala na długoterminową ocenę w okresie od tygodni do kilu miesięcy funkcjonowania osi podwzgórze przysadka nadnercza (HPA) [42]. Paznokcie Paznokieć, podobnie jak włos, zaliczany jest do przydatków skóry. Zbudowany jest z korzenia umiejscowionego pod wałem paznokciowym (obrąbek naskórkowy nadpaznokciowy) oraz blaszki. Paznokcie dłoni przyrastają średnio 1mm na tydzień, u stóp 0,25mm na tydzień. Tempo wzrostu uzależnione jest zarówno od wieku, płci, diety czy też pory roku paznokcie szybciej rosną latem [43]. Pobrany materiał ucięty fragment wolnego brzegu blaszki poddaje się oczyszczeniu z zanieczyszczeń zewnętrznych, rozdrobnieniu i ekstrakcji. Pomiaru dokonuje się za pomocą wysokoczułych i selektywnych technik, np. spektrometrii masowej w połączeniu z chromatografią cieczową( LC/MS) lub gazową (GC/MS) [44]. 257

4 Inkorporacja związków chemicznych do macierzy paznokcia odbywa się na drodze dyfuzji z krwi bądź też jako skutek narażenia środowiskowego dotyczy to zwłaszcza związków lotnych, które wnikają przez pory by następnie połączyć się wiązaniami tiolowymi z keratyną. Paznokcie wykorzystywane są do retrospektywnych badań w toksykologii sądowej jak i klinicznej. Dotyczy to zwłaszcza oznaczeń substancji psychoaktywnych m.in.: kannabinoidów, kokainy, amfetaminy [45, 46]. Analiza składu paznokci może także być cennym badaniem w ocenie narażenia środowiskowego i zawodowego na metale ciężkie takie jak arsen, kadm, chrom, ołów, mangan, żelazo, cynk [47]. Obecność niektórych pierwiastków w paznokciach może wskazywać na ryzyko rozwoju różnych chorób. Badania kliniczne wykazały istnienie dodatniej korelacji pomiędzy stężeniem ołowiu i arsenu w paznokciach a zapadalnością na raka trzustki [48], podwyższone stężenie kadmu w paznokciach świadczy o zwiększonym ryzyku rozwoju raka prostaty [49], a obniżone stężenie selenu w płytce paznokciowej towarzyszy zwiększonemu ryzyku chorób naczyniowo-sercowych [50]. Podobnie, jak w przypadku włosów, paznokcie mogą być alternatywnym materiałem służącym do wykrywania środków dopingujących stosowanych przez sportowców [51]. Powietrze wydychane Powietrze wydychane jest dogodnym materiałem do badań ze względu na możliwość nieinwazyjnego pobrania i szybkiej analizy, a także ze względu na istnienie korelacji pomiędzy stężeniem wielu substancji we krwi a ich obecnością w powietrzu wydychanym [52]. Wydychane powietrze zawiera w swoim składzie m.in. związki nielotne np. białka pochodzące z dróg oddechowych. Obecność tych nielotnych związków w wydychanym powietrzu jest spowodowana przez turbulentny przepływ powietrza, podczas którego ulegają one aerozolizacji i w postaci zawieszonych w gazach cząstek są wydychane [53]. Przez płuca wydalane są także substancje egzogenne, które zostały zaabsorbowane przez skórę lub w płucach po wcześniejszej inhalacji [54]. Istnieje kilka metod pobierania próbek do badań składu powietrza wydychanego. Często do badań wykorzystywany jest kondensat powietrza wydychanego (EBC; exhaled breath condensate). Wydychane powietrze przepływa przez kondensator, schłodzony do temperatury około -20 C. Para wodna wraz z nielotnymi związkami ulega w tych warunkach kondensacji. Pobieranie próbki przez 10 minut wystarcza, by otrzymać 1-2 ml kondensatu [55]. Inną metodą pobierania próbek z powietrza wydychanego jest użycie rurek pokrytych sorbentem, na którym osadzają się anality. Po desorpcji tych związków można je oznaczać przy użyciu chromatografów cieczowych lub gazowych sprzężonych ze spektrometrią masową. Do pobrania próbek powietrza wydychanego stosuje się również torebki oraz zbiorniki, w których próbka zostaje uwięziona po wykonaniu wydechu przez osobę badaną. Następnie zawartość takiego pojemnika może być wprowadzana bezpośrednio do spektrometru masowego [56]. Nową technologią, która umożliwia analizę lotnych związków w powietrzu wydychanym jest wykorzystanie tzw. elektronicznego nosa (e-nos). Podstawą działania e-nosów jest użycie zespołu detektorów, które reagując na obecność konkretnych substancji w badanej próbce poprzez zmianę właściwości elektrycznych generują sygnał analizowany przez oprogramowanie działające na zasadzie sieci neuronalnej [57]. System ten umożliwia nieinwazyjną, szybką, łatwą w przeprowadzeniu i dokładną analizę stanu zdrowia pacjenta, dlatego istnieje szansa, że w przyszłości jego użycie stanie się powszechne. Zastosowanie e-nosa w diagnostyce chorób układu oddechowego obejmuje diagnostykę infekcji (m.in. gruźlicy), przewlekłej obturacyjnej choroby płuc czy astmy [57]. Wykazano, że system ten sprawdza się także w diagnostyce onkologicznej pozwala na wykrycie obecności w powietrzu wydychanym związków towarzyszących swoiście nowotworom piersi, mózgu, płuc, prostaty, trzustki [58]. Dobrze znanymi testami diagnostycznymi są testy oddechowe wykrywające infekcję H. pylori czy nietolerancję laktozy. U pacjentów z podejrzeniem infekcji H. pylori wykonuje się ureazowy test oddechowy po spożyciu mocznika znakowanego węglem C-13 lub C-14 [55]. W obecności H. pylori jego bakteryjna ureaza rozkłada mocznik do dwutlenku węgla i amoniaku, co powoduje pojawienie się w powietrzu wydechowym cząsteczek CO 2 zawierających znakowany atom węgla. Pacjentom z podejrzeniem nietolerancji laktozy podaje się ten cukier. W przypadku nietolerancji laktozy (braku laktazy) węglowodan ten ulega fermentacji bakteryjnej, na co wskazuje wzrost ilości wodoru w powietrzu wydychanym. Prostym i nieinwazyjnym testem diagnostycznym wykonywanym u chorych na astmę jest pomiar stężenia tlenku azotu w powietrzu wydychanym FENO. Indukowalna syntaza tlenku azotu zwiększa swoją aktywność u tych chorych, co powoduje wzrost stężenia NO w wydychanym powietrzu. Poziom tlenku azotu obniża się u pacjentów prawidłowo leczonych kortykosteroidami czy lekami przeciwleukotrienowymi. FENO szybko zmienia się w odpowiedzi na włączone leczenie jak i w zaostrzeniu choroby, stąd badanie to jest przydatne w monitorowaniu stanu chorych na astmę [59]. Także analiza markerów stanu zapalnego może być pomocna w badaniu nasilenia astmy np. stężenie leukotrienów w EBC koreluje z ciężkością napadu a stężenie H 2 O 2, LTC4/D4/E4 czy ph kondensatu może być istotne w ocenie skuteczności leczenia przeciwzapalnego [60]. Kondensat powietrza wydychanego może być dogodnym źródłem biomarkerów chorób płuc. U pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc stwierdza się wysokie stężenia LTB4, PGE2, H 2 O 2, metabolitów tlenku azotu, cytokin IL-6, IL-10, TNF-α oraz obniżone ph w porównaniu z pacjentami zdrowymi. Analiza ph kondensatu może być przydatna w monitorowaniu ostrego odrzucenia przeszczepu płuc. Spadek ph związany z naciekiem neutrofili wskazuje na zagrożenie odrzuceniem przeszczepu [61]. Badania EBC mogą być także przydatne w chorobach o pierwotnej przyczynie zlokalizowanej poza drogami oddechowymi. Np. u pacjentów z nasiloną chorobą refluksową przełyku dochodzi do nasilenia stresu oksydacyjnego w drogach oddechowych, co powoduje obniżone stężenie tlenków azotu w EBC [62]. Wykazano także przydatność monitorowania stężenia w powietrzu wydychanym leków stosowanych w anestezjologii: propofolu i fentanylu, kwasu walproinowego leku przeciwpadaczkowego czy metadonu, leku stosowanego w terapii heroinistów. Natychmiastowa analiza próbek oddechu pacjenta mogłaby znaleźć 258

5 Diagn Lab 2014; 50(3): zastosowanie na oddziałach intensywnej terapii czy w anestezjologii, gdzie często dochodzi do szybkich zmian stężeń leków we krwi. Na razie monitorowanie leczenia w czasie rzeczywistym jest stosunkowo nowym kierunkiem rozwoju badań nad składem powietrza wydychanego, ale przewiduje się, że wraz z rozwojem spektrometrii masowej ma szansę stać się w przyszłości metodą z wyboru w anestezjologii [56]. W wydychanym powietrzu można oznaczać alkohol ale również narkotyki -amfetaminę i metamfetaminę. Związki te osadzają się na powierzchni ze zmodyfikowanej krzemionki, a następnie mogą zostać wykryte metodą HPLC MS. W podobny sposób możliwe jest wykrycie THC, metadonu, kokainy czy buprenorfiny. Próbki wydychanego powietrza są łatwiej dostępne niż dotychczas stosowane materiały do badania w kierunku obecności narkotyków. Mogą być one pobrane bez pogwałcenia intymności osoby kontrolowanej przy jednoczesnej obecności osoby nadzorującej. Duże nadzieje wiązane są z dalszym rozwojem i miniaturyzacją tej technologii [63]. Nasienie Nasienie jest płynną wydzieliną, której komponenty (plemniki oraz plazma nasienia) są produkowane w obrębie jąder, najądrzy, pęcherzyków nasiennych, prostaty i gruczołów opuszkowo- -cewkowych. Przeciętna objętość ejakulatu wynosi około 2-5 ml; według kryteriów WHO z 2010 roku objętość ta nie powinna być niższa niż 1,5 ml [64]. Oddanie nasienia do analizy powinna poprzedzać kilkudniowa abstynencja seksualna. Zaleca się analizę dwóch niezależnych próbek, przy zachowaniu stałego okresu abstynencji. W przypadku analizy ruchliwości plemników należy unikać stosowania lubrykantów. W celu ograniczenia ekspozycji materiału na różnice temperatur i dokładnej kontroli czasu upływającego pomiędzy pobraniem materiału a analizą, materiał jest zwykle pobierany w przeznaczonych do tego celu pomieszczeniach przy laboratorium. Materiał powinien być przechowywany w temperaturze pokojowej, a jego analiza powinna rozpocząć się nie później niż po godzinie od jego uzyskania. Badanie rozpoczyna się od określenia czasu upłynnienia spermy, w tym celu najlepiej umieścić próbkę w inkubatorze o temperaturze 37 o C, gdzie jest ona od czasu do czasu łagodnie mieszana [65]. Standardowa analiza w laboratorium obejmuje ocenę makroskopową (wygląd, objętość, ph) i mikroskopową liczbę plemników, ich ruchliwość, żywotność i morfologię, a także agregację, aglutynację, ocenę jakościową i ilościową komórek innych niż plemniki. W przypadku zaobserwowania aglutynacji bada się obecność przeciwciał skierowanych przeciw plemnikom [66]. W specjalistycznych laboratoriach wykonywane są zaawansowane badania potencjału rozrodczego nasienia. Należą do nich między innymi test penetracji śluzu (SMPT; sperm mucus penetration test), badanie odsetka reakcji akrosomalnej spontanicznej i indukowanej, fuzji plemnika i oocytu, test wiązania plemnika do osłonki przejrzystej czy test hipoosmotyczny. Nieprawidłowe wyniki testów penetracji śluzu czy wiązania plemnika do osłonki przejrzystej korelują ze zmniejszoną zdolnością do zapłodnienia w warunkach in vitro. Odchylenia od normy w teście SMPT mogą świadczyć o obecności przeciwciał zaburzających ruchliwość plemników oraz ich zdolność do penetracji śluzu szyjkowego [67]. Z kolei test hipoosmotyczny pozwala ocenić integralność błony komórkowej plemników, która jest niezbędna dla prawidłowego przebiegu procesu kapacytacji, reakcji akrosomalnej i wiązania do powierzchni komórki jajowej. Wynikiem badania wskazującym na zaburzenia integralności błony jest stwierdzenie niskiego odsetka plemników, w których doszło do efektu puchnięcia witki [68]. Wśród testów posiadających najwyższą wartość prognostyczną jest badanie przy użyciu cytometrii przepływowej fragmentacji DNA plemników. Określa się wówczas indeks fragmentacji DNA (DFI; DNA fragmentation index), czyli odsetek plemników w których wykazano uszkodzenie chromatyny. Wysokie ryzyko niepłodności występuje u pacjentów, u których ponad 30% plemników posiada uszkodzoną chromatynę [69]. W specjalistycznych placówkach dostępna jest analiza wielu parametrów biochemicznych w nasieniu. Niskie stężenie fruktozy jest wskaźnikiem ciężkiej dysfunkcji lub obustronnej agenezji pęcherzyków nasiennych, chociaż pojawia się też w obstrukcji przewodów wytryskowych [70]. Oznaczenia syntazy prostaglandyny D (PGDS) są używane do różnicowania obstrukcyjnej i nieobstrukcyjnej azoospermii u osób z azoospermią obstrukcyjną stwierdza się obniżone stężenie PGDS [71]. Wskaźnikiem niedrożności nasieniowodów na odcinku poniżej najądrzy jest niskie stężenia karnityny w nasieniu, podczas gdy obstrukcji dróg wyprowadzających nasienie w obrębie jąder towarzyszy prawidłowy poziom karnityny [65]. Podwyższony poziom kinazy kreatynowej (CK) w nasieniu występuje u mężczyzn z ciężką oligospermią, niezależnie od jej przyczyny. Poziom tego enzymu negatywnie koreluje z liczbą i ruchliwością plemników oraz odsetkiem plemników o prawidłowej morfologii. Badanie aktywności tego enzymu jest czułym wskaźnikiem jakości spermy i prawidłowego przebiegu procesu spermatogenezy [72]. Pot Jest to płyn hipotoniczny produkowany i wydzielany przez gruczoły potowe w naskórku. Wyróżnia się trzy rodzaje tych gruczołów: ekrynowe (najliczniejsze), apokrynowe (przy mieszkach włosowych), apoekrynowe (w skórze owłosionej) [73]. Skład chemiczny potu zależy od wielu czynników, takich jak: dieta, klimat, stan zdrowia, aktywność fizyczna, a także zależy od miejsca wydzielania na ciele. Woda stanowi 99% potu ekrynowego bezbarwnego i bezzapachowego, pot apokrynowy jest bardziej oleisty [74]. W ciągu doby ludzki organizm wytwarza przeciętnie ml potu, choć ilość ta może wzrosnąć do 2-4 l/h [75]. Do potu substancje (leki, ich metabolity, narkotyki) mogą przedostawać się w różny sposób: na drodze dyfuzji z krwi do gruczołów potowych zgodnie z gradientem stężeń lub w wyniku transportu transdermalnego. Najłatwiej wydzielane są substancje o charakterze słabo zasadowym, ponieważ ich niezjonizowana postać może ulegać akumulacji w pocie środowisku o niższym, w porównaniu do krwi, ph [76]. Pobranie materiału do badań wymaga stymulacji cieplnej lub chemicznej, zwykle stosuje się jontoforezę pilokapilarną. Miejsce po stymulacji bezpiecznym napięciem oczyszcza się destylowaną lub dejonizowaną wodą, a pot zbiera się z zastosowaniem gazików, 259

6 bibuły lub mikroprobówek. Aby zapobiec kontaminacji oraz parowaniu próbki materiał chłonący okleja się nieprzepuszczalną membraną. Gazik/bibuła ważony jest przed i po zebraniu materiału, w celu wyliczenia ilości zebranego potu [77]. Komercyjne zestawy zbudowane są z wklęsłego dysku i spiralnej rurki zakończonej centralnie położoną mikroprobówką, do której zasysana jest odpowiednia ilość potu [78]. Najczęściej oznacza się w pocie stężenie chlorków (test potowy). Oznaczenie to jest badaniem przesiewowym w diagnostyce mukowiscydozy, przy czym należy pamiętać, że stężenie chlorków w pocie rośnie z wiekiem u małych dzieci wartości powyżej 60 mmol/l są typowe dla mukowiscydozy, natomiast u zdrowych dorosłych takie stężenia chlorków są normą [79]. Do badań toksykologicznych najczęściej potwierdzających abstynencję stosuje się plastry przylepiane na skórę nawet na kilka dni. Zbudowane są one z warstwy chłonącej oraz półprzepuszczalnej membrany, która umożliwia oddychanie skóry [80]. Zaletą jest zagęszczenie analitu w warstwie chłonnej przy kilkudniowym noszeniu plastra. Wykazano możliwość oceny w takich próbkach stężenia metali ciężkich, leków/narkotyków, alkoholu czy środków dopingujących. Po ekstrakcji substancji (np. wytrząsanie z mieszaniną metanol-acetonitryl, ekstrakcja SPE) z plastra, rozdział i oznaczenia wykonuje się najczęściej za pomocą GC-MS, LC-MS/ MS lub testów immunologicznych [81, 82]. Prowadzone są badania nad sensorami elektrochemicznymi, które mogłyby w sposób ciągły monitorować ph, stężenie mleczanów, amoniaku, innych elektrolitów w pocie [83, 84]. Wykazano również, że stężenie wielu peptydów w pocie, w tym cytokin prozapalnych, koreluje ze stężeniami we krwi, co może mieć zastosowanie w monitorowaniu np. chorób sercowo-naczyniowych czy depresji [85]. Łzy Ciecz łzowa, zwana też filmem łzowym, jest fizjologicznie wydzielana przez gruczoł łzowy w objętości 1,5 2 ml na dobę. [86]. W sytuacji podrażnienia produkcja łez może wzrosnąć nawet stukrotnie. Film łzowy cechuje się budową trójwarstwową. Warstwa powierzchniowa tłuszczowa odpowiada za ochronę przed parowaniem i infekcjami, przed wypływaniem cieczy poza powieki oraz ułatwia mruganie. Warstwa wodna środkowa obmywa rogówkę z substancji resztkowych, zawiera także substancje o działaniu bakteriobójczym oraz koryguje w nieznacznym stopniu nieregularności przedniej powierzchni rogówki. Dodatkowo odpowiada ona za rozprowadzanie substancji odżywczych i tlenu. Warstwa dolna mucynowa (śluzowa) produkowana jest głównie przez komórki kubkowe spojówki, uławia przyleganie filmu łzowego do gałki ocznej i rozprowadzanie warstwy wodnej po jej powierzchni [87]. Istnieje kilka metod pobrania cieczy łzowej. Jedną z nich jest wykorzystanie specjalnie przygotowanego krążka nitrocelulozowego papieru filtracyjnego i umieszczenie go na kilka sekund w obrębie spojówki dolnej lub tarczki górnej (po odwróceniu powieki). Można też zastosować specjalne paski bibuły, które umieszcza się w dolnym załamku oka na ok. 5 minut. Istnieje także możliwość pobrania łez bezpośrednio do kapilar [88]. Badania łez osmolalność oraz stężenia mediatorów stanu zapalnego wykonywane są w diagnostyce zespołu suchego oka (DED) [89]. Ciecz łzowa jest też wykorzystywana w diagnostyce ocznych chorób alergicznych. Istnieje możliwość oznaczania mediatorów zapalenia takich jak histamina, tryptaza, ECP, IL-4, IL-5 czy eotaksyna [90]. Przy zastosowaniu czułych metod immunologicznych (np. macierze kulkowe) pojawiła się możliwość oznaczania we łzach śladowych stężeń aktywnych biologicznie białek m.in. chemokin, cytokin czy też czynników wzrostowych. Wiadomo że, stężenie glukozy we łzach koreluje ze stężeniem we krwi [91]. Dlatego prowadzone są badania nad oznaczaniem glukozy w cieczy łzowej z zastosowaniem specjalnych soczewek kontaktowych z wbudowanym sensorem amperometrycznym [92]. Istnieją także szybkie testy serologiczne wykorzystujące łzy jako materiał do badania. Przykładem może być oznaczanie przeciwciał klasy IgG i IgA w zakażeniach oczu wywołanych przez Chlamydia trachomatis [93]. Ponadto ciecz łzowa może być wykorzystywana w metodach PCR np. w diagnostyce zakażenia wirusem Herpes simplex typu 1 [94]. Wydzielina śluzowa górnych dróg oddechowych Śluz jest produkowany przez komórki kubkowe i gruczoły podśluzowe [95]. W śluzie poza wodą występują jony, głównie Na+ oraz Cl -, makrocząsteczki m.in. tłuszcze, węglowodany, przeciwciała, proteazy, glikoproteiny oraz mucyny odpowiedzialne za lepkość śluzu [96]. Pobranie próbki wydzieliny śluzowej nosa może odbywać się na zasadzie: wydmuchania nosa przez pacjenta, zassania wydzieliny (przy użyciu specjalnych pomp lub poprzez przyłożenie cienkiej szklanej kapilary), wykonania płukania nosa czy z użyciem bawełnianych bądź wykonanych z gumy piankowej absorbentów [97]. Obecnie metodą z wyboru w diagnostyce chorób alergicznych górnych dróg oddechowych jest wymaz z dolnej małżowiny nosowej i jego ocena cytologiczna [98]. Jednak wykonywane są też analizy biochemiczne wydzieliny m.in. pomiar stężenia eozynofilowego białka kationowego (ECP) i tryptazy. Wykazano zależność między poziomem ECP w wydzielinie śluzowej nosa a aktywnością zapalenia z naciekiem eozynofilowym w tkance, a obniżenie stężenia jest dobrym markerem skuteczności terapii sterydowej, antyhistaminowej i immunoterapii [97]. Podwyższony poziom tryptazy w popłuczynach z jamy nosowej jest użytecznym wskaźnikiem wystąpienia reakcji alergicznej oraz jest indykatorem aktywacji mastocytów w odpowiedzi typu natychmiastowego [99]. Podsumowanie Do niepodważalnych zalet wyżej opisanych materiałów do badań, należy zaliczyć nieinwazyjny i bezbolesny sposób ich pozyskania. Jest to szczególnie doceniane w przypadku dzieci i osób starszych, u których pobranie krwi może być trudne. Dodatkową zaletą jest zminimalizowanie ryzyka przeniesienia infekcji na pacjenta lub personel medyczny. Ponadto w porównaniu do krwi i moczu warunki takie jak temperatura czy sposób przechowywania mają znacznie mniejszy wpływ na zmienność parametrów oznaczanych w ślinie, włosach czy paznokciach. Co więcej, wyniki analiz przydatków skóry nie są obciążone błędem związanym z krótkoterminowymi zmianami stężeń substancji w nich oznaczanych. Brak zrozumienia dla korzyści ze stosowania 260

7 Diagn Lab 2014; 50(3): tych materiałów jest jedną, ale nie jedyną przyczyną rzadkiego ich wykorzystywania w diagnostyce. Niestety, w większości przypadków stężenie substancji oznaczanych w tych materiałach jest bardzo niskie w porównaniu do ich stężeń we krwi. Konieczne jest zatem wykorzystanie czułych i zwykle drogich metod pomiarowych. Często brak jest poprawnie zdefiniowanych wartości referencyjnych. Ich ustalenie utrudniają znaczne wahania i zmienna szybkość wydzielania składników w ciągu doby w przypadku śliny oraz potu, a także różnice w składzie tych materiałów zależne od środowiska życia, płci, rasy, diety, stanu zdrowia, a nawet rodzaju środków i zabiegów pielęgnacyjnych stosowanych na włosach, skórze i paznokciach. Również brak standaryzacji metod a tym samym unifikacji przedziałów wartości referencyjnych utrudnia porównywanie wyników uzyskanych z różnych laboratoriów. Czynniki te powodują, że interpretacja wyników badań wykonywanych w materiałach biologicznych pobieranych w sposób nieinwazyjny jest trudna. Piśmiennictwo 1. Kearns AJ, O Mathúna DP, Scott PA. Diagnostic self-testing: autonomous choices and relational responsibilities. Bioethics 2010; 24: Tucker JD, Bien CH, Peeling RW. Point-of-care testing for sexually transmitted infections: recent advances and implications for disease control. Curr Opin Infect Dis 2013; 26: Humphrey SP, Williamson RT. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 2001; 85: Topkas E, Keith P, Dimeski G. Evaluation of saliva collection devices for the analysis of proteins. Clin Chim Acta. 2012; 413: Bartoszewicz ZP, Kondracka A. Ślina jako alternatywny materiał laboratoryjny dla oznaczeń hormonalnych zalety i ograniczenia. Wiad Lek 2011, 64; Hofman LF. Human saliva as a diagnostic specimen. J Nutr 2001; 131: 1621S-5S. 7. Malamud D. Saliva as a diagnostic fluid. Dent Clin North Am 2011; 55: Ozbay Y, Aydin S, Dagli AF, et al. Obestatin is present in saliva: alterations in obestatin and ghrelin levels of saliva and serum in ischemic heart disease. BMB Rep 2008; 41: Jusko WJ, Milsap RL. Pharmacokinetic principles of drug distribution in saliva. Ann N Y Acad Sci 1993; 694: Langman L. The use of oral fluid for therapeutic drug management: clinical and forensic toxicology. J Ann N Y Acad Sci 2007; 1098: Drummer OH. Drug testing in oral fluid. Clin Biochem Rev 2006; 27: PYDT Saliva Drug Testing, Madar R, Straka S, Baska T. Detection of antibodies in saliva--an effective auxiliary method in surveillance of infectious diseases. Bratisl Lek Listy 2002; 103: Corstjens PL, Abrams WR, Malamud D. Detecting viruses by using salivary diagnostics. J Am Dent Assoc 2012; 143: 12S-8S. 15. Sönmezoglu M, Baysal B, Ergen A, Barut SG. Detection and evaluation of salivary antibodies to Helicobacter pylori in dyspeptic patients. Int J ClinPract 2005; 59: Tiwari SK, Khan AA, Ahmed KS, et al. Rapid diagnosis of Helicobacter pylori infection in dyspeptic patients using salivary secretion: a non-invasive approach. Singapore Med J 2005; 46: Corstjens PL, Abrams WR, Malamud D. Detecting viruses by using salivary diagnostics. J Am Dent Assoc 2012; 143:12S-8S. 18. Jonsson R, Vogelsang P, Volchenkov R, et al. The complexity of Sjögren s syndrome: novel aspects on pathogenesis. Immunol Lett 2011; 141: Condò R, Costacurta M, DocimoR. The anti-transglutaminase auto-antibodies in children s saliva with a suspect coeliac disease: clinical study. OralImplantol (Rome) ; 6: Hasan HR, Ghadhban JM, Abudal Kadhum ZI. Salivary ceruloplasmin ferroxidase & oxidase activities in celiac patients. Int J Biomed Sci 2012; 8: Pfaffe T, Cooper-White J, Beyerlein P, et al. Diagnostic potential of saliva: current state and future applications. Clin Chem 2011; 57: Liu J, Duan Y. Saliva: a potential media for disease diagnostics and monitoring. Oral Oncol 2012; 48: Spielmann N, Wong DT. Saliva: diagnostics and therapeutic perspectives. Oral Dis 2011; 17: Punyadeera C, Dimeski G, Kostner K, et al. One-step homogeneous C-reactive protein assay for saliva.j Immunol Methods 2011; 373: Foo JY, Wan Y, Kostner K, et al. NT-ProBNP levels in saliva and its clinical relevance to heart failure. PLoS One 2012, DOI: /journal.pone Mirzaii-Dizgah I, Hejazi SF, Riahi E, Salehi MM. Saliva-based creatine kinase MB measurement as a potential point-of-care testing for detection of myocardial infarction. Clin Oral Investig 2012; 16: Mirzaii-Dizgah I, Riahi E. Salivary high-sensitivity cardiac troponin T levels in patients with acute myocardial infarction. Oral Dis 2013; 19: Rogers GE. Hair follicle differentiation and regulation. Int J Dev Biol 2004; 48: Cordero RC, Lee S, Paterson S. Distribution of concentrations of cocaine and its metabolites in hair collected postmortem from cases with diverse causes/ circumstances of death. J Anal Toxicol 2010; 34: Skendera LV, Karacic V, Brcic I, et al. Quantitative determination of amphetamines, cocaine, and opiates in human hair by gas chromatography/mass spectrometry. Forensic Science International 2002; 125: Kim JY, Suh S III, Kyo M, et al. Gas chromatography-high-resolution mass spectrometric method for determination of methamphetamine and its major metabolite amphetamine in human hair. J Anal Toxicol 2005; 29: Bednarek J. O włos tradycyjne metody badania włosów. Genetyka i Prawo 2013; 3: Rojek S, Kłys M, Konopka T. Zastosowanie analizy wybranych substancji psychoaktywnych we włosach dla celów opiniowania sądowo-lekarskiego Część I. Analiza segmentowa włosów w przypadkach śmiertelnych zatruć opioidami i amfetaminami. Arch Med Sąd Krym 2009; 59: Madea B, Mußhoff F. Knock-out drugs: their prevalence, modes of action, and means of detection. Dtsch Arztebl Int 2009; 106: Florescu A, Ferrence R, Einarson T. Methods for quantification of exposure to cigarette smoking and environmental tobacco smoke: focus on developmental toxicology. Ther Drug Monit 2009; 31: Concheiro M, Cruz A, Mon M, et al. Ethylglucuronide determination in urine and hair from alcohol withdrawal patients. J Anal Toxicol 2009; 33: Kintz P, Cirimele V, Ludes B. Discrimination of the nature of doping with 19-norsteroids through hair analysis. Clin Chem 2000; 46: Salquebre G, Bresson M, Villain M, et al. Clenbuterol determination in calf hair by uplc-ms-ms: case report of a fraudulent use for cattle growth. J Anal Toxicol 2007; 31: Suliborska J. A Comparison of levels of select minerals in scalp hair samples with estimated dietary intakes of these minerals in women of reproductive age. Biol Trace Elem Res 2011; 144: Barton H. Advantages of the use of deciduous teeth, hair and blood analysis for lead and cadmium bio-monitoring in children. A Study of 6-Year-Old Children from Krakow (Poland). Biol Trace Elem Res 2011; 143: Thomas V, Knight R, Haswell S. Maternal hair selenium levels as a possible long- -term nutritional indicator of recurrent pregnancy loss. BMC Women s Health 2013; 13: Kimberly L, Hernandez A, Ross R. Hair cortisol levels as a retrospective marker of hypothalamicpituitary axis activity throughout pregnancy: Comparison to salivary cortisol. Physiol Behav 2011; 104: Yaemsiri S, Hou N, Slining M, et al. Growth rate of human fingernails and toenails in healthy American young adults. J Eur Acad Dermatol Venereol 2010; 24: He K. Trace elements in nails as biomarkers in clinical research. Eur J Clin Invest 2011; 41: Lemos NP, Anderson RA, Robertson JR. Nail analysis for drugs of abuse: extraction and determination of cannabis in fingernails by RIA and GC-MS. J Anal Toxicol 1999; 23: Lin DL, Yin RM, Liu HC. Deposition characteristics of methamphetamine and amphetamine in fingernail clippings and hair sections. J Anal Toxicol 2004; 286: Karimi G, Shaharar S, Homayouni N. Association between trace element and heavy metal levels in hair and nail with prostate cancer. Asian Pac J Cancer Prev 2012; 139:

8 48. Amaral A, Porta M, Silverman D. Pancreatic cancer risk and levels of trace elements. Gut 2012; 61: Vinceti M, Venturelli M, Sighinolfi C, et al. Case-control study of toenail cadmium and prostate cancer risk in Italy. Sci Total Environ 2007; 373: Gomez-Aracena J, Martin-Moreno JM, Riemersma RA. Association between toenail scandium levels and risk of acute myocardial infarction in European men: the EURAMIC and Heavy Metals Study. Toxicol Ind Health 2002; 18: Brown HG, Perret D. Detection of doping in sport: detecting anabolic-androgenic steroids in human fingernail clippings. Med Leg J 2011; 79:67-9. DOI: /mlj Ruzsanyi V i Baumbach BI. Analysis of human breath using IMS. Int J Ion Mobility Spectrom 2005; 8: Dodig S, Cepelak I. Exhaled breath condensate from an analytical point of view. Biochem Med (Zagreb) 2013; 23: Dent AG, Sutedja TG, Zimmerman PV. Exhaled breath analysis for lung cancer. J Thorac Dis 2013; 5: Mutlu GM, Garey KW, Robbins RA, et al. Collection and analysis of exhaled breath condensate in humans. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164: Bertchold C, Bosilkovska M, Daali Y, et al. Real time monitoring of exhaled drugs by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev 2013; 9999: Hanson CW, Thaler ER. Electronic nose prediction of a clinical pneumonia score: biosensors and microbes. Anesthesiology 2005; 102: Chen S, Wang Y, Choi S. Applications and technology of electronic nose for clinical diagnosis. Open Journal of Applied Biosensor 2013; 2: Zitt M. Clinical applications of exhaled nitric oxide for the diagnosis and management of asthma: a consensus report. Clin Ther 2005; 27: Borrill ZL, Roy K, Singh D. Exhaled breath condensate biomarkers in COPD. Eur Respir J 2008; 32: Dupont LJ, Dewandeleer Y, Vanaudenaerde BM, et al. The ph of exhaled breath condensate of patients with allograft rejection after lung transplantation. Am J Transplant 2006; 6: Soyer T, Soyer OU, Birben E, et al Pepsin levels and oxidative stress markers in exhaled breath condensate of patients with gastroesophageal reflux disease. J Pediatr Surg 2013; 48: Beck O, Stephanson N, Sandqvist S, et al. Detection of drugs of abuse in exhaled breath using a device for rapid collection:comparison with plasma, urine and self-reporting in 47 drug users. J Breath Res 2013; 7: WHO (2010). WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5th ed. Geneva, World Health Organization. 65. Agarwal A, Bragais FM, Sabanegh E. Assessing sperm function. Urol Clin N Am 2008; 35: Semczuk M. Badanie nasienia. In: Semczuk M, Kurpisz M, (eds.). Andrologia. Wyd Lek PZWL, Warszawa, 2006: McLahan RI, Baker HW, Clarke GN, et al. Semen analysis: its place in modern reproductive medical practice. Pathology 2003; 35: Ramu S, Jeyendran RS. The hypo-osmotic swelling test for evaluation of sperm membrane integrity. Methods Mol Biol 2013; 927: Oleszczuk K, Giwercman A, Bungum M. Intra-individual variation of the sperm chromatin structure assay DNA fragmentation index in men from infertile couples. Hum Reprod 2011; 26: Diamandis EP, Arnett WP, Foussias G, et al. Seminal plasma biochemical markers and their association with semen analysis findings. Urology 1999; 53: Heshmat SM, Mullen JB, Jarvi KA, et al Seminal plasma lipocalin-type prostaglandin D synthase: a potential new marker for the diagnosis of obstructive azoospermia. J Urol 2008; 179: Hallak J, Sharma RK, Pasqualotto FF, et al. Creatine kinase as an indicator of sperm quality and maturity in men with oligospermia. Urology 2001; 58: Sato K, Leidal R, Sato F. Morphology and development of an apoeccrine sweat gland in human axillae. Am J Physiol 1987; 252: R Labows JN, Preti G, Hoelzle, et al. Steroid analysis of human apocrine secretion. Steroids 1979; 34: Kintz P, Samyn N. Unconventional samples and alternative matrices. In: Bogusz MJ(ed).Handbook of Analytical Separations, Vol.2 Forensic Science. Elsevier Science, Amsterdam, 2000: Huestis MA, Oyler JM, Cone EJ, et al. Sweat testing for cocaine, codeine and metabolites by gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999; 733: Sweat testing: sample collection and quantitative chloride analysis; approved guideline third edition. CLSI document C34-A3; Ely MR, Ely BR, ChinevereTD, et al. Evaluation of the megaduct sweat collector for mineral analysis. Physiol Meas 2012; 33: Program badań przesiewowych noworodków w Polsce na lata , www2.mz.gov.pl 80. Gallardo E, Queiroz JA. The role of alternative specimens in toxicological analysis. Biomed Chromatogr 2008; 22: Koster RA, Alffenaar JW, Greijdanus B, et al. Application of sweat patch screening for 16 drugs and metabolites using a fast and highly selective LC-MS/MS method. Ther Drug Monit 2014; 36: Barroso M, Gallardo E, Vieira DN, et al. Bioanalytical procedures and recent developments in the determination of opiates/opioids in human biological samples. Anal Bioanal Chem 2011; 400: Bandodkar AJ, Hung VW, Jia W, et al. Tattoo-based potentiometric ion-selective sensors for epidermal ph monitoring. Analyst 2013; 138: Jia W, Bandodkar AJ, Valdés-Ramírez G, et al. Electrochemical tattoo biosensors for real-time noninvasive lactate monitoring in human perspiration. Anal Chem 2013; 85: Marques-Deak A, Cizza G, Eskandari F, et al. Measurement of cytokines in sweat patches and plasma in healthy women: validation in a controlled study. J Immunol Methods 2006; 315: Ohashi Y, Dogru M, Tsubota K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta 2006; 369: Nowak M; Marek B; Kajdaniuk A, et al. Zespół suchego oka schorzenie interdyscyplinarne. Wiad lek 2005; 58: Markoulli M, Papas E, Petznick A, et al. Validation of the flush method as an alternative to basal or reflex tear collection. Curr Eye Res 2011; 36: Enríquez-de-Salamanca E, Castellanos M. Tear cytokine and chemokine analysis and clinical correlations inevaporative-type dry eye disease. A Stern; Molecular Vision 2010; 16: Leonardi A. Allergy and allergic mediators in tears. Exp Eye Res. 2013; 117: DOI /j.exer Sen DK, Sarin GS. Tear glucose levels in normal people and in diabetic patients. Br J Ophthalmol 1980; 64: Yao H, Shum A, Cowan M. A contact lens with embedded sensor for monitoring tear glucose level. Biosens Bio electron 2011; 26: Darougar S, Treharne JD, Minassian D. Rapid serological test for diagnosis of chlamydial ocular infections. Br J Opthalmol 1978; 62: Seung YL, Mee JK, Mee KK, Won RW. Comparative Analysis of Polymerase Chain Reaction Assay for Herpes Simplex Virus 1 Detection in Tear. Korean J Ophthalmol 2013; 27: Rubin BK. Physiology of airway mucus clearance. Respir Care 2002; 47: Lillehoj ER, Kim KC. Airway mucus: its components and function. Arch Pharm Res 2002; 25: Klimek L, Rasp G. Norm values for eosinophil cationic protein in nasal secretions: influence of specimen collection. Clin Exp Allergy 1999; 29: Woszczek G, Kowalski ML, Majkowska Wojciechowska B i wsp. Porównanie obrazu cytologicznego błony śluzowej nosa w badaniach wymazów, wyskrobin i popłuczyn nosa. Alerg Astma Immun 1996, 1, Castells M, Schwartz LB. Tryptase levels in nasal-lavage fluid as an indicator of the immediate allergic response. J Allergy Clin Immunol 1988; 82: Adres do korespondencji: dr hab. Przemysław Tomasik Zakład Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kraków, ul. Wielicka 265 tel p.tomasik@uj.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: